Células Pluripotenciais Induzidas

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1 Células Pluripotenciais Induzidas Uma vez dominados os processos envolvidos na obtenção, cultivo, e diferenciação de CTE em células de interesse clínico, outra limitação prática deve ser levada em conta. Apesar de bancos de CTE poderem ser eventualmente criados, permitindo o estabelecimento de grandes coleções, elas dificilmente iriam abranger toda a diversidade existente. Assim, as CTE teriam seu uso restrito a receptores histo-compatíveis. Uma das alternativas à criação de bancos de CTE envolve a reprogramação do núcleo de células somáticas (no caso, o paciente sem doador) pelo citoplasma de um oócito, de forma a obter CTEh autólogas. Esta abordagem é também conhecida como clonagem terapêutica uma vez que não visa gerar um indivíduo clonado, mas somente CTE para uso terapêutico. A reprogramação do núcleo somático induzida pelo citoplasma de oócitos resulta da presença de diferentes moléculas, incluindo fatores de transcrição e outras proteínas. Recentemente, vários grupos relataram a indução de pluripotência em fibroblastos primários humanos através da transdução dos mesmos com vetores virais expressando os genes OCT4, C-MYC, KLF4 e SOX2. As chamadas células-tronco pluripotentes induzidas (ips) têm morfologia característica de CTEs, expressam marcadores de células pluripotentes e são capazes de se diferenciar in vitro e in vivo em tecidos derivados dos três folhetos embrionários. Assim, a geração de ips a partir da indução de células somáticas por fatores específicos, poderia representar uma alternativa para a obtenção de células tronco histo-compatíveis. Os resultados preliminares obtidos pelo grupo coordenado pelo Dr. Dimas Tadeu Covas do Hemocentro de Ribeirão Preto mostram a eficiência na produção de vetores lentivirais, na transdução de células-tronco mesenquimais e progenitores endoteliais e na modificação do padrão de expressão de célulastronco endoteliais com gene Nanog. Assim, este grupo, através do sub-projeto 5, intitulado Modificação gênica de células-tronco, terá como objetivo geral, modificar geneticamente Células Tronco Mesenquimais (CTM) e células progenitoras endoteliais com vetores lentivirais contendo fatores de transcrição, com o intuito de transformar células multipotentes em células pluripotentes e com maior capacidade de expansão in vitro. Para tanto, o projeto envolverá as seguintes abordagens: a) transduzir CTM com vetores lentivirais 1054-CIGWS contendo um dos

2 fatores de transcrição (Nanog, Oct3/4, Sox 2, β-catenina, Kfl4, c-myc, Esrrb, Tcl 1e Tbx 3) juntamente com o gene GFP para que as células transduzidas possam ser selecionadas por citometria de fluxo (GFP positivas); b) Inicialmente, as transduções de CTM serão realizadas com um fator de transcrição de cada vez e posteriormente um conjunto de quatro vetores serão utilizados para transdução; c) avaliar as alterações causadas no perfil de expressão gênica; d) avaliar mudanças na morfologia das células transformadas; e) determinar se as células modificadas apresentam marcadores típicos de células-tronco embrionárias (como por exemplo: fosfatase alcalina e/ou antígenos SSEA-1) e por fim avaliar se estas células modificadas adquirem a capacidade de se diferenciar em tecidos dos três folhetos germinativos. Uma grande limitação dos estudos pré-clínicos com CTEs é a falta de modelos animais de grande porte onde se possa realizar esses testes, uma vez que uma série de dificuldades técnicas e biológicas dificultam e/ou impedem o estabelecimento de CTEs a partir de embriões desses modelos. Com isto em mente, o grupo coordenado pela Dra. Lygia da Veiga Pereira da USP de São Paulo através do sub-projeto 6, intitulado Estabelecimento de linhagens de células tronco pluripotentes induzidas (ips) de modelos animais de grande porte, pretende desenvolver uma metodologia para estabelecer linhagens de ips de modelos animais de grande porte, especificamente de primatas não-humanos e cães. As células geradas serão utilizadas em ensaios pré-clínicos de lesão de medula espinhal nos respectivos modelos animais. Para este fim: vetores lentivirais da empresa AddGene (EUA) serão empacotados em células 293 por co-transfecção transiente com vetores de empacotamento; culturas de fibroblastos caninos e de macacos serão transduzidos com lentivírus expressando o gene repórter GFP para avaliação de eficiência de transdução com diferentes sistemas de empacotamento; transdução dos fibroblastos animais com vetores de indução de acordo com as condições estabelecidas acima, e isolamento de ips em meio de cultura específico para CTE (caso não consigamos estabelecer as ips usando vetores com genes humanos de indução, serão isolados os homólogos de cada espécie por RT-PCR de embriões pré-implantação, e novos vetores espécie-específicos serão construídos e utilizados para indução); caracterização da pluripotência das ips por imunofluorescência, diferenciação in vitro em corpos embrióides e in vivo por ensaio de formação de teratomas; diferenciação neural das ips animais por cultura

3 em meio com acido retinóico; transplante das células diferenciadas em modelos de lesão de medula. Apesar de ainda inadequadas para uso clínico, as ips são uma ferramenta importante de pesquisa básica, principalmente aquelas células derivadas de indivíduos com diferentes doenças genéticas. Assim, o grupo coordenado pela Dra. Lygia da Veiga Pereira através do sub-projeto 7, intitulado Estabelecimento de linhagens de células tronco pluripotentes induzidas (ips) a partir de fibroblastos de pacientes com doenças genéticas mendelianas e multifatoriais (com componente genético), pretende implantar a metodologia de geração de ips humanas de forma a poder estabelecer ips a partir de diferentes tecidos de pacientes com doenças genéticas de interesse do grupo, particularmente pacientes com displasia óssea, diabetes tipo I, esclerose múltipla e leucemia promielocitica aguda. As ips estabelecidas servirão como modelo experimental para o estudo dos mecanismos básicos por trás das respectivas doenças. Além disso, serão construídos novos vetores baseados em adenovirus, que não se integram ao genoma, de forma a gerarmos ips não modificadas geneticamente, mais adequadas para o uso clínico. Com esta finalidade, as seguintes abordagens experimentais serão utilizadas: vetores lentivirais da empresa AddGene (EUA) serão empacotados em células 293 por co-transfecção transiente com vetores de empacotamento; células mesenquimais de medula óssea de pacientes com diabetes tipo 1 e de leucemia PMA congeladas serão expandidas em cultura para transdução com vetores virais; padronização de estabelecimento de linhagem de células adequadas para indução a partir de sangue periférico humano; transdução das células humanas com vetores lentivirais e seleção de células ips em meio de cultura de CTEhs; caracterização das ips por imunofluorescência e FACS com marcadores de células pluripotentes (OCT4, NANOG, SSEA-1,2,3,4); diferenciação em corpos embrióides e caracterização por imunofluorescência; formação de teratomas em camundongos SCID; caracterização da pluripotência das ips por imunofluorescência, diferenciação in vitro em corpos embrioides e in vivo por ensaio de formação de teratomas. Apesar das técnicas de indiferenciação induzida pela incorporação de fatores de transcrição no genoma de células somáticas (Takahashi e Yamanaka, 2006) constituírem possíveis aliados à terapia celular autóloga, é importante ressaltar

4 neste contexto que a aplicação prática de células induzidas à diferenciação pela modificação genética ainda precisa ser melhor estudada e avaliada (Liu, 2008). Por outro lado, a técnica de transferência de núcleo (TN) é bem estabelecida e já se mostrou capaz de produzir animais saudáveis a termo, confirmando a capacidade eficiente de reprogramação de uma célula diferenciada (Wilmut, Schnieke et al., 1997; Keefer, Keyston et al., 2002). Adicionalmente, quando utilizado como receptor, o citoplasto bovino já se mostrou capaz de reprogramar células diferenciadas de diversas espécies (Chen, Wen et al., 2002; Illmensee, Levanduski et al., 2006), suportando o desenvolvimento embrionário inicial necessário para o isolamento de células-tronco embrionárias. Aliada à reprogramação eficiente do citoplasto, a abundância e facilidade de obtenção de material biológico torna o modelo bovino adequado para o estabelecimento de metodologias eficientes de obtenção de células pluripotentes de origem embrionária pela reprogramação de células somáticas diferenciadas de diversas espécies (Cibelli, Stice et al., 1998). Com isto em vista, o grupo coordenado pelo Dr. Flavio Vieira Meirelles da USP de Pirassununga através do sub-projeto 8, intitulado Células pluripotentes autólogas geradas a partir de células somáticas diferenciadas, terá como objetivo geral, caracterizar metodologias de obtenção de células pluri/totipotentes a partir de células somáticas em termos de morfologia, expressão gênica e estudos epigenéticos. Além de determinar uma metodologia mais adequada no modelo bovino comparando os grupos com o controle e aplicá-la no sistema interespecífico. Para esta finalidade, inicialmente será estabelecida uma linhagem celular somática bovina derivada do cultivo in vitro de fibroblastos adultos. Uma parte destas células será utilizada na transdução lentiviral de fatores de transcrição responsáveis pela indiferenciação celular (Takahashi e Yamanaka, 2006). Tais células serão caracterizadas no modelo bovino e, juntamente com as células não modificadas, serão utilizadas como doadoras de núcleo no processo de transferência nuclear. Células embrionárias derivadas destes processos serão comparadas entre si e com aquelas somáticas indiferenciadas em termos de morfologia, expressão gênica e epigenética. Serão também comparadas com as células embrionárias obtidas através de processos naturais de fertilização. A metodologia que prover características mais parecidas com aquelas do grupo controle será julgada a mais adequada para a produção de células-tronco a partir

5 de células somáticas diferenciadas e, portanto, será utilizada no modelo interespecífico, onde serão produzidas células pluripotentes de primatas. A reprogramação do núcleo de células somáticas pelo citoplasma de um oócito implica na combinação entre o genoma nuclear de um indivíduo e o mitocondrial de outro. Considerando o grande potencial deste tipo de abordagem no desenvolvimento futuro da terapia celular, o controle da herança mitocondrial é de suma importância para viabilizar i) a produção de células-tronco humanas por reprogramação da célula doadora de núcleo em citoplasma não humano e, ii) a produção de células-tronco humanas autólogas (Illmensee, Levanduski et al., 2006). Neste sentido, o modelo bovino é interessante pela abundância de material disponível e pelo grande conhecimento disponível sobre os mecanismos que regulam a herança do DNA mitocondrial (mtdna) durante a embriogênese. Em embriões bovinos produzidos por transferência de núcleo de células somáticas, a porcentagem de mtdna da célula doadora de núcleo aumenta entre o terceiro e o quarto ciclo celular em relação ao mtdna proveniente do oócito (Ferreira, Meirelles et al., 2007). Por outro lado, a centrifugação de zigotos bovinos possibilita a depleção mecânica de parte das mitocôndrias sem comprometer o desenvolvimento embrionário, pois o embrião é capaz de repor o mesmo conteúdo de mtdna observado em blastocistos não depletados (Chiaratti et al., 2008). Além disso, com a depleção mitocondrial é possível introduzir uma maior quantidade de mitocôndrias exógenas nos zigotos (Ferreira et al., submetido). Frente ao exposto, o grupo coordenado pelo Dr. Flavio Vieira Meirelles da USP de Pirassununga através do sub-projeto 9, intitulado Modelo animal para estudo da herança mitocondrial intra e inter-espécie, terá como objetivo geral, avaliar a viabilidade da produção de embriões contendo mtdna de origem somática intra e inter-específico e aumentar a porcentagem herdada deste mtdna pelos blastocistos. Mais especificamente, pretende-se produzir blastocistos bovinos (Bos taurus) que contenham mtdna de origem somática intra (B. indicus) ou interespecífica (Homo sapiens) em heteroplasmia com mtdna de origem embrionária (herdado do oócito) e; adicionalmente, desenvolver um método para aumentar a porcentagem herdada nos blastocistos de mtdna somático (B. indicus ou H. sapiens). Para isso, as seguintes abordagens tecnológicas serão empregadas: Estabelecimento de linhagens mesenquimais de células oriundas de B. indicus e H.

6 sapiens; enucleação de células mesenquimais por centrifugação e fusão dos citoplastos para utilização como doadores de citoplasma (Shay, Gershenbaum et al., 1975; Marchington, Barlow et al., 1999); produção in vitro de zigotos bovinos (B. taurus) partenogenéticos a partir de oócitos aspirados de ovários coletados em abatedouro e maturados in vitro (Meo, Yamazaki et al., 2007); centrifugação dos zigotos para concentrar as mitocôndrias num dos pólos do embrião e remoção de parte das mitocôndrias por micromanipulação (Ferreira et al., submetido); fusão dos citoplastos (B. indicus ou H. sapiens) aos zigotos depletados (B. taurus) e cultivo in vitro (Inoue, Nakada et al., 2000); determinação da porcentagem de mtdna (mtdna somático em relação à quantidade total de mtdna) mediante PCR em Tempo Real imediatamente à fusão, às 72 horas (embriões com cinco ou mais células) e às 168 horas (blastocistos) após a ativação partenogenética (Ferreira et al. submetido)(ferreira, Meirelles et al., 2007). A porcentagem de mtdna será analisada considerando como efeito o citoplasto usado (B. indicus e H. sapiens), o momento da análise (0, 72 e 168 horas) e a interação ambos os fatores.