Índice. 1 Introdução 1. 2 Aspectos Gerais da Doença da Murchidão dos Pinheiros 5

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1 i Índice Índice i Agradecimentos v Resumo ix Abstract xi 1 Introdução 1 2 Aspectos Gerais da Doença da Murchidão dos Pinheiros O Nemátodo da Madeira do Pinheiro O Hospedeiro O Insecto Vector Interacção Nemátodo Hospedeiro Insecto Vector A Relação Forética Nemátodo Insecto Vector A Patogenicidade do Nemátodo da Madeira do Pinheiro Dinâmica da Doença da Murchidão dos Pinheiros Meios de Luta contra a Doença da Murchidão dos Pinheiros 24 3 Materiais e Métodos Interacção Nemátodo Hospedeiro Distribuição do Nemátodo da Madeira do Pinheiro Distribuição no Povoamento Distribuição no Hospedeiro Métodos para Avaliação Precoce da Doença Indução do Fluxo de Resina Medição da Resistência Eléctrica do Lenho Medição do Fluxo de Seiva Interacção Insecto Vector Hospedeiro Insectos Subcorticais e Xilófagos Associados ao Hospedeiro Na Parte Aérea Nas Raízes 39

2 ii Distribuição do Insecto Vector no Hospedeiro Comportamento Dispersivo de Monochamus galloprovincialis Estudo sobre a Dispersão de Monochamus galloprovincialis Estimativas Populacionais de Monochamus galloprovincialis em Tróia Modelo Processual para Descrição da Doença da Murchidão dos Pinheiros Avaliação e Desenvolvimento de Meios de Luta Ao Nível do Hospedeiro (case study Erradicação em Tróia) Ao Nível do Insecto Vector (Armadilhas e Atraentes) 55 4 Resultados e Discussões Interacção Nemátodo Hospedeiro Distribuição do Nemátodo da Madeira do Pinheiro Distribuição no Povoamento Distribuição no Hospedeiro Métodos para Avaliação Precoce da Doença Indução do Fluxo de Resina Medição da Resistência Eléctrica do Lenho Medição do Fluxo de Seiva Discussão Interacção Insecto Vector Hospedeiro Insectos Subcorticais e Xilófagos Associados ao Hospedeiro Na Parte Aérea Nas Raízes Distribuição do Insecto Vector no Hospedeiro Comportamento Dispersivo de Monochamus galloprovincialis Estudo sobre a Dispersão de Monochamus galloprovincialis _ Estimativas Populacionais de Monochamus galloprovincialis em Tróia Modelo Processual para Descrição da Doença da Murchidão dos Pinheiros Discussão 120

3 iii 4.3 Avaliação e Desenvolvimento de Meios de Luta Ao Nível do Hospedeiro (case study Erradicação em Tróia) Ao Nível do Insecto Vector (Armadilhas e Atraentes) Discussão Considerações Finais Referências Bibliográficas 177

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5 v Agradecimentos Doutor Edmundo Manuel Rodrigues de Sousa (Instituto Nacional de Recursos Biológicos, ex-estação Florestal Nacional do INIAP), pela orientação na elaboração desta tese, desde a planificação dos estudos incluídos até à escrita e, muito mais importante, pela amizade. Não sendo original, tem efectivamente sido o meu mentor profissional nos últimos doze anos. Professor Doutor Pedro Duarte Rodrigues, por ter aceite ser meu orientador, novamente, vinte anos depois do trabalho de fim de curso. Doutor Makihiko Ikegami, do Forest Research de Inglaterra, pela imprescindível colaboração na programação do modelo preditivo. I ll be forever grateful to you, my best Japanese friend. A todos os investigadores e técnicos no antigo Departamento de Protecção Florestal da ex-estação Florestal Nacional (INRB, I.P.) que, ao longo dos últimos doze anos, contribuíram de algum modo para a realização e conclusão do trabalho apresentado nesta tese, com especial ênfase para o Doutor Pedro Naves, parceiro de gabinete e nesta aventura ao mundo do nemátodo da madeira do pinheiro, que iniciámos juntos em A toda a equipa de nematologistas da ex-estação Agronómica Nacional (INRB, I.P.) que, sob a coordenação da Engª Maria Antónia Lampreia, receberam e analisaram com rigor e prontidão as centenas de amostras de madeira recolhidas ao longo dos ensaios para despiste da presença do nemátodo. Engª Célia Ferreira (Sonae Turismo) e Sr. José Luís (Companhia das Lezírias), como representantes das respectivas direcções por autorizarem a realização dos estudos, nomeadamente o estabelecimento das parcelas de acompanhamento e, pessoalmente, pela constante disponibilidade de apoio e meios logísticos durante a realização dos frequentes trabalhos de campo. Doutora Teresa Soares David, da ex-estação Florestal Nacional (INRB, I.P.) pelo apoio na instalação das sondas para o registo do fluxo de seiva e muito interessantes discussões na interpretação dos resultados.

6 vi Engº José Manuel Rodrigues da Autoridade Florestal (PROLUNP), pela disponibilidade em fornecer informação, documentação e acesso a madeira indispensável para a realização de alguns dos ensaios incluídos nesta tese! Também da Autoridade Florestal, o Eng. Luís Caparica, pelo apoio no campo, sempre solícito e bem disposto. Doutor Katsunori Nakamura (Forest Products Research Institute, Japão), pelo amável e rápido envio de armadilhas e conjuntos de atraentes químicos utilizados no Japão e interessantes discussões, quer por mensagens electrónicas quer pessoalmente aquando de encontros internacionais. A todos os outros que, em algum momento, colaboraram na realização de algum dos ensaios apresentados, como o Engº Fernando Praias e o Engº Paulo Cipriano Costa. Doutora Teresa Rebelo e Doutora Carla Rego, a amizade e constante encorajamento. Por fim, agradeço à minha família: pais, sogros e cunhados pelo apoio, a todos os níveis, e incentivo no longo processo que foi a realização desta tese e, muito especialmente, à minha esposa, Mestre Mónica Ribeiro, pela ajuda durante o trabalho de campo, a revisão deste manuscrito com constante questionar, pela dedicação e enorme paciência em aturar e as minhas certezas absolutas, enfim, por tudo. Os trabalhos apresentados nesta tese foram parcialmente financiados pelo projecto europeu: QLK5 CT PHRAME Development of improved pest risk analysis techniques for quarantine pests, using pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, in Portugal as a model system, entre 2003 e 2006, e pela bolsa de doutoramento usufruída.

7 vii À Mónica, Henrique e Guilherme, a parte mais importante na minha vida!

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9 ix Resumo A introdução acidental em Portugal, em 1999, do nemátodo Bursaphelenchus xylophilus (NMP), agente causal da doença da murchidão dos pinheiros, provocou a morte de inúmeros pinheiros bravos. A presente tese pretende ser um contributo para: a compreensão da interacção entre o nemátodo, a árvore hospedeira e Monochamus galloprovincialis, o insecto vector em Portugal; elaboração de um modelo preditivo da evolução da doença; desenvolvimento e avaliação de meios de luta. A mortalidade dos pinheiros infectados por NMP apresentou uma distribuição espacial agrupada (cluster), tendo maior incidência nos pinheiros com diâmetro à altura do peito superior a 15cm (94%). O primeiro efeito da infecção foi a cessação da produção de resina (em 93% das situações monitorizadas), surgindo os sintomas visuais (amarelecimento da copa) cerca de 45 dias mais tarde, detectando-se o nemátodo no tronco à altura do peito passado mais um mês. A maioria dos pinheiros mortos, infectados por NMP, encontrava-se colonizada por M. galloprovincialis (89%), exclusivamente ao nível da copa (ramos e tronco com diâmetros entre 15 e 5cm e casca mais fina - 2 a 0,5cm). O comportamento dispersivo de M. galloprovincialis envolve uma fase migratória (taxa de recaptura inferior a 1%) e uma fase dispersiva (taxa de recaptura superior a 80%) com uma distância média de 4,72m e máxima de 14m. O modelo processual simulou com rigor os pinheiros visitados pelo vector e infectados por NMP na parcela de Tróia, para 2001 (p<0,0001 em ambas as variáveis) e 2002 (p=0,0012 e p=0,004), perdendo acuidade para 2003 (não significativo) e 2004 (p=0,0982 e p=0,0859), quando diminuiu o número de pinheiros infectados. A eliminação dos pinheiros mortos antes do período de voo do insecto vector (erradicação), permitiu ao fim de três anos, a redução da mortalidade anual em cerca de 85% e a diminuição da incidência do NMP (de 80% para 14,9%). Complementarmente, desenvolveu-se uma armadilha de paíneis cruzados transparentes e determinou-se a melhor combinação de atraentes (aguarrás, etanol e metilbutenol) na captura de M. galloprovincialis. Os resultados mostram que é possível reduzir o impacto da doença da murchidão dos pinheiros para níveis de mortalidade registados, devido a outros factores bióticos, nos povoamentos de pinheiro bravo. Palavras-chave: Longicórnio do pinheiro, Pinus pinaster, nemátodo da madeira do pinheiro, relação forética, meios de luta.

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11 xi Abstract In 1999 was detected in Portugal the nematode Bursaphelenchus xylophilus (PWN), causal agent of the pine wilt disease, killing thousands of maritime pines. The objectives of this thesis are: understanding the phoretic interaction established between the host tree, the nematode and the sole vector insect in Portugal, Monochamus galloprovincialis; development of a predictive model for the disease spreading; improvement of control measures. The PWN infected trees showed a clustered spatial distribution with higher incidence on thicker pine trees (over 15cm DBH) (94%). The first effect of the infection was the lack of oleoresin flow (93% of monitored situations); followed by visual symptoms after 45 days (yellow needles) and the nematode presence in the trunk at breast height only occurred one more month later. Most of dead pine trees infected by PWN were colonized by M. galloprovincialis (89%), exclusively at canopy level (branches and trunk with diameter between 15 and 5cm and thinner bark 2 to 0,5cm). The pine sawyer dispersal behavior showed a migratory stage (recapture rate less than 1%) and a short range dispersal stage (recapture rate over 80%) with 4,72m average flight distance and maximum of 14m. The process based model simulated accurately the pines visited by the pine sawyer and PWN infections for Tróia plot, in 2001 (p<0,0001 for both variables) and 2002 (p=0,0012 and p=0,004), losing statistical strength for 2003 (not significative) and 2004 (p=0,0982 and p=0,0859), as the number of infected trees decreased. The removal of dead pines before insect vector flight period (eradication) allowed after 3 years the annual pine mortality reduction in about 85% and PWN contaminations decreased from 80% to 14,9%. A transparent cross-vane trap was build and the best chemical lure (turpentine, ethanol and methylbutenol) for M. galloprovincialis capture. Overall results show that is possible to reduce pine wilt disease impact on pine stands to the same mortality levels due to the others biotic agents Key-words: Pine sawyer, Pinus pinaster, pine wood nematode, phoretic interaction, control measures.