ATIVIDADE FUNGICIDA DE COMPOSTOS INÉDITOS DE TRIAZÓIS OBTIDOS A PARTIR DE GLICEROL SOBRE Alternaria solani

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1 ATIVIDADE FUNGICIDA DE COMPOSTOS INÉDITOS DE TRIAZÓIS OBTIDOS A PARTIR DE GLICEROL SOBRE Alternaria solani Wendielle Barbosa de Sousa, Rodolfo Ferreira de Mendonça, Tatiane Paulino da Cruz, Vagner Tebaldi de Queiroz, Adilson Vidal Costa, Willian Bucker Moraes Universidade Federal do Espírito Santo/Departamento de Produção Vegetal, Alto Universitário, s/nº, Guararema - CEP Alegre-ES, Brasil, wendibs@hotmail.com, rodolfofmendonca@gmail.com, agronomapaulino@hotmail.com, vagnertq@gmail.com, avcosta@hotmail.com, willian.moraes@ufes.br Resumo - O objetivo desse trabalho foi avaliar a eficiência de novas moléculas fungicidas do grupo dos triazóis obtidas a partir de glicerol no manejo in vitro de Alternaria solani. O experimento foi montado a partir dos resultados dos primeiros ensaios onde foram testados triazóis (T1 a T8) e selecionados T1, T2 e T3 como os mais eficientes na diminuição ou inibição do crescimento micelial de Alternaria solani, para posteriormente conduzir o experimento montado em esquema fatorial 3x2+3 (3 moléculas inéditas de triazóis em duas concentrações (75 e 150 ppm) e três testemunhas adicionais (DMSO e fungicida (Cerconil) em duas concentrações). Onde o triazol 3 na concentração de 150 ppm apresentou o melhor resultado na diminuição do crescimento micelial de A. solani em comparação aos demais triazóis utilizados e o fungicida se apresentou eficiente na inibição do crescimento micelial do fungo em ambas concentrações. Palavras-chave: pinta-preta, controle químico, Lycopersicum esculentum. Área do Conhecimento: Agronomia Introdução Do grupo das hortaliças, o tomate (Lycopersicum esculentum Mill) é a espécie mais importante, tanto sob o ponto de vista econômico quanto social, no Brasil, pelo volume da produção e geração de empregos. É também uma espécie cosmopolita, pois é cultivada no mundo todo. O Brasil possui uma área de mil ha plantados e produção de toneladas, sendo que, o Espírito Santo foi responsável por 3,8% desta produção (IBGE, 2017). O fruto do tomateiro é rico em vitaminas B e C, rico em ferro, fósforo e licopeno, responsável pela coloração do fruto (ROSA et al., 2011). Segundo Lemos e colaboradores (2007) esta hortaliça fornece um produto muito perecível, com curto tempo de prateleira e também está sujeito a diversas doenças, que consequentemente limitam sua produção. Das diversas doenças fúngicas que acometem a cultura do tomateiro, a pinta-preta (Alternaria solani) que afeta toda a parte aérea da planta em qualquer idade se destaca com alto potencial de dano econômico sobre a lavoura. É amplamente detectada em todas as regiões produtoras de tomate no Brasil, e observada em todas as áreas que o tomate é cultivado (KUROZAWA; PAVAN, 2005). Para se obter sucesso na prevenção e no tratamento de doenças deve-se sempre considerar a eficiência dos métodos e o custo dos tratamentos, sendo óbvio que os métodos empregados devem apresentar justificativa econômica para sua utilização. Para a cultura do tomate, sujeita à ocorrência de problemas fitossanitários, o uso excessivo de fungicidas na cultura têm aumentando o custo da produção e danos ao meio ambiente (VALE et al., 2000). Devido à grande agressividade do patógeno, o uso de fungicidas é um método mais eficiente quando as condições climáticas são favoráveis. Entre os fungicidas mais utilizados para o controle de doenças de plantas existem os fungicidas orgânicos do grupo químico dos triazóis, podendo ser adquiridos a partir do glicerol, que é um subproduto na síntese do biodiesel, considerado um sério problema ambiental quando utilizado de maneira incorreta e em larga escala. Esse grupo possui uma ação antifúngica satisfatória no controle de várias doenças. Desta forma, O objetivo foi obter um destino adequado para o glicerol, visando avaliar o efeito de novos compostos fungicidas à base de 1,2,3-triazol sintetizados a partir do glicerol com o propósito de manejar a Alternaria solani. 1

2 Metodologia Os compostos contendo o anel 1,2,3-triazol foram produzidos pelo grupo de pesquisa GEAPS (Grupo de Estudos Aplicados em Produtos Naturais e Síntese Orgânica) da UFES e os ensaios de inibição in vitro de Alternaria solani foram conduzidos nos Laboratório de Epidemiologia e Manejo de Doenças de Plantas (LEMP) e do Núcleo de Desenvolvimento Científico e Tecnológico em Manejo Fitossanitário de Pragas e Doenças (NUDEMAFI) do Centro de Ciências Agrárias e Engenharias da Universidade Federal do Espírito Santo (CCAE-UFES), situado na cidade de Alegre (20 45' S, 41 29' W), localizada ao sul do Estado do Espírito Santo. A obtenção do isolado deu-se a partir de tecidos lesionados de tomateiro apresentando sintomas típicos de pinta-preta, adquiridos no campo, coletado em dois momentos distintos, onde a primeira coleta foi feita em setembro de 2015 e outra em março de 2016, a partir do qual foram retirados pequenos fragmentos dos tecidos sintomáticos e, após assepsia dos mesmos, procedeu-se, em câmara de fluxo laminar, a sua deposição em meio de cultura BDA sintético (batata-dextrose-ágar), contido em placas de Petri de 9 cm de diâmetro. As placas foram mantidas em câmara de crescimento de demanda bioquímica de oxigênio (BOD) em temperatura de 25 ± 1 C, com fotoperíodo de 12h. Após 48 horas, o isolamento foi efetuado com a retirada de discos de micélios das extremidades das colônias fúngicas crescidas dos fragmentos vegetais. Para isto, foi utilizada alça de platina, transferindo-se os discos para outras placas de Petri, contendo o meio BDA. As placas contendo o fungo foram posteriormente mantidas em estufas BOD, com temperatura de 25 C ± 1 C, sob fotoperíodo 12h claro/12h escuro. Tal procedimento permite manter os isolados para posterior uso em pesquisa especifica. Para se verificar o efeito dos triazóis sobre o crescimento micelial, foi montado um esquema fatorial 8 x (oito triazóis denominados T1, T2, T3, T4, T5, T6, T7 e T8, cinco alíquotas de cada triazol e duas testemunhas adicionais), sendo cada triazol adicionado ao meio de cultura batata-dextrose-ágar (BDA) na concentrações de 5, 10, 15, 20, 25μL e sobre o meio foi disposto um disco de micélio de 0,5 cm contendo o fungo. Como testemunhas foram usados o fungicida Isatalonil e o DMSO, sendo dispostos sobre as placas de Petri de 9 cm de diâmetro com meio de cultura BDA com um disco de micélio contendo o fungo a ser avaliado com 7 dias de incubação. Os resultados obtidos nesse teste não foram satisfatórios, pois não foram eficientes na inibição ou diminuição do crescimento micelial de A. solani, surgindo à necessidade de realizar um novo teste para avaliar as concentrações. A partir dos resultados obtidos em ensaio feito com os triazóis T1 a T8 para testar a eficiência dos triazóis na diminuição ou inibição do crescimento micelial, onde os cada triazol foi incorporado ao meio de cultura BDA e adicionado um disco de micélio contendo o fungo, fechadas com papel aderente, identificadas e incubadas em estufa tipo BOD sob fotoperíodo de 12h à temperatura de 25 C para verificação do crescimento de A. solani, foram selecionados os triazóis denominados de triazol 1 (T1), triazol 2 (T2) e triazol 3 (T3) como mais eficientes no controle de Alternaria solani e foram selecionados para serem avaliados nas concentrações de 75 e 150ppm, que foram diluídas em meio BDA padrão para compor cada tratamento. As placas de Petri que foram utilizadas para contenção do meio tiveram o padrão de 9 cm de diâmetro. Após a importação do meio BDA especifico para as placas, foi inserido um disco de 0,5 cm de diâmetro do meio de cultura contendo micélio do patógeno a ser avaliado com 10 dias de incubação. As placas foram seladas com papel aderente, identificadas e incubadas em estufa tipo BOD sob fotoperíodo de 24h de escuro à temperatura de 25 C. A avaliação do experimento teve início 72h após sua instalação, realizando-se medições ortogonais do diâmetro das colônias diariamente, sendo cada medição a média de duas medidas diametralmente opostas da colônia fúngica, tendo como referência as placas testemunhas (sem adição de triazol no meio de cultura) (BALBIPEÑA et al., 2006). O crescimento foi avaliado até a testemunha preencher todo o diâmetro da placa. Para estudar o efeito de cada concentração do triazol sobre os isolados de Alternaria solani, o experimento foi montado em delineamento inteiramente ao acaso em esquema fatorial 3 x 5 + 3, três triazóis, cinco alíquotas de cada triazol e três testemunhas adicionais para cada isolado, onde cada triazol foi testado nas concentrações de 75 e 150ppm e como testemunhas foram utilizados DMSO onde não houve a adição de triazol no meio de cultura e o fungicida Cerconil na concentração de 300ppm, onde 60μL do ingrediente ativo do produto comercial foi adicionado a 100 ml do meio de cultura e na recomendação de uso, onde 300μL do produto comercial foi adicionado a 100 ml do meio 2

3 de cultura. Em todos os experimentos foram utilizadas 5 repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e o efeito das diferentes alíquotas no índice de crescimento micelial foi analisado através do teste tukey com o software SISVAR (FERREIRA, 2008). Resultados Na obtenção dos primeiros resultados a partir do teste com os triazóis 1 ao 8 nas concentrações de 5, 10, 15, 20, 25μL não foram obtidos resultados aceitáveis pois não foi observada coibição do crescimento micelial do fungo, a partir desse teste foram determinadas novas concentrações de teste. Com relação ao estudo da interação patógeno-triazol em diferentes épocas do ano que a doença ocorre, não foi possível realizar devido as condições adversas do ambiente que ficou desfavorável ao desenvolvimento da doença na região. Na tabela 1 encontra-se os resultados encontrados no teste com os triazóis que tiveram melhor desempenho (T1, T2 e T3), pode-se verificar que o triazol 1 e 2, independente da concentração estudada, não diferiu estatisticamente da testemunha com o DMSO, bem como do triazol 3 na menor concentração. Dentre os novos compostos triazólicos testados o que apresentou maior nível de inibição foi observado no triazol 3, na concentração de 150ppm, apresentando também maior eficiência relativa quando comparado com os demais triazóis testados (Tabela 2), porém quando comparado com a menor concentração testada não difere estatisticamente, já o fungicida comercial em ambas as concentrações se mostrou altamente eficiente inibindo em 100% o crescimento micelial do fungo durante o período avaliado. Tabela 1. Médias de crescimento micelial e porcentagem de inibição aos 10 dias após a repicagem.de A. solani, em diferentes tratamentos. Tratamentos Crescimento Micelial (cm) Testemunha 4,38a T1 75ppm 3,89ab T1 150ppm 3,77ab T2 75ppm 3,61ab T2 150ppm 4ab T3 75ppm 3,58ab T3 150ppm 3,03b Fungicida 60μL 0c Fungicida 300μL 0c CV(%): 16,15 Médias seguidas pela mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Os triazóis são moléculas que ao entrar em contato com o fungo promove danos diretos na membrana, além também de ocasionar alterações morfológicas identificadas como inchamento de células, vacuolização excessiva, septação incompleta, surgimento de vesículas entre a membrana e a parede celular, além também de formação de inclusões membranosas, esses fatores promovem o colapso das células e ocasiona a morte do patógeno (KATO, 1986). 3

4 Tabela 2. Eficiência relativa de diferentes tratamentos para controle in vitro de A. solani. Tratamentos Eficiência relativa (%) T1 75ppm T1 150ppm T2 75ppm T2 150ppm T3 75ppm T3 150ppm Fungicida 60μL Fungicida 300μL 11,19 13,93 17,58 8,67 18,26 30, Discussão Os resultados encontrados demostram que ocorreu sensibilidade do fungo a essas novas moléculas de triazóis, porém quando se analisa a eficiência relativas das novas moléculas (Tabela 2) observa-se que ocorreu uma baixa eficiência. O triazol 2 na concentração de 150 ppm foi o que apresentou a menor eficiência com 8,67%, já o triazol 3, apesar de ter uma baixa eficiência, foi superior ao anterior com 30,82%. Os dados deste trabalho diferem dos encontrados na literatura. De acordo com Töfoli et al. (2003), os fungicidas triazolicos comerciais: tebuconazole e difenoconazole, quando foram testados in vitro para o controle de A. solani demonstraram eficiência superior a 80%, usando a concentração de 1μg/mL e quando aumentou a concentração para 100 μg/ml houve inibição de 100% do crescimento micelial. Pesquisa desenvolvida por FANCELLI (1991), também encontrou resultados onde os triazóis foram eficientes no controle de A. solani de tomate e batata usando os fungicidas tebuconazole e difenoconazole. Conclusão Os resultados encontrados com neste trabalho demonstram que as novas moléculas possuem baixa eficiência na inibição do desenvolvimento de A. solani. O triazol 3 foi o que apresentou melhor resultado e os triazóis 1 e 2 apresentaram piores resultados de eficiência relativa na inibição do crescimento micelial do patógeno. Referências BALBI-PEÑA, M.I.; BECKER, A.; STANGARLIN, J.R.; FRANZENER, G; LOPES, M.C.; SCHWAN- ESTRADA, K.R.F. Controle de Alternaria solani em tomateiro por extratos de Curcuma longa e curcumina I. Avaliação in vitro. Fitopatologia Brasileira, n.31, p , FANCELLI, M.I. Comparação patogênica, cultural, serológica e eletroforética entre isolados de Alternaria solani do tomate e da batata e variabilidade patogênica de Alternaria solani f. sp. lycopersici N. F. Piracicaba: p. [Tese (Doutorado) - Universidade São Paulo]. FERREIRA, D.F. SISVAR: Um programa para analises e ensino de estatística. Revista Symposium, Lavras, v.6, p.36-41, INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA. Levantamento Sistemático da Produção Agrícola. Disponível em: <ftp://ftp.ibge.gov.br/producao_agricola/levantamento_sistematico_da_producao_agricola_[mensal]/ Fasciculo/lspa_ pdf >. Acesso: 07 agosto

5 KUROZAWA, C.; PAVAN, M.A. Doenças do tomateiro. In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; REZENDE, J.A.M.; BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L.E.A. Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. São Paulo: Agronômica Ceres, v.2, p LEMOS, O.L.; REBOUÇAS, T.H.; SÃO JOSÉ, A.R.; VILA, M.T.R.; SILVA, K.S. Utilização de biofilmes comestível na conservação de pimentão Magali R em duas condições de armazenamento. Bragantia, Campinas, v.66, n.4, p , ROSA, C.L.S.; SOARES, A.G.; FREITAS, D.G.C.; ROCHA, M.C.; FERREIRA, J.C.S.; GODOY, R.L.O. Caracterização físico-química, nutricional e instrumental de quatro acessos de tomate italiano (Lycopersicum esculentum Mill) do tipo Heirloom produzido sob manejo orgânico para elaboração de polpa concentrada. Alimentos e Nutrição, Araraquara, v.22, n.4, p , TÖFOLI, J.G.; DOMINGUES, R.J.; KUROZAWA, C. Ação in vitro de fungicidas no crescimento micelial e germinação de conídios de alternaria solani, agente causal da pinta preta do tomateiro. Arq. Inst. Biol., São Paulo, v.70, n.3, p , jul./set., VALE, F.X.R.; ZAMBOLIM, L.; PAUL, P.A.; COSTA, H. Doenças causadas por fungos em tomate. In: ZAMBOLIM, L.; VALE, F.X.R.; COSTA, H. (Eds.). Controle de doenças de plantas hortaliças. Viçosa: UFV, p