DESCRIÇÃO MORFOLÓGICA DO COMPLEXO FOLICULAR EM Cichla kelberi (PERCIFORMES, CICHLIDAE). OLIVEIRA, P. V. 1* ; SIQUEIRA-SILVA, D. H. 1,2 ; NINHAUS-SILVEIRA, A. 1 ; VERÍSSIMO-SILVEIRA, R. 1 prila_pac@hotmail.com *Graduanda em Ciências Biológicas, UNESP, Ilha Solteira, SP; 1 LINEO Laboratório de Ictiologia Neotropical, Departamento de Biologia e Zootecnia, UNESP, Ilha Solteira, SP; 2 Doutorando do Programa de Pós-Graduação em Biologia Animal, UNESP, São José do Rio Preto, SP. Introdução Pertencente a Ordem Perciformes, a família Cichlidae é considera a mais numerosa dentre os peixes não-ostariophysi, com estimativa de 571 espécies de água doce ocorrendo no Brasil, com destaque para o gênero Cichla, popularmente conhecidos como tucunarés (KULLANDER, 1998). Em quase todos os Osteichthyes, o epitélio germinativo em ambos os sexos, é composto por células somáticas e células germinativas, é ativo por toda a vida do animal e está relacionado com a reprodução variável das fêmeas (PARENTI & GRIER, 2004). Uma das células germinativas presente no epitélio é a oogônia, que por sua vez, são células iniciais para formação do folículo, entram em meiose originando os oócitos formando o complexo folicular (MAZZONI; GRIER; QUAGIO-GRASSIOTTO, 2010). Deste modo, este estudo teve por objetivo, descrever as mudanças ocorridas no complexo folicular ao longo da oogênese em Cichla kelberi, pois o conhecimento das etapas do desenvolvimento oocitário é uma ferramenta importante para os estudos da biologia reprodutiva da espécie. Material e Métodos Fêmeas de C. kelberi foram capturadas no Reservatório de Jupiá no ano de 2011, os animais foram anestesiados com uma solução de benzocaína obtida a partir da diluição de 0,5 g de benzocaína em 5mL de álcool absoluto e 5L de água. As gônadas foram expostas, removidas e seccionadas transversalmente na região mediana. Os fragmentos foram fixados em solução de paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% em tampão fosfato Sorensen, 0,1M
a ph 7,2, por pelo menos 24 horas, sendo posteriormente processados para a microscopia de luz com historesina Technovit 7100. Após emblocados, os ovários foram submetidos a cortes de 3 e 4 μm em um micrótomo Leica RM 2245. Os cortes foram corados em Hematoxina/Eosina (H.E.) e PAS + Metanil Yellow e fotografados em Zeiss AXIOCAM-MRc5 com aumento de 500 vezes para padronizar a medição, no laboratório de Ictiologia Neotropical (L.I.NEO) em Ilha Solteira. Resultados Ao término da foliculogênese, as células pré-foliculares que antes circundavam o cisto ovariano, avançarem para o interior do mesmo, tornando-se células foliculares, separando deste modo os oócitos um dos outros. As células foliculares secretam uma membrana basal, que juntos formam o folículo. Após a foliculogênese, o oócito em diplóteno inicial entra em crescimento primário. No estágio de crescimento primário ou também conhecido como oócito perinuclear, células oriundas de fibroblastos do estroma lamelar, as células da teca, englobam o folículo, formando o complexo folicular (Fig. 1A). Sendo assim, o complexo folicular é formado pelo oócito incluindo a zona radiata e mais três camadas celulares (de fora para dentro), o envelope folicular: as células da teca, membrana basal e a camada de células foliculares. Nos ovários analisados de Cichla kelberi, os complexos foliculares apresentaram modificações principalmente nas células foliculares, nas camadas da teca e no diâmetro do oócito ao longo da oogênese. As células foliculares do oócito em crescimento primário são pavimentosas e seus núcleos se apresentam alongados, as células da teca também são alongadas e é difícil a visualização da camada da teca externa. A zona radiata ainda é fina. Os diâmetros desses oócitos variam, partindo de 100 á 200 µm. No fim do crescimento primário, há a formação de alvéolos corticais que fazem com que o diâmetro do oócito aumente. Logo no início da vitelogênese, ou crescimento secundário, já é possível distinguir as camadas interna e externa da teca, a zona radiata já é mais espessa e mais corada, e as células foliculares já possuem núcleos arredondados e mais próximos um dos outros, tornando-se cubóides. Só com esse início de captação de vitelo, há um aumento significativo do diâmetro do oócito, variando de 346,85 µm a 526,49 µm (Figs 1 H-I). Nesta fase há uma aparente transição das células foliculares, elas apresentam-se de forma desorganizada, isto é, não são cubóides e ainda não são colunares (Fig. 1E).
A vitelogênese vai progredindo, a incorporação de vitelo vai aumentando e este preenche cada vez mais o oócito. Com isso o envelope folicular vai alterando sua conformação. Associados a teca interna estão vasos sanguíneos, que nutrem as camadas celulares do complexo folicular, e de acordo com o desenvolvimento do complexo, o calibre desses vasos aumentam. As células foliculares mostram-se mais desenvolvidas tornando-se colunares (Fig. C) com núcleo posicionando-se na porção superior da célula. Conforme a maturação do oócito vai progredindo, a zona radiata vai tornando-se espessa e mais consistente, e neste estágio de vitelogênese é possível observar estrias, com um diâmetro de 3,65 µm e 4,4 µm. As camadas da teca interna e externa estão bem desenvolvidas e evidentes. Em relação ao diâmetro de um complexo folicular no qual o oócito está em vitelogênese este é muito maior do que os oócitos nos estágios anteriores, atingindo valores de 1172,94 µm, 1333,49 µm e 1409,7 µm. É considerado um complexo folicular maduro quando há a migração do núcleo para a região do pólo animal no oócito e o aparecimento da micrópila. A micrópila é uma descontinuidade é ocupada por células micropilares, que próximo do momento da ovulação torna-se uma abertura que permitirá a entrada e fertilização pelo espermatozoide (Fig. 1D). Em um oócito maduro a zona radiata mede cerca de 12,19 µm (Fig. 1D), o oócito atinge 1815,10 µm de diâmetro e as camadas celulares do complexo folicular atingem seu maior tamanho e desenvolvimento, cerca de 36,8 µm. Discussão e Conclusões A formação do complexo folicular ocorre no mesmo estágio e com as mesmas camadas de células em C. kelberi que descrito por Grier (2000), de modo que após a saída do oócito com a zona radiata, as camadas da teca, membrana basal e células foliculares permanecem no estroma do ovário. Esses componentes do complexo folicular sofrem mudanças ao longo da oogênese bem como descrito por GUIMARÃES & QUAGIO- GRASSIOTTO (2001); QUAGIO-GRASSIOTTO & GUIMARÃES (2003); LUBZENS, GRAHAM- YOUNG, BOBE & CERDÀ (2009). Wallace & Selman (1981) afirmam que em oócitos de crescimento primário, as organelas celulares tornam-se maiores e mais numerosas e que além disso, uma grande quantidade de RNA e proteínas se acumulam no citoplasma proporcionando o crescimento do oócito o que explica o aumento de 100 µm do oócito no início para o fim do crescimento primário.
Fig. 1: Ovário de Cichla kelberi: A: Oócito em crescimento primário, mostrando as células foliculares pavimentosas e a teca interna. B: Oócitos em crescimento secundário, mostrando a diferença nas células foliculares cubóides e colunares. C: Oócito em crescimento secundário, em detalhe o aparecimento da teca externa e as células foliculares cubóides. D: Complexo folicular com oócito maduro, o deslocamento do núcleo e surgimento da micrópila. E: Diferença das Células foliculares pavimentosas (oócito em crescimento primário) e cubóides (oócito em crescimento secundário). F-G: oócitos em crescimento secundário, evidenciando a mudança das células foliculares de cubóides para colunares. H-I: Oócitos em crescimento secundário com medições, com aumento de 500 vezes para padronização das medidas. A-G: PAS+Metanil Yellow+Hematoxilina. D, H, I: HE. Legenda: Grânulo de vitelo (GV); Zona radiata (ZR); Células foliculares (CF); Vaso sanguíneo (VS); Oócito em crescimento primário (OCP); Oócito em crescimento secundário (OCS); Micópila: M; Seta: Teca interna; *: Teca externa Agradecimentos Agradecemos à FAPESP pelo apoio financeiro (Processo 2012/00484-5). Referências GUIMARÃES, A. C. D., QUAGIO-GRASSIOTO, I. Ultrastructural aspects of oogenesis
and oocyte primary growth in Serrasalmus spilopleura (Teleostei, Characiformes, Characidae). Tissue&Cell. 2001. GRIER, H. J. Ovarian germinal epithelium and folliculogenesis in the common snook Centropomus undecimalis (Teleostei: Centropomidae). Journal of Morphology, New York, v. 243, p. 265 281, 2000. KULLANDER S. O.; FERREIRA, E. J. G. A review of the South American Cichlid Genus Cichla, With Descriptions of nine New Species (Teleostei: Cichlidae). Freshwaters, München, v. 17, n. 4, p. 289-398. 2006 LUBZENS, Esther et al. Oogenesis in teleosts: How fish eggs are formed.general And Comparative Endocrinology, Espanha, v. 2010, n. 165, p.367-389, 2009. MAZZONI, T. S.; GRIER, H. J.; QUAGIO-GRASSIOTTO, I. Germline cysts and the formation of the germinal epithelium during the famale gonadal morphogenesis in Cyprinus capio (Teleostei: Ostariophysi: Cypriniformes). Wiley Interscience 2010 QUAGIO-GRASSIOTO, I., GUIMARÃES A. C. D. Follicular epithelium, theca and egg envelope formation in Serrasalmus spilopleura (Teleostei, Characiformes, Characidae). Acta zoológica. The royal Swedich Academy of Sciences. 2003. SELMAN, K; WALLACE, R. A.;. Cellular and dynamic daspects of oocyte growth in teleosts. American zoologist, Thousand Oaks, v. 21, n. 2, p. 325-343, 1981.