UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS Programa de Pós-Graduação em Veterinária Tese Avaliação da transmissão da imunidade passiva e efeitos fisiopatológicos frente a infecção experimental primária e desafio de cordeiros com Haemonchus placei e H. contortus Regina Celis Pereira Reiniger Pelotas, 2012

0 REGINA CELIS PEREIRA REINIGER Avaliação da transmissão da imunidade passiva e efeitos fisiopatológicos frente a infecção experimental primária e desafio de cordeiros com Haemonchus placei e H. contortus Tese apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Medicina Veterinária da Universidade Federal de Pelotas, como requisito parcial à obtenção do título de Doutor em Ciências (área de concentração: Sanidade Animal). Orientadora: Profª Drª Maria Elisabeth Aires Berne Co-Orientadora: Drª Magda Vieira Benavides Pelotas, 2012

1 Dados de catalogação na fonte: (Marlene Cravo Castillo CRB-10/744) R364a Reiniger, Regina Celis Pereira Avaliação da transmissão da imunidade passiva e efeitos fisiopatológicos frente a infecção experimental primária e desafio de cordeiros com Haemonchus placei e H. contortus / Regina Celis Pereira Reiniger; orientador Maria Elisabeth Aires Berne; co-orientador Magda Vieira Benavides.- Pelotas, 2012.-72f. : il. - Tese (Doutorado). Área de Concentração Sanidade Animal-Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Faculdade de Veterinária. Universidade Federal de Pelotas. Pelotas, 2012. 1.Haemonchus 4.Imunidade II.Título. 2.Alterações hematológicas 3.Ovinos I.Berne, Maria Elisabeth Aires(orientador) CDD 636.3 82 4

2 Banca examinadora: Profª Drª Maria Elisabeth Aires Berne (UFPEL) Profª Drª Eliza Simone Viegas Sallis (UFPEL) Prof. Dr. Leandro Quintana Nizoli (UFPEL) Dr. Tiago Gallina Corrêa (EMATER)

3 Dedico este trabalho a meu marido, Cezar Augusto, a meus filhos Ana Paula e Rodrigo e minha mãe Gleci, como forma de agradecimento pelo amor, incentivo e compreensão nesta caminhada.

4 Agradecimentos À Universidade Federal de Pelotas e à Embrapa Pecuária Sul pela oportunidade oferecida para realização deste curso de Pós-Graduação. À Universidade da Região da Campanha que através da administração atual facilitou a realização deste curso, em especial ao Diretor do Centro de Ciências Rurais Prof. MSc Derli João Siqueira da Silva e a Coordenadora do curso de Medicina Veterinária Profª MSc Cléia Maria Gisler Siqueira. À Profª Drª Maria Elisabeth Aires Berne e a Drª Magda Vieira Benavides, pela amizade, dedicação, incentivo, exemplo de profissionalismo e orientação para realização deste curso, já que o mesmo sempre foi um grande objetivo a ser alcançado. A todos os professores do curso de Pós-graduação em Veterinária pela seriedade e aos ensinamentos transmitidos. À equipe do Laboratório da Embrapa Pecuária Sul, Rossana Leitzke Granada e Bernardo Macke Franck e a todos os bolsistas, pelo auxilio e o conhecimento a mim disponibilizados. À equipe do Laboratório de Helmintologia do Instituto de Biologia da UFPel, em especial a grande amiga, colega e parceira Luciana Laitano Dias de Castro. A minha família por entender o pouco tempo que dediquei a eles neste período, e aos amigos Ana Luiza Cabral Risch, Carmen Saionara do Couto e Fernando Castilhos Karan que muito me ajudaram, incentivaram e que tornaram essa jornada menos exaustiva. A todos colegas do Centro de Ciências Rurais (URCAMP), as monitoras, Mirella do Couto Soares, Ana Paula Rocha, Bruna Costa e Mayara Pereira e aos meus alunos em geral, muito obrigada!

5 Resumo REINIGER, Regina Celis Pereira. Avaliação da transmissão da imunidade passiva e efeitos fisiopatológicos frente a infecção experimental primária e desafio de cordeiros com Haemonchus placei e H. contortus. 2012. 71f. Tese (Doutorado) Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Brasil. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da transmissão da imunidade passiva e efeitos fisiopatológicos frente à infecção experimental primária e desafio de cordeiros com Haemonchus placei ou H. contortus. Na primeira fase experimental avaliou-se a transmissão da imunidade passiva em cordeiros, mantidos livres de infecções por nematódeos gastrintestinais. Posteriormente cordeiros com seis meses de idade, divididos em três grupos: infectados com H. contortus (Hc), com H. placei (Hp) e não infectados (C). E para o desafio os cordeiros foram divididos quatro grupos: Hc-Hc, Hc-Hp, Hp-Hc e C-C. As análises sorológicas evidenciaram a transferência de anticorpos IgG anti-h. contortus, porém com um declínio gradual ao longo do tempo tanto nas fêmeas como cordeiros. Durante a primo-infecção a média de OPG do grupo Hc foi duas vezes superior ao grupo Hp (p<0,0001). O grupo Hc apresentou as menores médias de volume globular, em relação aos demais grupos (p<0,0001). Os animais primo infectados, tanto com H. placei como H. contortus, não desenvolveram resistência quando desafiados, tanto com a mesma espécie ou cruzada de Haemonchus. A infecção experimental em única dose de 5000 L3 não foi suficiente para provocar sinais clínicos, elevar e manter os níveis de IgG anti-h. contortus nos animais infectados. Há transmissão passiva de IgG anti-h. contortus para os cordeiros através do colostro, entretanto estes iniciam uma queda gradativa já a partir do 30º dia pós nascimento. Palavras-chave: Haemonchus. Alterações hematológicas. Ovinos. Imunidade.

6 Abstract REINIGER, Regina Celis Pereira. Avaliação da transmissão da imunidade passiva e efeitos fisiopatológicos frente a infecção experimental primária e desafio de cordeiros com Haemonchus placei e H. contortus. 2012. 71f. Tese (Doutorado) Programa de Pós-Graduação em Veterinária. Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, Brasil. The aim of this study was to evaluate the effect of the transfer of passive immunity and pathophysiological effects against experimental Haemonchus placei or H. contortus primary infection and challenge. The first experiment evaluated the transmission of passive immunity in parasite-free lambs. At 6-month old, lambs were divided in three groups: infected with H. contortus (Hc), with H. placei (Hp) and uninfected (C for control), and challenged at 9-month old when lambs were again divided in four groups: Hc-Hc, Hc-Hp, Hp-Hc and C-C. Serological analyses showed the transfer of anti-h. contortus IgG, but with a gradual decline over time in both females and lambs. During primary infection, faecal egg count (FEC) average was twice for the Hc group compared to Hp (p <0.0001). The Hc group presented the lowest packed cell volume compared to the other groups (p <0.0001). Primo-infected sheep with either H. placei or H. contortus did not develop resistance when challenged with same species- or across-species parasite. Single 5,000 L3 dose experimental infection was not sufficient to cause clinical signs, nor to rise and maintain anti-h. contortus IgG levels in the infected animals. There is passive transfer of anti-h. contortus IgG for lambs through the colostrum, however the IgG levels begin a gradual decrease from day 30 after birth. Keywords: Haemonchus. Haematologic alterations. Sheep. Immunity.

7 LISTA DE FIGURAS ARTIGO 2 Figura 1 Figura 2 ARTIGO 3 Efeitos fisiopatológicos da primo-infecção experimental em cordeiros com Haemonchus placei ou H. contortus Médias de ovos por grama de fezes (OPG) eliminados por cordeiros infectados experimentalmente com 5000 L 3 de Haemonchus contortus (Hc) e H. placei (Hp) durante 60 dias pós infecção (dpi)... 36 Médias de eosinófilos sanguíneos em cordeiros infectados com H. contortus e H. placei durante a primo-infecção... 39 Avaliação da resposta de cordeiros ao parasitismo por Haemonchus contortus ou H. placei após primo-infecção com H. placei ou H. contortus Figura 1 Médias de eosinófilos mm³/sangue durante desafio experimental de cordeiros infectados com H. contortus e H. placei e grupo não infectado... 55

8 LISTA DE TABELAS ARTIGO 1 Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 ARTIGO 2 Tabela 1 Tabela 2 Tabela 3 ARTIGO 3 Tabela 1 Transmissão da imunidade passiva de IgG anti-haemonchus contortus a cordeiros durante a fase de lactação Médias e desvio padrão da contagem de ovos por grama de fezes (OPG) das matrizes nos primeiros 60 dias após o parto... 23 Médias e desvio parão de IgG anti - H. contortus pela técnica de ELISA das matrizes e das suas progênies durante o período experimental... 23 Coeficiente de correlação entre as variáveis IgG, ovos por grama de fezes (OPG) e peso durante o período experimental... 25 Efeitos fisiopatológicos da primo-infecção experimental em cordeiros com Haemonchus placei ou H. contortus Médias e desvio padrão da variável volume globular durante a primo-infecção nos grupos H. contortus, H. placei e controle (não infectados)... 37 Valores das médias e desvio padrão da proteína plasmática total durante a primo-infecção por H. contortus, H. placei e grupo controle... 38 Médias de absorbância e desvio padrão dos soros de cordeiros primo-infectados com H. contortus, H. placei e não infectados, durante o período experimental... 40 Avaliação da resposta de cordeiros ao parasitismo por Haemonchus contortus ou H. placei após primo-infecção com H. placei ou H. contortus Valores médios e desvio padrão de OPG entre os grupos desafiados com H. contortus e H. placei durante período experimental... 54

9 Tabela 2 Tabela 3 Tabela 4 Tabela 5 Médias dos grupos para contagem de ovos por grama de fezes (OPG), carga parasitária, fecundidade das fêmeas, comprimento das fêmeas, volume globular e contagem total de leucócitos em cordeiros desafiados experimentalmente com H. contortus e H. placei... 54 Correlações de Pearson (r) entre os leucócitos totais e diferenciais (neutrófilos, eosinófilos, monócitos e linfócitos), OPG, VG e os dias experimentais entre os grupos Hc-Hc, Hc- Hp, Hp-Hc e o grupo controle... 56 Coeficiente de correlação (r) entre OPG aos 60 dias do experimento com a carga parasitária, fecundidade das fêmeas e níveis de IgG anti- H. contortus em cordeiros, nos grupos Hc-Hc, Hc-Hp e Hp-Hc... 57 Médias de absorbância e desvio padrão dos soros de cordeiros desafiados com H. contortus e H. placei e não infectados (CTL) durante o período experimental... 58

10 SUMÁRIO 1.Introdução. 11 2. Objetivos. 14 2.1 Objetivos específicos.. 14 3. Artigos...... 16 3.1 Transmissão da imunidade passiva de IgG anti-haemonchus contortus a cordeiros durante a fase de lactação... 16 3.2 Efeitos fisiopatológicos da primo-infecção experimental em cordeiros com Haemonchus placei ou H. contortus... 28 3.3 Avaliação da resposta de cordeiros ao parasitismo por H. contortus ou H. placei após primo-infecção com H. placei ou H. contortus... 45 4. Conclusão Geral... 67 5. Referências...... 68 Anexo... 70

11 1 INTRODUÇÃO No Rio Grande do Sul a ovinocultura é uma das atividades mais antigas, principalmente na região do Pampa. A atividade era voltada principalmente a produção lã, porém com a introdução de materiais sintéticos, no qual a indústria têxtil internacional oferecia matéria-prima mais barata e de fácil adaptação às exigências do mercado, acarretou a um declínio da ovinocultura. Na década de 1990 ocorreu uma queda do rebanho da região sul devido a crise internacional da lã e pelo aumento da área cultivada com grãos (VIANA, 2008). Atualmente o rebanho ovino brasileiro é estimado em 17.380.581, constituído de dois grandes polos de criação onde a região sul está em segundo lugar, ficando atrás apenas do nordeste. Embora 56,71% do total dessa espécie sejam encontrados no nordeste, o principal estado produtor é o Rio Grande do Sul, sendo os municípios de Santana do Livramento e Alegrete os maiores produtores nacionais (IBGE-2010). Ainda que o rebanho brasileiro tenha diminuído em 20% nas últimas décadas (1990 a 2007), a produção de carne ovina manteve-se em torno de 78 mil toneladas. O mercado atual é bastante favorável, pois o número de importações de carne ovina vem aumentando, passando de US$ 6 milhões para mais de US$ 23 milhões, pois as regiões tradicionais de criação são insuficientes para suprir o mercado interno brasileiro, sendo o Uruguai o principal país exportador de carne ovina para o Brasil. Vale resaltar que o consumo brasileiro está entre 0,6-0,7 Kg per capita ano, considerado muito baixo em relação a outros tipos de carne (FAO, 2007). Estima-se um crescimento anual de 2,1% na produção de carne ovina durante o período de 2005 a 2014, principalmente em países em desenvolvimento. A ovinocultura brasileira encontra-se em expansão, entretanto o consumo da carne ovina é o principal desafio a ser vencido (VIANA, 2008). Portanto, para a obtenção de animais saudáveis para a comercialização, a sanidade do rebanho está intimamente ligada ao combate eficiente dos parasitas.

12 As endoparasitoses gastrintestinais constituem o principal entrave da ovinocultura, em todo o mundo, especialmente, nas regiões tropicais, aonde os prejuízos econômicos são mais acentuados (VIEIRA, 2008). Entre os nematódeos gastrintestinais de ovinos destaca-se o Haemonchus contortus devido a sua prevalência e patogenicidade (AMARANTE et al., 2004), desencadeando o comprometimento da produção ovina em decorrência da perda de apetite, anemia e em casos severos, morte do animal (ATHANASIADOU; KYRIAZAKIS, 2004). A faixa etária mais sensível as parasitoses são os animais jovens (COLDITZ ET al., 1996; SCHALLING, 2000). Haemonchus é um parasito do abomaso dos ruminantes e por ser hematófago, pode levar a anemia e hipoproteinemia. No Brasil estão presentes as espécies H. contortus, H. similis e H. placei (AMARANTE et al., 2007), sendo o H. contortus o principal parasito de ovinos e caprinos e o H. placei dos bovinos (GONZALES; SANTIAGO, 1969). Estima-se que a grande maioria (95%) dos nematódeos gastrintestinais encontre-se na fase de vida livre nas pastagens e, somente 5% (estágios de vida parasitária) infectando os hospedeiros. Além disso, estes nematódeos gastrintestinais mostram elevado potencial biótico, no qual o H. contortus tem uma capacidade de oviposição de 5.000 ovos dia e uma longa permanência no hospedeiro, com relatos de permanência de fêmeas adultas por até 19 meses (DUNN, 1978). Portanto, além do H. contortus apresentar um alto grau de patogenicidade, sua frequência e resistência aos cinco grupos de modernos anti-helmínticos têm gerado muitos estudos para encontrar formas alternativas e integradas para seu controle (VALVERDE, 2001). Para o controle dessa parasitose, é indispensável a utilização de antihelmínticos, principalmente nas regiões tropicais úmidas, o que leva a maioria dos criadores a aplicarem diversos princípios ativos e em média nove dosificações por ano (ECHEVARRIA et al., 1996), acarretando, inevitavelmente, a diminuição na eficácia do produto (BORGES, 2003). Uma das alternativas usadas para diminuir a utilização desses fármacos e minimizar as perdas geradas pela verminose é o pastoreio misto entre bovinos adultos e ovinos (COLES, 2005). O pastoreio misto ou alternado com bovinos ou equinos é recomendado em programas de controle integrado de helmintos de pequenos ruminantes (ZAJAC, 2006).

13 Embora o H. contortus tenha uma maior especificidade por ovinos e o H. placei por bovinos, quando essas espécies são criadas juntas, poderá ocorrer infecções mistas, ou seja, ovinos podem ser parasitados por H. placei, mas o contrário é de ocorrência mais rara (LE JAMBRE, 1979; 1983). Amarante et al. (1997) observaram infecções cruzadas envolvendo as espécies H. placei e H. contortus em ovinos e bovinos que compartilharam pastagens, porém essas infecções foram leves e naturalmente eliminadas. Em geral, as espécies de pequenos ruminantes não infectam com sucesso equinos ou bovinos e as larvas são mortas quando ingeridas por essas espécies hospedeiras. Porém, há exceções a essa generalização, terneiros podem ser suscetíveis a infecções H. contortus e não devem ser expostos a pastagens contaminadas com este parasito (ZAJAC, 2006). Greer (2008) relata que a busca de controles sustentáveis para helmintoses gastrintestinais em pastagens, deve ser resultante de estratégias que auxiliem os ovinos a montar uma resposta imune eficiente. A principal razão para esse direcionamento de pesquisas é o decréscimo da eficácia das terapias antihelmínticas e as preocupações dos consumidores e ambientalistas quanto ao uso excessivo de produtos químicos (LACROUX et al., 2006; ROWE et al., 2008; BASETTO et al., 2011). O controle do tamanho de uma população de uma espécie de parasito pode regular de forma cruzada outro tipo de população de uma espécie diferente, ou seja, o desenvolvimento da imunidade protetora contra uma espécie pode proteger contra outro tipo de parasitismo (ADAMS et al., 1989). Basseto et al. (2011) usaram uma vacina constituída de proteínas da membrana do intestino de H. contortus para testar sua eficácia frente a dois grupos de terneiros desafiados após a imunização, com H. contortus e H. placei respectivamente. A imunização conferiu proteção em ambos os grupos. A busca de novas estratégias de controle dos nematódeos gastrintestinais, em especial H.contortus se faz necessário, visto ao grave problema de resistência deste parasito aos fármacos disponível. Investigar meios que induzam a uma resposta imune de cordeiros como a infecção prévia com H. placei, espécie menos patogênica para ovinos, proporcionará subsídio para implementação de medidas alternativas de controle e assim contribuir para minimizar os prejuízos e contribuir para o desenvolvimento da ovinocultura.

14 2 OBJETIVOS GERAIS Verificar a transmissão da imunidade passiva e os efeitos fisiopatológicos frente a primeira infecção e desafio experimental de cordeiros suscetíveis com H. placei e H. contortus. 2.1 Objetivos específicos 2.1.1 Experimento I Avaliação parasitária e imunológica para Haemonchus contortus no período de lactação de ovinos - Verificar a transmissão de anticorpos da classe IgG anti- H. contortus. - Avaliar a correlação entre os níveis de IgG entre as ovelhas e cordeiros. 2.1.2 Experimento II Efeitos fisiopatológicos da primo-infecção experimental em cordeiros com Haemonchus placei e H. contortus tratamentos. no soro. - Avaliar a infecção dos cordeiros. - Verificar o perfil hematológico dos cordeiros. - Avaliar o desenvolvimento ponderal dos ovinos submetidos aos diferentes - Quantificar a resposta imune humoral por detecção de IgG anti- H. contortus 2.1.3 Experimento III Avaliação da resposta de ovinos ao parasitismo por H. contortus e H. placei após infecção prévia com a espécie cruzada. - Avaliar os níveis de OPG durante a fase de desafio experimental. - Avaliar o perfil hematológico dos cordeiros.

15 - Avaliar o desenvolvimento ponderal dos ovinos submetidos aos diferentes tratamentos. - Investigar a resposta imune humoral por detecção de IgG anti- H. contortus. - Avaliar a estrutura histológica da mucosa abomasal de ovinos parasitados e não parasitados. - Avaliar a carga parasitaria e fecundidade de fêmeas de Haemonchus.

16 3 ARTIGOS 3.1 Artigo 1 TRANSMISSÃO DA IMUNIDADE PASSIVA DE IgG ANTI-Haemonchus contortus A CORDEIROS DURANTE A FASE DE LACTAÇÃO ANTI-Haemonchus IgG PASSIVE TRANSMISSION FROM DAMS TO LAMBS DURING LACTATION REINIGER, Regina Celis Pereira* 1 ; DIAS DE CASTRO, Luciana Laitano 2 ; AGUIAR, Cintia Lidiane Guidotti 2 ; BENAVIDES, Magda Vieira 3 ; BERNE, Maria Elisabeth Aires 4 1 Doutoranda Programa de Pós-Graduação em Veterinária, FV-UFPel, docente URCAMP-Bagé; 2 Programa de Pós-Graduação em Veterinária, FV-UFPel;3 Dr.ª Pesquisadora EMBRAPA LabEx EUA; 4 Prof.ª Dr.ª Instituto de Biologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, UFPel, *reginareiniger@hotmail.com

17 Resumo O objetivo deste trabalho foi verificar a transferência de IgG anti-haemonchus contortus, via leite, para cordeiros durante o período de lactação. Foram utilizados 41 ovelhas e 44 cordeiros, mantidos estabulados, livres de infecção, desde os nascimentos. As coletas de fezes para contagem de ovos por grama de fezes (OPG), e sangue, tanto das mães como de suas crias foram realizadas nos dias 15, 30, 45, 60 dias pósparto e aos 180 dias somente dos cordeiros. Os soros obtidos foram avaliados através da técnica de ELISA indireta para detecção de anticorpos anti-h. contortus. Os cordeiros permanecerem livres de infecção durante todo o período experimental. Os resultados das análises sorológicas, durante a lactação, mostraram que os níveis de IgG, tanto materno, como dos cordeiros, foram mais elevados aos 15º dia, decrescendo aos 60 dias pós parto. Os níveis de IgG dos cordeiros foram superiores em relação as ovelhas nas coletas do 15º, 30º e 45º dia pós parto (p<0,0001; p<0,0001; p=0,0011 respectivamente). Na coleta do 60º dia pós parto os níveis maternos foram superiores aos dos cordeiros (p=0,0015). Como esperado, houve transferência de IgG anti-h. contortus para os cordeiros através do colostro, com níveis séricos superiores de suas mães. Palavras-chave: Nematódeos gastrintestinais. Imunidade passiva. Ovinos. Haemonchus.

18 Abstract Transmission of anti-haemonchus contortus IgG passive immunity from dams to lambs via colostrum and milk during lactation was monitored in 44 lambs, left indoors from day 1 after lambing. Dams and offspring were maintained indoors throughout the experiment. Lambs were kept parasite-free until weaning. Faecal samples from the 41 dams were taken at days 1, 15, 30, 45 and 60 after lambing, when sera sample were also taken to detect anti-haemonchus contortus IgG by indirect ELISA. Anti- Haemonchus contortus IgG levels in dams and lambs were higher at 15 days after lambing, reaching their lowest levels at day 60 after lambing. Lamb anti-h. contortus IgG levels were higher than their dams at 15, 30, and 45 days after lambing (p<0.0001; p<0.0001; p=0.0011 respectively). Only at day 60 dam IgG levels were higher than those recorded in lambs (p=0.0015). Anti-H. contortus IgG were transferred to lambs with levels higher than those observed in their dams. Keywords: Gastrointestinal nematodes. Passive immunity. Sheep. Haemonchus..

19 INTRODUÇÃO A ovinocultura é uma das atividades mais antigas da produção pecuária mundial e há bastante tempo praticado no Rio Grande do Sul, principalmente na região do pampa. Atualmente vem demonstrando um aumento no interesse pela exploração dessa espécie, através do uso de novas tecnologias com melhorias na produção, principalmente em países desenvolvidos (VIEIRA, 2003). Para a obtenção de animais saudáveis para a comercialização, a sanidade do rebanho está intimamente ligada ao combate eficiente dos parasitos. Entre os nematódeos gastrintestinais de ovinos destaca-se o Haemonchus contortus devido a sua prevalência e patogenicidade (AMARANTE et al., 2004), desencadeando o comprometimento da produção em decorrência da perda de apetite, anemia e em casos severos, morte do animal (ATHANASIADOU & KYRIAZAKIS, 2004). No período do periparto, as ovelhas se tornam mais susceptíveis às infecções por nematódeos gastrintestinais, o que provoca aumento no número de ovos eliminados nas fezes, e, consequentemente, aumento da contaminação da pastagem e de suas crias, denominado de fenômeno do periparto (AMARANTE et al., 1992). Segundo Barger (1993) o fenômeno spring rise ou quebra da imunidade no periparto, ocasiona um aumento do número de ovos de nematódeos por grama de fezes no final do parto e início da lactação. A maior suscetibilidade, tanto da fêmea como do cordeiro, se deve a baixa capacidade de reação imunológica às infecções por helmintos (BUENO et al., 2002; ROCHA; AMARANTE; BRICARELLO, 2004). A progesterona e prolactina presentes nesta fase reprodutiva contribuem para o aumento no número de H. contortus nas ovelhas, o que poderá determinar em diminuição de leite e comprometer o desenvolvimento de suas crias (FLEMING; CONRAD, 1989), sendo os cordeiros desmamados muito suscetíveis as helmintoses (COLDITZ ET al., 1996). Outra hipótese para o aumento de ovos por grama de fezes (OPG) neste período baseiase não apenas ao aumento na fecundidade dos nematódeos adultos, mas também a retomada de desenvolvimento de larvas hipobióticas e ao estabelecimento de novas larvas infectantes (BARGER, 1993).

20 Os cordeiros apresentam uma grande suscetibilidade à helmintoses até a puberdade (SCHALLING, 2000), e o grau de infecções variam de acordo com o manejo e a intensidade de contaminação das pastagens. Em algumas criações são observadas elevadas contagens de OPG em cordeiros mesmo antes do desmame (ROCHA; AMARANTE; BRICARELLO, 2005; AMARANTE, 2008). Os neonatos são hipogamaglobulinêmicos, devido ao tipo de placenta sindesmocorial que impede a passagem de anticorpos da mãe para o feto (TIZARD, 2008). Portanto a transferência principalmente de imunoglobulinas da classe G, presentes no colostro materno garante a proteção adequada, quando atravessam a barreira epitelial do intestino delgado e são absorvidas, durante as primeiras semanas de vida (JEFFCOTT, 1972). Turquino; Flaiban; Lisbôa (2011) relatam que trabalhos referentes a transferência da imunidade passiva em ovinos ainda é reduzido, embora exista um grande número de informações sobre o assunto em bovinos. O objetivo deste trabalho foi avaliar os níveis de IgG específica para H. contortus em fêmeas ovinas durante a lactação e verificar a transmissão passiva em suas respectivas progênies. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido no Centro de Pesquisa de Pecuária dos Campos Sulbrasileiros (CPPSul/Embrapa) e no Laboratório de Helmintologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas RS. Obtenção das Amostras Foram mantidos confinados na Cabanha de experimentos da Embrapa CPPSul, 41 ovelhas cruza Corriedale e suas progênies. Estas matrizes, naturalmente infectadas com nematódeos gastrintestinais, foram estabuladas após 24 horas do nascimento dos animais em baias de piso ripado e longe do solo, alimentados com feno de alfafa e água a vontade. Neste momento ocorreu a primeira coleta de fezes dessas fêmeas. Todos os partos ocorreram com um intervalo de sete dias.

21 Aos 15 dias após o parto iniciaram-se as coletas de sangue para obtenção do soro das matrizes e dos cordeiros, porém a pesagem foi realizada apenas nos cordeiros, em um total de quatro coletas com intervalo de quinze dias (15, 30, 45 e 60 dias após o parto). Os cordeiros foram submetidos a quinta coleta de soro aos 180 dias pós parto. As amostras de fezes foram obtidas diretamente da ampola retal das ovelhas para a contagem de ovos por grama de fezes (OPG) segundo a técnica de Gordon e Whitlock (1939). Esta técnica também foi usada para confirmar a negatividade para nematódeos gastrintestinais dos cordeiros. Avaliação da imunidade humoral Os níveis de IgG anti-h. contortus dos cordeiros e das ovelhas foram mensurados através da técnica de ELISA indireta (Enzyme linked immunosorbent assay). A placa de 96 poços (COSTAR 3590) foi sensibilizada com o antígeno diluído 1:240 em PBST 0,1% (ph 7,2), foi utilizado 100µL/poço, o equivalente a 100ng, e incubado a 37 C por uma hora e 30 minutos. Os sítios livres para ligação de proteína foram bloqueados com PBST 0,1% em leite em pó desnatado a 5%, foi utilizado 100µL/poço e incubado a 37 C por uma hora. Os soros tanto teste como controle positivo (ovino infectado experimentalmente com H. contortus) e negativo (soro fetal de ovino) foram diluídos 1:40 em PBST 0,1% em leite em pó desnatado a 5%, incubados, 100µL/poço, a 37 C por uma hora. O conjugado peroxidase anti - IgG ovino (SIGMA) foi diluído 1:4000 em PBST 0,1%, foi utilizado 100µL/poço e incubado a 37 C por uma hora. Entre todas as fases do teste as placas foram lavadas por três vezes com PBST 0,1%. Como cromógeno foi utilizado ortofenilenodiamina (OPD), em tampão citrato-fosfato (ph 4,0), acrescida do substrato peróxido de hidrogênio, foi utilizado 100µL/poço e o tempo para reagir foi de 15 minutos em temperatura ambiente, protegida da luz. Em seguida a reação foi interrompida com 50µL/poço com ácido sulfúrico 2,5N. A leitura das absorbâncias foi determinada em leitor de ELISA (Thermo plate) com comprimento de onda de 492nm. Todas as avalições foram realizadas em duplicata.

22 Análise estatística A análise estatística das variáveis foi realizada através do software Statistix 9.0, por da Análise de Variância (ANOVA) e para comparação das médias o Teste de Tukey. Também foram realizadas correlações a partir da utilização do Coeficiente de Pearson. Os dados obtidos foram submetidos à análise da normalidade através do teste de Shapiro-Wilk. A variável OPG não demonstrou normalidade, sendo a mesma transformada em Log (x+1). RESULTADOS E DISCUSSÃO Através dos resultados das coletas de fezes realizadas quinzenalmente, verificou-se que os cordeiros permaneceram livres de infecção durante todo o período experimental. As médias observadas do OPG das matrizes, demonstraramse elevadas durante os 45 dias pós parto (Tabela 1), sem diferença estatística entre as quatro primeiras coletas. Esses resultados vêm de encontro a quebra da imunidade no periparto, no qual proporciona um aumento do OPG entre o final da gestação, lactação e diminui após o desmame (BARGER, 1993). Conforme citações de Gennari et al. (2002) em experimento com vacas foi observado que a eliminação de ovos de nematódeos é mais evidente da segunda semana pré-parto a segunda semana pós-parto. Com base no que foi observado neste trabalho, o 30º dia pós parto foi o que demonstrou maiores médias de OPG. Rocha; Amarante; Bricarello (2004) demonstraram altas médias de OPG em ovelhas Santa Inês durante o primeiro mês de lactação, seguido pela diminuição gradativa até o final do desmame. Após a quarta coleta, as ovelhas foram tratadas com moxidectina 0,2% via oral, justificando a redução das médias e a diferença estatística significativa em relação às coletas anteriores. O uso de anti-helmínticos demonstrou uma redução de OPG, porém apenas 34,2% das fêmeas apresentaram-se negativas, e 65,8% continuaram positivas (100 1400, valor mínimo e máximo de OPG). Esses resultados demonstram resistência a grupos químicos modernos como lactonas macrocíclicas, o que já foi evidenciado no Brasil por Thomaz-Soccol et al. (2004).

23 Tabela 1- Médias e desvio padrão da contagem de ovos por grama de fezes (OPG) das matrizes nos primeiros 60 dias após o parto. Coletas (dias após parto) Médias Desvio Padrão 0 1556 a ±1645 15 1443,9 a ±1829,2 30 1834,1 a ±2356,3 45 1417,6 a ±1471,8 60 336,6 b ±356,2 Letras diferentes indicam diferença estatistica significativa, entre as coletas, pelo teste Tukey (p<0,05). As médias se referem a valores de OPG não transformados, no entanto as análises foram realizadas após transformação logarítmica. Os resultados obtidos nas análises sorológicas (Tabela 2), pela técnica de ELISA, durante a lactação demonstrou que os níveis de IgG, tanto materno como dos cordeiros, no 15º dia após o parto foram os mais elevados em relação aos demais dias, e os valores mínimos ocorreram aos 60 dias após o parto. Esses valores demonstram a transferência dos anticorpos maternos para suas crias, pois vale ressaltar que os cordeiros durante o período experimental não foram submetidos a qualquer tipo de estimulação antigênica (vacinação), metodologia também utilizada por Costa et al. (2008). Tabela 2 - Médias e desvio parão de IgG anti - H. contortus pela técnica de ELISA das matrizes e das suas progênies durante o período experimental. Coletas (dias após parto) IgG Materno IgG Cordeiro 0 0,6957 a (±0,1675) - 15 0,6186 a (±0,189) 0,8498 a (±0,2595) 30 0,3025 b (±0,0805) 0,424 b (±0,1124) 45 0,29 b (±0,0856) 0,2368 c (±0,0913) 60 0,2257 c (±0,0834) 0,1616 cd (±0,0702) 180-0,113 d (±0,0836) Letras diferentes indicam diferença estatistica significativa, entre as coletas, pelo teste Tukey (p<0,05). Quanto a análise entre os dias, as médias dos cordeiros apresentaram diferença estatística entre as coletas. A análise aos 60 dias pós parto foi semelhante a coleta do dia 45 e 180, porém observou-se uma redução gradativa dos níveis de

24 IgG durante o período experimental (p<0,0001). Em relação as matrizes não houve diferença entre o dia 0 e 15º, porém diferiu entre 30º, 45º e 60º dia após o parto (p<0,0001). A diminuição gradativa dos níveis de IgG com o decorrer dos dias analisados, vem de encontro aos resultados descritos por Pauletti et al. (2003) em experimento com terneiros, no qual verificaram que animais com concentrações adequadas de anticorpos, a fase de catabolismo das imunoglobulinas foram prolongadas o que ocasionou um inicio mais tardio da síntese endógena de anticorpos. Em experimento com bovino de corte, Costa et al. (2008) observaram uma redução contínua de imunoglobulinas circulantes consequente da degradação e à sua combinação com antígenos. O declínio dos níveis de IgG observado nas matrizes durante a lactação vem de encontro com as citações descritas por Houdijk et al. (2000), no qual a diminuição pode estar relacionada a imunossupressão inespecífica das fêmeas durante o período de lactação. Os níveis de IgG dos cordeiros foram superiores em relação as ovelhas nas coletas do 15º, 30º e 45º dia pós parto (p<0,0001; p<0,0001; p=0,0011 respectivamente). Na coleta do 60º dia pós parto os níveis maternos foram superiores aos cordeiros (p=0,0015). Observou-se correlação com associação forte entre o IgG do cordeiro e materno nos 15º e 30º dias após o parto. Porém nas coletas do 45º e 60º dia a associação foi moderada (Tabela 3). Os resultados do peso corporal dos cordeiros demonstraram um aumento gradativo durante o período de lactação, apresentando diferença significativa (p<0,0001) entre cada coleta. A avaliação através do coeficiente de Pearson foi de 0,9964, sendo significativo o ganho de peso em relação ao tempo de lactação (p<0,0001). Esses resultados provavelmente estão relacionados ao ambiente em que os animais se encontravam, junto a suas mães que receberam alimentação adequada durante o período avaliado.

25 Tabela 3- Coeficiente de correlação entre as variáveis IgG, ovos por grama de fezes (OPG) e peso durante o período experimental. 15 dia pós parto OPG Materno IgG do Cordeiro Peso do Cordeiro IgG Materno 0,0921 0,6747*** 0,1182 OPG Materno 0,1575-0,1282 IgG do Cordeiro - 0,0277 30 dia pós parto OPG Materno IgG do Cordeiro Peso do Cordeiro IgG Materno - 0,0728 0,6575*** 0,0874 OPG Materno - 0,0249-0,1850 IgG do Cordeiro - 0,0024 45 dia pós parto OPG Materno IgG do Cordeiro Peso do Cordeiro IgG Materno - 0,1043 0,4213** - 0,0242 OPG Materno 0,0860-0,0892 IgG do Cordeiro - 0,1237 60 dia pós parto OPG Materno IgG do Cordeiro Peso do Cordeiro IgG Materno - 0,1803 0,3477* 0,0839 OPG Materno - 0,1154-0,1155 IgG do Cordeiro - 0,0900 *** (p 0,0001) ** (p 0,001) * (p 0,05). CONCLUSÃO Os cordeiros receberam IgG anti-haemonchus contortus através do colostro, apresentando níveis séricos superiores de suas mães. Sugere-se que o OPG materno constitui uma fonte de infecção nas pastagens no período pós-parto, porém sem influenciar em seus níveis de anticorpos e também de suas progênies.

26 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMARANTE, A.F.T.; BARBOSA, M.A.; DE OLIVEIRA, M.; SIQUEIRA, E.R. Eliminação de ovos de nematódeos gastrintestinais por ovelha de quatro raças durante diferentes fases reprodutivas. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 27, n.1, p. 47-51, 1992. AMARANTE, A.F.T.; BRICARELLO, P.A.; ROCHA, R.A.; GENNARI, S.M. Resistance of Santa Ines Suffolk and Ile de France lambs to naturally acquired gastrointestinal nematode infections. Veterinary Parasitology, v. 120, p. 91-106, 2004. AMARANTE, A.F.T. Fatores que afetam a resistência dos ovinos à verminose. In: VERÍSSIMO, C.J. Alternativas de controle da verminose em pequenos ruminantes. Instituto de Zootecnia, Nova Odessa, 2008. Cap. 1, p. 15-21. ATHANASIADOU, S. & KYRIAZAKIS, I. Plant secondary metabolites: antiparasitic effects and their role in ruminant production systems. Proceedings of the Nutrition Society, v. 63, n. 4, p. 631-639, 2004. BARGER, I.A. Influence of sex and reproductive status on susceptibility of ruminants to nematode parasitism. International Journal Parasitology, v.23, n.4, p. 463-469, 1993. BUENO, M.S.; CUNHA, E. A.; VERÍSSIMO, C.J.; SANTOS, L.E.; LARA, M.A.C.; OLIVEIRA, S.M.; SPÓSITO FILHA, E.; REBOUÇAS, M.M. Infección por nematodos em razas de ovejas carnicas criadas intensivamente em la región del sudeste del Brasil. Archivos de Zootecnia, v. 51, p. 271-278, 2002. COLDITZ, I.G.; WALTSON, D.L.; GRAY, G.D.; EADY, S.J. Some relationships between age, immune responsiveness and resistance to parasites in ruminants. International Journal for Parasitology, v. 26, n. 8-9, p. 869-877, 1996. COSTA, M.C.; FLAIBAN, K.K.M.C.; CONEGLIAN, M.M.; FEITOSA, F.L.F.; BALARIN, M.R.S.; LISBÔA, J.A.N. Transferência da imunidade passiva em bezerros das raças Nelore e Limousin e proteinograma sérico nos primeiros quatro meses de visa. Revista Veterinária Brasileira, v. 28, n. 9, p. 410-416, 2008. FLEMING, M.W.; CONRAD, S.D. Effects of exogenous progesterone and/or prolactin on Haemonchus contortus infections in ovariectomized ewes. Veterinary Parasitology, v. 34, p. 57-62, 1989. GENNARI, S.M.; BLASQUES, L.S.; RODRIGUES, A.A.; CILENTO, M.C.; SOUZA, S.L.; FERREIRA, F. Determinação da contagem de ovos de nematódeos no período peri-parto em vacas. Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science, v. 39, n.1, p. 32-37, 2002. GORDON, H.M.; WHITLOCK, H.V. A new technique for counting nematode eggs in sheep faeces. Journal of the Council for Scientific and Industrial Research, Australia, vol. 12, p. 50 52, 1939.

27 HOUDIJK, J.G.M.; KYRIAZAKIS, I.; JACKSON, F.; HUNTLEY, J.F.; COOP, R.L. Can an increased intake of metabolizable protein affect the periparturient relaxation in immunity against Telardosagia circumcincta in sheep. Veterinary Parasitology, v.91, p. 43-62, 2000. JEFFCOTT, L.B. Passive immunity and its transfer with special reference to the horse. Biological Rewiews, v. 47, n. 4, p. 439-464, 1972. PAULETTI, P.; MACHADO NETO, R.; PACKER, I.U.; D ARCE, R.D.; BESSI, R. Quality of colostral passive immunity and pattern of serum protein fluctuation in newborn calves. Scientia Agricola, v. 60, n.3, p. 453-456, 2003. ROCHA, R.A.; AMARANTE, A.F.T.; BRICARELLO, P.A. Influence of reproduction status on susceptibility of Santa Inês and Ile de France ewes to nematode parasitism. Small Ruminant Research, v. 55, p. 65-75, 2004. SCHALLIG, H.D.F.H. Immunological responses of sheep to Haemonchus contortus. Parasitology, v. 120, p. S63-S72, 2000. THOMAZ-SOCCOL, V.; SOUZA, F.P.; SOTOMAIOR, C.; CASTRO, E.A.; MILCZEWSKI, V.; MOCELIN, G.; PESSOA E SILVA, M.C. Resistance of gastrointestinal nematodes to anthelmintics in sheep (Ovis aries). Brazilian Archives of Biology and Technology, v. 47, p. 41-47, 2004. TIZARD, I.R. Imunologia Veterinária - Uma Introdução. 8ª ed., Elsevier Editora, Rio de Janeiro, 2008. 587p. TURQUINO, C.F.; FLAIBAN, K.K.M.C.; LISBÔA, J.A.N. Transferência de imunidade passiva em cordeiros de corte manejados extensivamente em clima tropical. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 31, n. 3, p. 199-205, 2011. VIEIRA, L.S. Alternativas de controle da verminose gastrintestinal dos pequenos ruminantes. Sobral. EMBRAPA- CNPC, 2003. (Documentos, 29).

28 3.2 Artigo 2 EFEITOS FISIOPATOLÓGICOS DA PRIMO-INFECÇÃO EXPERIMENTAL EM CORDEIROS COM Haemonchus placei OU H. contortus PHYSIOPATOLOGICAL EFFECTS OF EXPERIMENTAL Haemonchus placei OR H. contortus PRIMO-INFECTION IN LAMBS REINIGER, R.C.P. 1 ; BENAVIDES, M.V. 2 ; BERNE, M.E.A. 3 1 Doutoranda Programa de Pós-Graduação em Veterinária, FV-UFPel, docente URCAMP-Bagé; 2 Dr.ª Pesquisadora EMBRAPA LabEx EUA; 3 Prof.ª Dr.ª Instituto de Biologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, UFPel, *reginareiniger@hotmail.com

29 Resumo A infecção por Haemonchus contortus representa um dos principais problemas na criação de ovinos em caráter mundial. O objetivo deste estudo foi monitorar a primoinfecção por H. placei em ovinos e avaliar as alterações orgânicas ocasionadas pela primo-infecção experimental por H. contortus ou H. placei nestes animais. Foram utilizados 39 cordeiros, mantidos em ambiente livre de contaminação desde seu nascimento. Aos seis meses de idade os cordeiros foram divididos em três grupos, sendo o grupo Hc constituído por 20 cordeiros que receberam 5000 larvas (L3) de H. contortus, grupo Hp 10 cordeiros infectados com 5000 L3 de H. placei e grupo controle (CTL) nove animais livres de infecção. Os animais foram monitorados durante 60 dias através do número de ovos por grama de fezes (OPG), proteínas plasmáticas totais, volume globular (Vg), contagem total de leucócitos, contagem absoluta de eosinófilos sanguíneos, níveis de IgG anti-haemonchus e peso corporal. A média de OPG do grupo Hc foi duas vezes superior à média do grupo Hp (p<0,0001). O grupo Hc apresentou as menores médias de volume globular, em relação aos demais grupos (p<0,0001). Observou-se correlação negativa com associação moderada entre OPG e VG nos grupos infectados (Hc r=-0,44 e Hp r=-0,38). Não foi observado eosinofilia, porém o grupo Hc apresentou diferença significativa (p=0,0087) com valores médios superiores ao grupo controle no 21º dia pós infecção. O mesmo grupo apresentou correlação negativa entre OPG e o número de eosinófilos (r=- 0,21). A infecção experimental tanto por H. contortus como por H. placei desencadeou uma resposta imune com níveis similares de IgG. Os resultados evidenciaram que ovinos são infectados por H. placei, entretanto o estabelecimento da infecção, traduzido pelo OPG indica menor especificidade. Uma única infecção com H. placei ou H. contortus, nas condições estudadas, não foi suficiente para ocasionar sinais clínicos e ou provocar alterações orgânicas nos cordeiros. Palavras-chave: Alterações fisiológicas. Ovinos. Haemonchus sp.

30 Abstract Haemonchus contortus infection is the main sheep related health problem worldwide. The objective of this study was to monitor sheep H. contortus infection after experimental primo-infection with H. contortus and H. placei. Thirty nine 6-month old indoor naïve lambs were grouped in the following way: 20 animals primo-infected with 5000 infective H. contortus L 3 larvae (Hc group), 10 animals primo-infected with 5000 infective H. placei L 3 larvae (Hp group), and 9 non-infected lambs (control group). The animals underwent a 60-day monitoring period for faecal egg count (FEC), blood leukocyte and eosinophil counts, plasmatic protein levels, packed cell volume (PCV), anti-h. contortus IgG levels and liveweight. Faecal egg count for the Hc group was twice the average observed for Hp group (p<0.0001). Hc primo-infected lambs showed the lowest PCV averages (p<0.0001). Faecal egg count and VG showed negative moderate correlations in the infected groups (Hc r=-0.44 and Hp r=- 0.38). There was no eosinophilia, however Hc group lambs showed higher eosinophil levels at day 21 after infection (p=0.0087). This same group showed low negative correlation between FEC and eosinophil counts (r=-0.21). Experimental infection with either H. contortus or H. placei triggered an immune response with similar anti-h. contortus IgG levels. Results show that H. placei does infect sheep but FEC are lower compared to H. contortus infected animals, confirming that H. placei is not a specific parasite for sheep. A single 5000 L 3 dose was not enough to trigger haemonchosis clinical signs. Keywords: Physiological alterations. Sheep. Haemonchus sp.

31 INTRODUÇÃO Ovinos e bovinos jovens são frequentemente parasitados por Haemonchus spp causando graves problemas pelo potencial patogênico devido principalmente à hematofagia deste nematódeo, que dependendo do nível de infecção do animal, podem ocasionar hipoproteinemia e uma anemia fatal (ZAJAC, 2006). No Brasil estão presentes as espécies H. contortus, H. similis e H. placei (AMARANTE et al., 2007; ROCHA et al., 2008). Embora, H. contortus tenha uma maior especificidade por ovinos e H. placei por bovinos, poderá ocorrer infecções cruzadas e consequente co-infecção nos animais (BORBA, 1988). Amarante et al. (1997) observaram infecções cruzadas envolvendo ovinos e bovinos, porém estas infecções foram leves e naturalmente eliminadas. Segundo Condi et al. (2009), em estudo desenvolvido no Brasil em pastoreio de ovinos e bovinos estes últimos estavam infectados naturalmente com predomínio de H. placei seguido de H. contortus e menor percentagem por H. similis. Nos Estados Unidos, bovinos mantidos em áreas sem ovinos mantiveram-se infectados por H. contortus por 40 anos, com nível de infecção significativa (GASBARRE et al., 2009). A faixa etária mais sensível a hemoncose são os animais jovens, que adquirem resistência durante os primeiros 12 meses de vida, após repetidas exposições à infecção (COLDITZ et al., 1996). A imunização com glicoproteínas de intestino de H. contortus protege bovinos ao desafio com H. contortus e H. placei, sendo que na infecção desafio observou-se um retardo no desenvolvimento do H. contortus, com recuperação de menor número de parasitos adultos, bem como menor número de ovos nas fezes (OPG) (BASSETTO et al., 2011). As alterações fisiopatológicas devido a infecção por Haemonchus vão depender da resposta imunológica do ovino, que por sua vez estão na dependência principalmente do nível de infecção, idade, genética, estado nutricional e fisiológico e também na habilidade de compensar perdas agudas ou crônicas de proteínas plasmáticas, de hemoglobina e de outros constituintes do sangue (NISHI et al., 2002; RADOSTITIS et al., 2002). Aumento de eosinófilos no sangue periférico e da mucosa abomasal ocorrem em infecções experimentais de ovinos com H. contortus (BALIC; BOWLES;

32 MEEUSEN, 2002). Também Bricarello et al. (2002), Gauly; Erhardt (2001), verificaram alterações na concentração de proteínas plasmáticas e no volume globular (VG) de ovinos infectados com H.contortus, respectivamente. A busca de métodos alternativos de controle, como o pastoreio simultâneo ou alternado de ovinos e bovinos se faz necessário, pois há décadas vem decrescendo a eficácia dos tratamentos anti-helmínticos devido sua utilização de forma excessiva e exclusiva. Neste contexto este estudo teve como objetivo estabelecer a infecção de cordeiros com H. placei e verificar as alterações orgânicas ocasionadas pela primo-infecção experimental por H. contortus e H. placei. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido no Centro de Pesquisa de Pecuária dos Campos Sulbrasileiros (CPPSul /Embrapa), no laboratório de Análises Clínicas em Veterinária da Urcamp, Bagé RS e no Laboratório de Helmintologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas - RS. Obtenção de cepas puras de H. placei e H. contortus Cepas puras de H. contortus Haemonchus adultos foram coletados de ovinos adultos mantido em áreas de pastoreio exclusivo com ovinos. As fêmeas foram utilizadas para obtenção de larvas infectantes (L 3 ), realizando-se coproculturas (ROBERTS; O' SULLIVAN, 1950), com macerado das fêmeas de Haemonchus misturado a fezes ovinas livres de helmintos, mantidas por sete dias em câmara de climatização (B.O.D. a 27ºC e 70% de umidade). Os machos foram fixados em metanol e ácido acético (3:1) para cariotipagem. As L 3 obtidas das coproculturas foram utilizadas para infectar cordeiros que serviram de doadores de larvas.

33 Cepas puras de H. placei Cepas puras de H. placei de bovinos, criopreservadas, foram obtidas na Embrapa Gado de Corte, pelo Dr. João Batista Catto, e processadas conforme metodologia descrita no item anterior. Primo-infecções com H. placei e H. contortus Manutenção de ovinos sensíveis Foram utilizados trinta e nove cordeiros cruza Corriedale, machos e fêmeas, livres de infecções parasitária, nascidos e mantidos confinados na cabanha de experimentos da Embrapa CPPSul em baias de piso ripado e elevado a 1,5m de altura do solo. Os animais foram alimentados com farelo de arroz desengordurado peletizado e feno de alfafa em quantidade suficiente para proporcionar um crescimento de 100 g/dia e água a vontade. Aos 60 dias de idade os cordeiros foram desmamados e mantidos até a necropsia no mesmo ambiente, com avaliações coprológicas quinzenais. Primo-infecção dos animais experimentais Aos seis meses de idade os animais foram divididos em três grupos: Grupo HC vinte cordeiros infectados com 5.000 larvas L 3 de H. contortus; Grupo HP dez cordeiros infectados com 5.000 larvas L 3 de H. placei e grupo controle (CTL) nove cordeiros mantidos livres de infecção (não infectados). As infecções experimentais foram realizadas via oral, em uma única dose de 5.000 L 3, conforme descrito em LE JAMBRE, (1983). Quatro dias antes da infecção, foram realizadas coletas individuais de fezes para OPG e de sangue com e sem anticoagulante para hemograma e sorologia, respectivamente. Este mesmo procedimento foi realizado a partir do 21 dia pós infecção, sendo que para OPG, VG e proteínas plasmáticas totais, as coletas foram a cada dois dias. Para hemograma as coletas foram semanais e mensais para sorologia. Os cordeiros foram pesados quatro dias antes da infecção e aos 30 e 60 dias pós infecção.

34 Descrições das análises Exames parasitológicos de fezes As amostras foram obtidas diretamente da ampola retal para contagem de OPG seguindo a técnica descrita por Gordon; Whitlock (1939) modificada. Avaliação hematológica As amostras de sangue com anticoagulante foram colhidas por venopunção da jugular para determinação do volume globular e proteínas plasmáticas totais, contagem total e diferencial de leucócitos. O volume globular foi avaliado através do método do microhematócrito. O leucograma foi realizado de acordo com a técnica descrita por Jain (1986) e Weiss; Wandrop (2010). As proteínas plasmáticas totais foram avaliadas pelo refratômetro clínico (COLES, 1984). Avaliação da imunidade humoral A presença de anticorpos anti-h. contortus foi avaliada pela técnica de ELISA indireta (Enzyme linked immunosorbent assay), nos soros obtidos individualmente antes e após infecção. O antígeno utilizado foi preparado a partir de formas adultas de H. contortus coletados diretamente do abomaso de ovinos naturalmente infectados. A placa de 96 poços (COSTAR 3590) foi sensibilizada com o antígeno diluído 1:240 em PBST 0,1% (ph 7,2), foi utilizado 100µL/poço, o equivalente a 100ng, e incubado a 37 C por uma hora e 30 minutos. Os sítios livres para ligação de proteína foram bloqueados com PBST 0,1% em leite em pó desnatado a 5%, foi utilizado 100µL/poço e incubado a 37 C por uma hora. Os soros tanto teste como controle positivo (ovino infectado experimentalmente com H. contortus) e negativo (soro fetal de ovino) foram diluídos 1:40 em PBST 0,1% em leite em pó desnatado a 5%, incubados, 100µL/poço, a 37 C por uma hora. O conjugado peroxidase anti - IgG ovino (SIGMA) foi diluído 1:4000 em PBST 0,1%, foi utilizado 100µL/poço e incubado a 37 C por uma hora. Entre todas as fases do teste as placas foram lavadas por três vezes com PBST 0,1%. Como cromógeno foi utilizado ortofenilenodiamina (OPD), em tampão citrato-fosfato (ph 4,0), acrescida do substrato peróxido de hidrogênio, foi utilizado 100µL/poço e o tempo para reagir foi de 15 minutos em temperatura ambiente, protegida da luz. Em seguida a reação foi

35 interrompida com 50µL/poço com ácido sulfúrico 2,5N. A leitura das absorbâncias foi determinada em leitor de ELISA (Thermo plate) com comprimento de onda de 492nm. A intensidade de coloração foi determinada em leitor de ELISA (BIO-RAD 2550, USA), a um comprimento de onda de 492nm e expressa em densidade ótica (DO). Todos os soros foram analisados em duplicata. Análise estatística O modelo estatístico incluiu os grupos como variáveis independentes e as demais variáveis OPG (ovos por grama de fezes), VG (volume globular), PPT (proteína plasmática total), CGB (contagem de glóbulos brancos), contagem diferencial do leucograma, peso corporal e níveis de IgG anti-h. contortus, como variáveis dependentes. Os dados foram submetidos à análise da normalidade através do teste de Shapiro-Wilk. A variável OPG e eosinófilos não demonstraram normalidade, sendo a mesma transformada em Log (x+1). A análise estatística das variáveis foi realizada através do software Statistix 9.0, por da Análise de Variância (ANOVA) para comparação das médias através do Teste de Tukey, sendo considerado como diferença significativa quando p<0,05. Também foram realizadas correlações a partir da utilização do Coeficiente de Pearson. RESULTADOS E DISCUSSÃO O período pré-patente para H. contortus e H. placei foi de 22 e 26 dias, respectivamente (Fig. 1). Bricarello et al. (2002), infectaram cordeiros com 200 L 3 (Kg de peso) de H. contortus e os primeiros ovos foram detectados aos 21 dias pós infecção. Santiago; Da Costa; Benevenga (1981), em experimento com ovinos no Rio Grande do Sul, verificaram o período pré-patente médio para H. contortus de 16 dias, período bem menor ao encontrado no presente experimento, provavelmente isto se deva ao fato da avaliação de todo material fecal eliminado diariamente, portanto aumentando as chances de detectar os primeiros ovos eliminados. No entanto, Riggs (2001) ao infectar três cordeiros (4000 L 3 ) com H. placei de origem ovina (cepas mantidas por três gerações em ovinos), observou período pré-patente de 25 dias, similar ao PPP para H. placei observada no presente estudo, confirmando maior período para está espécie em ovinos. Entretanto, segundo Santiago (1968)

36 não ocorre alteração no PPP do Haemonchus com a troca de hospedeiro. Nishi et al. (2002) ao infectar terneiros com 100.000 L 3 de H. placei, observaram o período pré patente na quarta semana pós infecção (aproximadamente 28 dias). A média de OPG do grupo Hc foi duas vezes maior em relação à média do grupo Hp (p<0,0001), como pode ser observado na Figura 1. Esses resultados vem de encontro aos constatados por Amarante (2004) em relação à especificidade desses nematódeos, aqui demonstrada pelo menor número de ovos nas fezes (OPG) nos cordeiros infectados por H. placei (p<0,0001). Também Borba (1988) verificou que embora H. placei seja um nematoide específico de bovinos, em área de pastoreio simultâneo de bovinos e ovinos, estes últimos apresentaram 22% de H. placei e 78% de H. contortus. Figura 1 - Média de ovos por grama de fezes (OPG) eliminados por cordeiros infectados experimentalmente com 5000 L 3 de Haemonchus contortus (Hc) e H. placei (Hp) durante 60 dias pós infecção (dpi). O volume globular quando comparado aos ovinos livres de infecção (CTL) demonstrou diferença significativa em sete e quatro dias analisados para o Hc e Hp, respectivamente (Tabela 2). Esses resultados demonstram que os cordeiros não apresentaram anemia, sugerindo que a dose de larvas infectantes provocou uma infecção subclínica, já que não houve queda progressiva de VG como descrita por Dargie; Allonby (1975), na primeira fase de evolução da hemoncose. Foi observada correlação negativa com associação moderada entre OPG e VG nos grupos infectados (Hc r=-0,44 e Hp r=-0,38), resultados semelhantes aos relatados por Mattos et al. (2005). Bambou et al. (2008) infectaram caprinos aos 10 meses de

37 idade com 10000 L 3 de H. contortus e consideraram a infecção como leve, já que os animais não apresentaram sinais clínicos, justificando em parte esses resultados, pela alimentação com elevada quantidade de proteína. Tabela 1 - Médias e desvio padrão da variável volume globular durante a primo infecção nos grupos H.contortus, H. placei e controle (não infectados). Dia pós HC HP CTL p Dia pós HC HP CTL infecção infecção -4 34,85 ±3,937 35,4 ±3,134 34,11 ±3,48 43 34,6 b ±2,604 35,8 ab ±2,098 37,11 a ±2,848 0,056 22 35,35 ±2,907 35,9 ±2,767 36 ±2,121 45 31,95 b ±2,523 33,3 b ±2,003 36,22 a ±2,048 0,0002 25 35,3 ±3,213 34,1 ±2,025 36,56 ±3,283 47 34,3 ±2,774 35,1 ±2,47 35,22 ±2,333 27 31,4 b ±3,185 32,7 ab ±2,058 34,78 a ±2,333 0,015 49 33,5 b ±2,705 33,9 ab ±1,912 36,56 a ±2,698 0,015 29 34,2 ±2,931 33 ±2,261 33,56 ±2,068 51 33,65 ab ±2,434 33,1 b ±1,792 35,67 a ±2 0,035 31 32,4 ±2,927 31,4 ±2,271 32,22 ±1,202 53 34 b ±2,695 34 b ±1,944 36,89 a ±2,369 0,014 33 33,25 b ±2,552 35,2 ab ±1,814 35,78 a ±2,539 0,02 55 32,65 ±2,56 32,6 ±2,271 34,11 ±2,369 35 32,2 ±2,462 32,7 ±2,312 34,22 ±2,167 57 33,1 b ±2,989 33,6 b ±2,366 37,67 a ±2,236 0,0005 37 32,85 ±2,498 33,7 ±2,312 34,67 ±1,803 59 32,9 ±2,808 31,4 ±1,578 33,67 ±2,958 39 34,15 b ±1,981 36,7 a ±1,636 35,67 ab ±2,236 0,005 60 36 ±3,146 36,3 ±2,406 37,67 ±2,739 41 32,25 ±2,314 33 ±2,494 33,22 ±2,949 - Letras diferentes denotam diferença significativa entre os tratamentos pelo Teste de Tukey (p<0,05). Não ocorreu diferença estatística entre os grupos para variável proteína plasmática total, exceto no 31º dpi, no qual se observou que os cordeiros infectados, tanto por H. contortus como por H. placei, mostraram oscilações das médias em

38 algumas coletas, com valores normais e abaixo da referência entre os dias 27 e 59 dpi (Tabela 3). Tabela 2 Médias e desvio padrão da proteína plasmática total durante a primoinfecção por H. contortus, H. placei e grupo controle. dpi HC HP CTL Dpi HC HP CTL _4 6,3(±0,4) 6,3(±0,5) 6,3(±0,3) 43 6,1(±0,4) 6,0(±0,2) 6,3(±0,3) 22 6,5(±0,3) 6,3(±0,4) 6,6(±0,4) 45 5,9(±0,4) 5,9(±0,4) 6,2(±0,2) 25 6,2(±0,4) 6,0(±0,4) 6,2(±0,4) 47 5,8(±0,3) 5,7(±0,4) 6,0(±0,3) 27 5,9(±0,3) 6,0(±0,4) 6,0(±0,4) 49 5,9(±0,3) 5,9(±0,4) 6,1(±0,2) 29 5,9(±0,3) 5,8(±0,4) 6,1(±0,4) 51 6,1(±0,3) 5,9(±0,4) 6,1(±0,2) 31 5,7 a (±0,3) 5,4 b (±0,2) 5,9 a (±0,2) 53 6,0(±0,3) 5,8(±0,4) 6,1(±0,2) 33 6,0(±0,3) 6,2(±0,3) 6,2(±0,2) 55 5,9(±0,3) 5,8(±0,4) 6,0(±0,2) 35 5,9(±0,2) 5,8(±0,3) 6,1(±0,2) 57 6,0(±0,3) 5,9(±0,4) 6,3(±0,1) 37 6,0(±0,3) 5,9(±0,5) 6,2(±0,2) 59 6,1(±0,3) 5,9(±0,3) 6,0(±0,2) 39 6,2(±0,3) 6,3(±0,3) 6,2(±0,2) 60 6,5(±0,3) 6,5(±0,3) 6,4(±0,2) 41 5,9(±0,3) 5,9(±0,3) 6,1(±0,3) Letras diferentes denotam diferença significativa entre os tratamentos pelo Teste de Tukey (p<0,05). Correlações positivas foram observadas entre PPT e VG (Hc r=0,38 e Hp r= 0,47) e negativas quando comparadas a variável OPG (Hc r=- 0,41 e Hp r=- 0,34). Esse declínio foi discreto, o que não interferiu nas atividades orgânicas, caracterizando uma infecção subclínica. Esses resultados condizem com as citações de Baroni (1979) no qual demonstrou que os níveis de proteína plasmática total diminuem proporcionalmente com a elevação dos níveis de infecção em ovinos. De outra forma, Rowe et al. (1982) observaram que as proteínas plasmáticas perdidas no abomaso pela presença de H. contortus em ovinos é em parte reabsorvida no intestino delgado. Dargie; Allonby (1975) relatam que a hipoalbuminemia é uma característica da hemoncose aguda em ovinos, causada por aumento considerável da perda de proteínas plasmáticas no abomaso com um significativo aumento do catabolismo da albumina.

39 Quanto a contagem total de leucócitos, não houve diferença estatística entre os grupos, no qual apresentaram valores dentro dos padrões normais para espécie (4-12 x10/mm³ de sangue), indicando que a primo infecção por H. contortus e ou H. placei não foi suficiente para acionar as citocinas que alteram a cinética dos leucócitos, entre a medula óssea e consumo tecidual, o que vem de encontro com as observações Balic; Cunningham; Meeusen (2006) e Thrall (2007). Não houve eosinofilia nos animais experimentais, porém no 14º dpi observouse um pico de eosinófilos no grupo Hc, sem diferir estatisticamente dos demais grupos. Os cordeiros infectados H. contortus, apresentou diferença significativa com número médio de eosinófilos superiores ao grupo CTL no 21º dpi (p=0,0087). Os cordeiros infectados com H. placei não diferiram entre os demais. Observou-se correlação negativa com associação fraca entre o número de eosinófilos e OPG apenas no grupo infectado por Hc (r=-0,21). Resultados similares foram também observados por Gill (1991) em cordeiros com infecção primária de H. contortus. Amarante et al. (1999) observaram um pico de eosinófilos no 21º dia pós desafio experimental, com posterior declínio. Figura 2 - Médias de eosinófilos sanguíneos em cordeiros infectados com H. contortus e H. placei durante a primo-infecção. Correlações negativas entre OPG e eosinófilos foram descritos por Rosalinski-Moraes et al. (2011), justificado pela migração tecidual devido a liberação de IL-5 pelos linfócitos Th2 na mucosa abomasal (BALIC; CUNNINGHAM; MEEUSEN, 2006; TEREFE et al., 2007).

40 O grupo Hp apresentou níveis de OPG duas vezes menor em relação aos animais infectados por Hc, sugerindo um menor estabelecimento dessa espécie. Os níveis de anticorpos da classe IgG anti-h. contortus durante a primoinfecção, podem ser observados na Tabela 3, mostrando que os cordeiros responderam de maneira similar a infecção com as duas espécies de Haemonchus. Embora o grupo Hc tenha diferido estatisticamente do grupo controle, o mesmo não diferiu do grupo Hp. Segundo Cuquerella; Gómez-Muñoz; Alunda (1991) cordeiros infectados e desafiados com H. contortus aos quatro e seis meses respectivamente, não conseguiram montar uma resposta imune protetora contra o desafio. A infecção primária não provocou qualquer aumento de anticorpos IgG anti-haemonchus. Os autores relacionam seus resultados a imaturidade imunológica devido a idade dos cordeiros. Tabela 3 - Médias de absorbância e desvio padrão dos soros de cordeiros primo infectados com H. contortus, H. placei e não infectados, durante o período experimental. Tratamento -4dpi 26dpi 60dpi Hc Hp CTL 0,1179 a ±0,0951 0.1606 a ±0,1537 0.0576 a ±0,0836 0,4335 a ±0,2137 0.3230 ab ± 0,1735 0.1290 b ±0,0702 0,2840 a ±0,2840 0.2491 ab ±0,1488 0.0966 b ±0,0894 Letras diferentes apresentam diferença significativa entre os grupos (Teste de Tukey, p<0,05). Dpi dias pós primo-infecção. (Cut-off média 25 soros negativos acrescida de dois desvios padrão Hc=0,085). No experimento em questão, os cordeiros foram infectados aos seis meses e foram avaliados até oito meses de idade. Nas condições estudadas as médias mais elevadas foram observadas no 26º dpi e após declinaram, e os níveis baixos de IgG anti-haemonchus provavelmente estão relacionado a dose única de L 3, já que o grau de resistência adquirido frente a esse patógeno está relacionado a exposições constantes durante o primeiro ano de vida do animal (COLDITZ et al., 1996). O peso corporal dos cordeiros submetidos aos diferentes tratamentos não foi observada diferença estatística entre os grupos (p=0,4039) durante o período experimental. Provavelmente isto se deva as condições nutricionais a que foram

41 submetidos, levando a instalação de uma infecção subclinica incapaz de desencader alterações orgânicas significativas, que podessem interferir na ingestão e absorção de nutrientes. Strain; Stear (2001) utilizaram uma dieta com suplementação proteica em cordeiros com cinco meses de idade, no qual foram infectados com H. contortus. Os resultados demonstraram que não houve diferença no número de fêmeas recuperadas na necropsia, mas o comprimento e a fecundidade dessas foram menores nos cordeiros que receberam a suplementação. CONCLUSÕES Os ovinos podem ser infectados por H. placei, entretanto o estabelecimento da infecção, traduzido pelo OPG indica menor especificidade, sugerindo que a infecção de H. placei em ovinos, leve a menor contaminação do ambiente. Uma única infecção com H. placei ou H. contortus, nas condições estudadas, não foi suficiente para ocasionar sinais clínicos e ou provocar alterações orgânicas nos cordeiros. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AMARANTE, A.F.T.; BAGNOLA,JR.; AMARANTE, M.R.V.; BARBOSA, M.A. Host specificity of sheep and cattle nematodes in São Paulo state, Brazil. Veterinary Parasitology, v. 73, p.89-104, 1997. AMARANTE, A.F.T.; CRAIG,T.M.; RAMSEY, W.S.; DAVIS, S.K.; BAZER, F.W. Nematode burdens and cellular responses in the abomasal mucosa and blood of Florida Native, Rambouillet and crossbreed lambs. Veterinary Parasitology, v. 80, p. 311-324, 1999. AMARANTE, A.F.T. Controle integrado de helmintos de bovinos e ovinos. Revista Brasileira de Parasitologia Veterinária, v. 13, p. 68-71, 2004. Suplemento 1. AMARANTE, A.F.T.; ROCHA, R.A.; BRICARELLO, P.A. Relationship of intestinal histology with the resistance to Trichostrongylus colubriformis infection in three breeds of sheep. Pesquisa Veterinária Brasileira, v. 27, n. 1, p. 43-48, 2007. BALIC, A.; BOWLES, V.M.; MEEUSEN, E.N.T. Mechanisms of immunity to Haemonchus contortus infection in sheep. Parasite Immunology, v. 24, p. 39-46, 2002. BALIC, A.; CUNNINGHAM, C.P.; MEEUSEN, E.N.T. Eosinophil interactions with Haemonchus contortus larvae in the ovine gastrointestinal tract. Parasite Immunology, v. 28, p. 107-115, 2006.

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45 3.3 Artigo 3 AVALIAÇÃO DA RESPOSTA DE CORDEIROS AO PARASITISMO POR H. contortus ou H. placei APÓS PRIMO-INFECÇÃO COM H. placei OU H. contortus LAMB RESPONSE TO H. contortus OR H. placei CHALLENGE WHEN H. placei OR H. placei PRIMO-INFECTED REINIGER, R.C.P. 1 ; BENAVIDES, M.V. 2 ; BERNE, M.E.A. 3 1 Doutoranda Programa de Pós-Graduação em Veterinária, FV-UFPel, docente URCAMP-Bagé; 2 Dr.ª Pesquisadora EMBRAPA LabEx EUA; 3 Prof.ª Dr.ª Instituto de Biologia, Departamento de Microbiologia e Parasitologia, UFPel, *reginareiniger@hotmail.com

46 Resumo Este trabalho foi realizado com o objetivo de verificar a resposta de ovinos ao parasitismo por Haemonchus contortus ou H. placei após infecção prévia com H. placei e Haemonchus contortus, respectivamente. Foram avaliados 39 cordeiros com seis meses de idade, previamente infectados experimentalmente com 5000 L 3 de H. contortus e H. placei, tratados com anti-helmíntico e desafiados aos dez meses de idade. Os animais foram distribuídos em quatro grupos, sendo um grupo não infectado (CTL), grupo que recebeu Hc, tanto na primo infecção como no desafio (Hc-Hc), e os outros dois grupos receberam infecção cruzada (Hc-Hp e Hp-Hc). As variáveis avaliadas foram o número de ovos de helmintos por grama de fezes (OPG), carga parasitária, fecundidade das fêmeas, comprimento das fêmeas, volume globular (VG), leucograma, análise histológica do abomaso e níveis de IgG anti-h. contortus. Os resultados demonstraram que uma dose de 5000 L 3 provocou uma infecção subclínica em todos os animais dos diferentes grupos infectados, sendo o grupo que recebeu H. placei no desafio o que apresentou menores médias de OPG. Em todos os grupos infectados o volume globular apresentou correlação negativa em relação ao OPG (Hc-Hc r=-0,6988; Hc-Hp r=-0,5449; Hp-Hc r=-0,5815), assim como o número de eosinófilos e OPG (Hc-Hc r=-0,4208; Hc-Hp r=-0,2357; Hp-Hc r=-0,239). Os níveis de IgG não apresentaram diferença significativa entre os grupos infectados. Os resultados sugerem que os animais dos grupos primo infectados tanto com H. contortus como com H. placei não desenvolveram resistência quando desafiados com H. placei ou H. contortus, respectivamente. A infecção provocada com 5000 L 3 de Haemonchus spp. não foi suficiente para provocar sinais clínicos nos animais, nem aumentar os níveis de IgG anti-h. contortus. Palavras-chave: Ovinos. OPG. IgG anti-h. contortus.

47 Abstract The aim of this study was to monitor lamb response to Haemonchus contortus or H. placei soon after primo H. placei or H. contortus infection, respectively. Thirty nine 6-month old lambs, previously primo-infected with either H. contortus or H. placei 5000 L3 larvae, drenched, and challenged at 10-month old. Out of the twenty H. contortus primoinfected lambs, 10 were challenged with H. placei (HcHp group) and 10 with H. contortus (HcHc group). Ten H. placei primo-infected lambs were challenged with H. contortus (Hp-Hc group) and the nine remainders were left uninfected (control group). All animals were necropsied 60-day post-challenge. At necropsy FEC, blood leukocyte and eosinophil counts, plasmatic protein levels, packed cell volume (PCV), anti-h. contortus IgG levels, abomasum histology, liveweight, parasite burden, adult nematode length and adult female parasite fecundity were evaluated. Results showed that a single 5000 L 3 dose caused a sub-clinical infection in all the infected animals. Packed cell volume of infected lambs showed moderate to high correlations with FEC (Hc-Hc r=-0.6988; Hc-Hp r=-0.5449; Hp-Hc r=-0.5815), and moderate to low negative correlations of eosinophil counts with FEC (Hc-Hc r=-0.4208; Hc-Hp r=-0.2357; Hp- Hc r=-0.239). Results show H. placei or H. contortus primo-infected lambs were not able to withstand subsequent infection when challenged with H. contortus or H. placei, respectively. A single 5000 L 3 dose was not enough to trigger haemonchosis clinical signs, nor consistent anti-h. contortus IgG levels. Keywords: Sheep. FEC. Anti-H. contortus IgG levels.

48 INTRODUÇÃO Os nematódeos gastrintestinais são indiscutivelmente o maior problema à produção de ovinos mundialmente (MILLER; HOROHOV, 2006), e especificamente os da Família Trichostrongylidae são responsáveis pelas maiores perdas de produtividade e desempenho de ovinos e caprinos. No Brasil as espécies mais frequentes nesses animais são Haemonchus contortus, Ostertagia sp., Trichostrongylus axei, T. colubriformis, Cooperia curticei, Nematodirus sp., Strongyloides spp., Oesophagostomum sp. e Trichuris sp. (AMARANTE, 2004). A maior prevalência de um ou mais gêneros é dependente de um conjunto de fatores, como: temperatura, precipitação pluviométrica, solo, tipo e manejo de pastagem, espécie, raça, idade, estado fisiológico e nutricional e manejo dos animais (RUAS; BERNE, 2007). Porém dentre esses parasitos destaca-se H. contortus devido à sua ação patogênica, maior prevalência (AMARANTE, 2004) e resistência à maioria dos anti-helmínticos utilizados no seu controle (SCZESNY-MORAES et al., 2010). Para o controle dessa parasitose, é indispensável a utilização de tratamentos anti-helmínticos, principalmente nas regiões tropicais úmidas, o que leva a maioria dos criadores a aplicarem diversos princípios ativos e em média nove dosificações por ano (ECHEVARRIA et al., 1996) acarretando, inevitavelmente, a diminuição na eficácia do produto (BORGES, 2003). Greer (2008) relata que a busca de controles sustentáveis para helmintoses gastrintestinais em pastagens, deve ser resultante de estratégias que auxiliem os ovinos a montar uma resposta imune eficiente. A principal razão para esse direcionamento de pesquisas é o decréscimo da eficácia das terapias antihelmínticas e as preocupações dos consumidores e ambientalistas quanto ao uso excessivo de produtos químicos (LACROUX et al., 2006; ROWE et al., 2008; BASETTO et al., 2011). Uma das alternativas usadas para diminuir a utilização desses fármacos e minimizar as perdas geradas pelas helmintoses é o pastoreio misto entre bovinos adultos e ovinos, pois H. contortus e o H. placei são parasitos específicos para ovinos e bovinos, respectivamente (COLES, 2005). Entretanto, Amarante et al. (1997) observaram infecções cruzadas envolvendo as espécies H. placei e H. contortus em

49 ovinos e bovinos que compartilharam pastagens, sendo a identificação realizada pela análise dos cromossomas. Algumas pesquisas apontam a suscetibilidade de terneiros frente ao H. contortus, indicando o uso de bovinos adultos para o pastoreio junto a ovinos (ZAJAC, 2006). O controle do tamanho de uma população de uma espécie de parasita pode regular de forma cruzada outro tipo de população de uma espécie diferente, ou seja, o desenvolvimento da imunidade protetora contra uma espécie pode proteger contra outro tipo de parasitismo (ADAMS et al., 1989). Com bases nesses conhecimentos o objetivo deste trabalho foi verificar a resposta de ovinos ao parasitismo por H. contortus e H. placei após infecção prévia com a espécie cruzada. MATERIAL E MÉTODOS O trabalho foi desenvolvido no Centro de Pesquisa de Pecuária dos Campos Sulbrasileiros (CPPSul/Embrapa), no laboratório de Análises Clínicas em Veterinária da Urcamp, Bagé RS e no Laboratório de Helmintologia do Instituto de Biologia da Universidade Federal de Pelotas - RS. Desafios com H. placei e H. contortus Trinta e nove cordeiros cruza Corriedale foram mantidos estabulados desde 24 horas após seus nascimentos, como forma de mantê-los livres de contaminação. Aos seis meses de idade foram divididos em três grupos para a primo-infecção, sendo o grupo Hc, constituídos de vinte animais infectados com 5000L 3 de H. contortus. O grupo Hp foi formado por dez animais infectados com 5000L 3 de H. placei e o grupo controle por nove animais não infectados. No final de 60 dias os animais foram tratados com anti-helmíntico (moxidectina 0,2%). Todos os animais apresentaram-se negativos para contagem de ovos por grama de fezes no início do desafio. Os animais aos dez meses de idade, mantidos sob condições já descritas foram distribuídos da seguinte maneira: Grupo Hc-Hc - dez ovinos primo-infectados com H. contortus foram desafiados com 5.000 L 3 de H. contortus; Grupo Hc-Hp - dez ovinos primo-infectados com H. contortus

50 foram desafiados com 5.000 larvas L 3 de H. placei; Grupo Hp-Hc - dez ovinos primoinfectados com H. placei foram desafiados com 5.000 larvas L 3 de H. contortus; Grupo CTL nove ovinos foram mantidos livres de parasitos desde seu nascimento, constituindo o grupo controle negativo do experimento. Os animais foram alimentados com farelo de arroz desengordurado peletizado e feno de alfafa em quantidade suficiente para proporcionar um crescimento de 100 g/dia e água a vontade. As infecções experimentais foram realizadas via oral, com uma dose de 5000 L 3, conforme descrito em Le Jambre (1983). Todos os grupos foram avaliados através de OPG e volume globular no dia da infecção (dia 0), 7, 14 e 21 dias pós desafio (dpd), seguindo de coletas a cada dois dias até o final do experimento. Semanalmente foram realizadas coletas de sangue para realização do leucograma. Mensalmente fizeram-se as coletas de sangue para obtenção de soro para determinação dos níveis de anticorpos específicos através da técnica de ELISA, nesta mesma frequência, todos os animais foram pesados individualmente, nos dias 0, 30 e 60 dpd. Aos 60 dias após desafio todos os animais foram eutanasiados e necropsiados. Descrições das análises Exames parasitológicos de fezes As amostras foram obtidas diretamente da ampola retal para contagem de OPG seguindo a técnica descrita por Gordon; Whitlock (1939) modificada. Avaliação hematológica As amostras de sangue com anticoagulante foram colhidas por venopunção da jugular para determinação do volume globular e proteínas plasmáticas totais, contagem total e diferencial de leucócitos. O volume globular foi avaliado através do método do microhematócrito. O leucograma foi realizado de acordo com a técnica descrita por Jain (1986) e Weiss; Wandrop (2010).

51 Avaliação da imunidade humoral A presença de anticorpos anti-h. contortus foi avaliada pela técnica de ELISA indireta (Enzyme linked immunosorbent assay), nos soros obtidos individualmente antes e após infecção. O antígeno utilizado foi preparado a partir de formas adultas de H. contortus coletados diretamente do abomaso de ovinos naturalmente infectados. A placa de 96 poços (COSTAR 3590) foi sensibilizada com o antígeno diluído 1:240 em PBST 0,1% (ph 7,2), foi utilizado 100µL/poço, o equivalente a 100ng, e incubado a 37 C por uma hora e 30 minutos. Os sítios livres para ligação de proteína foram bloqueados com PBST 0,1% em leite em pó desnatado a 5%, foi utilizado 100µL/poço e incubado a 37 C por uma hora. Os soros tanto teste como controle positivo (ovino infectado experimentalmente com H. contortus) e negativo (soro fetal de ovino) foram diluídos 1:40 em PBST 0,1% em leite em pó desnatado a 5%, incubados, 100µL/poço, a 37 C por uma hora. O conjugado peroxidase anti - IgG ovino (SIGMA) foi diluído 1:4000 em PBST 0,1%, foi utilizado 100µL/poço e incubado a 37 C por uma hora. Entre todas as fases do teste as placas foram lavadas por três vezes com PBST 0,1%. Como cromógeno foi utilizado ortofenilenodiamina (OPD), em tampão citrato-fosfato (ph 4,0), acrescida do substrato peróxido de hidrogênio, foi utilizado 100µL/poço e o tempo para reagir foi de 15 minutos em temperatura ambiente, protegida da luz. Em seguida a reação foi interrompida com 50µL/poço com ácido sulfúrico 2,5N. A leitura das absorbâncias foi determinada em leitor de ELISA (Thermo plate) com comprimento de onda de 492nm. A intensidade de coloração foi determinada em leitor de ELISA (BIO-RAD 2550, USA), a um comprimento de onda de 492nm e expressa em densidade ótica (DO). Todos os soros foram analisados em duplicata. Necropsia dos animais experimentais O sistema digestório foi imediatamente isolado por ligaduras e feito a remoção dos linfonodos da região do abomaso. Após a separação do abomaso dos demais compartimentos, o mesmo foi aberto pela curvatura maior e lavado com um litro de água morna para remover os parasitos, sendo que os remanescentes foram recuperados manualmente com pinça. O conteúdo proveniente da lavagem foi

52 recolhido em cálices de sedimentação para homogeneização e separação de 100 ml do mesmo, no qual foi adicionada a mesma quantidade de Líquido de Raillet. O abate dos animais seguiram as normas do comitê de ética da EMBRAPA, conforme Anexo I. Avaliação da carga parasitária, tamanho e fertilidade das fêmeas O material obtido do abomaso foi examinado em esteriomicroscópio para coleta, contagem e sexagem dos parasitos. Destes 20% de machos e fêmeas tiveram seus comprimentos mensurados através de sistema de análise de imagens (Axio-vision Karl Zeis). As fêmeas, após medição, foram avaliadas quanto a sua fertilidade através da contagem dos ovos presentes no útero. Para obter os ovos foi adicionada uma solução contendo 125μL de hipoclorito de sódio P.A. a 50% diluído em água destilada para cada fêmea, e levada ao agitador para romper a cutícula e o útero e assim liberar os ovos. A esse volume inicial foram adicionados 125μL de lugol e 1250μL de água destilada. Após homogeneização dos 1500μL, foram montadas duas lâminas com 250μL cada, para contagem dos ovos no microscópio ótico em objetiva de 10x. O total de ovos presentes no volume de 500μL foi multiplicado por três para quantificação total de ovos por fêmeas. Análise histológica da mucosa do abomaso Fragmentos da região fúndica do abomaso obtidos durante a necropsia foram fixados em formol a 10% tamponado. As amostras foram processadas pelo método de parafina e coradas por hematoxilina-eosina. As análises histológicas da mucosa da região fúndica do abomaso foram realizadas em objetiva de 10 e 40X em toda a extensão do corte histológico, para verificar possíveis alterações nas glândulas e células que constituem essa porção. Análise estatística O modelo estatístico incluiu os grupos como variáveis independentes e as demais variáveis OPG (ovos por grama de fezes), VG (volume globular), contagem

53 total e diferencial dos leucócitos no sangue, carga parasitária, comprimento das fêmeas e machos, fecundidade das fêmeas, peso corporal e níveis de anticorpos da classe IgG como variáveis dependentes. Os resultados das coletas foram analisados pelo programa Statistix 9.0, por análise de variância múltipla pelo teste Tukey. Os dados foram submetidos à análise da normalidade através do teste de Shapiro-Wilk. As variáveis OPG, contagem total e diferencial dos leucócitos, carga parasitária e fecundidade das fêmeas, tiveram seus dados transformados em logaritmo para normalização dos dados (log (x+1)), sendo considerado como diferença significativa quando p < 0,05. Também foram realizadas correlações a partir da utilização do Coeficiente de Pearson. RESULTADOS Os animais do grupo controle permaneceram com OPG negativos durante toda a fase experimental. Os resultados demonstraram a ocorrência do estabelecimento dos nematódeos em todos os animais que receberam L 3 de H. contortus e H. placei. A análise de OPG dos ovinos desafiados com Hc, independente do agente utilizado na primeira infecção, apresentou um período pré-patente de 26 dias, enquanto do grupo desafiado com Hp foi de 30 dias. As médias das contagens de OPG durante desafio, demonstraram que o grupo Hc-Hp apresentou valores mais baixos, com diferença significativa (p= 0,025) em relação ao grupo Hp-Hc em vários dias analisados, porém, não diferiram estatisticamente do grupo Hc-Hc (Tabela 1). A variável fecundidade das fêmeas apresentou as mesmas diferenças demonstradas em relação a OPG, ou seja o grupo Hp-Hc diferiu estatisticamente (p= 0,0049) do grupo Hc-Hp, porém o grupo Hc-Hc não apresentou diferença entre os demais grupos. As demais variáveis analisadas não demonstraram diferença significativa entre os grupos durante o período experimental (Tabela 2).

54 Tabela 1 Valores médios e desvio padrão de OPG entre os grupos desafiados com H. contortus e H. placei durante período experimental. Dias/grupos Hc-Hc Hp-Hc Hc-Hp Dias/grupos Hc-Hc Hp-Hc Hc-Hp 26 100 AB ±230 230 A ±245 0 B 44 2020 AB ±2378 1210 A ±876 240 B ±283 28 1120 A ±1835 660 A ±744 0 B 46 2790 AB ±3123 4200 A ±2774 840 B ±1095 30 1630 A ±2607 1950 A ±1487 10 B ±31,6 48 2870 AB ±2910 4390 A ±3510 1000 B ±1066 32 1830 A ±3016 1830 A ±1330 150 A ±117 50 2940 AB ±3514 3270 A ±2175 650 B ±573 34 1585 AB ±2776 1770 A ±1475 120 B ±103 52 3100 AB ±3092 3460 A ±2059 610 B ±593 36 2580 A ±2490 1980 A ±1357 790 A ±865 54 2400 AB ±2344 3650 A ±2232 770 B ±984 38 1550 AB ±1549 1830 A ±1375 525 B ±576 56 1930 AB ±1598 2510 A ±1583 590 B ±898 40 1950 AB ±2675 1990 A ±1533 500 B ±600 58 3570 A ±3439 2950 A ±1703 1000 A ±1202 42 2090 A ±1841 2310 A ±1777 780 A ±795 60 3570 AB ±3756 3640 A ±1836 590 B ±513 Letras diferentes apresentam diferença significativa entre os grupos (Teste de Tukey, p<0,05).* As médias se referem a valores de OPG não transformados, no entanto a diferença entre os grupos foi analisada com os dados após transformação logarítmica. Tabela 2 - Médias dos grupos para contagem de ovos por grama de fezes (OPG), carga parasitária, fecundidade das fêmeas, comprimento das fêmeas, volume globular e contagem total de leucócitos em cordeiros desafiados experimentalmente com H. contortus e H. placei. Variáveis HC-HC HC-HP HP-HC CTL OPG* Carga parasitária* Fecundidade das fêmeas Comprimento das fêmeas Volume globular Contagem leucócitos 3.570 ab (±3756) 316 a (±268) 199,5 ab (±108,25) 20,8 a (±2,573) 34,2 a (±1,89) 6.420 a (±917) 590 b (±513) 397 a (±355) 118,05 b (±74,50) 20,8 a (±1,686) 35 a (±1,41) 6.010 a (±1260) 3.640 a (±1837) 429 a (±330) 320,07 a (±174,07) 21,8 a (±1,229) 33,9 a (±1,97) 6.010 a (±806) - - - 34,7 a (±0,87) 7.200 a (±2516) Letras diferentes apresentam diferença significativa entre os grupos (Teste de Tukey, p<0,05). * As médias se referem a valores de carga parasitaria e OPG não transformados, no entanto a diferença entre os grupos foi analisada com os dados de carga parasitária e OPG após transformação logarítmica.

55 Durante a fase experimental, não foi observado eosinofilia, porém através da análise de variância, os resultados demonstraram diferença significativa (p=0,0002) entre as médias, mais altas, dos grupos infectados quando comparados ao grupo controle. Quando analisado por dia experimental as diferenças ocorreram no 14º dpd (p<0,0001) no qual os grupos infectados apresentaram médias mais altas em relação ao grupo controle, e no 24º dpd (p<0,0001) os grupos Hc-Hc e Hc-Hp demonstraram médias muito semelhantes, e mais altas em relação aos demais, portanto, diferiram do grupo Hp-Hc que também diferiu do grupo controle, no qual esse último apresentava as menores médias (Fig. 1). Figura 1- Médias de eosinófilos mm³/sangue durante desafio experimental de cordeiros infectados com H. contortus e H. placei e grupo não infectado (CTL). Em todos os grupos infectados observou-se correlação negativa entre OPG e eosinófilos e VG, e correlação positiva entre OPG e os dias experimentais. Nos grupos Hc-Hc e Hp-Hc houve correlações positivas entre o número total de leucócitos em relação aos neutrófilos, eosinófilos, monócitos e linfócitos. No grupo Hc-Hp observou-se correlações negativas entre os linfócitos e os neutrófilos, e também entre OPG e neutrófilos. Os monócitos demonstraram correlação positiva em relação ao OPG e VG no decorrer dos dias experimentais. O grupo controle demonstrou correlações positivas entre o número de leucócitos totais com: VG, neutrófilos, linfócitos monócitos e eosinófilos. Durante os

56 dias experimentais observou-se uma correlação negativa com os neutrófilos, e positiva em relação aos eosinófilos e monócitos (Tabela 3). Tabela 3 Correlações de Pearson (r) entre os leucócitos totais e diferenciais (neutrófilos, eosinófilos, monócitos e linfócitos), OPG, VG e os dias experimentais entre os grupos Hc-Hc, Hc-Hp, Hp-Hc e o grupo controle. *** (p 0,0001) ** (p 0,001) * (p 0,05) As correlações entre os níveis de IgG anti-h.contortus e a carga parasitária, fecundidade das fêmeas e o OPG não apresentaram grau de significância. A correlação foi significativa entre OPG em relação a fecundidade das fêmeas e carga parasitária, e entre a carga parasitária com a fecundidade das fêmeas nos grupos Hc-Hc e Hp-Hc (Tabela 4).