UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL)

UNIVERSIDADE FEDERAL FLUMINENSE FACULDADE DE VETERINÁRIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA VETERINÁRIA (CLÍNICA E REPRODUÇÃO ANIMAL) DANIELA PRADO RODRIGUES OCORRÊNCIA DE HEMOPARASITOS EM FELÍDEOS E CANÍDEOS SELVAGENS DO ZOOLÓGICO DA CIDADE DO RIO DE JANEIRO, RJ. NITERÓI 2010

ii DANIELA PRADO RODRIGUES OCORRÊNCIA DE HEMOPARASITOS EM FELÍDEOS E CANÍDEOS SELVAGENS DO ZOOLÓGICO DA CIDADE DO RIO DE JANEIRO, RJ. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica e Reprodução Animal) da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. Orientadora: Prof. a Dr.ª NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY Co-orientador: Prof. Dr. ALOYSIO DE MELLO FIGUEIREDO CERQUEIRA Niterói 2010

iii R696 Rodrigues, Daniela Prado Ocorrência de hemoparasitos em felídeos e canídeos selvagens do zoológico da cidade do Rio de Janeiro, RJ/ Daniela Prado Rodrigues; orientadora Nádia Regina Pereira Almosny. 2010. 173f. Dissertação (Mestrado em Clínica e Reprodução Animal) Universidade Federal Fluminense, 2010. Orientadora: Nádia Regina Pereira Almosny 1. Parasitologia veterinária. 2. Doenças parasitárias em animais. 3.Doenças do animal selvagem. 4. Animal de zoológico. 5. Reação em cadeia da polimerase. I. Título. CDD 636.089696

iv DANIELA PRADO RODRIGUES OCORRÊNCIA DE HEMOPARASITOS EM FELÍDEOS E CANÍDEOS SELVAGENS DO ZOOLÓGICO DA CIDADE DO RIO DE JANEIRO, RJ. Aprovada em 26 de abril de 2010. Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária (Clínica e Reprodução Animal) da Universidade Federal Fluminense, como requisito parcial para a obtenção do Grau de Mestre. BANCA EXAMINADORA Prof.ª Dr.ª NÁDIA REGINA PEREIRA ALMOSNY - Orientadora Universidade Federal Fluminense Prof. Dr. ALOYSIO DE MELLO FIGUEIREDO CERQUEIRA - Co-orientador Universidade Federal Fluminense Prof.ª Dr.ª RITA DE CÁSSIA ALVES ALCANTARA MENEZES Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Prof. Dr. DANIEL DE BARROS MACIEIRA Universidade Federal Fluminense Niterói 2010

v Aos animais selvagens.

vi AGRADECIMENTOS A todos os felídeos e canídeos selvagens cativos do Jardim Zoológico da cidade do Rio de Janeiro. À minha mãe e meu padrasto, pela vida, amor e valores morais; À minha família, irmãos e avó Sonia, pelo carinho, apoio e compreensão nos momentos dispensados; Ao Vinicius, pelo amor, apoio, paciência e tudo mais; À Prof a Dr a Nadia Almosny, minha orientadora, por acreditar no projeto e me apoiar no desenvolvimento do mesmo, pelo aprendizado, orientação e amizade; Ao Prof. Dr. Aloysio Cerqueira, meu co-orientador nesta empreitada, pela paciência, compreensão, apoio e carinho dispensados na árdua rotina da biologia molecular; À equipe do Jardim Zoológico da cidade do Rio de Janeiro, pelo imprescindível auxílio na obtenção de amostras e em especial aos amigos Gabriella Landau Remy e Valdir Ramos pelo apoio e amizade de sempre e aos meus eternos estagiários, Camila, Fabrícia e Diogo pela amizade e apoio durante as coletas; À amiga Renata Ferreira, companheira de pesquisa, pelo apoio e colaboração nos momentos de angústia e dúvidas; Aos amigos que encontrei no Laboratório de Bactérias Enteropatogênicas e Microbiologia de Alimentos da UFF, vulgo LABAC: Lavicie Arais, Cecília Guimarães, Raphael Azevedo, Davi Alves da Costa, Guilherme Barandas e Prof a Marcia Xavier por onze meses de trabalho repletos de amizade, companheirismo e cumplicidade, nos bons e maus momentos; À amiga Esther Helena Prado, pela amizade, apoio e colaboração no LABAC; Aos colegas do grupo de hemoparasitos Alexandre Garcia, Tatiana Didonet e Leticia Maia pelos controles positivos e primers ; Ao Prof. Dr. Rodolfo Mattos Albano (UERJ) pelo auxílio na extração de DNA; À colega Tatiana, Laboratório de Virologia da UFF, pelo auxílio nas análises do sequencimento dos produtos da PCR; Aos professores e colegas da pós-graduação e do Laboratório Clínico da UFF; Às fundações de fomento CNPq, FAPERJ e CAPES, as quais possibilitaram a realização desta pesquisa, meus sinceros agradecimentos.

vii RESUMO As hemoparasitoses vêm sendo comumente descritas em animais domésticos. Estudos recentes revelam que canídeos e felídeos selvagens podem ser parasitados por vários hemoparasitos comuns aos animais domésticos alem de tornarem-se reservatórios naturais. Este trabalho visou descrever a ocorrência de hemoparasitos em canídeos e felídeos selvagens cativos, pertencentes à Fundação RIOZOO e observar as diferenças do diagnóstico microscópico através de esfregaço de sangue periférico e a técnica de PCR. Foram coletadas amostras de sangue periférico (ponta de orelha) dos felídeos e canídeos selvagens para confecção de lâminas de microscopia que, após coloração com corante Wright, foram analisadas em microscopia óptica quanto à presença de hemoparasitos. Amostras de sangue total destes animais também foram coletadas para ensaios de PCR para pesquisa de hemoparasitos, além da realização de hemograma completo e bioquímica sérica (uréia, creatinina, AST, ALT e glicose). Os dados encontrados foram submetidos a análises estatísticas e comparados com informações pré-existentes. Três amostras de felídeos apresentaram formas intraeritrocitárias de piroplasmas indistinguíveis entre Cytauxzoon e Babesia. Cinco amostras de felídeos estavam positivas para Cytauxzoon felis e Babesia canis nos ensaios de PCR. O sequenciamnto genético confirmou que todas as amostras positivas eram de Cytauxzoon felis. Os resultados dos exames laboratoriais indicam que Cytauxzoon felis pode estar presente em felídeos selvagens cativos sem demonstrar alterações hematológicas ou bioquímicas séricas. Concluiu-se que Cytauxzoon felis está presente na população cativa de felídeos do Jardim Zoológico da Cidade do Rio de Janeiro; para a pesquisa de hemoparasitos em canídeos e felídeos selvagens os ensaios moleculares são métodos mais sensíveis do que a análise morfológica de esfregaço sanguíneo e, que resultados dos ensaios da PCR devem ser confirmados com o sequenciamento genético em estudos de piroplasmídeos como C. felis e B. canis. Palavras-chave: Hemoparasitos, Cytauxzoon felis, PCR, sequenciamento genético, felídeos e canídeos selvagens.

viii ABSTRACT The hemoparasitosis have been commonly described in domestic animals. Recent studies show that wild dogs and cats can be infected by various blood parasites common to domestic animals besides becoming natural reservoirs. This study aimed to describe the occurrence of blood parasites in captive wild canids and felids belonging to the RIOZOO Foundation and observe the differences of the microscopic diagnosis by peripheral blood smear and PCR. Samples were collected from peripheral blood (ear tip) of wild canids and felids for making that microscope slides, stained with Wright's stain were examined under an optical microscope for the presence of blood parasites. Whole blood samples from these animals were also collected for testing the PCR for blood parasites, and the realization of complete blood count and serum biochemistry (urea, creatinine, AST, ALT and glucose). The data were subjected to statistical analysis and compared with pre-existing. Three samples of wild cats showed intraerythrocytic forms of piroplasmas indistinguishable between Cytauxzoon and Babesia. Five samples of felids were positive for Cytauxzoon felis and Babesia canis in the PCR test. The genetic sequenciament confirmed all positive samples were Cytauxzoon felis. The laboratory results indicate that Cytauxzoon felis may be present in captive wild felids without showing hematological or serum biochemistry. It was concluded that Cytauxzoon felis is present in the captive population of wild cats from the Zoo of Rio de Janeiro, for the detection of blood parasites in captive wild felines and dogs from Rio de Janeiro molecular testing methods are more sensitive than morphological analysis of blood smears, and that the PCR test results should be confirmed with the genetic sequencing studies of how piroplasmids Cytauxzoon felis and Babesia canis. Keywords: Blood parasites, Cytauxzoon felis, PCR, genetic sequencing, wild cats and canids.

ix SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS... p. xi LISTA DE TABELAS... p. xii LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS... p. xiii 1. INTRODUÇÃO... p. 15 2. REVISÃO DE LITERATURA... p. 18 2.1. Hemoparasitos da Família Anaplasmataceae... p. 18 2.1.1. Histórico e etiologia... p. 18 2.1.2. Distribuição geográfica... p. 20 2.1.3. Transmissão... p. 21 2.1.4. Ciclo biológico... p. 22 2.1.5. Aspectos clínicos da doença... p. 24 2.1.6. Diagnóstico... p. 26 2.1.7. Tratamento e Prevenção... p. 35 2.1.8. Hemoparasitos da Família Anaplasmataceae e animais selvagens... p. 35 2.2. Babesia spp.... p. 41 2.2.1. Histórico e etiologia... p. 41 2.2.2. Distribuição geográfica... p. 42 2.2.3. Transmissão... p. 45 2.2.4. Ciclo biológico... p. 47 2.2.5. Aspectos clínicos da doença... p. 48 2.2.6. Diagnóstico... p. 50 2.2.7. Tratamento e Prevenção... p. 55 2.2.8. Babesia spp. e animais selvagens... p. 57 2.3. Micoplasmas hemotrópicos... p. 63 2.3.1. Histórico e etiologia... p. 63 2.3.2. Distribuição geográfica... p. 67 2.3.3. Transmissão... p. 68 2.3.4. Ciclo biológico... p. 71 2.3.5. Aspectos clínicos da doença... p. 72 2.3.6. Diagnóstico... p. 75 2.3.7. Tratamento e Prevenção... p. 78 2.3.8. Micoplasmas hemotrópicos e animais selvagens... p. 79 2.4. Cytauxzoon spp. e Theilleria spp... p. 81 2.4.1. Histórico e etiologia... p. 81 2.4.2. Distribuição geográfica... p. 82 2.4.3. Transmissão... p. 84 2.4.4. Ciclo biológico... p. 86 2.4.5. Aspectos clínicos da doença... p. 87 2.4.6. Diagnóstico... p. 88 2.4.7. Tratamento e Prevenção... p. 91 2.4.8. Cytauxzoon spp. e Theilleria spp. e animais selvagens... p. 92 3. MATERIAL E MÉTODOS... p. 98 3.1. Tamanho da amostra e origem dos animais... p. 98 3.2. Coleta de material... p. 100 3.3. Processamento das amostras... p. 102

x 3.3.1. Confecção de esfregaços sanguíneos com sangue capilar... p. 102 3.3.2. Hemogramas... p. 102 3.3.3. Dosagens bioquímicas... p. 103 3.3.4. Extração de DNA genômico... p. 103 3.3.5. Ensaios de PCR das amostras de felídeos e canídeos para amplificação de seqüências genéticas de hemoparasitos... p. 103 3.3.6. Preparo das misturas das PCR... p. 105 3.3.7. Condições das PCR... p. 105 3.3.8. Visualização dos resultados da PCR... p. 107 3.3.9. Sequenciamento dos produtos da PCR... p. 107 3.4. Análise filogenética das amostras... p. 108 3.5. Análise estatística... p. 108 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO... p. 109 4.1. Felídeos... p. 109 4.1.1. Pesquisa morfológica da ocorrência de hemoparasitos... p. 109 4.1.2. Pesquisa molecular da ocorrência de hemoparasitos... p. 112 4.1.2.1. Família Anaplasmataceae... p. 112 4.1.2.2. Micoplasmas hemotrópicos... p. 113 4.1.2.3. Piroplasmas... p. 114 4.1.2.3.1. Babesia e Theilleria... p. 114 4.1.2.3.2. Cytauxzoon felis... p. 116 4.1.3. Resultados do Sequenciamento dos produtos da PCR... p. 118 4.1.4. Comparação dos métodos diagnósticos... p. 120 4.1.5. Alterações clínicas... p. 120 4.1.6. Presença de ectoparasitos... p. 121 4.1.7. Avaliação laboratorial... p. 122. 4.1.7.1. Parâmetros hematológicos... p. 122 4.1.7.2. Parâmetros bioquímicos e proteínas plasmáticas... p. 123 4.2. Canídeos... p. 126 4.2.1. Pesquisa morfológica da ocorrência de hemoparasitos... p. 126 4.2.2. Pesquisa molecular da ocorrência de hemoparasitos... p. 126 4.2.3. Alterações clínicas... p. 127 4.2.4. Presença de ectoparasitos... p. 127 4.2.5. Avaliação laboratorial... p. 128 4.2.5.1. Parâmetros hematológicos... p. 128 4.2.5.2. Parâmetros bioquímicos e proteínas plasmáticas... p. 128 5. CONCLUSÕES... p. 131 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... p. 132 7. ANEXOS... p. 170 Anexo 1: Autorização do IBAMA para atividades com finalidade científica (Licença do SISBIO)... p. 171 Anexo 2: Certificado de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa Animal (CEPA) da Universidade Federal Fluminense (UFF)... p. 173

xi LISTA DE FIGURAS Figura 1: Figura 2: Figura 3: Figura 4: Figura 5: Figura 6: Croqui dos recintos de exposição dos animais do Jardim Zoológico da cidade do Rio de Janeiro (Fundação RIOZOO). Destaca-se na coloração vermelha um grupo de recintos destinados aos felídeos e na coloração amarelada, os destinados aos canídeos. Demonstração: 2.1- da coleta de sangue da veia jugular de um espécime de Leopardus tigrinus. 2.2 - da coleta de sangue da veia cefálica de um espécime de Chrysocyon brachyurus. 2.3- do armazenamento de cada amostra de sangue total em dois tubos microtubos estéreis contendo anticoagulante EDTA. 3.1- Obtenção da primeira gota de sangue capilar em um espécime de Leopardus tigrinus. 3.2 - Esfregaços sanguíneos de sangue capilar de um espécime de Leopardus tigrinus. Esfregaço sanguíneo com forma intraeritrocítica de piroplasma (indicada por seta) parasitando hemácia de um exemplar macho de Panthera onca pertencente à Fundação RIOZOO. Coloração: Giemsa. Aumento: 1000X. Resultados obtidos para a amplificação por PCR de uma porção do gene codificador 18S do RNA ribossomal de Babesia canis ( 400 pb). (5) Marcador de peso molecular - 100 bp DNA Ladder; (1) Controle positivo para Babesia canis; (8) Controle negativo para Babesia canis; (6) Amostra negativa para Babesia canis; (2,3,4,7) Amostras positivas para Babesia canis. Resultados obtidos para a amplificação por PCR de uma porção do gene codificador 18S do RNA ribossomal de Cytauxzoon felis ( 284 pb). (7) Marcador de peso molecular - 100 bp DNA Ladder; (1,12) Controles positivos para C. felis; (13) Controle negativo para C. felis; (2,3,4,5) Amostras negativas para C. felis; (6,8,9,10,11) Amostras positivas para C. felis. p. 100 p. 101 p. 101 p. 110 p. 115 p. 116

xii LISTA DE QUADROS E TABELAS Quadro 1: Relação das espécies e número de espécimes das amostras coletadas de felídeos provenientes do Jardim Zoológico da Cidade do Rio de Janeiro, RJ. Quadro 2: Relação das espécies e número de espécimes das amostras coletadas de canídeos provenientes do Jardim Zoológico da Cidade do Rio de Janeiro, RJ. p. 99 p. 99 Tabela 1: Tabela 2: Tabela 3: Descrição do número de amostras das espécies de felídeos provenientes do Jardim Zoológico da cidade do Rio de Janeiro, RJ e os resultados do número de espécimes positivos e negativos nos ensaios de PCR para a ocorrência de infecções por Babesia canis. Descrição do número de amostras das espécies de felídeos provenientes do Jardim Zoológico da cidade do Rio de Janeiro, RJ e os resultados do número de espécimes positivos e negativos nos ensaios de PCR para a ocorrência de infecções por Cytauzxoon felis. Porcentagem de infestação por ectoparasitos (pulgas) por espécies de felídeos selvagens cativos do Jardim Zoológico da Cidade do Rio de Janeiro, RJ. p. 117 p. 118 p. 122 Tabela 4: Valores hematológicos (Média, mínimos e máximos) encontrados nas amostras de felídeos selvagens pertencentes à Fundação RIOZOO e parâmetros de normalidade descritos na literatura. p. 124 Tabela 5: Tabela 6: Valores bioquímicos e proteínas plasmáticas (Média, mínimos e máximos) encontrados nas amostras de felídeos selvagens pertencentes à Fundação RIOZOO e parâmetros de normalidade descritos na literatura. Porcentagem de infestação por ectoparasitos (pulgas) por espécies de canídeos selvagens cativos do Jardim Zoológico da Cidade do Rio de Janeiro, RJ. p. 125 p. 128 Tabela 7: Valores hematológicos (Média, mínimos e máximos) encontrados nas amostras de canídeos selvagens pertencentes à Fundação RIOZOO e parâmetros de normalidade descritos na literatura. Tabela 18: Valores bioquímicos e proteínas plasmáticas (Média, mínimos e máximos) encontrados nas amostras de canídeos selvagens pertencentes à Fundação RIOZOO e parâmetros de normalidade descritos na literatura. p. 129 p. 130

xiii LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS L M χ 2 AIF AIDS ALT AST CID CPDA-1 DNA DNNE dntp Dr. Dr. a EDTA EUA FA FeLV FIV fl g/dl GGT Hb IFI IgG IgM LE LG M mg/dl mg/kg MgCl 2 min mm mm 3 n o Microlitro Micromolar Qui-quadrado Anemia Infecciosa Felina Síndrome da Imunodeficiência adquirida Alanina aminotransferase Aspartato aminotransferase Coagulação intravascular disseminada Citrato-fosfato-dextrose-adenina Ácido desoxirribonucléico Desvio Nuclear de Neutrófilos à Esquerda Trifosfatos desoxirribonucleosídeos Doutor Doutora Ácido etileno diamino tetracético Estados Unidos da América Fosfatase alcalina Vírus da leucemia felina Vírus da imunodeficiência felina Fentolitro Gramas por decilitro Gama glutamiltransferase Hemoglobina Imunofluorescência indireta Imunoglobulina G Imunoglobulina M Leucometria específica Leucometria global Molar Miligrama por decilitro Miligrama por quilograma Cloreto de magnésio Minuto Milimolar Milímetro cúbico Número p. Página pb Pares de base

PCR Do inglês Polymerase Chain Reaction, reação em cadeia da polimerase ph Potencial hidrogeniônico PPT Proteínas plasmáticas totais PR Paraná Prof. Professor(a) RFLP Do inglês Restriction Fragment Lenght Polymorphism, polimorfismo de comprimentos de fragmentos de restrição RJ Rio de Janeiro RNA Ácido ribonucléico rrna RNA ribossomal RT-PCR Do inglês real temi-pcr, PCR em tempo real s Segundos SP São Paulo SPF Do inglês Specific-pathogen-free Taq Thermophilus aquaticus U Unidade internacional de medida U/L Unidades por litro UFF Universidade Federal Fluminense UFRRJ Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro UNESP Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho USP Universidade de São Paulo VG Volume globular VGM Volume globular médio Marca registrada TM Do inglês Trade Mark xiv

15 1. INTRODUÇÃO O estudo do papel das doenças constitui um eixo importante das estratégias para a conservação de animais selvagens, seja em ambiente natural ou de cativeiro. Estudos ecológicos reconhecem as doenças como fatores regulatórios de populações naturais, embora os fatores envolvidos nestas cadeias regulatórias raramente sejam conhecidos. Animais mantidos em cativeiro são acometidos, frequentemente, por doenças de causas nem sempre elucidadas, o que geralmente requer um diagnóstico etiológico para que medidas terapêuticas e profiláticas possam ser tomadas (FILONI, 2006). Considerando-se que muitas espécies das famílias Felidae e Canidae encontram-se ameaçadas de extinção, que os habitats reduzem-se progressivamente e que há um número considerável de felídeos e canídeos mantidos em cativeiro, torna-se necessário conhecimento acumulado e sua aplicabilidade imediata para resolver questões referentes à saúde destas famílias para sua conservação. No Brasil, país de clima tropical, que favorece a manutenção de vetores como os carrapatos, as hemoparasitoses têm sido descritas em quase todo seu território. As possibilidades atuais de transporte rápido de animais domésticos e tráfico de animais selvagens entre diferentes cidades e habitats, propiciam a instalação de novos patógenos e vetores de doenças a áreas não endêmicas. A degradação de ecossistemas que vêm ocorrendo podem influenciar a prevalência e a patogenia de

16 hemoparasitas, podendo ocorrer novas cepas e/ou espécies mais patogênicas ou menos adaptadas (AGUIRRE, 2009). As hemoparasitoses, desde a descrição dos primeiros casos no Brasil, no início da década de 70, com um relato de infecção por Ehrlichia canis em Belo Horizonte, vêm sendo descritas comumente em cães domésticos (COUTO, 1998; ALMOSNY e MASSARD, 2002). Infecções por hemoplasma em gatos domésticos têm sido diagnosticadas em todo o mundo. As hemoparasitoses mais importantes são as hemoplasmoses, anaplasmoses, ehrlichioses, neorickettsioses, cytauxzoonoses, babesioses e bartoneloses (REINE, 2004). Estudos realizados até o momento revelam que canídeos e felídeos selvagens podem ser parasitados por vários hemoparasitos comuns aos animais domésticos e a outras espécies selvagens (VAN HEERDEN, 1979; KIER et al., 1982; ROHER et al., 1983; RUAS et al., 2003). Em felinos selvagens, as hemoparasitoses estão comumente associadas ao vírus da imunodeficiência felina, ao vírus da leucemia felina ou a peritonite infecciosa felina (HAEFNER et al., 2003). Os animais selvagens são descritos como possíveis reservatórios naturais de hemoparasitos sem apresentarem sinais clínicos e, em situações de estresse, privação ou imunodeficiência podem desenvolver a doença e chegar até ao óbito (EWING et al., 1964; PRICE e KARSTAD, 1980; CHANG et al., 2000). Assim, canídeos selvagens podem servir como excelentes sentinelas de patógenos emergentes (AGUIRRE, 2009). Embora já exista de fato conhecimento acumulado na literatura científica sobre animais selvagens, muitos dados ou relatos não são extensivos o suficiente para cobrir as diversas populações ou permitir uma correta avaliação clínica em casos de doenças. Tratados individualmente ou como populações, a abordagem clínica ou terapêutica de animais selvagens, deve se fundamentar em dados epidemiológicos e laboratoriais (FILONI, 2006). Entretanto, no caso de hemoparasitos, sua epidemiologia e transmissão ainda são pouco compreendidas (WILLI et al, 2007), porém é sabido que são agentes causadores de anemias e trombocitopenias de muitas espécies de mamíferos (REINE et al, 2004). Sendo assim, estudos baseados em diagnósticos mais precisos são importantes para

17 elucidar algumas questões relacionadas à infecção de animais selvagens por parasitos sanguíneos. A ocorrência de infecções em animais selvagens por hemoparasitos vem sendo até agora, enfocada superficialmente (WILLI et al., 2007). Em ambiente natural, mamíferos selvagens percorrem extensos territórios em busca de alimento e abrigo. Consequentemente estão expostos a uma ampla gama de patógenos presentes nos ambientes ou provenientes de seus contactantes, sejam eles presas, outros competidores, elementos de sua própria espécie e muito recentemente, em termos biogeográficos e evolutivos, também animais domésticos. Muitos zoológicos e criadouros possuem animais errantes, principalmente gatos domésticos, que habitam áreas comuns ou próximas aos recintos de exposição de mamíferos selvagens. Assim, esta pesquisa visou o estudo da ocorrência de hemoparasitos em felídeos e canídeos cativos do Jardim Zoológico da Cidade do Rio de Janeiro (Fundação RIOZOO) por meio de avaliação microscópica direta de lâmina de esfregaço de primeira gota de sangue periférico e amplificação de DNA extraído de sangue total pela reação de PCR, observando as diferenças dos métodos diagnósticos e achados laboratoriais da fauna hemoparasitária em animais selvagens cativos da Cidade do Rio de Janeiro.

18 2. REVISÃO DE LITERATURA 2.1. Hemoparasitos da Família Anaplasmataceae 2.1.1. Histórico e etiologia: O primeiro microrganismo do gênero Ehrlichia foi descoberto na Argelia por DONATIEN e LESTOQUARD em 1935 em cães infestados com o carrapato Rhipicephalus sanguineus, que desenvolveram, ocasionalmente, uma acentuada doença febril. Tais manifestações foram atribuídas a um microrganismo aparentemente transmitido pelo carrapato, o qual recebeu o nome de Rickettsia canis. Em 1945, Rickettsia foi renomeada como E. canis (RISTIC e HUXSOLL, 1984). Em 1957 foi relatada na America do Norte e em 1986 foi observado um caso na America do Sul, no Brasil, por COSTA et al (MUNHOZ e BABO, 1998). A doença causada por este agente já recebeu vários nomes como erliquiose canina, febre hemorrágica canina, síndrome hemorrágica idiopática, doença do cão rastejador, pancitopenia tropical canina (HUXSOLL et al., 1972) e doença do cão de pista (MUNHOZ e BABO, 1998). O primeiro caso no Novo Mundo foi descrito em cães nas Antilhas Holandesas (BOOL e SUTMÖLLER, 1957 apud EWING, 1969). Nos Estados Unidos, o primeiro caso foi descrito por EWING em 1963 que ao examinar inclusões em leucócitos de cães parasitados por Babesia canis visualizou estruturas características de E. canis. (EWING, 1969).

19 Poucos relatos têm sido efetuados a respeito de ehrlichiose em gatos. Entretanto, todos os autores concordam em relação aos sintomas e aconselham que esta doença deva ser considerada no diagnóstico diferencial, quando observamos anemia nestes animais (BUORO et al., 1989; BEAUFILS et al., 1995; BOULOY et al., 1994, ALMOSNY et al., 1998). Em 1986, CHARPENTER e GROULADE, descreveram na França um provável caso de ehrlichiose em um gato. O primeiro relato de ehrlichiose no Brasil ocorreu em 1973 na Cidade de Belo Horizonte, em Minas Gerais (COSTA et al., 1973). No Rio de Janeiro só foi descrita em 1976 acometendo cães da Polícia Militar do Estado (CARRILLO et al., 1976). No sul do Brasil em 1985 foi descrito um caso em Santa Maria no Estado do Rio Grande do Sul (SILVA et al., 1985). Atualmente, autores relatam que esta doença vem sendo descrita com freqüência em vários locais do território brasileiro (ALMOSNY et al., 1998; ALMOSNY e MASSARD, 2002). Segundo CALIC et al. (2004), a febre maculosa brasileira (FMB rickettsioses) é a mais comum e mais reconhecida rickettsiose humana no Brasil. Até a década de 80, agentes etiológicos da doença conhecida como Ehrlichiose canina foram alocados na tribo Ehrlichiae (RISTIC e HUXSOLL, 1984). Em 1991, RIKIHISA et al. revisaram esta classificação e acrescentaram algumas novas espécies, desconhecidas até então. Posteriormente, com base no sequenciamento de uma porção do gene codificador da unidade 16S do RNA ribossomal do parasito, tornou-se possível o agrupamento das espécies da tribo Ehrlichieae em três genogrupos distintos (ANDERSON et al., 1991). Esses grupos foram formados levando-se em consideração as primeiras espécies identificadas de cada grupo, assim formou-se o genogrupo E. canis, E. phagocytophila, e E. sennetsu (DUMLER et al., 1995; WALKER e DUMLER, 1996; POPOV et al., 1998; RIKIHISA, 2000). Análises genéticas mais recentes dos genes codificadores da unidade 16S RNAr, genes de proteínas de superfície e análise genética da proteína de choque térmico groesl indicaram que as designações taxonômicas apresentavam falhas, dentro dos gêneros Anaplasma, Ehrlichia, Cowdria, Neorickettsia e Wolbachia. (DUMLER et al., 2001). Assim, uma nova classificação foi proposta e todos os membros das tribos Ehrlichieae e Wolbachieae foram

20 transferidos para a família Anaplasmataceae, e a estrutura tribal da família Rickettsiaceae foi eliminada. O gênero Anaplasma foi corrigido para incluir a espécie Anaplasma phagocytophila (englobando as espécies E. phagocytophila, E. equi e o agente da ehrlichiose granulocítica humana), a espécie A. platys e a espécie A. bovis foram criadas em substituição às espécies Ehrlichia platys e Ehrlichia bovis respectivamente. O gênero Ehrlichia foi corrigido para incluir a espécie Ehrlichia ruminantium no lugar de Cowdria ruminantium, assim como o gênero Neorickettsia, para a inclusão das espécies Neorickettsia risticii no lugar da Ehrlichia risticii; e Neorickettsia sennetsu no lugar de Ehrlichia sennetsu. A espécie A. phagocytophila teve seu nome corrigido para A. phagocytophilum e as a espécies A. bovis e A. platys, foram propostas como novas combinações para E. bovis e E. platys (DUMLER et al., 2001). 2.1.2. Distribuição geográfica: A doença associada a estes hemoparasitos ocorre em países de clima temperado, subtropical e tropical e tem sido relatada em todos os continentes (ALMOSNY e MASSARD, 2002). Sua distribuição geográfica é bastante ampla, já descrita nos Estados Unidos, Europa, África do Sul, América do Sul e Ásia (SKOTARCZAK, 2003). No Brasil, verifica-se uma maior freqüência de E. canis no Nordeste e Centro- Oeste (BORBA et al., 2002; LABARTHE et al., 2003), e menor em Estados de clima mais temperado como o Paraná, onde chega a 4,7% (LABARTHE et al., 2003). Um estudo realizado por CARLOS et al., em 2007, que objetivou avaliar a freqüência de anticorpos anti-e. canis, nas cidades de Ilhéus e Itabuna, microrregião Ilhéus- Itabuna, Bahia, e verificar se existe diferença entre os dois municípios, comentou, baseado nos seus resultados e na comparação deste com outros estudos, que alguns fatores como tipo de amostragem, tamanho das amostras e sensibilidade.podem influenciar nos resultados de freqüências deste patógeno. Para LABARTHE et al., 2003, as diferenças de reagentes para E. canis, entre os estados

21 do Nordeste e do Sul, podem estar relacionadas a uma melhor adaptação e, conseqüentemente ao maior número de carrapatos em climas quentes e úmidos, do que em climas temperados. Novas doenças transmitidas por carrapatos, como a Anaplasmose Granulocítica Humana (HGA) e a Ehrlichiose Monocítica Humana (HME), têm sido descritas em muitos países. Infecções humanas por Ehrlichia chaffeensis foram relatadas na América do Norte, Ásia e Europa (COSTA et al., 2006). 2.1.3. Transmissão: Ehrliquiose ou Anaplasmose é uma zoonose emergente causada por bactérias intracelulares obrigatórias provenientes dos gêneros Anaplasma, Ehrlichia e Neorickettsia, presentes no ambiente através de interações entre hospedeiros vertebrados e invertebrados (ANDRE et al., 2009a). É uma doença causada por microorganismos gram-negativos, intracelulares obrigatórios e apresentam como vetores principais os carrapatos (MADEWELL et al., 1982; EWING et al., 1997; INOKUMA et al., 2001). Segundo HOSKINS, 1991, E. canis é a espécie de maior prevalência entre os cães, sendo também considerada a mais virulenta. A transmissão ocorre entre cães principalmente através do carrapato Rhipicephalus sanguineus (GROVES et al., 1975; WOODY e HOSKINS, 1991; RIKIHISA, 1991; NEER, 1998; BREITSCHWERDT, 2000). Outro provável vetor de E. canis é o carrapato Dermacentor variabilis, uma vez que a infecção experimental de cães por E. canis utilizando-se este carrapato como vetor foi obtida com êxito (JOHNSON et al., 1998). Ehrlichia canis também pode ser transmitida através de transfusões sanguíneas (WOODY e HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1998; BREITSCHWERDT, 2000) Isso foi acompanhado com sangue de cães cronicamente infectados por E. canis por mais de cinco anos, havendo então implicações óbvias para cães doadores de sangue em áreas endêmicas. (BREITSCHWERDT, 2000).

22 Doenças transmitidas por vetores artrópodes são mundialmente importantes para a saúde humana e animal, pois são patogênicas para animais e humanos (KAKOMA e MEHLHORN, 1994; WANER e DAWSON, 1996; DAGNONE et al., 2001) e se mantém através de um ciclo enzoótico entre a fauna silvestre e carrapatos sugadores de sangue. Doenças humanas como a Anaplasmose Granulocítica Humana (HGA) e a Ehrlichiose Monocitica Humana (HME) são transmitidas por carrapatos ixodídeos (CALLIC et al., 2004). Animais assintomáticos podem servir de reservatórios e serem responsáveis pela transmissão dos microrganismos para humanos (MURPHY et al., 1998). 2.1.4. Ciclo biológico: Ehrlichia canis é um microorganismo intracelular obrigatório, gram-negativo, transmitido principalmente pelo carrapato marrom do cão doméstico R. sanguineus. Tem um ciclo de vida complexo envolvendo carrapatos e é mantido na natureza por infecções persistentes em canídeos selvagens (GROVES et al., 1975). Vários fatores se relacionam com a disseminação da doença, principalmente os que favorecem a proliferação do carrapato transmissor (DUMLER et al., 1995). O carrapato vermelho vetor do cão geralmente se torna infectado após ingerir sangue contaminado com leucócitos infectados por E. canis (WOODY e HOSKINS, 1991), o microrganismo se multiplica nos hemócitos e em células da glândula salivar, podendo penetrar no intestino infectando o epitélio do mesmo (SMITH et al., 1976) e infecta cães no momento do repasto sanguíneo, quando inocula sua secreção salivar contaminada no local da picada (GROVES et al., 1975). A transmissão do cão para o carrapato é mais fácil de acontecer durante as 2-3 primeiras semanas pós-infecção no cão. Isto acontece porque os leucócitos contaminados são mais prevalecentes na circulação durante os estádios iniciais da infecção (WOODY e HOSKINS, 1991). Uma vez infectado, ocorre transmissão transestadial no carrapato, e a transmissão para cães pode ocorrer em qualquer um dos

23 estágios do carrapato durante 155 dias (LEWIS et al., 1975). A transmissão entre carrapatos é estritamente trans-estadial (NEER, 1998). Os microrganismos quando vistos individualmente são chamados de corpúsculos elementares. Essas estruturas entram nos monócitos caninos por fagocitose, porém não ocorre formação do fago-lisossoma na célula infectada e os corpúsculos elementares começam a crescer e se dividir por divisão binária. Entre os dias três e cinco pós-infecção, um pequeno número de corpúsculos elementares aglomerados é observável como inclusão pleomórfica chamadas de corpúsculos iniciais. Durante os sete a doze dias subseqüentes ocorrem replicações e um crescimento adicional, e os corpúsculos iniciais passam a serem inclusões maduras, sendo então denominadas mórulas. A mórula é a estrutura característica que identifica o gênero Ehrlichia. (MCDADE, 1990) que é encontrada principalmente em monócitos de hospedeiros mamíferos (EWING, 1965; SIMPSON, 1972; HILDEBRANDT et al.,1973). A patogenia da Ehrlichiose Monocítica Canina envolve um período de incubação que dura de oito a vinte dias (HARRUS et al., 1997). O período de incubação é seguido de três fases identificadas através das alterações clínicopatológicas que provocam as fases: aguda, subclínica e, em alguns casos, crônica. (RIKIHISA, 1991; WOODY e HOSKINS, 1991; HARRUS et al., 1997; NEER, 1998; BREITSCHWERDT, 2000) As seguintes espécies do gênero Ehrlichia já foram descritas no mundo todo causando infecções naturais em cães domésticos: E. canis (DONATIEN e LESTOQUARD, 1935); E. platys (HARVEY et al., 1978); E. risticii (KAKOMA et al., 1994); E. ewingii (ANDERSON et al., 1992); E. chaffeensis (DAWSON et al., 1992; BREITSCHWERDT et al., 2000); E. phagocytophila (JOHANSSON et al., 1995); E. equi (LEWIS et al., 1975; MADEWELL et al., 1982) e o agente da ehrlichiose granulocítica humana (HGE) (GREIG et al., 1996).

24 2.1.5. Aspectos clínicos da doença: As espécies do gênero Ehrlichia que infectam cães incluem algumas que freqüentemente causam doença clínica e outras que aparentemente causam uma doença mais branda ou assintomática e assim, podem servir de reservatórios e serem responsáveis pela transmissão dos microrganismos para humanos (MURPHY et al., 1998). Estudos realizados nas regiões de Barra do Piraí e Maricá, Cidades do Rio de Janeiro, identificaram animais positivos para E. canis na PCR sem sinais evidentes de doença clínica (FONSECA, 2008; VELHO, 2009). A doença em cães normalmente se apresenta em três fases: a aguda, a subclínica e a crônica (TROY e FORRESTER, 1990; SKOTARCZAK, 2003). O tipo de doença produzida difere com as espécies de organismos e de hospedeiros (MUNHOZ e BABO, 1998). Em um estudo, realizado por MUNHOZ e BABO em 1998, foram observados que os principais sintomas encontrados em animais com diagnósticos clínicos ou laboratoriais para ehrlichiose eram febre, mucosas pálidas, epistaxe, secreção ocular e nasal, hemorragias, hepatoesplenomegalia, dificuldade de locomoção, incoordenação e edema generalizado. Com um tratamento adequado os cães se recuperam bem não indo para a outra fase. Quando não tem um tratamento adequado acabam evoluindo para a fase subclínica ficando assintomáticos durante meses e até anos (EWING, 1965). Os cães que não conseguem eliminar o microorganismo evoluem para a fase crônica da doença que é a mais grave. O animal apresenta aplasia medular, pancitopenia, diminuição da resposta ao tratamento, hemorragias e morte (COHN, 2003). Alterações dermatológicas como queda de pêlo generalizada, áreas focais de alopecia e lesões de formato arredondado devido a presença de fungos como Aspergillus niger e Penicillium podem ser observadas decorrentes de imunodepressão e alterações imunomediadas acarretadas pelo parasito (WERMELINGER et al., 1999). As condições que levam a doença a ter esse curso grave e, muitas vezes, fatal ainda não foram elucidadas. Acredita-se que algumas raças apresentem uma forma mais severa da doença (NYINDO et al., 1980; HARRUS et al., 1997), e que infecções associadas a outros hemoparasitas também transmitidos por carrapatos podem

25 colaborar com a severidade da doença (MYLONAKIS et al., 2004). Outra hipótese pouco estudada é a possibilidade de variedades diferentes de E. canis estarem relacionadas com a apresentação clínica do paciente (HEGARTY et al., 1997; HARRUS et al., 1999). Em estudo descrito por ORIÁ et al. em 2008 para detectar os sintomas oftalmológicos da Ehrlichiose demonstrou que existe uma alta correlação entre a uveíte clínica e sorologia positiva para E. canis. Poucos relatos têm sido feitos a respeito da erliquiose em felinos domésticos cujos sinais clínico-laboratoriais são semelhantes aos da erliquiose canina (BEAUFILS et al., 1995; ALMOSNY e MASSARD, 1999; BEAUFILS et al., 1999; BJOERSDORFF et al., 1999). Gatos experimentalmente infectados por N. risticii apresentam diarréia intermitente, linfadenopatia, depressão aguda e anorexia entre o vigéssimo e o vigéssimo quarto dia após inoculação (DAWSON et al., 1988). Já a infecção por A. phagocytophilum é caracterizada por hiperestesia, mialgias, artralgias, rigidez de pescoço, claudicação, incoordenação, neutrofilia com desvio a esquerda, linfopenia, além dos outros sinais clínico-laboratoriais comuns à erliquiose canina (BJOERSDORFF et al., 1999; TARELLO, 2005). Poucos são os relatos de achados de necropsia em felinos portadores de erliquiose clínica. Sinais de caquexia, emaciação, diarréia, distúrbio congestivo hemorrágico, notavelmente nos pulmões, foram achados anátomo-patológicos em gatos jovens inoculados experimentalmente com E. canis (ALMOSNY e MASSARD, 2002). Observações a partir de biópsias de linfonodos mesentéricos revelaram um infiltrado inflamatório (neutrófilos e macrófagos), caracterizando uma linfadenite piogranulomatosa (BOULOY et al., 1994). No Brasil, ALMOSNY et al. (1998) descreveu um caso de ehlichiose clínica em um gato doméstico com a presença de febre, apatia, anorexia, mucosas pálidas, leve desidratação, além da presença de mórulas características de Ehrlichia sp em linfócitos ao examinar os esfregaços sanguíneos e anemia, normocítica normocrômica e BILLETER et al. (2007) observou também leucopenia no hemograma de felinos dos Estados Unidos.

26 2.1.6. Diagnóstico: Segundo CALIC et al., 2004, é difícil estabelecer o diagnóstico da infecção por Rickettsia spp em humanos pela rotina de métodos microbiológicos, criando uma falsa idéia de que as infecções por Rickettsia e Ehrlichia são raras e sem importância em humanos. O diagnóstico clínico em cães e gatos é difícil de ser feito, pois há muitas outras doenças que apresentam os mesmos sinais e sintomas que podem estar acometendo os cães de forma isolada, ou em conjunto com a infecção por E. canis. (NEITZ e THOMAS, 1938). Perda de peso, anorexia, depressão, fraqueza, febre, hipotermia (e conseqüente choque), dores articulares, hiperestesia, esplenomegalia e anemia regenerativa foram relatadas em animais domésticos que apresentavam hemoparasitoses (COLES, 1986; TILLEY e SMITH, 1997; MEYER e HARVEY, 1998; ALMOSNY et al., 2002). Desta forma, o diagnóstico laboratorial da infecção causada por E. canis é extremamente importante e pode ser feito através da visualização de mórulas de E. canis em mononucleares, detecção de anticorpos contra E. canis ou ainda a amplificação de uma porção do genoma do parasito através da técnica da Reação em cadeia da polimerase (PCR) (BREITSCHWERDT, 2000). O isolamento do agente a partir de cultura de células também poderia ser usado. Este método parece ser o mais sensível e confiável dentre todos os previamente citados, com o parasito podendo ser isolado do sangue de cães experimentalmente infectados a partir de colheitas de sangue efetuadas dois dias após a infecção. Entretanto, o procedimento de reisolamento é pouco prático para uso em laboratórios clínicos quando o objetivo final é apenas o diagnóstico da doença, em função do resultado demorar de quatorze a trinta e quatro dias para ser obtido. Ademais, requer uma estrutura física que torne a cultura de células viável, o que eleva os custos de forma acentuada (IQBAL et al., 1994). Sendo assim, a cultura e o reisolamento do agente são considerados apenas ferramentas de pesquisa. (NEER et al., 2002). As inclusões das espécies do gênero Ehrlichia, porém podem ser caracterizadas de três formas: mórula, descrita como uma colônia arredondada com grânulos que se apresentam como corpúsculos elementares corados em azul escuro

27 pelo método de Giemsa, estruturas amorfas (corpúsculos elementares), arredondadas, de vários tamanhos, podendo ser visualizadas em vacúolos no citoplasma de monócitos e forma granular (corpúsculos iniciais) que é composta de múltiplos grânulos (ALMOSNY e MASSARD, 2002). A visualização de mórulas em mononucleares através da avaliação do esfregaço sangüíneo de sangue periférico ou de aspirados de tecidos constituem um diagnóstico definitivo para infecções causadas por espécies do gênero Ehrlichia. Entretanto, o achado de mórulas é difícil, costuma ocorrer somente na fase aguda da infecção e requer muito tempo e paciência do profissional que estiver avaliando o esfregaço sangüíneo, tendo assim uma baixa sensibilidade e grande ocorrência de falsos negativos. (RIKIHISA, 1991; NEER, 1998). Além disso, poucas células circulantes contêm mórulas, que são achadas em pequeno número. (WOODY e HOSKINS, 1991; IQBAL et al, 1994). Uma medida que pode aumentar a sensibilidade do diagnóstico microscópico é a confecção do esfregaço sangüíneo a partir da primeira gota de sangue periférico (área marginal da orelha, por exemplo). Essa gota contém muito mais leucócitos do que as gotas subseqüentes (NEITZ e THOMAS, 1938). Essa medida foi confirmada por ALMOSNY et al., 1998, que em avaliação experimental observou um maior número de leucócitos mononucleares em relação às gotas seguintes e o número de mórulas foi acentuadamente maior nos esfregaços sangüíneos efetuados com a 1ª gota de sangue. Na fase anterior ao aparecimento de mórulas, a partir do quinto dia após a inoculação, podem ser observadas pequenas inclusões basofílicas em mononucleares, representadas por elementos arredondados e pequenos que diferem das granulações azurófilas porque estes últimos possuem coloração avermelhada. As inclusões foram caracterizadas como sendo os corpúsculos iniciais de E. canis. Devido ao baixo aparecimento de mórulas na circulação, a observação de corpúsculos iniciais pode aumentar, significativamente, a sensibilidade da observação microscópica como forma de diagnóstico de infecção por Ehrlichia sp (ELIAS, 1991). Outro obstáculo do diagnóstico microscópico é saber diferenciar as estruturas observadas. Leishmania donovani, Hepatozoon canis, Babesia canis e Babesia gibsoni fagocitadas, bactérias fagocitadas, plaquetas fagocitadas ou sobrepostas, precipitados de corantes e artefatos sobre os leucócitos podem ser confundidos com estruturas características de Ehrlichia (NEITZ e THOMAS, 1938).

28 Segundo WOODY e HOSKINS, 1991, exames de aspirados teciduais e impressões de amostras de biópsias (especialmente pulmões, linfonodos ou baço) para a procura de inclusões citoplasmáticas foram usados para confirmar o diagnóstico de E. canis, entretanto são pouco úteis nos procedimentos de diagnóstico. De acordo com MYLONAKIS et al., 2003, o uso do diagnóstico citológico através da análise da capa leucocitária e linfonodos pode levar a um diagnóstico definitivo na fase aguda da doença. Em cães com linfoadenopatia periférica, a sensibilidade é relativamente alta, e as mórulas de E. canis, que devem ser diferenciadas das outras estruturas intra-citoplasmáticas, são mais encontradas dentro de linfócitos do que monócitos. Nesse estudo, todos os cães eram positivos para E. canis nos métodos de PCR e de imunofluorescência indireta. Associando os resultados citológicos com os resultados dos dois métodos previamente citados apontou-se uma concordância de 66% quando feito exame citológico da capa leucocitária e de 60,9% quando o exame citológico foi efetuado a partir de linfonodos. Pode ocorrer uma trombocitopenia entre dez e vinte dias pós-infecção e um aumento do número de plaquetas imaturas circulantes, que persiste por toda a doença na maioria dos animais, que é devido à diminuição da meia-vida das plaquetas, resultante de sua destruição, decorrente da estimulação dos sistemas imunológicos e de coagulação e, em parte, devido à resposta inflamatória (ANDEREG e PASSOS, 1999). Um estudo, realizado por ORIÀ et al. em 2008 em cães positivos na sorologia para E. canis, revelou como achados hematológicos na maioria das amostras, uma diminuição de células vermelhas e uma acentuada redução na contagem das plaquetas. A anemia é um achado consistente na maioria dos casos, também sendo descrita por diversos autores. (NEITZ e THOMAS, 1938; HUXSOLL et al., 1972; HOSKINS, 1991; WOODY e HOSKINS, 1991; ALMOSNY et al., 1998, observou que os valores de volume globular médio e da hemoglobina globular média se mantinham dentro dos parâmetros de normalidade, caracterizando assim, uma anemia normocítica normocrômica e um quadro eritrocitário arregenerativo. Entretanto, se houver hemólise concomitante ou perda excessiva de sangue, essa anemia pode ser regenerativa (HOSKINS, 1991).

29 Na fase aguda podem ocorrer aumento nas atividades séricas de ALT (alanina transaminase), fosfatase alcalina, proteínas reativas e glicoproteínas além de aumento da bilirrubina total devido à hemólise intensa e hiperproteinemia devido ao aumento do nível das globulinas (ANDEREG e PASSOS, 1999). RIKIHISA afirmou em 1991 que todos os agentes do gênero Ehrlichia induzem uma resposta humoral, fato este que constitui a base para o diagnóstico sorológico, assim outro método de diagnóstico é a detecção de anticorpos contra E. canis. Técnicas moleculares, como a reação em cadeia da polimerase (PCR), que permitem amplificações de material genômico (DNA), estão sendo cada vez mais utilizadas como importantes métodos complementares aos testes sorológicos e evidências clínicas no diagnóstico das erliquioses em seres humanos e animais. A PCR é uma técnica baseada na síntese enzimática de milhões de cópias de uma parte da fita de DNA alvo. É uma técnica rápida, sensível e específica para detecção de microorganismos (RODRIGUEZ, 1997) e vários estudos demonstram que a PCR é um método efetivo para detecção de riquetsias no sangue de cães (IQBAL et al., 1994; WEN et al.,1997; MURPHY et al., 1998; INOKUMA et al., 2001; CHAE et al., 2003; MACIEIRA et al., 2005; FENOLLAR e RAOULT, 2004; MANNA et al., 2004; VELHO et al., 2009), detecção em material de cultivo celular (DAWSON et al., 1994), diferenciação das espécies infectantes (HANCOCK et al., 2001) e análises filogenéticas (YU et al., 2001; DRANCOURT e RAOULT, 1994). MCBRIDE et al., em 1996 concluíram que a PCR é uma excelente ferramenta para distinguir a infecção crônica dos animais que apenas apresentam anticorpos contra E. canis por exposição ao agente, e enfatizaram que problemas relacionados à sensibilidade inadequada e dificuldade com o diagnóstico diferencial são superados com a PCR. Segundo IQBAL et al., 1994, a PCR é eficaz na detecção de níveis baixos de parasitemia em tecidos de cães. WEN et al., 1997 indicaram a utilização da PCR junto a testes de imunofluorescência indireta para auxílio no diagnóstico de infecção inicial ou avaliação do tratamento. A seqüência do RNA ribossomal (rrna) da subunidade menor do ribossoma procariota varia de uma maneira ordenada através de linhagens filogenéticas, e contém segmentos que são conservados entre espécie, gênero ou reino. Com o uso de oligonucleotídeos iniciadores que anelam diretamente em seqüências

30 conservadas no genoma das Eubactérias, a amplificação de seqüências do gene 16S rrna pela PCR pode ser útil para propósitos de seqüenciamento. Ainda possui uma ampla variedade de aplicações, incluindo a detecção e identificação de patógenos conhecidos ou novos, os quais são difíceis de serem cultivados (LEW e JORGENSEN, 2005). Também, como alguns segmentos do rrna são conservados, enquanto outros são variáveis em diferentes graus, é possível gerar oligonucleotídeos complementares a segmentos que são específicos para qualquer nível da árvore filogenética, do reino às espécies (GIOVANONNI et al., 1998). A utilização de métodos auxiliares moleculares demonstrou ser muito eficaz em um caso de anaplasmose humana que apresentou reação de PCR positiva, porém apresentou resultado soronegativo para este agente por mais de seis meses após a detecção molecular do patógeno (DE LA FUENTE et al., 2005). Outros testes moleculares baseados em reações múltiplas de PCR, denominadas de Multiplex PCR, também têm sido utilizados para facilitar o diagnóstico de co-infecção por agentes da Família Anaplasmataceae (SIRIGIREDDY e GANTA, 2005). As limitações do teste são o custo elevado e risco contaminação de DNA devido à elevada sensibilidade da técnica, por isso é importante manter os cuidados com o procedimento e os controles durante o preparo da reação (FENOLLAR e RAOULT, 2004). O desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) levou a um avanço na detecção de DNA de material colhido in vivo e de cultivo celular (DALY e DOYLE, 2003). Essa técnica, entretanto, não é isenta de falhas. Por exemplo, a presença de moléculas inibidoras em uma reação de PCR pode suprimir a atividade da enzima Taq polimerase e, consequentemente, a amplificação de DNA, levando a resultados falso-negativos (BARBER et al., 1999). O sequenciamento do 16S rrna com finalidade de determinar relações filogenéticas entre bactérias ou a sua distinção a nível de gênero ou espécie tem sido amplamente utilizado. Pequenas diferenças (> 0,5 % para o Gênero Ehrlichia) são significantes no nível de espécie uma vez que este gene rrna é altamente conservado e apresenta mutações em baixas freqüências (ANDERSON et al., 1991). A seqüência de pequenas subunidades do rrna varia de uma maneira ordenada entre linhagens filogenéticas e contém segmentos que são conservados nas

31 espécies, gêneros e ao nível de Reino (WILSON et al., 1990). A reação de Seqüenciamento é também muito importante quando há problema na identificação morfológica, como em citologia do sangue e em problemas de especificidade, quando oligonucleotídeos iniciadores baseados em pequenas subunidades de RNA ribossomal, como o 16S rrna, anelam em amostras com outros agentes erliquiais presentes (HANCOCK et al., 2001). Vários genes erliquiais vêm sendo seqüenciados, como o gene que codifica a enzima Citrato Sintetase (glta), os genes codificadores de proteína de choque térmico (groesl) e genes que codificam proteínas de superfície (DUMLER et al., 2001; INOKUMA et al., 2001). O gene que codifica uma proteína externa de membrana ( Major Surface Protein ) do Anaplasma phagocytophilum, denominada msp-2, foi utilizado para a caracterização molecular das espécies detectadas desse agente em carrapatos Ixodídeos em Portugal (SANTOS et al., 2004). Na África, SARIH et al., 2005 utilizaram gene 16S rrna para detecção e identificação de membros da Família Anaplasmataceae em carrapatos. NAKAGHI et al. (2008) realizaram um estudo comparativo entre métodos de diagnóstico direto e indireto de E. canis em cães com suspeita clínica de erliquiose, verificando que a sorologia associada à nested PCR são as técnicas mais adequadas no diagnóstico definitivo da doença. ORIÁ et al., 2008 observou em sua pesquisa que o teste de imunoensaio (DBELIA) foi mais sensível para o diagnóstico da ehrlichiose que o teste de anticorpo por imunofluorescência indireta (IFATT). IQBAL e RIKIHISA em 1994, utilizou a técnica da PCR pela primeira vez para amplificação do DNA de E. canis extraído de tecidos de animais e revelou que este é um teste altamente sensível e específico na detecção de baixos níveis de E. canis. Os achados de um estudo realizado por HARRUS et al. em 1998 sugerem que o baço é o órgão mais provável de abrigar o parasito E.canis durante a fase subclínica da doença e o ultimo órgão que acomoda o parasitos antes da eliminação, o que pode-se concluir que a PCR de DNA extraído de aspirado esplênico é um método confiável para determinar o estado de portador do parasito. Em um artigo publicado por AGUIAR et al (2008), foi obtido um isolado de Ehrlichia canis a partir de um cão naturalmente infectado com sinais clínicos de erliquiose, oriundo do município de São Paulo, SP, Brasil que foi caracterizado molecularmente pela PCR e