Como que células tronco diferenciam? BMC 0132 BMH5769 EMBRIOLOGIA MOLECULAR Existe alguma conservação evolutiva dos processos embrionários? O que interessa ao embriologista? 1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão? 2. O que estas células PODEM ser? 3. QUANDO elas decidem o que vão ser? Evolução (Evo-Devo) 4. COMO ocorre esta decisão? Ambiente e Especiação (ECO-Devo) 1
Existe uma homologia de sinalização que gera homologia anatômica Por outro lado, como é que são geradas as diferenças entre segmentos do corpo? Drosophila m. ULTRABITHORAX Gallus g. Com Tbx5 ectópico A Biologia do Desenvolvimento explica os bicos dos tentilhões de Galápagos (hellloooo, Darwin?!) https://embriomol.wordpress.com/ www.biocel.icb.usp.br https://embriomol.wordpress.com/ 2
REGRAS A SEREM CUMPRIDAS NAS AULAS PRÁTICAS Material da Prática 1 pinça de relojoeiro tamanho 5 1 tesoura de manicure ROTEIRO de aulas práticas O CUMPRIMENTO DESTAS REGRAS É OBRIGATÓRIO PARA AS AULAS!!!! 1. MELECA E MALOCA NÃO!!! Vocês terão a sua disposição, baldes forrados com saco plástico e papel higiênico. Eles estão aí para que VOCÊ MANTENHA A SUA BANCADA, CHÃO, TETO ETC LIMPOS!! É imprenscidível que a sala esteja limpa no final das aulas,caso contrário o curso perde o direito a aulas práticas. 2. LAVE AS MÃOS. Ovos podem ter Salmonella. Lavem as mãos depois das aulas. 3. LUPAS e MICROSCÓPIOS. Cada dupla é responsável por retirar e guardar as lupas no armário. Use apenas a lupa designada para sua dupla. http://embriomol.wordpress.com Avaliação Teórica As provas teóricas terão duração de 120 minutos e serão dissertativas. Prova substitutiva: substitui provas perdidas pelo aluno, com toda a matéria. Prova em grupo: http://embriomol.wordpress.com Aluno Nota sozinho Nota em grupo A 5,5 5,5 5,5 B 7 5,5 7 C 4 5,5 4 Aluno Nota sozinho Nota em grupo A 5,5 7 5,5 B 7 7 7 C 4 7 4 Aluno Nota sozinho Nota em grupo A 5,5 7,5 6 B 7 7,5 7,5 C 4 7,5 4,5 Nota final Nota final Nota final 3
A avaliação do projeto experimental será feita de duas formas: a proposta escrita e a apresentação oral no final do curso. A proposta escrita do projeto experimental (10pag, fonte 11pt espaço de linha 1,5) deve incluir: Introdução, onde serão descritos os objetivos do projeto, a hipótese a ser comprovada, e uma breve explicação do contexto e significância do projeto. Metodologia, onde deve ser descrito em detalhe o procedimento experimental, o material utilizado, tempo(s) de incubação, método de análise Resultados esperados e discussão. Média Final (soma das notas das 3provas teóricas) + (projeto experimental) 4 Média final = (soma das notas das 3 provas teóricas) + (média do projeto experimental) 4 A apresentação oral do projeto ao final do curso deverá incluir breve introdução da problemática, hipótese formulada e os experimentos propostos para comprovação da hipótese. A avaliação será feita baseada na clareza da apresentação, na compreensão do significado da problemática e da lógica utilizada nos experimentos. Eu Vocês Evolução (Evo-Devo) Ambiente e Especiação (ECO-Devo) Fertilização Externa Externa Externa Interna Interna Desenvol vimento Externo Externo Externo Externo Interno 4
1. Fertilização 2. Clivagem = aumento de número de células 3. Movimentos morfogenéticos = definição da forma 4. Organogênese=Diferenciação celular= Identidade tecidual 5. Crescimento= definição do tamanho CLIVAGEM Objetivo: Multicelular Três folhetos Forma de faríngula Aumento do número de células Espaço para manobra Rearranjo celular CLIVAGEM CLIVAGEM: o mesmo processo em espécies diferentes 1. Ouriço-do-mar 1.Frequência 2. Sincronia 3. Padrão de clivagem As clivagens geram blastômeros (BLÁSTULA) 5
CLIVAGEM: o mesmo processo em espécies diferentes 2. Anfíbio CLIVAGEM: o mesmo processo em espécies diferentes 3. Peixe CLIVAGEM As clivagens ocorrem de forma periódica O período até a gástrula é o de maior divisão celular. Mas.. Quanto tempo tem uma blástula? Anfíbio: 1-37.000 células/43 horas =15 células/min Drosophila:1-50.000/12 horas =70 células/min 6
Na clivagem embrionária, NÃO ocorre G1 e G2, ou seja, há aumento do número celular sem ocorrer crescimento celular Nos animais de desenvolvimento externo: 1) O período imediatamente após a fertilização é seguido de divisões celulares com ciclo celular abreviado ciclo celular abreviado CLIVAGEM 2) Não há tempo para transcrição 3) Dependem de estoques maternos, i.e. presentes no citoplasma do ovo As clivagens ocorrem de SINCRONIZADA (BLÁSTULA) O período até a gástrula é o de maior divisão celular 7
Transição meso-blástula de anfíbios. Velocidade de divisão celular diminui 1. Início da transcrição Zigótica 2. Incorporação dos estágios G1 e G2 3. Perda da sincronicidade de divisão celular Ex.: em Xenopus passa de 30min/ciclo para 4h/ciclo CLIVAGEM 1.Frequência 2. Sincronia 3. Padrão de clivagem Velocidade= ciclo celular abreviado Até a trancrição zigótica (mãe é mãe) E OS MAMÍFEROS? 1.5 DIAS PARA 2 CÉLULAS MÉDIA DE 12h-24h/CICLO CELULAR Fertilização Externa Externa Externa Interna Interna 2,2 h/ciclo no embrião de 6,5 dias Desenvol vimento Externo Externo Externo Externo Interno Farrell et al., Current Biology 2004 8
E OS MAMÍFEROS? As primeiras clivagens são assincrônicas. Como é o ciclo celular? Tem G1 e G2 Holoblástico rotacional MIO Y., MAEDA K., 2008 American journal of obstetrics and gynecology 199: 660.e1 5. E OS MAMÍFEROS? Fertilização Externa Externa Externa Interna Interna As primeiras clivagens são assincrônicas. Como é o ciclo celular? Desenvol vimento Externo Externo Externo Externo Interno Tem G1 e G2 Transcrição zigótica a partir de 2-células Anexos embrionários ausentes ausentes ausentes Âmnio, saco vitelínico, alantóide, córion Âmnio, saco vitelínico, alantóide, córion Interface materno-fetal Não Não Não Não SIM 9
E OS MAMÍFEROS? Hipotetiza-se que a fase imediatamente após a fertilização é focada na segregação de células embrionárias e extraembrionárias. E não no aumento acelerado de n. de células. 1.Frequência 2. Sincronia 3. Padrão de clivagem CLIVAGEM Velocidade= ciclo celular abreviado Até a trancrição zigótica (mãe é mãe) CLIVAGEM TIPOS DE CLIVAGENS Ouriço Holoblástico radial Anfíbio Holoblástico radial Peixe Meroblástico As clivagens são classificadas quanto a direção do plano de clivagem; Caramujo Holoblástico espiral e quanto a totalidade da divisão Tipos de Clivagem Tipos de Clivagem TOTALIDADE VITELO DIREÇÃO do plano de clivagem TOTALIDADE VITELO DIREÇÃO do plano de clivagem HOLOblástico (holo=completo) MEROblástico (mero=incompleto) Isolécito (Iso=igual) Mesolécito (Meso=meio/moderado) Telolécito (Telo=extremidade) Centrolécito (Centro=central) 10
Tipos de Clivagem Tipos de Clivagem TOTALIDADE VITELO DIREÇÃO do plano de clivagem TOTALIDADE VITELO DIREÇÃO do plano de clivagem HOLOblástico (holo=completo) Isolécito (Iso=igual) Mesolécito (Meso=meio/moderado) HOLOblástico Isolécito MEROblástico (mero=incompleto) Telolécito (Telo=extremidade) Centrolécito (Centro=central) Tipos de Clivagem TOTALIDADE VITELO HOLOblástico Mesolécito DIREÇÃO do plano de clivagem A presença do vitelo diminui a velocidade da progressão da citocinese Tipos de Clivagem TOTALIDADE VITELO Meroblástico Telolécito DIREÇÃO do plano de clivagem TOTALIDADE HOLOblástico (holo=completo) Tipos de Clivagem VITELO Isolécito (Iso=igual) Mesolécito (Meso=meio/moderado) DIREÇÃO do plano de clivagem MEROblástico (mero=incompleto) Telolécito (Telo=extremidade) Centrolécito (Centro=central) 11
Tipos de Clivagem HOLOBLÁSTICA RADIAL TOTALIDADE VITELO DIREÇÃO do plano de clivagem Radial Rotacional Bilateral Espiral Desigual Discoidal Superficial HOLOBLÁSTICA ESPIRAL Ou seja Na clivagem RADIAL,os 3 primeiros planos de clivagem são ortogonais ; enquanto que na clivagem ROTACIONAL, há um deslocamento dos plano de clivagens, que resulta na intercalação dos blastômeros. 12
COMO É GERADA ESTA VARIEBILIDADE? Holoblástico rotacional Cariocinese ( Microtúbulos) Citocinese (Microfilamentos) A posição do plano de clivagem é perpendicular ao fuso mitótico. EXISTE ALGUMA RAZÃO PARA ESTA VARIEBILIDADE? 1)Possivelmente para acomodar os diferentes tipos de ovos (distribuição de vitelo) ; A direção da clivagem em alguns caramujos pode variar, formando indivíduos de carapaça destrógera ou sinistra. 2)O posicionamente relativo dos blastômeros é importante para eventos de indução. 13
?? Você trata um embrião de Xenopus logo após a fertilização com um fármaco que inibe a RNA polimerase II. O que é esperado da clivagem e da gastrulação? a)normal b)clivagem anormal e gastrulação normal c)clivagem anormal e gastrulação anormal d)clivagem normal e gastrulação anormal. Você trata um embrião de Xenopus logo após a fertilização com um fármaco que inibe a RNA polimerase II. O que é esperado da clivagem e da gastrulação? a)normal b)clivagem anormal e gastrulação normal c)clivagem anormal e gastrulação anormal d)clivagem normal e gastrulação anormal. Ablação/extirpação em ouriços Então, até a transcrição zigótica ocorrer, todos os blastômeros são iguais? H. Driesch (1891) Ablação/extirpação em anfíbios H. Driesch (1891) Spemann, 1938 14
Não perca! Nos próximos capítulos de: Então, até a transcrição zigótica ocorrer, todos os blastômeros são iguais? CLIVAGEM CLIVAGEM 1.Frequência 2. Sincronia Velocidade= ciclo celular abreviado Até a trancrição zigótica (mãe é mãe) Objetivo: Multicelular Três folhetos Forma de faríngula Aumento do número de células Espaço para manobra 3. Padrão de clivagem Varia de acordo com o tipo de ovo Rearranjo celular 15
A Blastocele: espaço para manobra * Blastocele= Cavidade interna da Blástula 1. Permite migração celular 2. Compartimentaliza regiões diferentes * * O blastocisto de mamífero contêm MASSA CELULAR INTERNA que formará o embrião propriamente dito Holoblástico rotacional e o TROFOECTODE RMA, que formará o córion da placenta Ao final de várias mitoses, distinguem-se duas populações de células: Massa Celular Interna Trofoectoderma Fertilização Externa Desenvol vimento Externo Externa Externa Interna Interna Externo Externo Externo Interno Massa Celular Interna Blastocele Embrião Propriamente Dito Porção Embrionária da Placenta Anexos embrionários ausentes ausentes ausentes Âmnio, saco vitelínico, alantóide, córion Âmnio, saco vitelínico, alantóide, córion Trofoectoderma Porção Embrionária da Placenta Interface materno-fetal Não Não Não Não SIM Zona Pelúcida 16
1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão? 2. O que estas células PODEM ser? 3. QUANDO elas decidem o que vão ser? 4. COMO ocorre esta decisão? 5. Como é determinada a MORFOLOGIA tecidual? Descrição Cirurgia Expressão Descrição Cirurgia Expressão Embriologia Clássica Mapa do Destino Imunohistoquímica Hibridização in situ RT-PCR Cultura Transplantação Ablação SUPERexpressão SUBexpressão RNA antisenso RNAi Knockout ou mutação Descrição Cirurgia Expressão Desenvolvimento do Olho 1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão? 2. O que estas células PODEM ser? 3. QUANDO elas decidem o que vão ser? 4. COMO ocorre esta decisão? 5. Como é determinada a morfologia tecidual? 17
Descrição Cirurgia Expressão Embriologia Clássica Mapa do Destino Imunohistoquímica Hibridização in situ RT-PCR Gallus gallus Embriogênese: 21 dias VANTAGENS Desenvolvimento quase todo externo Estádios iniciais similares ao mamífero Ferramentas de interferência gênica rápidas Não há problemas éticos com parental DESVANTAGENS Estádios posteriores diferentes do mamífero Ausência de ferramentas genômicas Dificuldade em analisar efeitos maternais O olho se desenvolve a partir da vesícula óptica e do ectoderme sobrejacente Dobras neurais Tubo neural Vesícula óptica ectoderme Gilbert 8th Edition 26h 30h 33h (7 somitos) 36h (10 somitos) 18
Desenvolvimento do olho em Vertebrados Descrição Cirurgia Expressão Embriologia Clássica Mapa do Destino Imunohistoquímica Hibridização in situ RT-PCR Pergunta: Daonde vêm as células que irão formar o olho? Hamburger V Hamilton HL, 1951 E1.5-E2.5 Como seguir uma célula entre várias? A injeção de corante flourescente permite acompanhar o destino celular Gilbert 8th Edition A região que originará o olho (campo óptico) fica gradativamente mais definida 19
O ectoderma precursor do cristalino fica progressivamente distinto do ectoderma precursor da fosseta nasal. Descrição Cirurgia Expressão Mapa do Destino Imunohistoquímica Hibridização in situ RT-PCR Pergunta: Que tipo de proteínas as células oculares expressam durante a sua diferenciação? O anticorpo anti-delta-cristalina marca especificamente o cristalino, i.e. delta cristalina é um bom marcador para cristalino Marcadores Moleculares (molecular markers) são genes/proteínas característicos para cada tecido Neural Hoxb-9 N-CAM Tor70, Keratan Sulphate (MZ15) MyoD xpax-2 GATA-2/4 O ectoderma precursor do cristalino fica progressivamente distinto do ectoderma precursor da fosseta nasal. A expressão de Pax6 (marcador de campo óptico) progressivamente segrega da expressão de Dlx5 (marcador de campo nasal) Dlx5 Pax6 20
O fator de transcrição Pax6 fica com expressão restrita aos tecidos ópticos em desenvolvimento Marcadores Moleculares (molecular markers) são genes/proteínas característicos de etapas de diferenciação Hibridização in situ Notch Notch Delta Notch Proliferação Neurogênese Diferenciação Descrição Cirurgia Expressão 1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão? 2. O que estas células PODEM ser? Cultura Transplantação Ablação 3. QUANDO elas decidem o que vão ser? 4. COMO ocorre esta decisão? Pergunta: Qual o POTENCIAL de outras células formarem olho? Que região do ectoderma pode formar cristalino? Algumas regiões que no embrião não participam da formação do olho, podem formar olho em cultura. Imuno para cristalina Campo claro Cultura de ectoderma 21
O transplante de vesícula óptica para o ectoderma do tronco em anfíbios gera cristalino ectópicos. O ectoderma do tronco tem potencial de formar cristalino. Transplantação: troca de microambiente/mudança de contexto doador aceptor O fator de transcrição Pax6 fica com expressão restrita aos tecidos ópticos em desenvolvimento 1. De onde as células vêm? PARA ONDE vão? 2. O que estas células PODEM ser? Hibridização in situ 3. QUANDO elas decidem o que vão ser? 4. COMO ocorre esta decisão? Descrição Cirurgia Expressão RNA antisenso inibe a tradução DNA Hipótese: A presença do fator de transcrição Pax6 é necessária para formação de olho SUPERexpressão SUBexpressão RNA antisenso RNAi Knockout ou mutação RNA mensageiro RNA antisenso Inibição da Tradução 22
A eletroporação de antisenso para Pax6 em galinha altera o desenvolvimento ocular O que acontece com mamíferos? KNOCKOUT de PAX-6 CONTROLE antisenso para Pax6 ( Mouse life cycle VANTAGENS Modelo de mamífero Ferramentas genéticas Velocidade de desenvolvimento Questões éticas DESVANTAGENS Dificuldade de acesso ao embrião Ninhada pequena Mus musculus Embriogênese: 21 dias Velocidade de desenvolvimento transgênico vs. KNOCKOUT A massa celular interna do blastocisto de embrião de mamíferos é a fonte de célulastronco embrionárias Drug Discovery Today Volume 3, Issue 2, Summer 2006, Pages 129 135 23
Inserção randômica do DNA em quebras cromossomais do prónucleo masculino. http://www.nature.com/jidsp/journal/v10/n1/images/5640176f1.gif Injeção de DNA no pró-nucleo: Transgênese Injeção de células selecionadas no blastocisto: Knockout ou knockin Knockout 1) Transfecção de células-tronco embrionárias Linhagem da massa celular interna http://www.youtube.com/watch?v=ysq-lqp1-ho Knockout : 2) Recombinação O Knockout, ao contrário da transgênese, requer recombinação Neo: resistência neomicina (G418) TK: susceptibilidade a gancliclovir http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/t/transgenicanimals.html 24
Inserção recombinante: Inserção recombinante: resistente neomicina (G418) resistente a ganciclovir resistente neomicina (G418) resistente a ganciclovir A recombinação bem sucedida resulta em: 1) Incorporção de neo no genoma 2) Mas NÄO de tk Neo=Resistência a neomicina = sucesso na recombinação e Tk=Resistência a ganciclovir =que a inserção não foi randômica. http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/t/transgenicanimals.html Neo: resistência neomicina (G418) TK: susceptibilidade a gancliclovir http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/t/transgenicanimals.html Neo: resistência neomicina (G418) TK: susceptibilidade a gancliclovir Inserção aleatória: Knockout : 3) Seleção A inserção aleatória resulta em 1)Incorporção de neo no genoma 2)E de tk Não houve recombinação neomicina ganciclovir resistente neomicina (G418) suscetível a gancliclovir http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/biologypages/t/transgenicanimals.html Você quer fazer um camudongo knockout. O gene normal tem 2 exons e um intron, como demonstrado abaixo. Qual das construções abaixo seria o ideal para fazer o knockout? TK= gene da timidina quinase (presença deletéria no processo de seleção) neor= gene de resistência a neomicina (presença positiva no processo de seleção) Você quer fazer um camudongo knockout. O gene normal tem 2 exons e um intron, como demonstrado abaixo. Qual das construções abaixo seria o ideal para fazer o knockout? TK= gene da timidina quinase (necessário para o processo de seleção) neor= gene de resistência a neomicina (necessário para o processo de seleção) 25
Knockout : 4) Barriga de aluguel Knockout : 5) Quimeras Transgênese: 6) Cruzamento Genótipo para pelagem escura: E/E Genótipo para pelagem clara: e/e Neste camudongo quimera, a percentagem de gametas E produzidas é de: a)25% b)50% c)entre 0% a 50% d)entre 0% e 100% ) Genótipo para pelagem escura: E/E Genótipo para pelagem clara: e/e Neste camudongo quimera, a percentagem de gametas E produzidas é de: a)25% b)50% c)entre 0% a 50% d)entre 0% e 100% 26
3/3/2015 A mutação do gene Pax6 é deletéria para o desenvolvimento ocular em camudongos O peixe-cego das cavernas mexicanas A Ontogenia recapitula a Filogenia (Ernst Haeckel, 1891) Os peixes de cavernas são anoftálmicos porque não expressam Pax6 por tempo suficiente Astyanax fasciatus mexicanus Descrição Cirurgia Expressão SUPERexpressão SUBexpressão uper Expressão Gênica!!!! Microinjeção de RNA Eletroporação Hipótese: A presença do fator de transcrição Pax6 é suficiente para formação de olho Infecção Transgênese 27
Drosophila Melanogaster Embriogênese: 9 dias Pax6 comanda o desenvolvimento ocular: A expressão de Pax6 em patas cria olhos ectópicos VANTAGENS Modelo genético tradicional Ferramentas genéticas Velocidade de desenvolvimento Conservação Evolutiva de Mecanismos Não é vertebrado DESVANTAGENS Drosophila melanogaster Superexpressão de Pax6 forma de olhos extras Normal Visão dorsal Mutante com mais Pax6 Visão dorsal A superexpressão de Pax6 no tronco de anfíbios forma olhos ectópicos (identificação por imuno para delta cristalina). Xenopus laevis Embriões de Cefalópodos expressam Pax6 no olho Conclusão: Pax 6 é necessário e suficiente para induzir formação de olho 28
Planárias transgênicas demonstram a presença de Pax6 nos olhos O olho da planária é constituído apenas de células pigmentares associadas a fotorreceptores Promotor sensível a Pax6 EGFP http://cas.bellarmine.edu/tietjen/images/platyhelminthes.htm Conclusão: Pax 6 tem a função evolutivamente conservada de coordenar o desenvolvimento embrionário de órgãos fotossensíveis 29