1, II II II 111,11,11911 A111

(21)P10607119-8 A2 (22) Data de Depósito: 01/02/2006 (43) Data da Publicação: 11/08/2009 (RPI 2014) 1, II II II 111,11,11911 A111 (51) Int.CI.: A61 K 39/245 (2009.01) A61 K 39/145 (2009.01) A61 K 39/39 (2009.01) A61 K 9/16 (2009.01) C12N 15/85 (2009.01) C12N 15/44 (2009.01) C12N 15/38 (2009.01) C12N 15/31 (2009.01) C12N 15/36 (2009.01) (54) Título: CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, (57) Resumo: CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, POPULAÇÃO POPULAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO DE CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NIJCLEICO, SEQUENCIA NUCLEICO, SEQÜÊNCIA PROMOTORA QUIMÉRICA PROMOTORA QUIMÉRICA ISOLADA PURIFICADA, PARTÍCULAS REVESTIDAS, RECEPTÁCULO DE DOSAGEM PARA UM ISOLADA PURIFICADA, PARTÍCULAS REVESTIDAS, DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA, RECEPTÁCULO DE DOSAGEM PARA UM DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA, DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, E, PARTÍCULA, DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA MÉTODO IN VITRO DE OBTER A EXPRESSAO EM CÉLULAS DE MAMÍFERO DE UM POLIPEPTÍDEO DA INFLUENZA DE INTERESSE. POR PARTÍCULA, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, Uma construção de ácido nucleico que compreende uma seqüência COMPOSIÇÃO DE VACINA, E, MÉTODO IN VITRO DE promotora quimérica e um sítio de clonagem para a inserção de uma OBTER A EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFERO seqüência codificadora em ligação operável com o promotor quimérico, em que a sequência promotora quimérica compreende: (a) uma DE UM POLIPEPTÍDEO DA INFLUENZA DE sequência promotora inicial imediata de hcmv; (b) exon 1 e pelo menos INTERESSE uma parte do exon 2 do gene inicial imediato maior de hcmv; e (c) um íntron heterólogo fornecido no lugar da região de íntron A do gene inicial (30) Prioridade Union ista: 20/04/2005 GB 0507997.5, 01/02/2005 imediato maior de hcmv. US 60/648,382, 19/04/2005 US 60/672,497 (73) Titular(es): Powderject Vaccines, Inc. puc19 1,903. remanescentes de calicck KenR (Tn9031 (72) Inventor(es): James Fuller (74) Procurador(es): Momsen, Leonardos & CIA. sitio poila região ri3-glob Pa Remanescente ligador misc,903, remanescentes de pur.41( Remanescente Pucl9 MCS CMV Pra (86) Pedido Internacional: PCT GB2006000344 de 01/02/2006 (87) Publicação Internacional: WO 2006/082398de 10/08/2006 HI3Ver, BspI201 (3694) GMV Exonla Fusão Etam/Bgl íntron A de Insulina de rato 5'-UTR de FIFIV pré S2 ATG-Nhe H3 HA CDS fiel (1989)

1 Pr. o 6 o }1 19-'g "CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, PARTÍCULAS CARREADORAS, RECEPTÁCULO DE DOSAGEM PARA UM DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA, DISPOSITIVO DE LIBERAÇÃO MEDIADA POR PARTÍCULA, 5 POPULAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO NUCLEICO, SEQÜÊNCIA PROMOTORA QUIMÉRICA ISOLADA PURIFICADA, PARTÍCULAS REVESTIDAS, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, COMPOSIÇÃO DE VACINA, USO DE UMA CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, DE UMA POPULAÇÃO DE CONSTRUÇÕES DE ÁCIDO 10 NUCLEICO OU DE PARTÍCULAS REVESTIDAS, E, MÉTODO IN VITRO DE OBTER A EXPRESSÃO EM CÉLULAS DE MAMÍFERO DE UM POLIPEPTÍDEO DA INFLUENZA DE INTERESSE" Campo da Invenção A invenção diz respeito aos campos da biologia molecular e 15 imunologia e no geral aos reagentes úteis nas técnicas de imunização de ácido nucleico. Mais especificamente, a invenção diz respeito a. construções de ácido nucleico para a expressão de polipeptídeos e em particular polipeptídeos antigênicos, particularmente antígenos da influenza bem como a expressão de polipeptídeos adjuvantes e às estratégias de imunização com ácido nucleico 20 usando tais reagentes. Fundamentos da invenção A terapia de gene e imunização com ácido nucleico são métodos promissores para o tratamento e prevenção de doenças tanto adquiridas quanto herdadas. Estas técnicas fornecem a transferência de um 25 ácido nucleico desejado em um indivíduo com a expressão in vivo subseqüente. A transferência pode ser realizada pela transfecção das células ou tecidos do indivíduo ex vivo e reintroduzir o material transformado no hospedeiro. Alternativamente, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo diretamente ao receptor.

2 Cada uma destas técnicas requer a expressão eficiente do ácido nucleico na célula transfectada, para fornecer uma quantidade suficiente do produto de gene terapêutico ou antigênico. Diversos fatores são conhecidos afetar os níveis de expressão obtidos, incluindo a eficiência de transcrição, e a 5 eficiência com que o gene ou a seqüência de interesse é transcrita e o mrna traduzido. Vários sistemas de expressão foram descritos na técnica, cada um dos quais tipicamente consiste de um vetor contendo um gene ou seqüência de nucleotídeo de interesse operavelmente ligada às seqüências de 10 controle de expressão. Estas seqüências de controle incluem seqüências promotoras transcricionais e seqüências início e terminação transcricionais. Os promotores habitualmente usado para sistemas de expressão de célula de mamífero incluem o promotor inicial SV40, um promotor de citomegalovírus (CMV) tal como o promotor inicial imediato de CMV (Chapman et al (1991) 15 Nucl. Acids Res. 19: 3979-3986), o promotor de repetição de terminal longo (LTR) do vírus do tumor mamário de camundongo, o promotor tardio maior de adenovírus (Ad MLP) e o promotor do vírus simples do herpes (HSV), entre outros. Os promotores não virais, tais como um promotor derivado do gene da metalotioneína de murino também são habitualmente usados. 20 Os sistemas de expressão freqüentemente incluem elementos moduladores transcricionais, aludidos como "realçadores". Os realçadores são amplamente definidos como um agente que atua em cis, que quando operavelmente ligado a uma seqüência de promotor/ gene, aumentará a transcrição desta seqüência de gene. Os realçadores podem funcionar a partir 25 de posições que estão muito mais longe de uma seqüência de interesse do que outros elementos de controle de expressão (por exemplo, promotores), e podem operar quando posicionados em cada orientação relativa à seqüência de interesse (Banerji et al. (1981) Cell 27: 299-308, devilleirs et al. (1981) Nucl. Acids Res 9: 6251-6264). Os realçadores foram identificados a partir de

3 várias fontes virais, incluindo o vírus do polioma, vírus BK, citomegalovírus (CMV), adenovírus, vírus símio 40 (SV40), vírus do sarcoma -de Moloney, vírus do papiloma bovino e vírus do sarcoma de Rous (devilleirs et al supra, Rosenthal et al. (1983) Science 222: 749-755, Hearing et al. (1983) Cell 33: 5 695-703, Weeks et al. (1983) Mol. Cell. Biol. 3: 1222-1234, Levinson et al. (1982) Nature 295: 568-572, e Luciw et al. (1983) Cell 33: 705-716). Vários sistemas de expressão para a imunização com ácido nucleico e terapia de gene fazem uso do promotor inicial imediato do hcmv. Ver por exemplo, as Patentes US 5168062 e 5385839 concedidas a 10 Stinski, e Relatório Descritivo de Patente EP 0323997 B 1. Os vetores de expressão usando o promotor inicial imediato do hcmv incluem por exemplo, pwrg7128 (Roy et al, Vaccine 19, 764-778, 2001), e pbc12/cmv e pjw4303 que são mencionados na WO 95/20660. Chapman et al (1991) supra relatam níveis reduzidos de expressão do promotor inicial imediato do 15 hcmv na ausência de hcmv Intron A. Sumário da invenção Uma construção de ácido nucleico foi desenvolvido usando seqüências de promotor/expressão viral manipulados que fornece expressão realçada de seqüências codificadoras heterólogas em células hospedeiras. A 20 construção é adequada para a expressão eficiente de genes e em particular genes que codificam antígeno, e portanto podem ser usados na imunização com ácido nucleico. A construção também pode ser usada para expressar polipeptídeos adjuvantes. A construção pode ser fornecida em partículas carreadoras, para o uso na imunização mediada por partícula com ácido 25 nucleico. Em uma forma de realização especialmente preferida da invenção a construção codifica um antígeno da influenza, fragmento imunogênico deste ou uma variante imunogênica de cada um. Em uma outra forma de realização especialmente preferida a construção codifica um polipeptídeo adjuvante. Conseqüentemente, presente invenção fornece uma

4 construção de ácido nucleico adequada para a liberação a um indivíduo para induzir uma resposta imune contra o antígeno de hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, construção esta que compreende: (i) um seqüência promotora quimérica que compreende: 5 (a) uma seqüência promotora inicial imediata de hcmv; (b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial imediato maior de hcmv; e (c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron A do gene inicial imediato maior de hcmv; 10 (ii) uma seqüência codificadora em ligação operável com o promotor quimérico, onde a seqüência codificadora codifica um antígeno de hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, um fragmento imunogênico deste ou uma variante imunogênica do dito antígeno ou fragmento tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido ao dito antígeno ou fragmento; 15 (iii) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação operável com o promotor quimérico; e (iv) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região 3' 20 não traduzida (UTR) de uma seqüência do HBsAg ou de uma seqüência de gene inicial imediata de CMV símio, que está em ligação operável com o promotor quimérico e que está a jusante da seqüência codificadora. A presente invenção também fornece uma construção de ácido nucleico adequada para a liberação a um indivíduo para induzir uma resposta 25 imune contra antígeno de hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, construção esta que compreende: (i) uma seqüência promotora quimérica que compreende: (a) uma seqüência promotora inicial imediata de hcmv; (b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial

5 imediato maior de hcmv; e (c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron A do gene inicial imediato maior de hcmv; e (ii) uma seqüência codificadora em ligação operável com o 5 promotor quimérico, onde a seqüência codificadora codifica um antígeno de hemaglutinina (HA) do vírus da influenza, um fragmento imunogênico deste ou uma variante imunogênica do dito antígeno ou fragmento tendo pelo menos 80% de homologia de aminoácido ao dito antígeno ou fragmento. Além disso, a presente invenção fornece uma construção de 10 ácido nucleico que compreende uma seqüência promotora quimérica e um sítio de clonagem para a inserção de uma seqüência codificadora em ligação operável com o promotor quimérico, em que a seqüência promotora quimérica compreende: (a) uma seqüência promotora inicial imediata de hcmv; 15 (b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial imediato maior de hcmv; e (c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região do intron A do gene inicial imediato maior de hcmv. Em um exemplo preferido, a construção compreende uma 20 seqüência codificadora inserida no sítio de clonagem. Assim, uma seqüência codificadora pode ser fornecida no sítio de clonagem. Em uma outra forma de realização preferida uma construção da invenção pode compreender ainda: (a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da 25 seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou seqüência de antígeno tipo 2 gd do HSV e que está em ligação operável com o promotor quimérico; e/ou (b) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg, ou uma UTR 3' de uma

6 seqüência de gene inicial imediata de CMV símio e que está em ligação operável com o promotor quimérico, em que a seqüência realçadora está a jusante do sítio de clonagem. A invenção também fornece uma construção de ácido nucleico 5 que compreende uma seqüência promotora e uma seqüência codificadora operavelmente ligada ao promotor, onde a construção compreende ainda: (a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV, que está em ligação operável com a 10 seqüência codificadora e promotor que é heterólogo à seqüência codificadora; e/ou (b) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à seqüência codificadora, onde a seqüência realçadora é derivada de uma UTR 3' de uma seqüência do HBsAg ou uma UTR 3' de uma seqüência de gene 15 inicial imediata de CMV símio, e a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência realçadora 3'. A invenção também fornece uma construção de ácido nucleico que compreende: (i) uma seqüência promotora quimérica que compreende: 20 (a) uma seqüência promotora inicial imediata de hcmv; (b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial imediato maior de hcmv; e (c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron A do gene inicial imediato maior de hcmv; e 25 (ii) um sítio de clonagem para a inserção de uma seqüência codificadora em ligação operável com o promotor quimérico; e (iii) (a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da seqüência de antígeno pres2 de HBV, seqüência de antígeno e de HBV ou seqüência de antígeno tipo 2gD de HSV e que está em ligação

7 operável com o promotor quimérico; e/ou (b) uma seqüência realçadora que é derivada de uma região não traduzida 3' (UTR) de uma seqüência do HBsAg, ou uma UTR 3' de uma seqüência de gene inicial imediata de CMV símio e que está em ligação 5 operável com o promotor quimérico, em que a seqüência realçadora está a jusante do sítio de clonagem. A invenção também fornece uma construção de ácido nucleico que compreende: (i) uma seqüência promotora; 10 (ii) uma seqüência líder não traduzida derivada da seqüência de antígeno pres2 de HBV, seqüência de antígeno e de HBV ou seqüência de antígeno tipo 2 gd do HSV; e (iii) uma seqüência codificadora operavelmente ligada a (i) e (ii) 15 em que a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência líder não traduzida. A invenção também fornece uma construção de ácido nucleico que compreende: (i) uma seqüência promotora; 20 (ii) uma seqüência codificadora operavelmente ligada à seqüência promotora (i); e (iii) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à seqüência codificadora (ii); em que a seqüência realçadora (iii) é derivada de uma UTR 3' 25 de uma seqüência do HBsAg ou uma UTR 3' de uma seqüência de gene inicial imediata de CMV símio, e a seqüência codificadora (ii) é heteróloga à seqüência realçadora 3'. A presente invenção também fornece uma construção de ácido nucleico que compreende uma seqüência promotora e uma seqüência

8 codificadora operavelmente ligada ao promotor, onde a construção compreende ainda: (a) uma seqüência líder não traduzida que é derivada da seqüência de antígeno HBVpreS2, seqüência de antígeno e de HBV ou 5 seqüência de antígeno tipo 2 gd do HSV, que está em ligação operável com a seqüência codificadora e promotor que é heterólogo à seqüência codificadora; e/ou (b) uma seqüência realçadora 3' da e operavelmente ligada à seqüência codificadora, onde a seqüência realçadora é derivada de uma UTR 10 3' de uma seqüência do HBsAg ou uma UTR 3' de uma seqüência de gene inicial imediata de CMV símio, e a seqüência codificadora é heteróloga à seqüência realçadora 3'. A presente invenção adicionalmente fornece uma população de construções de ácido nucleico onde a população compreende pelo menos duas 15 construções diferentes da invenção. em um outro exemplo, a invenção fornece uma seqüência promotora quimérica isolada purificada que compreende: (a) uma seqüência promotora inicial imediata de hcmv; (b) exon 1 e pelo menos uma parte do exon 2 do gene inicial 20 imediato maior de hcmv; e (c) um intron heterólogo fornecido no lugar da região de intron A do gene inicial imediato maior de hcmv. A invenção também fornece - um método de obter a expressão em células de mamífero 25 de um polipeptídeo de interesse, método este que compreende transferir para dentro das ditas células uma construção de ácido nucleico, uma população de construções de ácido nucleico ou partículas revestidas da invenção; - partículas revestidas, adequadas para a liberação a partir de um dispositivo de liberação mediada por partícula, partículas estas que

9 compreendem partículas carreadoras revestidas com uma construção de ácido nucleico da invenção, a construção incluindo uma seqüência codificadora que codifica o polipeptídeo; - um receptáculo de dosagem para um dispositivo de 5 liberação mediada por partícula que compreende as partículas revestidas; - um dispositivo de liberação mediada por partícula carregado com as partículas revestidas; - um método de imunização com ácido nucleico que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz das partículas 10 revestidas da invenção; - uma composição farmacêutica que compreende uma construção de ácido nucleico da invenção ou uma população de construções de ácido nucleico da invenção juntas com um carreador ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis; 15 - uma composição de vacina que compreende uma construção de ácido nucleico da invenção ou uma população de construções de ácido nucleico da invenção ou partículas revestidas da invenção. Também é fornecido o uso de uma construção de ácido nucleico da invenção, uma população de construções de ácido nucleico da 20 invenção ou partículas revestidas da invenção na fabricação de um medicamento para a imunização com ácido nucleico. Estes e outros objetivos, aspectos, formas de realização e vantagens da presente invenção facilmente ocorrerão àqueles de habilidade comum na técnica em vista da divulgação aqui. 25 Descrição Resumida dos Desenhos A Figura 1 ilustra os níveis de expressão do antígeno de superficie do vírus da hepatite B (1-1BsAg) obtidos usando vários vetores de expressão de plasmídeo. A Figura 2 mostra o efeito da inclusão de intron sobre a

10 expressão do HBsAg em células SCC15 e de beta-gal em células B16 (média de três experimentos). A Figura 3 mostra o efeito do intron A da insulina de rato e da UTR 3' do HBV sobre a expressão de beta-gal em células SCC 15 (média de 5 três experimentos). A Figura 4 mostra o efeito do intron A da insulina de rato e da UTR 3' do HBV sobre a expressão de HSVgD em células SCC 15 (média de três experimentos). A Figura 5 mostra o efeito do intron A da insulina de rato e da 10 UTR 3' do HBV sobre a expressão de SEAP em células SCC15 e B16 (três repetições por linhagem de célula). A Figura 6 mostra a capacidade dos peptídeos de sinal heterólogos para direcionar a secreção de SEAP ou fragmento hfc em células B16. 15 A Figura 7 ilustra níveis de anticorpos detectados nos soros de camundongos imunizados com ácidos nucleicos que codificam antígeno contidos em uma variedade de vetores de expressão de plasmídeo. A Figura 8 é uma representação diagramática do vetor de expressão ppjv. 20 A Figura 9 é uma representação diagramática de ppjv7389. A Figura 10 é uma representação diagramática de ppjv7400. A Figura 11 é uma representação diagramática de ppjv7468. A Figura 12 é uma representação diagramática de ppjv7563. A Figura 13 demonstra a composição base para ppjv7563. 25 A Figura 14 fornece um diagrama de fluxo da derivatização dos plasmídeos ppjv7563 e ppjv1671. A Figura 15 fornece mapas dos plasmídeos chave na construção de ppjv 1671. A Figura 16 fornece um mapa característico de ppjv1671 e

11 fornece uma comparação de seqüência das seqüências dos terminais N do antígeno de HA, H3 Panama natural e do antígeno de HA, H3 Panama codificado pelo ppjv1671. A Figura 17 mostra os títulos de anticorpo da inibição da 5 hemaglutinação em porcos vacinados com ppjv 1671. A Figura 18 mostra as reações de pele locais que segue a liberação epidérmica mediada por partícula de ppjv1671 aos seres humanos. A Figura 19 mostra os títulos de anticorpo da inibição da hemaglutinação em porcos imunizados com uma vacina trivalente com base 10 na PMED. Os títulos de HI específicos para os vírus H3, H1 e B são mostrados para dois dispositivos de PMED. A Figura 20 é uma representação diagramática de ppml7789. A Figura 21 mostra a seqüência anotada de ppml7789. A Figura 22 é uma representação diagramática de ppjv2012. 15 A Figura 23 é um diagrama de fluxo para a construção de ppjv2012. A Figura 24 fornece a seqüência anotada de ppjv2012. A Figura 25 é uma representação diagramática do vetor ppjv7788. 20 A Figura 26 é uma representação diagramática do vetor ppjv7788 mostrando sítios de restrição. A Figura 27 é uma representação diagramática de picp27. A Figura 28 é a seqüência de aminoácido (SEQ ID NO: 65) de ICP27 da cepa MS de HSV-2 com base na seqüência de nucleotídeo de 25 picp27. A diferença de aminoácido único entre a seqüência publicada de ICP27 da cepa MS de HSV-2 (asparagina = N) e cepa HG52 (lisina) está em negrito. A seqüência identificada como o epítopo CD8 putativo na cepa MS do HSV-2 está sublinhada. A Figura 29 mostra a identificação de um epítopo ICP27

12 dominante em camundongos Balb/c. A: Células de baço (S) e linfonodo (N) de camundongos Balb/c infectados com HSV-2 (BS e BN, respectivamente) ou camundongos C57BL/6 (CS e CN) foram ensaiadas quanto à atividade de IFN-y ELISPOT usando as várias reuniões de peptídeo (C1-C12, R1-R6) 5 descritas no Exemplo 22. 5 x 10 5 células foram plaqueadas em cada reservatório e os resultados são tabulados como negativo (quadrados vazios), fraco (<25 ELISPOTs/reservatório, quadrados cinzas) ou forte (>25 ELISPOTs/reservatório, quadrados pretos). B: Seqüências dos dois peptídeos (SEQ ID NOS: 66 e 67) reconhecidos pelas células de camundongos Balb/c 10 salientando um epítopo Dd do HSV-2 potencial (negrito) e uma região (sublinhada) que corresponde a um epítopo do HSV-1 previamente identificado (Banks et al, J. Virol. 67, 613-616, 1993). A Figura 30 relata a caracterização da resposta de Balb/c a ICP27 usando um ensaio IFN-y ELISPOT. As células do baço de 15 camundongos Balb/c infectados foram ensaiadas quanto a atividade de IFN-y ELISPOT usando a reunião de peptídeo feita de todos os peptídeos de ICP27 (Reunião), ou peptídeos HGPSLYRTF individuais (P1, SEQ ID NO: 68) e LYRTFAANPRA (P2, SEQ ID NO: 69). 5 x 10 5 células foram plaqueadas em cada reservatório e os resultados são expressados como número de 20 ELISPOTs/reservatório. Além disso, uma aliquota da amostra de célula do baço foi tratada com pérolas magnéticas para esgotar a amostra de células CD8+ como descrito no Exemplo 22. A amostra original (+CD8) e amostra esgotada (-CD8) foram ensaiadas quanto a atividade de IFN-y ELISPOT usando a reunião de peptídeo feita de todos os peptídeos de ICP27 (Reunião). 25 A Figura 31 mostra a correlação entre a proteção contra a inoculação de HSV-2 e a produção de citocina específica de ICP27. Grupos de 16 camundongos receberam imunizações de PMED DNA primárias e de reforço consistindo da vacina picp27 DNA com e sem o vetor CT DEI ppjv2013 (subunidade dual A+B) ou subunidade do vetor LT DEI ppjv2012

13 (dual A+B). O picp27 para o vetor DEI foi uma razão de 9:1. Painel A: dados de sobrevivência após a inoculação. Metade dos animais em cada grupo foram inoculados duas semanas a seguir da segunda imunização com 50 LD 50 de HSV-2. Painéis B e C: produção de IFN-y específico de ICP27 e TNF-a em 5 cada grupo, respectivamente. Os animais remanescentes foram sacrificados no mesmo tempo e os esplenócitos foram coletados para a medição da produção de citocina específica de ICP27 usando um kit de série de pérola citométrica. A Figura 32 mostra o papel de IFN-y e TNF-a na proteção da inoculação letal de HSV-2 avaliação da morbidez. Grupos de 4 10 camundongos receberam imunizações primária e de reforço com a vacina picp27 PMED DNA com (4 grupos) ou sem (1 grupo) o vetor ppjv2012 dual A+B LT DEI. O picp27 para o vetor DEI foi uma razão de 9:1. Os animais foram intranasalmente inoculados duas semanas mais tarde com 50 LD50 de HSV-2. Para o esgotamento de célula T, os camundongos receberam 15 injeções intraperitoneais contendo 200 jig de anticorpo monoclonal específico para IFN-y e/ou TNF-a nos dias -2, 0, 2, 4, 6, e 8 em relação à inoculação viral como descrito no Exemplo 22. Os animais foram monitorados quanto a mortalidade (% de sobrevivência) e morbidez, classificados em uma escala de O a 4 de acordo com o seguinte programa: 4, saudável; 3, pelo eriçado, 20 espirrando; 2, feridas nos olhos ou nádegas, movimento reduzido; 1, encurvado, pouco movimento; 0, morto. A Figura 33 mostra o papel de populações de célula T na proteção da inoculação letal de HSV-2. Cinco grupos de 4 camundongos receberam imunizações primária e de reforço com a vacina picp27 PMED 25 DNA com (+LT, 4 grupos) ou sem (-LT, 1 grupo) o vetor ppjv2012 dual A+B LT DEI. O picp27 para vetor DEI foi uma razão de 9:1. Os animais foram inoculados intranasalmente com 50 LD 50 de HSV-2 duas semanas mais tarde. Três grupos dos animais imunizados com ICP27+LT DEI foram tratados com injeções intraperitoneais de 90 lig de anticorpos monoclonais

14 específicos de acd4 e/ou acd8, nos dias -2 e O em relação à inoculação virai. De modo a manter o DNA total no grupo picp27 sozinho (indicado como -LT) igual aos grupos picp27 + LT, vetor vazio foi adicionado ao grupo picp27 sozinho. 5 Descrição Resumida das Seqüências A SEQ ID NO: 1 é a seqüência promotora inicial imediata de hcmv (GenBank #M60321, X17403) A SEQ ID NO: 2 é a seqüência dos exons 1 e 2 do gene inicial imediato maior de hcmv (GenBank #M60321, X17403) 10 A SEQ ID NO: 3 é a seqüência do intron A da insulina de rato (GenBank #J00748) A SEQ ID NO: 4 é a seqüência de um promotor quimérico de acordo com a presente invenção A SEQ ID NO: 5 é uma seqüência líder da HBV pre S2 15 antígeno seqüência da UTR 5' do antígeno pré S2 do HBV (GenBank #M54923) A SEQ ID NO: 6 é uma seqüência líder da seqüência da UTR 5' do tipo 2 gd do HSV (GenBank #Z86099) A SEQ ID NO: 7 é uma seqüência líder da seqüência da UTR 20 5' do HBV e antígeno (GenBank #M54923) A SEQ ID NO: 8 é a seqüência da UTR 3' de HBVenh (GenBank #AF 143308) A SEQ ID NO: 9 é a seqüência da UTR 3' do gene inicial imediato símio (GenBank #M16019) 25 A SEQ ID NO: 10 é a seqüência poli A da globina de coelho (GenBank #K03256) A SEQ ID NO: 11 é a seqüência poli A do gene inicial imediato de scmv símio (GenBank #M16019) A SEQ ID NO: 12 é a seqüência poli A do gene gb do HSV2

15 (GenBank #Z86099) A SEQ ID NO: 13 é a seqüência poli A do gene inicial do HPV16 (GenBank #K02718) A SEQ ID NO: 14 é a seqüência do vetor de expressão de 5 ppjv A SEQ ID NO: 15 é o iniciador de PCR de JF93 A SEQ ID NO: 16 é o iniciador de PCR de F110 A SEQ ID NO: 17 é o iniciador de PCR de GW1 A SEQ ID NO: 18 é o iniciador de PCR de JF254 10 A SEQ ID NO: 19 é o iniciador de PCR de GW150 A SEQ ID NO: 20 é o iniciador de PCR de JF255 A SEQ ID NO: 21 é o iniciador de PCR de DS1 A SEQ ID NO: 22 é o iniciador de PCR de DA1 A SEQ ID NO: 23 é o iniciador de PCR de JF301 15 A SEQ ID NO: 24 é o iniciador de PCR de JF302 A SEQ ID NO: 25 é o iniciador de PCR de JF84 A SEQ ID NO: 26 é o iniciador de PCR de JF225 A SEQ ID NO: 27 é o iniciador de PCR de JF335 A SEQ ID NO: 28 é o iniciador de PCR de JF336 20 A SEQ ID NO: 29 é o iniciador de PCR de JF357 A SEQ ID NO: 30 é o iniciador de PCR de JF365 A SEQ ID NO: 31 é o iniciador de PCR de JF393 A SEQ ID NO: 32 é o iniciador de PCR de JF406 A SEQ ID NO: 33 é o iniciador de PCR de JF256 25 A SEQ ID NO: 34 é o iniciador de PCR de JF257 A SEQ ID NO: 35 é o iniciador de PCR de JF320 A SEQ ID NO: 36 é o iniciador de PCR de JF321 A SEQ ID NO: 37 é o iniciador de PCR de JF386 A SEQ ID NO: 38 é o iniciador de PCR de FcAS

16 A SEQ ID NO: 39 é o oligonucleotídeo JF354 A SEQ ID NO: 40 é o iniciador de PCR de JF355 A SEQ ID NO: 41 é o iniciador de PCR de JF356 A SEQ ID NO: 42 é o oligonucleotídeo JF348 5 A SEQ ID NO: 43 é o iniciador de PCR de JF349 A SEQ ID NO: 44 é o iniciador de PCR de JF350 A SEQ ID NO: 45 é o oligonucleotídeo JF351 A SEQ ID NO: 46 é o iniciador de PCR de JF352 A SEQ ID NO: 47 é o iniciador de PCR de JF353 10 A SEQ ID NO: 48 é o iniciador de PCR de JF430 A SEQ ID NO: 49 é o iniciador de PCR de JF442 A SEQ ID NO: 50 é o iniciador de PCR de JF421 A SEQ ID NO: 51 é o iniciador de PCR de JF444 A SEQ ID NO: 52 é a seqüência promotora do vírus da 15 Pseudo-raiva (PRV). A SEQ ID NO: 53 é a seqüência promotora do vírus do sarcoma de Rous (RSV). A SEQ ID NO: 54 fornece a seqüência de nucleotídeo do vetor ppjv1671 e a seqüência de aminoácido do antígeno H3N2 HA codificado. 20 A SEQ ID NO: 55 fornece a seqüência de aminoácido sozinha do antígeno H3N2 HA codificado por ppjv1671. A SEQ ID NO: 56 fornece a seqüência de aminoácido de N terminal natural do antígeno H3 Panama HA. A SEQ ID NO: 57 fornece a seqüência de aminoácido de 25 terminal N para o antígeno H3 Pananama HA codificado pelo ppjv 1671. A SEQ ID NO: 58 fornece a seqüência de consenso das seqüências das SEQ ID 1 11' 56 e 57. A SEQ ID NO: 59 fornece a seqüência de nucleotídeo do vetor ppml7789 e a seqüência de aminoácido do antígeno VN1194H5.

17 A SEQ ID NO: 60 fornece a seqüência de aminoácido sozinha do antígeno VN1194H5. A SEQ ID NO: 61 fornece a seqüência de nucleotídeo do vetor ppjv2012. 5 A SEQ ID NO: 62 fornece a seqüência de nucleotídeo do vetor PJV7788. As SEQ ID NOS: 63 e 64 são os iniciadores 5' e 3' usados no Exemplo 22 para amplificar o DNA da cepa MS do HSV-2. A SEQ ID NO: 65 é a seqüência de aminoácido de ICP27 da 10 cepa MS do HSV-2 com base na seqüência de nucleotídeo de picp27, Exemplo 22. As SEQ ID NOS: 66 e 67 são os peptídeos 45 e 46 reconhecidos pelas células de camundongos Balb/c no Exemplo 22. A SEQ ID NO: 68 é uma seqüência de nove aminoácidos 15 homóloga contida nos peptídeos 45 e 46. As SEQ ID NOS: 69 e 70 são regiões de aminoácido de HSV- 2 ICP27 e HSV-1 ICP27 que diferem em um aminoácido. Descrição Detalhada da Invenção Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser 20 entendido que esta invenção não é limitada às moléculas ou parâmetros do processo particularmente exemplificados visto que tais, naturalmente, podem variar. também deve ser entendido que a terminologia aqui usada é apenas com o propósito de descrever as formas de realização particulares da invenção, e não é intencionada a ser limitante. Além disso, a prática da 25 presente invenção utilizará, a menos que de outro modo indicado, métodos convencionais de virologia, microbiologia, biologia molecular, técnicas de DNA recombinante e imunologia todas as quais estão dentro da habilidade comum da técnica. Tais técnicas são explicadas completamente na literatura. Ver, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory

18 Manual (2 a Edição, 1989); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., 1984); A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); e Fundamental Virology, 2 a Edição, vol. I & II (B. N. Fields e D. M. Knipe, eds.). 5 Todas as publicações, patentes e pedidos de patente aqui citados, seja acima ou abaixo, são aqui incorporadas por referência em sua totalidade. Deve ser mencionado que, como usado neste relatório descritivo e nas reivindicações anexas, as formas singulares "um," "uma" e 10 "o", "a" incluem referentes plurais a menos que o conteúdo claramente dite de outro modo. Em casos onde um agente particular é especificado como compreendendo unidades particulares, em um exemplo preferido o agente pode consistir essencialmente de tais unidades. UM. 15 A Definições A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos aqui usados têm o mesmo significado como habitualmente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica à qual a invenção pertence. Embora vários métodos e materiais similares ou equivalentes 20 àqueles aqui descritos podem ser usados na prática da presente invenção, os materiais e métodos preferidos são aqui descritos. Na descrição da presente invenção, os seguintes termos serão utilizados e são intencionados a serem definidos como indicado abaixo. O termo "imunização com ácido nucleico" é aqui usado para 25 se referir à introdução de uma molécula de ácido nucleico que codifica um ou mais antígenos ou polipeptídeos selecionados em uma célula hospedeira para a expressão in vivo do antígeno ou antígenos. a molécula de ácido nucleico pode ser introduzida diretamente dentro do indivíduo receptor, tal como pela injeção intramuscular ou intradérmica padrão; liberação de partícula

19 transdérmica; inalação; topicamente, ou pelos modos de administração oral, intranasal ou mucósico. Em particular, o ácido nucleico pode ser administrado por intermédio da liberação de partícula transdérmica. A molécula alternativamente pode ser introduzida ex vivo dentro de células que foram 5 removidas de um indivíduo. Neste último caso, as células contendo a molécula de ácido nucleico de interesse são re-introduzidas no indivíduo tal que uma resposta imune pode ser montada contra o antígeno codificado pela molécula de ácido nucleico. As moléculas de ácido nucleico usadas em tal imunização são no geral aqui aludidas como "vacinas de ácido nucleico." 10 Qualquer um dos ácidos nucleicos aqui mencionados pode estar presente em tais vacinas e em particular as construções de ácido nucleico aqui mencionadas podem estar presentes. O termo "adjuvante" significa um material ou composição capaz de alterar específica ou não especificamente alterar, realçar, direcionar, 15 redirecionar, potenciar ou iniciar uma resposta imune específica de antígeno. Assim, a co-adminisração de um adjuvante com um antígeno pode resultar em uma dose mais baixa ou menos doses de antígeno que é necessário para se obter uma resposta imune desejada no indivíduo ao qual o antígeno é administrado, ou a co-administração pode resultar em uma resposta imune 20 qualitativa e/ou quantitativamente diferente no indivíduo. Em particular, a administração do adjuvante pode resultar em uma resposta imune realçada tal como uma de maior magnitude e/ou duração. A eficácia de um adjuvante pode ser determinada pela administração do adjuvante com uma composição de vacina em paralelo com uma composição de vacina sozinha aos animais e 25 comparar a imunidade mediada por anticorpo e/ou celular nos dois grupos usando ensaios padrão tais como radioimunoensaio, ELISAs, e ensaios de CTL. As construções da invenção podem expressar um ou mais polipeptídeos adjuvantes. Por "carreador de núcleo" é intencionado um carreador no qual

20 um ácido nucleico hóspede (por exemplo, DNA, RNA) é revestido de modo a comunicar um tamanho de partícula definido bem como uma densidade suficientemente alta para se obter a cinética requerida para a penetração da membrana celular, tal que a molécula hóspede possa ser liberada usando 5 técnicas mediadas por partícula (ver, por exemplo, a Patente U.S. W- 5.100.792). os carreadores de núcleo tipicamente incluem materiais tais como tungstênio, ouro, platina, ferrita, poliestireno e látex. Ver por exemplo, Particle Bombardment Technology for Gene Transfer, (1994) Yang, N. ed., Oxford University Press, Nova Iorque, NY páginas 10-11. 10 Por "seringa isenta de agulha" é intencionado um instrumento que libera uma composição particulada transdermicamente sem a ajuda de uma agulha convencional para perfurar a pele. As seringas sem agulha para o uso com a presente invenção são aqui debatidas. O termo liberação "transdérmica" significa administração 15 intradérmica (por exemplo, dentro da derme ou epiderme), transdérmica (por exemplo, "percutânea") e administração transmucósica, isto é, liberação pela passagem de um agente dentro ou através da pele ou tecido mucósico. Ver, por exemplo, Transdermic Drug Delivery: Developmental Issues and Research Initiatives, Hadgraft e Guy (eds.), Marcel Dekker, Inc., (1989); 20 Controlled Drug Delivery: Fundamentais and Applications, Robinson e Lee (eds.), Marcel Dekker Inc., (1987); e Transdermic Delivery of Drugs, Vols. 1-3, Kydonieus e Berner (eds.), CRC Press, (1987). Assim, o termo abrange a liberação a partir de uma seringa isenta de agulha como descrito na Patente U.S. N" 5.630.796, bem como a liberação mediada por partícula como 25 descrito na Patente U.S. N 5.865.796. Um "polipeptídeo" é usado no seu sentido mais amplo para se referir a um composto de dois ou mais aminoácidos de subunidades, análogos de aminoácido, ou outros peptidomiméticos. As subunidades podem ser ligadas pelas ligações de peptídeo ou por outras ligações, por exemplo éster,

21 éter, etc. Como aqui usado, o termo "aminoácido" refere-se a aminoácidos naturais e/ou não naturais ou sintéticos, incluindo glicina e ambos os isômeros óticos D ou L, e análogos de aminoácido e peptidomiméticos. Um peptídeo de três ou mais aminoácidos é habitualmente chamado um oligopeptídeo se a 5 cadeia de peptídeo é curta. Se a cadeia de peptídeo é longa, o peptídeo é tipicamente chamado um polipeptídeo ou uma proteína. Um "antígeno" refere-se a qualquer um agente, no geral uma macromolécula, que possa evocar uma resposta imunológica em um indivíduo. O termo pode ser usado para se referir a uma macromolécula 10 individual ou a uma população homogênea ou heterogênea de macromoléculas antigênicas. Como aqui usado, "antígeno" é no geral usado para se referir a uma molécula de proteína ou porção desta que contenha um ou mais epítopos. Um "antígeno" pode compreender, por exemplo, um polipeptídeo que ocorre naturalmente, um fragmento de um tal polipeptídeo 15 que seja imunogênico ou uma forma variante de cada um que retenha a imunogenicidade. Em um exemplo preferido, onde um fragmento ou variante é aludido, a resposta imune gerada pode ser preferivelmente capaz de reconhecer o polipeptídeo original a partir do qual o fragmento ou variante é derivado. 20 Para os propósitos da presente invenção, os antígenos podem ser obtidos ou derivados de qualquer fonte apropriada. Para os propósitos da presente invenção, um "antígeno" inclui uma proteína tendo modificações, tais como deleções, adições e substituições (no geral conservativas por natureza) à seqüência nativa, contanto que a proteína mantenha 25 imunogenicidade suficiente. Estas modificações podem ser deliberadas, por exemplo através da mutagênese direcionada ao sítio, ou pode ser acidental, tal Como através de mutações de hospedeiros que produzem os antígenos. Em uma forma de realização particularmente preferida da invenção o antígeno utilizado ou codificado pode ser um antígeno da influenza, um fragmento

22 imunogênico de um antígeno da influenza ou uma variante imunogênica de cada um. Uma "resposta imune" contra um antígeno de interesse é o desenvolvimento em um individual de uma resposta imune humoral e/ou um 5 celular para aquele antígeno. Para os propósitos da presente invenção, uma "resposta imune humoral" refere-se a uma resposta imune mediada por moléculas de anticorpo, enquanto que uma "resposta imune celular" é uma mediada pelos linfócitos T e/ou outras células sanguíneas brancas. Os termos "molécula de ácido nucleico" e "polinucleotídeo" 10 são usados aqui intercambiavelmente e referem-se a uma forma polimérica de nucleotídeos de qualquer comprimento, desoxinibonucleotídeos ou ribonucleotídeos, ou análogos destes. Os polinucleotídeos podem ter qualquer estrutura tri-dimensional, e pode realizar qualquer função, conhecida ou desconhecida. Os exemplos não limitantes de polinucleotídeos incluem um 15 gene, um fragmento de gene, exons, introns, RNA mensageiro (mrna), RNA de transferência, RNA ribossômico, ribozimas, cdna, polinucleotídeos recombinantes, polinucleotídeos ramificados, plasmídeos, vetores, DNA isolado de qualquer seqüência, RNA isolado de qualquer seqüência, sondas de ácido nucleico e iniciadores. 20 Um polinucleotídeo é tipicamente composto de uma seqüência específica de quatro bases de nucleotídeo: adenina (A); citosina (C); guanina (G); e timina (T) (uracila (U) no lugar de timina (T) quando o polinucleotídeo é RNA). Assim, o termo seqüência de ácido nucleico é a representação alfabética de uma molécula de polinucleotídeo. Esta representação alfabética 25 pode ser introduzida em bases de dados em um computador tendo uma unidade de processamento central e usada para aplicações de bioinformáticas tais como genômicas funcionais e pesquisa de homologia. Um "vetor" é capaz de transferir seqüências de ácido nucleico para alvejar células (por exemplo, vetores virais, vetores não virais,

23 carreadores particulados, e lipossomas). As células alvo podem ser procarióticas ou eucarióticas. Tipicamente, "construção de vetor," "vetor de expressão," e "vetor de transferência de gene," significam qualquer construção de ácido nucleico capaz de direcionar a expressão de um gene de 5 interesse e que pode transferir seqüências de gene para alvejar células. Assim, o termo inclui veículos de clonagem e expressão, bem como vetores virais. Um "plasmídeo" é um vetor na forma de um elemento genético extracromossômico. Uma seqüência de ácido nucleico que "codifica" um antígeno 10 selecionado é uma molécula de ácido nucleico que é transcrita (no caso de DNA) e traduzida (no caso de mrna) em um polipeptídeo in vivo ou in vitro quando colocado sob o controle de seqüências reguladoras apropriadas. Os limites da seqüência codificadora são determinados por um códon de partida no terminal 5' (amino) e um códon de parada de tradução no terminal 3' 15 (carbóxi). Para os propósitos da invenção, tais seqüências de ácido nucleico podem incluir, mas não são limitados a, cdna a partir de mrna viral, procariótico ou eucariótico, seqüências genômicas de DNA ou RNA virais ou procarióticos, e ainda seqüências de DNA sintéticas. Uma seqüência de terminação de transcrição pode estar localizada 3' em relação à seqüência 20 codificadora. Em alguns casos uma seqüência transcrita pode dar origem a polipeptídeos múltiplos, por exemplo um transcrito pode conter matrizes de leitura aberta múltiplas (ORFs) e também um ou mais Sítios de Entrada de Ribossoma Interno (IRES) para possibilitar a tradução de ORFs depois da 25 primeira ORF. Um transcrito pode ser traduzido para dar um polipeptídeo que é subseqüentemente clivado para dar uma pluralidade de polipeptídeos. Em alguns casos uma construção de ácido nucleico pode dar origem a transcritos múltiplos e por este motivo uma pluralidade de polipeptídeos. Um "promotor" é uma seqüência de nucleotídeo que inicia e

24 regula a transcrição de um polinucleotídeo que codifica polipeptídeo. Os promotores podem incluir promotores indutíveis (onde a expressão de uma seqüência de polinucleotídeo operavelmente ligada ao promotor é induzida por um análito, co-fator, proteína reguladora, etc.), promotores repressíveis 5 (onde a expressão de uma seqüência de polinucleotídeo operavelmente ligada ao promotor é reprimida por um análito, co-fator, proteína regulatória, etc.), e promotores constitutivos. É intencionado que o termo "promotor" ou "elemento de controle" inclui regiões promotoras e segmentos funcionais de tamanho natural (por exemplo, transcrição ou tradução de controle) destas 10 regiões. "Operavelmente ligada" refere-se a um arranjo de elementos em que os componentes assim descritos são configurados de modo a realizar a sua função usual. Assim, um dado promotor operavelmente ligado a uma seqüência de ácido nucleico é capaz de efetuar a expressão daquela seqüência 15 quando as enzimas apropriadas estão presentes. O promotor não precisa ser contíguo com a seqüência, contanto que o mesmo funcione para direcionar a sua expressão. Assim, por exemplo, seqüências interventoras não traduzidas embora transcritas podem estar presentes entre a seqüência promotora e a seqüência de ácido nucleico e a seqüência promotora pode ser ainda 20 considerada "operavelmente ligada" à seqüência codificadora. "Recombinante" é aqui usado para descrever uma molécula de ácido nucleico (polinucleotídeo) de origem genômica, cdna, semissintética ou sintética que, em virtude da sua origem ou manipulação não está associada com toda ou uma porção do polinucleotídeo com que a mesma está associada 25 na natureza e/ou está ligada a um polinucleotídeo outro que não aquele ao qual a mesma está ligada na natureza. Duas seqüências de ácido nucleico que estão contidas dentro de uma molécula de ácido nucleico recombinante única são "heterólogas" em relação uma à outra quando as mesmas não estão normalmente associadas uma com a outra na natureza.

25 Os homólogos de polinucleotídeos são aqui aludidos. Tipicamente um polinucleotídeo que é homólogo a um outro polinucleotídeo é pelo menos 70% homólogo ao polinucleotídeo, preferivelmente pelo menos 75, 80 ou 90% e mais preferivelmente pelo menos 95%, 97% ou 99% 5 homólogo a este. Os métodos de medir a homologia são bem conhecidos na técnica e será entendido por aqueles de habilidade na técnica que no presente contexto, homologia é calculada com base na identidade de ácido nucleico. Tal homologia, por exemplo, pode existir em uma região de pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 30, por exemplo pelo menos 40, 60 ou 100 ou 10 mais nucleotídeos contíguos. A região de homologia pode ser acima de pelo menos 150, preferivelmente pelo menos 200 e ainda mais preferivelmente acima de pelo menos 300 nucleotídeos. A região de homologia pode dizer respeito a qualquer um dos elementos aqui aludidos em relação às construções de ácido nucleico da invenção. Em alguns casos, a região de homologia pode 15 ser acima da região inteira em questão, tal como, por exemplo, acima da região inteira de qualquer um dos elementos aqui especificados. Níveis equivalentes de homologia de aminoácido àqueles aludidos em relação à homologia de nucleotídeo acima pode estar presente. Assim, qualquer um dos níveis mencionados acima de homologia podem se 20 aplicar ao nível de aminoácido. Homologia ao nível de aminoácido, por exemplo, pode ser acima de pelo menos 15, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente acima de pelo menos 50, ainda mais preferivelmente pelo menos 75 e ainda mais preferivelmente acima de pelo menos 100 aminoácidos. A região de homologia pode estar acima do comprimento 25 inteiro do elemento em questão. Métodos de medir a homologia ou identidade de polinucleotídeo são conhecidos na técnica. Por exemplo o Pacote UWGCG fornece o programa BESTFIT que pode ser usado para calcular a homologia (por exemplo, usado nos seus ajustes de valor padrão) (Devereux et al (1984)

26 Nucleic Acids Research 12, p387-395). Os algoritmos de PILEUP e BLAST também podem ser usados para calcular a homologia ou seqüências arranjadas (tipicamente nos seus ajustes de valor padrão), por exemplo como descrito em Altschul S. F. 5 (1993) J Mol Evol 36: 290-300; Altschul, S, F et al (1990) J Mol Biol 215: 403-10. O software para realizar a análise BLAST está publicamente disponível através da National Centre for Biotechnology Information (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo envolve primeiro identificar 10 pares de seqüência de alta classificação (HSPs) pela identificação de palavras curtas de comprimento W na seqüência dúvida que se iguala ou satisfaz algumas contagens de patamar de valor positivo T quando alinhada com uma palavra do mesmo comprimento em uma seqüência da base de dados. T é aludido como o patamar de contagem de palavra da vizinhança (Altschul et 15 al, supra). Este acerto de palavra da vizinhança inicial atua como sementes para iniciar pesquisas para encontrar HSPs que as contenham. Os acertos de palavra são estendidos em ambas as direções junto de cada seqüência de modo que a contagem de alinhamento acumulativo possa ser aumentado. As extensões para os acertos de palavra em cada direção são paradas quando: a 20 contagem de alinhamento acumulativo vai a zero ou abaixo, devido ao acúmulo de um ou mais alinhamentos de resíduo de contagem negativa; ou o final de cada seqüência é atingido. Os parâmetros de algoritmo BLAST W, T e X determina a sensibilidade e velocidade do alinhamento. O programa BLAST usa como valores padrão um comprimento de palavra (W) de 11, os 25 alinhamentos de matriz de contagem BLOSUM62 (ver Henikoff e Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919) (B) de 50, expectação (E) de 10, M = 5, N = 4, e uma comparação de ambos os filamentos. O algoritmo BLAST realiza uma análise estatística da similaridade entre duas seqüências; ver por exemplo, Karlin e Altschul (1993)

27 Proc. Natl, Acad. Sci. USA 90: 5873-5787. Uma medida de similaridade fornecida pelo algoritmo BLAST é a menor probabilidade de soma (P(N)), que fornece uma indicação da probabilidade pela qual um emparelhamento entre duas seqüências de nucleotídeo ou aminoácido ocorreriam ao acaso. Por 5 exemplo, uma seqüência é considerada similar a uma outra seqüência se a menor probabilidade de soma em comparação da primeira seqüência para a segunda seqüência for menor do que cerca de 1, preferivelmente menor do que cerca de 0,1, mais preferivelmente menor do que cerca de 0,01, e o mais preferivelmente menor do que cerca de 0,001. 10 Os homólogos tipicamente hibridizam com o polinucleotídeo relevante em um nível significantemente acima do fundo. O nível de sinal gerado pela interação entre o homólogo e o polinucleotídeo é tipicamente pelo menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 100 vezes, tão intenso quanto a "hibridização de fundo". A intensidade de interação pode ser medida, por 15 exemplo, pela radiorrotulação da sonda, por exemplo, com 32P. A hibridização seletiva é tipicamente obtida usando condições de severidade média a alta, (por exemplo, 0,03 M de cloreto de sódio e 0,003 M de citrato de sódio de cerca de 50 C a cerca de 60 C. As condições de hibridização severas podem incluir 50% de 20 formamida, 5x de Solução de Denhardt, 5x SSC, 0,1% de SDS e 100 µg/ml de DNA de esperma de salmão desnaturado e as condições de lavagem podem incluir 2x SSC, 0,1% de SDS a 37 C seguido por 1 x SSC, 0,1% de SDS a 68 C. Definir as condições de hibridização apropriadas está dentro da habilidade da técnica. Ver, por exemplo, Sambrook et al., supra. 25 O homólogo pode diferir de uma seqüência no polinucleotídeo relevante em menos do que 3, 5, 10, 15, 20 ou mais mutações (cada uma das quais pode ser uma substituição, duplicação, deleção ou inserção). Estas mutações podem ser medidas em uma região de pelo menos 30, por exemplo pelo menos 40, 60 ou 100 ou mais nucleotídeos contíguos do homólogo. Em