VALÉRIA AQUINO CANTERLE

MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO SECRETARIA DE EDUCAÇÃO MÉDIA E TECNOLÓGICA CENTRO FEDERAL DE EDUCAÇÃO TECNOLÓGICA DE BENTO GONÇALVES CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM VITICULTURA E ENOLOGIA DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES SOMÁTICOS DE BRS CLARA EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA VALÉRIA AQUINO CANTERLE Bento Gonçalves 2007

VALÉRIA AQUINO CANTERLE DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES SOMÁTICOS DE VIDEIRA BRS CLARA EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA Monografia apresentada como um dos requisitos para a conclusão do Curso Superior de Tecnologia em Viticultura e Enologia Orientador: Eduardo Giovannini Supervisora: Regina Beatriz Bernd Bento Gonçalves 2007

AGRADECIMENTOS A Deus, por me acompanhar nos momentos difíceis e por ter me permitido chegar até aqui. A minha família e amigos, que sempre compartilharam comigo meus sonhos, vitórias e derrotas, alegrias e tristezas, incentivando-me a prosseguir a jornada, independente dos obstáculos. A eles, que mantiveram-se sempre ao meu lado, dedico essa conquista com a mais profunda admiração e gratidão. Aos mestres, por compartilharem comigo suas próprias experiências. O meu sincero agradecimento pela orientação constante, pelo auxílio nas lutas e por não se limitarem a ser apenas professores. O que importa de verdade na vida não são os objetivos a que nos propomos, mas os caminhos pelos quais seguimos para consegui-los. (Peter Bamm)

SUMÁRIO INTRODUÇÃO... 6 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 8 2.1 CARACTERIZAÇÃO DA CULTIVAR BRS CLARA... 8 2.2 EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA E REGENERAÇÃO DE PLANTAS 8 3 MATERIAL E MÉTODOS... 12 3.1 CONDUÇÃO DO EXPERIMENTO E VARIEDADE... 12 3.2 TRATAMENTOS... 13 3.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA... 13 3.4 VARIÁVEIS ANALISADAS... 14 4 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 15 CONCLUSÃO... 19 REFERÊNCIAS... 20

5 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Médias dos valores das avaliações de reatividade dos explantes ao meio de cultura, formação de raízes, formação de folhas e regeneração de plantas por tratamento...15 Tabela 2 Freqüências observadas e relativas (%) de reatividade dos explantes ao meio de cultura, formação de raízes, formação de folhas e regeneração de plantas por tratamento...17

1 INTRODUÇÃO A viticultura mundial está concentrada em regiões de clima temperado, porém é uma atividade com grande potencial para as regiões tropicais. No Brasil, a cultura da videira situa-se entre os paralelos 9 o S e 32 o S. As uvas de mesa constituem em grande oportunidade para cultivo sob condições tropicais. No Vale do São Francisco esta atividade já tem uma certa tradição, porém ressente-se de cultivares com alto valor mercadológico (apirênicas) e adaptadas às condições regionais. A falta de cultivares de uvas sem sementes (apirênicas) adaptadas às condições fitossanitárias e ambientais do Brasil, além de limitar a capacidade de exportação da fruta in natura, afeta a competitividade da uva brasileira, também no mercado interno, aberto à comercialização de uvas importadas (Mello, 2002). As moléstias fúngicas constituem em um dos principais problemas fitossanitários em todas as regiões produtoras de uva do Brasil, onde as condições climáticas são favoráveis ao desenvolvimento de fungos. O controle destes pode atingir 30% do custo da uva (Grigoletti e Sônego, 1993). Os mecanismos de controle utilizados para impedir as infecções por fungos envolvem, na sua maior parte, pulverizações repetidas de produtos químicos combinados com as práticas de manejo do dossel. O uso de produtos químicos, se repetido regularmente, pode induzir resistência na população de patógenos. Além disso, a aplicação de produtos químicos está se tornando cada vez mais indesejável e um número crescente de consumidores prefere produtos mais saudáveis e naturais. Os efeitos adversos, a longo prazo, de agrotóxicos no ambiente ainda não são conhecidos (Vivier,1999). Ao lançar as três primeiras cultivares brasileiras de uva sem semente (BRS Clara, BRS Linda e BRS Morena), a Embrapa Uva e Vinho deu um passo importante para assegurar a competitividade, a sustentabilidade e a independência tecnológica da viticultura de mesa nas regiões tropicais e subtropicais do Brasil (Camargo et al., 2003a, 2003b, 2003c).

7 No entanto, a busca de novas cultivares com características agronômicas que atendam as demandas da cadeia produtiva da viticultura brasileira é um desafio constante. O melhoramento genético de plantas através da transformação genética surge como uma nova alternativa para o controle de moléstias fúngicas na cultura da videira. A incorporação de genes de interesse em plantas por técnicas da engenharia genética tem grande potencial para a melhoria da videira (Gutoranov, 2001). Através da transformação genética de plantas, pode-se transferir um único gene, mantendo as características da cultivar inalteradas. Seria difícil conseguir resultado similar por métodos convencionais devido ao genótipo altamente heterozigótico (Franks et al., 1998). Para o sucesso da engenharia genética, a regeneração de plantas a partir de células ou tecidos somáticos é um pré-requisito necessário. Entre os dois caminhos de regeneração existentes, a organogênese in vitro foi considerada imprópria para a transformação, enquanto a embriogênese in vitro tem sido usada com sucesso (Torregrosa, 1998). Aumentar a eficiência da regeneração de plantas a partir de embriões somáticos produzidos via embriogênese somática constitui um ponto importante para o sucesso da transformação genética da videira. Este trabalho apresenta as atividades desenvolvidas no Laboratório de Cultura de Tecidos da Embrapa Uva e Vinho com objetivo de avaliar o desenvolvimento de embriões somáticos da cultivar BRS Clara em meios de regeneração de plantas, avaliar a formação de raízes, desenvolvimento da parte aérea, bem como avaliar diferentes estádios de desenvolvimento do embrião no processo de regeneração de plantas.

8 2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1 CARACTERIZAÇÃO DA CULTIVAR BRS CLARA A cultivar BRS Clara foi obtida através do cruzamento entre as cultivares CNPUV 154-147 e Centennial Seedless, através do método clássico de melhoramento, realizado em 1998, na Estação Experimental de Viticultura Tropical EEVT, da Embrapa Uva e Vinho, em Jales, SP. Caracteriza-se por ser uma cultivar vigorosa e fértil, adaptada ao cultivo nas condições tropicais, onde foi testada. Apresenta um ou dois cachos por ramo, sendo que o primeiro atinge cerca de 500 a 600 gramas. Com manejo adequado, produz facilmente 30 toneladas/hectare/ano nas regiões de Jales e de Pirapora (duas podas e uma colheita) e no Vale do São Francisco (duas colheitas de 15 ton/ha/ano). Em relação às moléstias fúngicas, esta cultivar apresenta comportamento similar à cv. Itália, devendo ser adequadamente protegida, com atenção para o Míldio (Plasmopara viticola). 2.2 EMBRIOGÊNESE SOMÁTICA E REGENERAÇÃO DE PLANTAS Embriogênese somática, adventícia ou assexual são termos usualmente empregados para designar o processo pelo qual células haplóides ou somáticas desenvolvem-se por meio de diferentes estádios embriogênicos, dando origem a uma planta, sem que ocorra fusão de gametas (Williams e Maheswaran, 1986). Esta técnica foi descrita pela primeira vez por Steward et al (1958) e Reinert (1958), em cenoura. Atualmente é relatada em mais de 300 espécies. A embriogênese somática é um método importante de propagação de plantas in vitro. Também é uma estratégia para estudos básicos relacionados com a fisiologia de desenvolvimento do embrião, apresentando facilidade de manipulação experimental em relação a embriões zigóticos, já que estes precisam ser localizados

9 no saco embrionário. A embriogênese somática vem sendo utilizada para a produção de plantas transgênicas e sementes sintéticas (Schultheis et al., 1990). A embriogênese somática constitui um exemplo da expressão da totipotência das células das plantas, ou seja, qualquer célula contém informações genéticas necessárias e pode regeneração de uma planta completa (Krikorian e Berquam, 1969). Em geral, quase todas as partes da planta podem ser usadas como explante inicial na indução da embriogênese somática: ápices caulinares, discos foliares, segmentos foliares, inflorescências e raízes, dentre outros (Chu et al, 1984). O padrão de desenvolvimento de um embrião somático em dicotiledôneas apresenta muitas características morfológicas semelhantes a do embrião zigótico. Inicialmente, ambos são caracterizados pela diferenciação de uma estrutura bipolar, constituída de ápice caulinar e radicular. Ambos passam pelos estádios de desenvolvimento pró-embrionário: globular e embrionário: cordiforme, torpedo e cotiledonar. Dois padrões básicos de expressão da embriogênese somática ocorrem in vitro. O primeiro corresponde ao modelo direto, no qual os embriões somáticos originam-se dos tecidos matrizes sem a formação de estádios intermediários de calo. (Guerra & Handro, 1991). O segundo padrão corresponde ao modelo indireto, no qual os embriões somáticos se formam a partir de um calo, que apresenta células em distintos estágios de diferenciação, as quais podem adquirir novas competências mediadas por mensageiros químicos específicos (Steward et al, 1958). Na maioria dos modelos de embriogênese induzida in vitro, as auxinas e entre elas o ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), são consideradas as substâncias responsáveis por desencadearem os processos de diferenciação e desdiferenciação (modelos indiretos) alterando determinação e conferindo novas competências às células responsivas presentes nos explantes. Uma vez que cada clone apresenta características únicas, determinadas por fatores genéticos, as necessidades para seu cultivo in vitro parecem estar associadas não apenas ao genótipo, mas também à atividade fisiológica na plantamatriz, sob o controle de diversos fatores endógenos. O verdadeiro desafio, portanto, está no material vegetal e na sua manipulação antes de excisar o explante inicial, e em todos os passos até o transplantio da planta produzida. Esta

10 manipulação inclui o manejo da planta matriz, as características do explante utilizado, o procedimento da subcultura adotado, as condições ambientais e microambientes dentro do frasco de cultura e o transplantio. Todas essas etapas são influenciadas por diversas variáveis imponderáveis, que frequentemente restringem a repetição dos resultados e dificultam a determinação de um protocolo efetivo de micropropagação (Torres et al. 1998). Cada espécie vegetal, ou mesmo diferentes genótipos dentro de uma mesma espécie, tem diferentes exigências nutricionais e hormonais para sua regeneração. O agente e a metodologia de seleção a serem utilizados também dependem do tipo de explante e do genótipo estudados. Mesmo para espécies cujos protocolos de regeneração e transformação já estejam estabelecidos, sua reprodução em outras condições de laboratório nem sempre é possível. Assim, o domínio da regeneração é um problema geral, qualquer que seja a espécie vegetal considerada, existindo ou não uma metodologia de transformação previamente descrita. Os principais fatores que afetam a indução de embriogênese somática são: o explante, o genótipo, a composição química do meio nutritivo (sais minerais, carboidratos, reguladores de crescimento), concentração osmótica e as condições físicas. O meio de cultura pode ser definido como uma formulação entre sais inorgânicos e compostos orgânicos requeridos para a nutrição e manipulação das culturas. Existem numerosas formulações, cada uma delas compreende entre 6 e 40 compostos. Os meios de cultura se compõem de uma fonte de carbono, nutrientes minerais, substâncias vitamínicas, substâncias reguladoras de crescimento, agente gelificante (em caso de meio semi-sólido), entre outros compostos. Praticamente todos os cultivos são heterotróficos e por isso necessitam de uma fonte de carbono. A sacarose é a mais utilizada. O myo-inositol pode ser incorporado em meios de cultura resultando em um melhor crescimento dos cultivos. Os macro e micronutrientes compreendem altas concentrações de nitrogênio, na forma de íon amônio ou nitrato de potássio. O ferro é incorporado conjuntamente com um agente quelante (Na 2 EDTA), que se faz disponível em ampla faixa de ph.

11 Entre as substâncias vitamínicas, a tiamina é a única indispensável para o bom crescimento das culturas. Também incorporara-se ácido nicotínico, piridoxina HCl, Glicina. Os reguladores de crescimento comumente usados são as auxinas (ácido naftalenoacético - ANA, ácido 2,4-diclorofenoxiacético - 2,4-D, ácido indolacético - AIA, ácido indol-butírico - IBA, ácido β-naftoxiacetico - NOA, Dicamba e Picloram), as citocininas (Benzilaminopurina BA e Thiadizurón) e as giberelinas, especialmente o ácido giberélico. Entre os agentes gelificantes mais utilizados em meios semi-sólidos são: o ágar, o agargel, o transfergel, o phytagel, a agarose e a gelrite. Muitas outras substâncias de variada composição química são adicionadas ao meio de cultura. O carvão ativado pode ser incorporado ao meio para a absorção de metabólitos tóxicos ao cultivo. Em alguns casos é necessário adicionar antioxidantes (L-cisteína, ácido ascórbico, polivinilpirrolidona) para prevenir o escurecimento do tecido causado pela oxidação de polifenóis presentes nos explantes. Entre as condições físicas pode-se mencionar os efeitos da temperatura: quanto mais próximas das ótimas para a espécie, maior será a resposta esperada; a umidade relativa: sua queda pode promover uma perda de água do meio, variando a concentração de seus compostos até chegar a níveis tóxicos; luminosidade: deve ser avaliada quanto à qualidade, intensidade e tempo de administração. A luz favorece a diferenciação de órgãos. (Echenique e Rubinstein, 2004).

3 MATERIAL E MÉTODOS 3.1 CONDUÇÃO DO EXPERIMENTO Os embriões somáticos da cultivar BRS Clara foram obtidos a partir de: Flores jovens (10 dias antes da antese) desta cultivar, as quais foram removidas de estacas cultivadas em câmara de nebulização. Cada flor foi retirada da haste principal da inflorescência, a fim de que todas flores fossem igualmente esterilizadas. A esterilização superficial procedeu-se com a imersão das flores em solução de hipoclorito de sódio 30% e Tween (1 gota/100 ml), detergente utilizado para a quebra de tensão superficial da flor, durante 10 minutos. Após realizaram-se 3 lavagens consecutivas com água destilada estéril em ambiente asséptico. As anteras foram removidas sob microscópio estereoscópio em câmara de fluxo laminar horizontal. As flores foram abertas na parte superior ao cálice (na inserção com a corola) e as anteras retiradas com o filete. As mesmas foram inoculadas em placa de Petri (100 x 20mm) contendo meio de cultura inicial (PIV) para indução de calogênese, com o filete voltado para cima. O meio PIV foi utilizado segundo o protocolo de Franks et al.(1998) e possui macronutrientes de Nitsch e Nitsch (1969), micronutrientes e FeEDTA de Murashige e Skoog (1962), vitaminas de Gamborg et al (1968), 6% de sacarose, caseína hidrolisada (1g/L), agente gelificante Gelrite (Sigma), reguladores de crescimento 2-4D (ácido 2,4 diclorofenoxiacético) e BAP (benzilaminopurina). Após a inoculação em meio inicial, as anteras foram mantidas em sala de cultura com temperatura 24 a 28 C, no escuro. Durante o período de indução da calogênese, os explantes foram mantidos no mesmo meio, sendo transferidos para novo meio de cultura a cada 30 dias. As avaliações para verificar a formação de calos foram feitas a cada repicagem. Os calos com diâmetro superior a dois milímetros foram transferidos para meio GS1CA, de Franks et al.(1998) mantidos nas mesmas condições de temperatura e luminosidade. Esse procedimento foi utilizado para o desenvolvimento dos calos e

13 posterior formação de embriões somáticos. Estes embriões foram individualizados, com auxílio de instrumentos cirúrgicos (pinças e bisturís estéreis) e separados de acordo com seu estádio de desenvolvimento. Depois de individualizados, foram transferidos em número de 20 por placa de Petri para os diferentes meios de regeneração de plantas. 3.2 TRATAMENTOS Os tratamentos foram compostos por 2 fatores: Fator 1: Meio de regeneração de plantas - Murashige e Skoog (1962) -MS ½ sais; - Murashige e Skoog (1962) com vitaminas do complexo vitamínico B5 de Gambog et al.(1968) - MS ½ sais e B5 vitaminas; - Galzy (1964) - Galzy; - Woody Plant Medium de Lloyd e McCown (1986)-WPM Todos os meios de cultura foram preparados com adição de 3% de sacarose, 0,6% de ágar, ph 5.7, e expostas a fotoperíodo de 16 horas de luz e temperatura de 26 C. Fator 2: Estádio de desenvolvimento do embrião - Estádio imaturo, com predominância de estádios iniciais do tipo globular; - Estádio maduro, com predominância de estádios mais desenvolvidos do tipo torpedo; 3.3 DELINEAMENTO E ANÁLISE ESTATÍSTICA Os tratamentos do fator 1, meios de regeneração de plantas, foram combinados com os tratamentos do fator 2, estádio de desenvolvimento do embrião, em um delineamento fatorial 4x2, correspondendo a 8 tratamentos. Cada tratamento com 5 repetições. Cada placa constituiu uma parcela, sendo cada uma composta por 20 embriões, o que resultou em 40 placas úteis para o experimento. Os respectivos tratamentos foram distribuídos aleatoriamente sobre 800 embriões de acordo com o delineamento inteiramente casualisado.

14 Foram feitas repicagens para novos meios aos 30 e 60 dias de cultura. Os embriões foram avaliados aos 60 dias de cultivo. Os tratamentos foram submetidos à análise de variância e as médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade. Desta forma, os tratamentos são os seguintes: T1 - MS ½ sais maduro T2 - MS ½ sais imaturo T3 - MS ½ sais e B5 vitaminas maduro T4 - MS ½ sais e B5 vitaminas imaturo T5 - Galzy maduro T6 - Galzy imaturo T7 - WPM maduro T8 - WPM imaturo 3.4 VARIÁVEIS ANALISADAS - Formação de raízes ou radículas a partir do embrião. - Formação de folhas a partir do embrião. - Regeneração de plântulas inteiras. Conjunto entre formação de raízes, parte aérea e desenvolvimento de folhas.

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO Os resultados de regeneração de plantas obtidos no meio de cultura WPM foram significativamente maiores do que os verificados nos demais meios de cultura. Estes resultados diferem daqueles obtidos por Amaral et al. (2001), com embriões zigóticos, que obteve 15% de embriões regenerados neste meio. O observado neste trabalho foi uma taxa de, aproximadamente, 33% de regeneração de plantas para o meio de cultura WPM (Tabela 1). Tabela 1 Médias dos valores das avaliações de reatividade dos explantes ao meio de cultura, formação de raízes, formação de folhas e regeneração de plantas por tratamento Tratamentos Raízes Folhas Regeneração T1-MS maduro 6,2 b 4,0 b 4,0 ab T2-MS imaturo 6,0 b 2,6 b 1,4 b T3-MS e B5 maduro 16,4 a 3,6 b 3,6 ab T4-MS e B5 imaturo 14,0 a 0,8 b 0,8 b T5-Galzy maduro 6,4 b 4,0 b 4,0 ab T6-Galzy imaturo 6,2 b 3,6 b 1,0 b T7-WPM maduro 7,8 b 12,4 a 6,6 a T8-WPM imaturo 7,8 b 10,8 a 1,8 b Médias seguidas por mesma letra na coluna não diferem significativamente entre si pelo teste de a Tukey 5% de probabilidade. Não significativo. Para a obtenção de plantas provenientes de cruzamento entre genitores apirênicos, videiras que produzem frutos com ausência de sementes, Amaral et al. (2001) fez o cultivo in vitro de embriões zigóticos em meio de cultura Woody Plant (WP), de Lloyd e McCown (1986), modificado pelo acréscimo de 0,65% de ágar, 3% de sacarose, 0,3% de carvão ativado e suplementado com BAP (Benzilaminopurina) 1uM. Estes embriões foram mantidos em sala de crescimento com controle de

16 temperatura (26 C), fotoperíodo de 16 horas de luz, por um período de 1 a 3 meses até desenvolverem plântulas. Amaral et al. (2001) ainda sugere subcultivar em meio Galzy (1964) as plantas que não apresentarem desenvolvimento normal, tais como aquelas parcialmente albinas, com cotilédones hiperhidratados, com deformidades nas folhas ou no sistema radicular. Conforme Oliveira et al. (1994), este subcultivo possibilitou a recuperação das partes da planta com germinação anormal, o que pode ser atribuído às características do meio nutritivo, reconhecido pela eficácia com que promove enraizamento e desenvolvimento da videira in vitro. Conforme Torregrosa (1998), para executar a técnica da engenharia genética em videira, a regeneração de plantas completas através de células ou tecidos somáticos é um pré-requisito fundamental. Para a regeneração de plantas das cultivares de Vitis vinifera Portan, Danuta, Syrah e Ugni Blanc, o autor sugere transferir os embriões somáticos para meio MS (Murashige e Skoog, 1962) com metade dos sais, sem a utilização de reguladores de crescimento e expostos às seguintes condições de cultura: fotoperíodo de 15 horas, temperatura 26 C, humidade 70%. Usualmente, 50 a 70% dos embriões somáticos transferidos para estas condições de germinação, tiveram um desenvolvimento normal suficiente para promover a micropropagação de plantas. Para a regeneração de plantas de videira, Franks et al (1998) transferiu embriões somáticos da cultivar Vitis vinifera Sultana para meio de regeneração com com macroelementos, microelementos, FeEDTA de MS (Murashige e Skoog, 1962), B5 Vitaminas (Gamborg et al, 1968), 1,5% de sacarose. Nas primeiras 4 semanas com carvão ativo e sem reguladores de crescimento, para estimular a germinação. Após iniciarem a germinação, os embriões foram transferidos para mesmo meio, com adição de 10 um de BAP e sem carvão ativo, sob iluminação para estimular a brotação. Uma vez iniciada a brotação, os embriões foram transferidos para mesmo meio de cultura contendo 0,5 um de ANA (ácido naftalenoacético) para estimular o desenvolvimento de raízes. Conforme Scorza et al. (1995), embriões somáticos formados a partir de embriões zigóticos de Vitis vinifera Thompson Seedless, após a transformação genética, foram transferidos para meio de indução da germinação, WP (Lloyd e

17 McCown, 1981) com 1,5% de sacarose, 1 um de BAP, 0,3% de carvão ativado e 0,75% de ágar conforme o protocolo de Emershad e Ramming (1994). A associação de meio de cultura e o estádio de desenvolvimento do embrião apresentou resultado com diferença significativa no teste de médias para regeneração de plantas apenas para o meio WPM. Os estádios mais desenvolvidos do embrião (T7, maduro) apresentaram maior desenvolvimento do que o verificado em embriões menos desenvolvidos (T8, imaturos). Os embriões maduros apresentaram 33% de regeneração enquanto que os embriões imaturos apresentaram 9% de regeneração, aproximadamente. (Tabela 2). Tabela 2 Freqüências observadas e relativas (%) de reatividade dos explantes ao meio de cultura, formação de raízes, formação de folhas e regeneração de plantas por tratamento Tratamentos Raízes Folhas Regeneração T1-MS maduro 31 20 20 T2-MS imaturo 30 13 7 T3-MS e B5 maduro 82 18 18 T4-MS e B5 imaturo 70 4 4 T5-Galzy maduro 32 20 20 T6-Galzy imaturo 31 18 5 T7-WPM maduro 39 62 33 T8-WPM imaturo 39 54 9 O fato de os embriões em estádio de desenvolvimento mais avançados serem mais eficientes em regenerar plantas, pode estar relacionado com as menores exigências em balanço nutricional dos meios de cultura e ao tempo de permanência em cultura. Ramming (1990) se referiu à necessidade de meios mais complexos quanto menores e mais imaturos os embriões e de uma simulação in vitro das condições encontradas no interior da semente. Da mesma forma, Raghavan (1976) distinguiu duas fases no desenvolvimento do embrião, com necessidades diferenciadas para o cultivo in vitro. Na primeira fase, heterotrófica, as exigências para o desenvolvimento do embrião seriam maiores, na

18 segunda, autotrófica, o embrião se caracterizaria por não depender mais de fontes exógenas de reguladores de crescimento. Nos demais tratamentos não foram observadas diferenças significativas no teste de médias. Na formação de folhas e desenvolvimento da parte aérea verificou-se superioridade do meio de cultura WPM, como pode ser observado nos tratamentos 7 e 8 da tabela 1, em relação aos demais tratamentos, na média do experimento. O meio WPM proporcionou a formação de folhas em 62% dos embriões, enquanto que nos demais, esta taxa não ultrapassou 20%. A formação de raízes observada no meio de cultura MSB5 (tratamentos 3 e 4, Tabela 1), foi significativamente maior em relação aos demais tratamentos. Este meio de cultura proporcionou o desenvolvimento de raízes em até 82% dos embriões, enquanto que nos demais tratamentos esta taxa não ultrapassou 39%. Verificou-se neste trabalho uma relação entre o desenvolvimento da parte aérea e a formação de raízes. Há maior dificuldade para a planta desenvolver a parte aérea quando a raíz se encontra formada, como pode ser observado nos tratamentos 3 e 4, nos quais houve o desenvolvimento da raiz em até 82% enquanto que para os mesmos tratamentos a taxa de formação de folhas não ultrapassou 20%.

5 CONCLUSÃO O meio de cultura Woody Plant medium mostrou-se eficiente no processo de regeneração de plantas de BRS Clara. Este meio de cultura também apresentou resultados com diferença significativa na formação de folhas e desenvolvimento da parte aérea nas condições estabelecidas para este experimento. A formação de raízes observada no meio de cultura MSB5 foi significativamente maior em relação aos demais tratamentos. Os estádios mais desenvolvidos do embrião apresentaram maior desenvolvimento do que o verificado em embriões menos desenvolvidos. Os embriões maduros apresentaram 33% de regeneração enquanto que os embriões imaturos apresentaram 9% de regeneração, aproximadamente.

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