ESPECTROSCOPIA NO INFRAVERMELHO PRÓXIMO COMO FERRAMENTA NA DETECÇÃO DE ADULTERAÇÃO EM AZEITE DE OLIVA EXTRA VIRGEM P.F. Filoda 1, L.F. Fetter 1, A.B. da Costa 1, G. A. Helfer 2, M. F. Ferrão 3, F. Barreto 4 1- Programa de Pós-Graduação em Sistemas e Processos Industriais Universidade de Santa Cruz do Sul, Av. Independência, 2293 Cep: 96815-900 Santa Cruz RS Brasil, Fone: 0xx51 3717 7632 e-mail: (adilson@unisc.br) 2- Departamento de Computação Universidade de Santa Cruz do Sul, Av. Independência, 2293 Cep: 96815-900 Santa Cruz RS Brasil 3- Instituto de Química - Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Av. Bento Gonçalves, 9500 - Cep: 91501-970 - Porto Alegre RS Brasil 4- Laboratório de Análise de Resíduos de Pesticidas e Medicamentos Veterinários Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento, Av. da Serraria, 3036 Cep: 91780-580 - Ponta Grossa, Porto Alegre RS Brasil RESUMO A utilização da técnica de espectroscopia no Infravermelho com Transformada de Fourier (FT-IR) tem sido muito utilizada combinada com a calibração multivariada no monitoramento de adulterações de azeite de oliva pela adição de óleos vegetais de menor valor comercial. Neste contexto, o objetivo do trabalho foi utilizar a espectroscopia no Infravermelho Próximo com Transformada de Fourier para verificar a autenticidade do azeite de oliva extra virgem adulterado com óleo de soja, combinar os dados espectrais com a calibração multivariada por PLS para quantificar os níveis de adulteração e por fim, avaliar o desempenho do modelo de calibração obtido. A metodologia proposta indicou ser uma potencial ferramenta para detecção e quantificação de adulteração em azeite de oliva extra virgem com óleo de soja, no entanto, em concentrações menores de adulterante, a técnica apresentou limitações quanto a predição da concentração das amostras, tornando-a adequada para níveis de adulteração acima de 5 %. ABSTRACT - The use of Spectroscopy Infrared Fourier Transform Spectroscopy (FTIR) has been widely used combined with multivariate calibration the monitoring olive oil adulteration by the addition of vegetable oils of lower commercial value. The aim of this work was to use the near infrared spectroscopy with Fourier transform (FT-NIR) to verify the authenticity of extra virgin olive oil adulterated with soybean oil, combine with the spectral data by PLS multivariate calibration for quantifying the levels of adulteration and finally, to evaluate the performance of the obtained calibration model. The proposed methodology indicated to be a potential tool for the detection and quantification of adulteration in extra virgin olive oil with soybean oil, however, in lower adulterant concentrations, the technique presented limitations on the prediction of the concentration of the samples, making it suitable for adulteration levels above 5%. PALAVRAS-CHAVE: azeite de oliva extra virgem; adulteração; espectroscopia no infravermelho; calibração multivariada. KEYWORDS: extra virgin olive oil; adulteration; near infrared spectroscopy; multivariate calibration. 1. INTRODUÇÃO O consumo de azeite de oliva tem aumentado muito nos últimos anos, pois sendo um alimento rico em antioxidantes naturais traz grandes benefícios à saúde (Downey et al. 2002). O azeite de oliva é normalmente o óleo mais caro entre os óleos de origem vegetal, devido aos custos do processo de
cultivo, colheita e extração do óleo. Tendo em vista que as adulterações de alimentos frequentemente envolvem a substituição de ingredientes de custo elevado por substitutos mais baratos, as fraudes envolvendo adulterações do azeite de oliva pela adição de outros tipos de óleos vegetais de menor valor comercial e de composição similar, tornam-se um grande problema tanto para a indústria como para a saúde e segurança dos consumidores (Flores et al. (2006); Vlachos et al. (2006)). Nos últimos anos, a utilização da técnica de espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR) tem sido muito utilizada em estudos com alimentos e particularmente, tem se tornado uma poderosa ferramenta analítica no estudo de óleos comestíveis e gorduras (Vlachos et al. 2006). Trata-se de uma técnica de análise rápida, não destrutiva e que requer o mínimo de preparo de amostra, que vem encontrando aplicações cada vez mais numerosas na quantificação de compostos e na diferenciação entre materiais de mesma natureza por meio da comparação dos perfis espectrais, sendo suficiente para indicar se há diferenças ou não (Inarejos-García et al., 2013). De acordo com Hirri et al. (2015), a espectroscopia FT-IR combinada com a calibração multivariada pode ser usada para monitorar adulterações em azeite de oliva extra virgem com óleos de qualidade inferior, onde os níveis de adulterantes foram determinados com sucesso utilizando o modelo de calibração por PLS (Regressão por Mínimos Quadrados Parciais). Neste contexto, o objetivo do trabalho foi utilizar a espectroscopia no infravermelho próximo com transformada de Fourier (FT-NIR) para verificar a autenticidade do azeite de oliva extra virgem adulterado com óleo de soja. Em um segundo momento, combinar os dados espectrais com a calibração multivariada por PLS para quantificar os níveis de adulteração e por fim, avaliar o desempenho do modelo de calibração obtido. 2. MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Amostragem Para o estudo, o azeite de oliva extra virgem com acidez 0,5 % e o óleo de soja, foram adquiridos no comércio local. As amostras de azeite de oliva foram consideradas como referência para o estudo, as quais foram então adulteradas com diferentes concentrações de óleo de soja (0,5-90 %, v/v), e em paralelo, foram preparadas amostras puras dos dois óleos, conforme apresentado na Tabela 1. As replicatas destas amostras receberam os sufixos A e B. Após a adulteração, as amostras foram agitadas para garantir a completa homogeneização. Tabela 1 Percentuais de adulteração com óleo de soja e a codificação das amostras do estudo. Codificação amostras Óleo de Soja (%) Codificação amostras Óleo de Soja (%) OLIVA 0,0 J300 30 A005 0,5 L350 35 B010 1,0 M400 40 C020 2,0 N500 50 D030 3,0 O600 60 E040 4,0 P700 70 F050 5,0 Q800 80 G100 10 R900 90 H150 15 SOJA 100 I200 20 2.2 Aquisição dos espectros no infravermelho
Os espectros foram obtidos em um espectrofotômetro Spectrum 400 (Perkin Elmer) empregando-se o acessório contendo esfera de integração, equipado com um detector Índio-Gálio- Arsênio, resolução de 4 cm -1 e 16 varreduras, utilizando os intervalos entre 4.000 e 10.000 cm -1. Com o uso de uma pipeta de Pasteur, 1mL de amostra foi depositado em uma capsula de quartzo com defletor de alumínio e posicionada sobre a esfera de integração. Foram adquiridas triplicatas dos espectros do conjunto das 19 amostras ilustradas na Tabela 1, cujas leituras foram utilizadas para a construção do modelo de calibração. Um segundo conjunto de 10 amostras cegas, foi adulterado e utilizado para efetuar a avaliação do desempenho do modelo através da predição. O espectro do branco foi obtido antes de cada análise. 2.3 Análise dos dados Após a obtenção dos espectros, os dados da matriz gerada foram submetidos a etapa de prétratamento para a remoção de informações físicas e/ou instrumentais que não estão relacionadas às informações químicas de interesse das amostras, utilizando o software Chemostat versão 1.0.1.2 (www.quimiometria.com.br). O pré-tratamento que melhor condicionou a matriz de dados para a análise foi obtido aplicando-se a normalização, primeira derivada e centrando os dados na média. A quantificação do percentual de óleo de soja no azeite de oliva extra virgem foi realizada através do algoritmo PLS utilizando o intervalo compreendido entre 6.000 e 4000 cm -1, relacionando as absorbâncias de cada amostra adulterada (matriz X) com as porcentagens utilizadas para a adulteração (matriz Y), onde o modelo de calibração obtido foi determinado em função do erro padrão de calibração (RMSEC) para o conjunto de dados de calibração. O conjunto de amostras cegas foi utilizado para evidenciar a eficácia do desempenho do modelo de calibração obtido em função do erro médio de previsão (RMSEP). 3. RESULTADOS E DISCUSSÃO A Figura 1 apresenta os espectros na região do infravermelho próximo referentes as amostras de azeite de oliva extra virgem adulteradas com óleo de soja na região entre 4.000 e 10.000 cm -1, podendo-se observar que os espectros apresentaram bandas semelhantes, sendo que a maior parte dos picos e bandas do infravermelho próximo são atribuídas aos grupos funcionais, conforme descrito por Inarejos-García et al. (2013). As diferenças espectrais notadas entre as amostras analisadas correspondem aos diferentes atributos de cada óleo, como por exemplo, suas composições e quantidades em ácidos graxos, trigliceróis, glicerol, esteróis, tocoferóis e fenóis (Lin et al. 2009). As bandas em torno de 8258 cm -1 são características de vibrações dos estiramentos das ligações C-H, enquanto que as bandas entre 7188 e 7064 cm -1, são decorrentes da combinação de vibrações das ligações C-H. As bandas em 5678 e 5790 cm -1 surgem a partir das vibrações dos estiramentos das ligações C-H de grupos metilas, metilênicos e etilênicos. A banda em 4660 cm -1, está relacionado às combinações das vibrações dos estiramentos das ligações C-H e C-O (Sinelli et al. 2010). A PC1 separou claramente as amostras com 100% de óleo de soja (SOJAA e SOJAB) das amostras com 100% de azeite de oliva (OLIVA e OLIVB), sendo que as amostras puras de óleo de soja encontraram-se para o lado negativo da PC1, enquanto as amostras puras do azeite de oliva, no lado positivo da PC1. Avaliando a disposição dos scores no gráfico PC1 x PC2 (Figura 2), podemos observar que as amostras com maiores concentrações de óleo de soja localizaram-se na parte negativa da PC1, onde estava a amostra com 100% de óleo de soja, o que nos indicou uma correta separação das amostras no gráfico. Observa-se também, que as amostras com menores concentrações de óleo de soja (A005A, A005B, B010A, B010B, C020A, C020B, E040A, 040B, G100A, G100B, I200A e a I200B) formara um
grupamento bastante próximo ao eixo central da PC2 (parte positiva da PC1), indicando maior proximidade destas em relação as amostras com 100% de azeite de oliva (OLIVA e OLIVB). Figura 1 Espectros no infravermelho próximo das 19 amostras utilizadas para a calibração, incluindo amostras puras de azeite de oliva extra virgem e óleo de soja. Ainda analisando o gráfico de scores da PC1xPC2 (Figura 2), nota-se que as amostras Q800A, Q800B, R900A e R900B, as quais possuem maiores proporções de óleo de soja em relação as demais amostras, encontram-se bastante próximas às amostras SOJAA e SOJAB, o que já era de se esperar. Adulterações inferiores a 50%, causaram a separação das amostras na parte positiva da PC1, enquanto que adulterações superiores a 50% de óleo de soja, encontraram-se separadas entre a parte positiva e negativa da PC2. Figura 2 Gráfico de scores PC1 x PC2 das 19 amostras utilizadas na calibração, incluindo amostras puras de azeite de oliva e óleo de soja.
No caso do azeite de oliva, 64-83% de sua composição é referente ao ácido oleico, enquanto que o óleo de soja, possui entre 50-57% em ácido linoleico. Esta diferença entre a composição destes óleos que causa as mudanças na intensidade das bandas dos perfis espectrais, resultado dos sobretons e combinações das vibrações das ligações das moléculas dos ácidos graxos que absorvem em comprimentos de ondas distintos (Downey et al. (2002); Vlachos et al. (2006)). A Figura 3 apresenta o comportamento dos loadings da PC1, onde pode-se verificar que as variáveis entre os intervalos 5400 e 6200 cm -1 e entre 4000 e 4800 cm -1, influenciaram na separação entre as amostras. No entanto, as variáveis entre 4200 a 4600 cm -1 apresentaram uma maior variação, e desta forma, foram as variáveis que mais contribuíram para a separação obtida com a PC1, devido as vibrações de estiramentos C-H dos grupamentos metil, metileno e etileno, além das combinações das vibrações dos estiramentos das ligações C-H e C-O. A Figura 3 apresenta o comportamento dos loadings da PC2, onde nota-se que existe um aumento na variância das bandas a partir de 7000 cm -1, o que auxilia na separação entre as amostras na PC2 devido ao fato de serem características desta região as vibrações dos estiramentos das ligações C- H, confirmando a separação obtida na Figura 2. Figura 3 Comportamento dos loudings da PC1 (a) e PC2 (b). Para identificação e exclusão de outlier foi aplicada a expressão T 2 de Hotelling, no entanto, nenhum dos espectros das amostras apresentou caraterísticas anômalas. Em seguida, os dados espectrais foram submetidos a etapa de calibração, utilizando o método de calibração multivariada PLS, conforme a Figura 4, na região entre 4.000 e 6.000 cm- 1, por ser a região que mais evidenciou a separação entre as amostras. Figura 4 Regressão por mínimos quadrados parciais (PLS).
O melhor resultado para o modelo de calibração obtido apresentou um coeficiente de determinação (R²) de 0,9996 (com 5 variáveis latentes), um erro médio de calibração (RMSEC) de 0,61 % e um erro médio de calibração cruzada (RMSECV) de 1,09 %, conforme demonstrado pelo gráfico da Figura 4. Desta forma, o modelo de predição para o conjunto de amostras cegas apresentou um coeficiente de determinação (R²) de 0,9992 e um erro médio de predição (RMSEP) de 1,61 %, ilustrado na Figura 4. Christy et al. (2004) empregaram a espectroscopia NIR associada a calibração por PLS para detectar adulteração em azeite de oliva com diferentes tipos de óleos vegetais, dentre eles, o óleo de soja, onde obtiveram um erro médio de calibração e predição de 0,87% e 0,96%, respectivamente, em níveis de adulteração de 0-100% (p/p). 4. CONCLUSÕES Através dos resultados apresentados neste trabalho foi possível concluir que o uso da espectroscopia no infravermelho próximo aliada ao método de calibração multivariada por PLS indicou ser uma potencial ferramenta para a detecção e quantificação de adulteração em azeite de oliva extra virgem com óleo de soja. Desta forma, esta metodologia pode ser utilizada por órgãos fiscalizadores para um rastreio rápido no combate a fraudes, uma vez que trata-se de uma análise que não requer nenhum tratamento prévio da amostra e o resultado é obtido em um curto espaço de tempo. Entretanto, em concentrações menores de adulterante, a técnica apresentou limitações quanto a predição da concentração das amostras, tornando-a adequada para níveis de adulteração acima de 5 %. 5. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e ao Fundo de Apoio a Pesquisa da Universidade de Santa Cruz do Sul (FAP), pelo apoio no desenvolvimento desta pesquisa. 6. REFERENCIAS Christy, A., Kasemsumran, S., Du, Y., & Ozaki, Y. (2004). The detection and quantification of adulteration in olive oil by near-infrared spectroscopy and chemometrics. Analytical Sciences, 20, 935-940. Downey, G., Mcintyre, P., Davies, A. (2002). Detecting and quantifying sunflower oil adulteration in extravirgin olive oils from the eastern mediterranean by visible and near-infrared spectroscopy. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 5520-5525. Hirri, A., Gammouh, M., Gorfti, A., Kzaiber, F., Bassbasi, M., Souhassou, S., Balouki, A.,Oussama, A. (2015). The use of Fourier transform mid infrared (FT-MIR) spectroscopy for detection and estimation of extra virgin olive oil adulteration with old olive oil. Sky Journal of Food Science, 5, 060-066. Inarejos-García, A., Gómez-Alonso, S., Fregapane, G., Salvador, M. (2013). Evaluation of minor components, sensory characteristics and quality of virgin olive oil by near infrared (NIR) spectroscopy. Food Research International, 50, 250-258. Lin, P., Chen, Y., He, Young. (2009). Identification of geographical origin of olive oil using visible and near-infrared spectroscopy technique combined with chemometrics. Food Bioprocess Techno,5,235-242. Sinelli, N., Cerretani, L., Di Egidio, V., Bendini, A., Casiraghi, E. (2010). Applicaton of near (NIR) infrared and mid (MIR) infrared spectroscopy as a rapid tool to classify extra virgin olive oil on the basis of fruity attribute intensity. Food Research International, 43, 369-375. Vlachos, N., Skopelitis, Y., Psaroudaki, M., Konstantinidou, V., Chatzilazarou, A., & Tegou, E. (2006). Applications of Fourier transform-infrared spectroscopy to edible oils. Analytica Chimica Acta, 573 574, 459 465.