Disciplina de BOQUÍMCA do Ciclo Básico de MEDCNA Universidade dos Açores 1º Ano ENSNO PRÁTCO 7ª AULA PRÁTCA 1. PRNCÍPOS GERAS DE ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORÇÃO - Lei de Beer-Lambert - Espectro de absorção (Hemoglobina oxigenada e desoxigenada) - Utilização do espectrofotómetro 2. ANÁLSE DO ESPECTRO DE ABSORÇÃO DA HEMOGLOBNA REDUZDA E OXDADA
1. PRNCÍPOS GERAS DE ESPECTROFOTOMETRA DE ABSORÇÃO A absorção de luz por uma substância em solução pode ser utilizada para determinar a sua concentração, uma vez que, para soluções diluídas, existe uma relação linear entre a concentração da substância e a quantidade de luz absorvida. Além disso, cada substância absorve mais fortemente uns comprimentos de onda do que outros. A absorção de luz característica de cada substância, que representa o seu Espectro de Absorção, pode ser utilizada para caracterizar e identificar uma ou mais substâncias numa mistura. Na Figura 1 exemplificam-se os espectros de absorção da hemoglobina na forma oxigenada (oxihemoglobina) e desoxigenada (desoxihemoglobina). Coeficiente de 532 576 extinção molar (cm -1 M -1 ) 542 15 000 ------ Oxihemoglobina Desoxihemoglobina 10 000 5 000 450 500 550 600 650 Comprimento de onda λ (nm) Fig. 1- Espectros de absorção da oxihemoglobina e desoxihemoglobina. O espectro da hemoglobina modifica-se acentuadamente, quando a hemoglobina liga O 2, como se observa pelos máximos de absorção característicos de cada espectro. 1
Leis da absorção aplicáveis à determinação da concentração de substâncias em solução (Lei de Beer-Lambert) Quando um feixe de luz passa através de uma solução, parte da luz é absorvida pelos componentes da solução. A relação matemática entre a concentração de uma substância em solução e a absorção, é dada pela lei de Beer-Lambert. Consideremos um tubo de espessura (l) contendo uma solução, e um feixe de luz monocromática ( ) que a atravessa: l A lei de Lambert pode expressar-se por: log K 1 x l em que: = intensidade original do feixe de luz = intensidade do feixe de luz depois de atravessar a solução l = espessura da solução, expressa em centímetros K 1 = constante de proporcionalidade que depende das características de absorção da substância, da temperatura e do comprimento de onda utilizado A lei de Beer pode expressar-se por: log K 2 x C em que: e têm o mesmo significado. C = concentração da substância em solução, expressa em moles por litro (ou molar) K 2 = constante de proporcionalidade 2
Combinando as duas expressões obtém-se a equação fundamental da absorção da luz, conhecida como lei de Beer-Lambert: 1og = k x l x C em que: k = coeficiente de extinção molar, normalmente referido por ε e log = Abs (absorvância) Assim, a expressão da lei de Beer-Lambert pode tomar a seguinte forma: Abs = ε x l x C Chama-se coeficiente de extinção molar de uma substância, ε, ao valor da absorvância de uma substância de concentração 1 M, medida num tubo com uma espessura de 1cm. O coeficiente de extinção molar é específico da substância, para um dado comprimento de onda, e tem normalmente um valor grande quando a luz de um dado comprimento de onda é absorvida eficientemente pela substância. A lei de Beer-Lambert pode, portanto, ser utilizada para determinar o coeficiente de extinção molar de substâncias em solução e para determinar a concentração de uma ou mais substâncias em solução. Deve notar-se que as leis da absorção indicadas só se aplicam à luz monocromática (de um comprimento de onda particular) e não podem ser aplicadas a bandas, ainda que estreitas, de diferentes comprimentos de onda. A lei de Beer-Lambert é válida somente para soluções relativamente diluídas, uma vez que acima de certas concentrações a relação entre a absorvância e a concentração deixa de ser linear, como se exemplifica na Figura 2. Para que seja possível utilizar a relação entre a densidade óptica de soluções de concentração conhecida e a concentração (curva padrão) para extrapolar concentrações de amostras de concentração desconhecida a partir da sua absorvância, é necessário que o meio usado na preparação dos padrões seja o mesmo usado na preparação das amostras e que se desconte sempre a leitura da absorvância do solvente sem substância adicionada, a todas as leituras das amostras. 3
Abs 0,6 0,5 0,4 Lei de Beer-Lambert não aplicável 0,3 Lei de Beer-Lambert aplicável 0,2 0,1 0 2,5 5,0 7,5 10,0 Concentração (mg/ml) Fig. 2- Relação entre a absorvância e a concentração de uma substância em solução. Esta curva padrão só deve ser utilizada para calcular a concentração de uma dada solução a partir da absorvância medida na região linear (linha a tracejado). No exemplo indicado, a uma absorvância de 0,2, corresponde uma concentração de 2,5 mg/ml. Funcionamento de um espectrofotómetro Há diversos tipos de espectrofotómetro. Consistem essencialmente num prisma de difracção, que funciona como monocromador e de um sistema eléctrico de detecção, amplificação e medição. Assim, a luz, proveniente de uma lâmpada, passa através de um monocromador que a separa nos vários comprimentos de onda (λ); apenas um feixe de luz (de um λ específico) atravessa uma pequena fenda e incide na amostra. Esta absorve uma parte da luz e a que não é absorvida é transmitida através da amostra e vai ser detectada por um detector; o sinal eléctrico gerado é amplificado no amplificador e é enviado para o voltímetro (calibrado em unidades de absorvância) que lê a quantidade de luz que passou através da amostra. O voltímetro pode ligar-se a um registador, onde se pode obter um registo permanente da absorvância da amostra em função do tempo. O aparelho que vamos utilizar tem a capacidade de medir valores de absorvância numa gama de comprimentos de onda determinados (por exemplo, de 400 a 500 nm, dando-nos os valores de absorvância de 1 em 1 nm) e inclui um registador. Antes de medir a absorvância a cada comprimento de onda acerta-se o zero do aparelho (Abs=0), com uma célula contendo água ou o solvente do ensaio em causa. 4
2. DETERMNAÇÃO DOS ESPECTROS DE ABSORÇÃO DE DFERENTES FORMAS DE HEMOGLOBNA A análise por difracção de raios X da desoxihemoglobina mostra que a estrutura terciária das quatro subunidades é idêntica à observada na oxihemoglobina Porém, existe uma alteração significativa na estrutura quaternária, isto é, no modo pelo qual as cadeias estão orientadas em relação umas às outras. Na desoxigenação, as cadeias α sofrem uma rotação de cerca de 9º e as cadeias β de cerca de 7º, seguindo eixos diferentes, o que origina uma alteração nos pontos de contacto entre as quatro subunidades e a formação de novas ligações iónicas entre elas. A ligação das quatro moléculas de oxigénio, cada uma apresentando um diâmetro relativamente pequeno, pode ocasionar uma profunda alteração na estrutura quaternária da hemoglobina. O modo pelo qual a molécula de hemoglobina liga o oxigénio tem uma importância fundamental na sua função, como transportador de oxigénio na hemácia, dos pulmões para os tecidos periféricos, pobres em oxigénio. A hemoglobina constitui cerca de 90% da proteína total das hemácias, encontrandose concentrada no citoplasma. Devido à capacidade da hemoglobina em ligar oxigénio, o sangue total pode absorver cerca de 21 ml de oxigénio gasoso por 100 ml de sangue, enquanto que o plasma sanguíneo absorve apenas cerca de 0,3 ml de oxigénio. A curva sigmoidal de ligação do oxigénio pela hemoglobina significa que esta possui uma afinidade relativamente baixa para a ligação da primeira ou segunda moléculas de oxigénio; porém, uma vez que estas estejam ligadas, a ligação das moléculas subsequentes de oxigénio é bastante favorecida. É de salientar que a ligação da hemoglobina ao oxigénio requer que o ião ferro do grupo hémico se encontre na forma reduzida (Fe 2+ ). De maneira inversa, a perda de uma molécula de oxigénio pela molécula de hemoglobina, totalmente oxigenada, ocasiona a dissociação do oxigénio mais rapidamente quando a pressão parcial de oxigénio é reduzida. A interacção hemoglobina/oxigénio é também afectada pelo ph. Quanto maior fôr o ph da solução de hemoglobina, a uma determinada pressão parcial de oxigénio, maior é a percentagem de saturação com o oxigénio. Este efeito, reversível, ocorre, porque a hemoglobina oxigenada ioniza-se, libertando um protão por cada oxigénio ligado, de acordo com a equação HHb + + O 2 HbO 2 + H +, 5
na qual HHb +, é uma subunidade protonada da molécula de desoxihemoglobina. Uma vez que essa reacção é reversível, o aumento na concentração de H +, ocasionará o deslocamento do equilíbrio para a esquerda, no sentido da menor saturação, enquanto que uma diminuição da concentração hidrogeniónica ( [H + ] ph) ocasionará o deslocamento do equilíbrio para a direita, no sentido do aumento da saturação. O efeito do ph no equilíbrio oxigénio/hemoglobina é denominado Efeito de Bohr. A pressão parcial do oxigénio e o ph, são os dois factores mais importantes que regulam a função da hemoglobina no transporte do oxigénio. Nos pulmões, onde a pressão parcial do oxigénio é elevada (cerca de 100 mmhg) e o ph é também relativamente alto, a hemoglobina tende a atingir quase o máximo de saturação com o oxigénio (cerca de 96%). No interior dos tecidos periféricos, onde a tensão do oxigénio é baixa (cerca de 45 mmhg) e o ph também é baixo (devido à elevada concentração do CO 2, formado como produto final do metabolismo energético), a hemoglobina liga-se ao oxigénio com menos intensidade e irá, assim, ceder parte do seu oxigénio às células. Ao nível dos tecidos, a hemoglobina apresenta cerca de 65% saturação pelo O 2. Assim, a hemoglobina recicla entre 65 e 96% de saturação com o oxigénio, na sua função como transportadora do oxigénio. A determinação dos espectros de absorção das diferentes formas de hemoglobina tem como objectivo ilustrar como o espectro de absorção serve para caracterizar substâncias de acordo com as suas propriedades de absorção da luz. Os espectros da hemoglobina oxigenada e desoxigenada são diferentes (Fig. 1), o que impossibilita uma determinação precisa da concentração de hemoglobina total numa solução que contém as duas formas (oxigenada e desoxigenada) em proporções desconhecidas. Uma possibilidade de resolver o problema é converter toda a hemoglobina na forma desoxigenada, medindo a sua concentração nesta forma. O problema prático é que uma solução de hemoglobina desoxigenada pelo ditionito de sódio não é estável, porque a reacção é reversível e a hemoglobina vai-se oxigenando lentamente. No entanto, a hemoglobina pode ser convertida irreversívelmente em cianometa-hemoglobina, através da adição de um reagente apropriado, o reagente de Drabkins, usado correntemente na determinação clínica da concentração de hemoglobina no sangue. 6
PROTOCOLO 1. dentifique dois tubos de ensaio, um para a determinação do espectro da hemoglobina reduzida (Hb-Fe 2+ ) e outro para o espectro da hemoglobina oxidada (Hb-Fe 3+ ). 2. Meça para o tubo Hb-Fe 2+ 5 ml de água destilada e para o tubo Hb-Fe 3+ Medir 5 ml de HCl 0,1 N. 3. Pique um dedo com uma lanceta hematológica esterilizada e coloque uma gota de sangue em cada um dos tubos. Agite bem e espere alguns segundos para permitir a hemólise dos glóbulos vermelhos e obter uma soluções límpidas de hemoglobina.. Determinação do espectro de absorção da Hemoglobina reduzida (Fe 2+ ) 1. Com uma cuvette contendo água destilada, faça a linha de base no espectrofotómetro entre 480 e 620 nm. Em seguida, trace o espectro o espectro de absorção da solução de hemoglobina, na mesma gama de comprimentos de onda. 2. Assinalar os picos de absorção máxima do espectro traçado e compare com as curvas teóricas para os dois tipos de Hb-Fe 2+.. Determinação do espectro de absorção da Hemoglobina oxidada (Fe 3+ ) NOTA: Na solução diluída de HCl, os glóbulos vermelhos hemolisam e o Fe 2+ passa a Fe 3+, isto é, oxida, o que confere ao grupo heme da hemoglobina diferentes características de absorção de luz. 1. Repita o que foi feito para a hemoglobina reduzida (ponto 1 do nº), ou seja, trace o espectro entre 480 e 620 nm. 2. Assinalar os picos de absorção máxima característicos desta forma de hemoglobina. Análise dos resultados: - Discuta os resultados obtidos de acordo com a estrutura da hemoglobina e as características da ligação do oxigénio ao grupo hémico. 1