Nome Seção 7.012 Conjunto de Problemas 5 Pergunta 1 Enquanto estudava um problema de infertilidade, você tentou isolar um gene hipotético de coelho que seria responsável pela prolífica reprodução desses animais. Após muito esforço, você finalmente conseguiu mapear um gene no cromossomo Y de alguns animais que pode ser responsável pela grande fertilidade dos coelhos. Você chama esse gene de Gene de Alta Reprodução Cromossomo Y, ou apenas hrgy. Você deseja testar o efeito da expressão do gene hrgy dos coelhos em camundongos. Você injeta o fragmento linear de DNA para o gene hrgy dos coelhos em óvulos fecundados de camundongo ainda no estágio unicelular. Esse DNA é aleatoriamente inserido no genoma dos camundongos. Os animais resultantes das injeções bem-sucedidas possuem o gene hrgy integrado na mesma posição do genoma em cada uma das células. Esses camundongos são chamados de transgênicos. a) Qual dos dois fragmentos a seguir do genoma dos coelhos você escolheria para injetar nos camundongos? Por quê? promotor DNA genômico de coelho gene hrgy Fragmento 1 Fragmento 2 O fragmento 1 inclui um promotor adjacente com potencial sobre outros sítios regulatórios que podem ser reconhecidos no sistema dos camundongos.
Pergunta 1 cont. Você injetou com sucesso o gene de coelho hrgy de 2200 bp em um óvulos fertilizados de camundongo em estágio unicelular. Desses óvulos nasceram filhotes de camundongos e você realiza um PCR para confirmar que esses animais carregam o gene hrgy de coelhos. Suas reações de PCR possuem como molde, como modelo uma amostra do DNA genômico de cada um dos filhotes de camundongo. Com os iniciadores adequados, você consegue amplificar um fragmento de 380 bp dentro de um íntron do gene hrgy de coelhos. O DNA amplificado é submetido a uma eletroforese em gel. b) Na faixa 1 do gel a seguir, ilustre a(s) banda(s) de DNA, caso existam, que poderia(m) ser visualizada(s) se o DNA fosse amplificado de um camundongo portador do gene hrgy de coelhos. Na faixa 2 do gel, ilustre a(s) banda(s), caso existam, que poderia(m) ser visualizada(s) se o camundongo não fosse portador do gene de coelhos. Marcadores MW Faixa 1 Faixa 2 c)após realizar as reações de PCR, você encontra um camundongo portador do DNA hrgy de coelhos. Isso é suficiente para mostrar que o gene é expresso? Caso a resposta seja negativa, quais são as outras moléculas que você deve procurar e por quê? Não. A presença do DNA sozinho não assegura que o gene esteja sendo transcrito ou traduzido. Para medir a expressão do gene, é necessário procurar o mrna ou até mesmo a proteína codificada pelo gene. d) Você procura por expressões do hrgy em diversos tipos de tecidos dos camundongos transgênicos e descobre que ele é expresso apenas em um órgão desses animais o testículo. Mas você sabe que o gene hrgy está presente em todas as células do animal. O que pode ser encontrado nas células testiculares que pode ser considerado como a expressão tecidual muito específica do gene hrgy? um ativador de transcrição que reconhece o promotor hrgy presente apenas nas células dos testículos. 2
Pergunta 2 Usando a seqüência conhecida de DNA do hrgy, é possível derivar a seqüência de aminoácidos da proteína HrgY para obter pistas sobre a sua função. Considerando a polaridade, carga e ordem da posição dos aminoácidos em HrgY, é possível observar a presença de um domínio transmembrana e sítios para a glicolização. a) i) Quais são as principais características do domínio transmembrana? Inclua o tipo de aminoácidos que serão encontrados em um domínio transmembrana. Os domínios de transmembrana são compostos por aproximadamente 30 aminoácidos hidrofóbicos contíguos que freqüentemente formam uma estrutura secundária de hélice alfa através da membrana. Nas proteínas transmembrana que formam os canais e que, portanto, possuem múltiplos segmentos de membrana, não é incomum que o lado da hélice alfa de frente para o canal (ou poro hidrofílico) apresente resíduos hidrofílicos e que o lado de frente para os lipídeos na bicamada da membrana seja composto por resíduos hidrofóbicos. Essa hélice alfa de natureza dupla é chamada de anfipática. ii) Onde é possível encontrar proteína com domínios transmembrana? Nas membranas ex.- nuclear, plasmática, RE, Golgi, mitocôndria, etc iii) Relacione duas funções de uma proteína de membrana em uma célula. Proteínas estruturais, poros, canais de íons, receptores. iv) O que é glicolização? Adição de resíduos de açúcar v) Em qual organela a glicolização ocorre? Retículo endoplasmático e complexo de Golgi b) Se houver a possibilidade de a Partícula de Reconhecimento de Sinal estar ausente em uma célula, poderíamos esperar. Circule uma opção 1 que as proteínas transmembrana dessa célula sejam glicolizadas? SIM NÃO 2 que as proteínas transmembrana sejam completamente traduzidas? SIM NÃO 3 que os genes que codificam as proteínas transmembrana sejam transcritos? SIM NÃO 4 que as seqüências de sinais sejam clivadas? SIM NÃO 5 que as proteínas secretadas sejam exportadas? SIM NÃO 3
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Pergunta 3 Ao comparar a seqüência de aminoácidos de HrgY com outras proteínas conhecidas, é possível observar que a proteína de HrgY apresenta uma homologia surpreendente em relação a outros receptores de tirosina quinases. a) Qual é a função do domínio da tirosina quinase (TK)? Ele fosforila cadeias laterais do aminoácido tirosina em proteínas usando o gama(? ) fosfato do ATP Em cadeias laterais fosforiladas do aminoácido tirosina em proteínas usando a fosfatase [x] do ATP b) Para determinar se o domínio TK é significativo ou não para a proteína HrgY, crie uma versão mutante do gene hrgy que codifique um domínio tirosina quinase ativo constitutivamente dentro da proteína HrgY. Essa proteína mutante não é mais acessível as fosfatases. A proteína mutante poderia ser encontrada em um estado fosforilado ou não-fosforilado? (Circule uma opção). Para descobrir o efeito que a proteína ativa HrgY pode apresentar, realize a clonagem do gene mutante hrgy em um vetor de mamífero (um plasmídeo que pode ser replicado em células de mamíferos). Faça a transfecção (semelhante á transformação em bactérias) das células testiculares de camundongo normais em cultura de tecido com as construções de seu vetor. Compare as células murinas transfeccionadas que contém o vetor portador do hrgy mutante com um grupo controle de células de camundongo que foram transfeccionadas apenas com o vetor ou com o vetor portador do gene hrgy tipo selvagem (veja a seguir). É possível observar que as células de camundongo que sintetizam a proteína HrgY mutante mostram um impressionante aumento nos níveis de uma outra proteína, que recebe o nome de Proteína X. células normais de testículo de camundongos Transfecção apenas com o vetor Transfecção com o vetor portador do gene hrgy selvagem Transfecção com o vetor portador do gene hrgy codificando um domínio ativo de TK na proteína HrgY Medir a produção de proteína Medir a produção de proteína Medir a produção de proteína baixos níveis de Proteína X baixos níveis de Proteína X altos níveis de Proteína X c) Explique, em termos gerais, como uma tirosina quinase ativa na membrana plasmática poderia causar o aumento da Proteína X dentro da célula. Certifique-se de incluir transcrição em sua resposta. 5
O receptor ativado de membrana sinaliza para uma cascata de proteínas. Pode ser que ele fosforilize outras proteínas ou que interaja por intermédio de outros mensageiros. O resultado final é que uma dessas proteínas modificadas entra no núcleo e ou ativa diretamente a transcrição ou ativa outros fatores de transcrição para ativar os genes. 6
Pergunta 4 Finalmente você consegue determinar que o gene hrgy incluído não possui nenhum efeito na fertilidade dos camundongos. Apesar de ter aprendido pouco a respeito do hrgy com a sua linhagem de camundongos transgênicos, você decide continuar seu estudo pois, nessa etapa, você já investiu um ano de pesquisa sobre esse gene e não se sente à vontade para dar início a um projeto completamente novo. Em um experimento longo, você cultiva em meio de cultura células isoladas dos testículos de camundongos transgênicos portadores do tipo selvagem do gene hrgy e mede a síntese da Proteína X. A produção de Proteína X nessas células é bastante baixa. Entretanto, quando essas células são cultivadas em um meio enriquecido com o soro de coelhos, você descobre que a expressão do nível de Proteína X aumenta de forma impressionante. (Veja figura a seguir). Observação: células normais de testículos de camundongo cultivadas em soro de coelhos não demonstram aumento nos níveis de Proteína X (dados não fornecidos). Isolar células de testículo de camundongos transgênicos expressando o gene hrgy. células de testículo de camundongos Dividir em duas placas de Petri Crescem na presença do soro de coelho Crescem sem o soro de coelho Medir a produção de proteína X Alta produção de Proteína X Baixa produção de Proteína X a) Como você explica isso? Algum componente no soro dos coelhos está interagindo com a proteína HrgY expressa, resultando em altos níveis de Proteína X. b) Você já determinou que o gene hrgy está sendo expresso nos testículos dos camundongos. Considerando o experimento descrito acima, por que motivo esse gene pode não estar afetando a fertilidade dos camundongos? O hrg Y (Hrg Y) sozinho não possui nenhum efeito. Provavelmente, seu ligante está presente no soro de coelhos e, portanto, ele é ativado somente na presença desse ligante. 7
Pergunta 4 cont. Após mais alguns anos de estudo (você está agora no quarto ano do UROP), você finalmente conseguiu purificar um componente do soro de coelhos que é capaz de induzir a expressão da Proteína X nas células transgênicas. Você determinou que o componente é uma proteína secretada à qual dá o nome de SecC. c) A proteína SecC purificada do soro teria uma seqüência de sinal anexa? Por quê? Não. Se ela foi secretada no soro, então a seqüência de sinal terá sido clivada. d) Você acredita que a proteína SecC possui uma seqüência de sinais em qualquer etapa da síntese? Se sua resposta for sim, quando? Sim. Quando ela foi traduzida inicialmente. O peptídeo nascente terá como sinal uma seqüência que é reconhecida pelo SRP, que levará esse complexo ribossomo/mensagem/peptídeo nascente para a partícula receptora de reconhecimento de sinal SRP na membrana do RER. Nesse ponto, a tradução continua e o SecC é translocado através da membrana do RER. Curioso em relação ao efeito da proteína SecC nos camundongos transgênicos vivos, você insere o gene codificando o SecC no genoma de um vírus. Você infecta o camundongo transgênico com esse vírus, que irá se integrar ao DNA (inclusive o gene secc) no genoma de qualquer uma das células do camundongo que ele venha a infectar. Surpreendentemente, os camundongos transgênicos infectados com o vírus portador do gene secc estão apresentando um aumento de fertilidade. e) O vírus portador do gene secc precisa infectar as células dos testículos dos camundongos transgênicos para aumentar a fertilidade? Explique sua resposta. Não. Se a SecC é uma proteína secretada, ela será secretada de qualquer célula na qual é expressa e será transportada através da linfa ou soro até alcançar o receptor. HrgY nos testículos (Pares receptor/ligante são altamente específicos). 8