Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia

Universidade Federal da Bahia Escola de Medicina Veterinária e Zootecnia Programa de Pós Graduação em Ciência Animal nos Trópicos PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS SÉRICOS ANTI- VÍRUS DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA EM REBANHOS BOVINOS DO ESTADO DE SERGIPE Juliana Matos Batista Salvador-Bahia 2013

i UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL NOS TRÓPICOS PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS SÉRICOS ANTI-VÍRUS DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA EM REBANHOS BOVINOS DO ESTADO DE SERGIPE JULIANA MATOS BATISTA Pós-Graduação em Medicina Veterinária SALVADOR - BAHIA FEVEREIRO 2013

ii JULIANA MATOS BATISTA PREVALÊNCIA DE ANTICORPOS SÉRICOS ANTI-VÍRUS DA LEUCOSE ENZOÓTICA BOVINA EM REBANHOS BOVINOS DO ESTADO DE SERGIPE Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciência Animal nos Trópicos, da Universidade Federal da Bahia, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Ciência Animal nos Trópicos. Orientador: Prof. Dr. Joselito Nunes Costa SALVADOR - BA FEVEREIRO - 2013

iii DADOS CURRICULARES DO AUTOR JULIANA MATOS BATISTA, filha de Antônio Batista Filho e Maria Amélia de Matos Batista, nasceu em 21/09/1985, na cidade de Aracaju, estado Sergipe. Iniciou o Curso de Graduação em Medicina Veterinária, na Faculdade Pio Décimo, no ano de 2003 e concluiu no ano de 2007/2. No ano de 2009 iniciou o Curso de Especialização sobre a forma de Residência Médica na área de Clínica e Cirurgia de Ruminantes, na Universidade Federal da Bahia, e concluiu no ano de 2011/1. Em 2011, ingressou no Programa de Pós- Graduação em Ciência Animal nos Trópicos, pela Universidade Federal da Bahia, sob a orientação do Prof. Dr. Joselito Nunes Costa, defendendo a dissertação em 25/02/2013.

iv É muito melhor lançar-se em busca de conquistas grandiosas, mesmo expondo-se ao fracasso, do que alinhar-se aos pobres de espírito, que nem gozam muito e nem sofrem muito, porque vivem numa penumbra cinzenta, onde não conhecem nem vitória, nem derrota. (Theodore Roosevelt) Este trabalho é dedicado aos meus pais, Antônio e Amélia. Á minha segunda mãe, Aparecida e a minha irmã, Diana. Ao meu grande amor, Gabriel e a todos os bovinos que participaram desta pesquisa.sem vocês nada disso seria possível.

v AGRADECIMENTOS A Deus pela força, coragem e esperança que tanto precisei nesses dois últimos anos, sem as quais não teria concluído mais uma etapa da minha vida. Obrigado, Senhor, por me guiar e iluminar o meu caminho em momentos tão difíceis e por ter colocado presentes tão valiosos em minha vida, sem os quais teria desistido de tudo. Ao meu pai, Antônio, pelo apoio e confiança em toda a trajetória da minha vida. À minha mãe, Amélia, pela amizade, pelos conselhos, pelas brincadeiras e por nunca ter desistido de mim. Á minha tia-mãe, Aparecida, pelo carinho, amizade, confiança, preocupação na época das colheitas e por sempre acreditar em mim. Obrigado pela ajuda na separação das amostras colhidas. Á minha irmã, Diana, pela amizade, companheirismo, pelas viagens engraçadas e cansativas na primeira parte das colheitas, mais que valeram a pena, pelos momentos felizes que já vivemos, pelos atendimentos veterinários que fazemos juntas e pelo aprendizado diário. Ao meu amor, Gabriel, por fazer parte da minha vida, pela ajuda nas colheitas das amostras, por me ajudar a superar os momentos de tristeza, mais também por trazer a felicidade e a alegria de viver. Foi o seu amor e carinho que não me deixaram desistir. Obrigado por tudo que fez e ainda faz por mim, mas principalmente pela felicidade que você me proporciona todos os dias. Ao meu orientador, Prof. Joselito, pelo apoio durante o curso e por acreditar no meu trabalho, permitindo a realização desta pesquisa. Aos meus amigos, Byanca, Carla e Tiago, pela amizade, por estarem sempre disponíveis a ajudar e sem os quais não teria conseguido realizar o exame de todas as amostras. Aos amigos que fiz no CDP, pelos momentos alegres, pelas brincadeiras, pelas comidas deliciosas que vou sentir falta. Nunca vou esquecer essas boas lembranças. À CAPES, pela concessão da bolsa de mestrado, a qual foi tão importante para a realização deste estudo. Aos bovinos e proprietários que contribuíram para a realização desta pesquisa. Sem vocês nada disso seria possível. Que Deus abençoe a todos.

vi RESUMO A Leucose enzoótica bovina (LEB) é uma doença infecciosa, de evolução crônica, causada por um agente viral oncogênico, pertencente à família Retroviridae. Está distribuída mundialmente e acomete especialmente os bovinos adultos, além de causar grandes prejuízos econômicos na bovinocultura leiteira relacionados a diminuição da produtividade dos animais. Tem como características principais a proliferação linfocitária e/ou formação de linfossarcomas. Com o objetivo de determinar a soroprevalência desta enfermidade em rebanhos bovinos do Estado de Sergipe, o mesmo foi dividido em três mesorregiões (Agreste Sergipano, Leste Sergipano e Sertão Sergipano) compostas cada uma por cinco municípios, onde foram coletadas 780 amostras sanguíneas, em 52 propriedades. Foram aplicados questionários nas propriedades visitadas com o objetivo de caracterizar o sistema de produção. A detecção de anticorpos específicos anti-vlb foi obtida através da técnica de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) das amostras séricas, utilizando kit comercial específico para a LEB produzido pelo Instituto Tecnológico do Paraná (TECPAR). A taxa de prevalência na população examinada foi de 11,92% (93/780) e foram obtidos animais soro-reagentes em 57,69% (30/52) dos rebanhos estudados. Apenas dois municípios não apresentaram animais reagentes (Poço Redondo e Gararu). A maior taxa de prevalência foi observada nas fêmeas (10,90%) do que nos machos (1,02%). Com relação a faixa etária foi evidenciada uma maior prevalência em animais com idade superior a sessenta meses (7,43%). Os manejos intensivo e semi-intensivo obtiveram as maiores prevalências. De forma geral, a grande maioria dos produtores não possuía informação sobre a LEB e adquiriam animais sem teste de sanidade para a doença. Não havia preocupação quanto a reutilização de agulhas e seringas, apesar das práticas freqüentes de vacinação e vermifugação. Palavras-Chave: Leucose enzoótica bovina, soroprevalência, Sergipe

vii ABSTRACT The Enzootic bovine leukosis (EBL) is an infectious disease, of chronic evolution, caused by a viral oncogenic agent, belonging to the family Retroviridae. It is distributed worldwide and especially affects adult cattle, besides causing huge economic losses in dairy cattle related to the reduction of productivity of the animals. Its main characteristics are lymphocyte proliferation and / or formation of lymphoosarcomas. Aiming to determine the seroprevalence of this disease in cattle herds in the state of Sergipe, the state was divided into three mesoregions (Agreste, East and Sertão of Sergipe), each consisting of five counties in which were collected 780 blood samples in 52 properties. Questionnaires were applied in the properties visited aiming to characterize the production system. The detection of specific anti-vlb antibodies was obtained through the technique of Agarose Gel Immunodiffusion (AGID) of serum samples using a commercial kit specific to the EBL, produced by the Technological Institute of Paraná (TECPAR). The prevalence rate in the population studied was 11.92% (93/780) and serum-reactive animals were found in 57.69% (30/52) of the herds. Only two counties showed no reagent animals (Poço Redondo and Gararu). The prevalence rate was higher on females (10.90%) than on males (1.02%). With respect to age it was found higher prevalence in animals with age over sixty months (7.43%). The intensive and semi-intensive management obtained the highest prevalence. In general, most of the producers did not have information about EBL and purchased animals without sanity test for the disease. There was no concern about the reuse of needles and syringes, despite the frequent practice of vaccination and worming. Keywords: Enzootic bovine leukosis, seroprevalence, Sergipe

viii LISTA DE FIGURAS Revisão de Literatura Figura 1. Leucose Bovina Multicêntrica juvenil... 9 Figura 2. Linfossarcoma bovino: linfonodo pré-escapular direito bastante aumentado de tamanho... 10 Quadro 1. Principais sinais clínicos da forma multicêntrica da Leucose Enzoótica Bovina com sua relação anátomo-patológica e suas prováveis causas... 11 Capítulo 1- Inquérito Soroepidemiológico da Leucose Enzoótica Bovina em Rebanhos Bovinos do Estado de Sergipe Figura 1. Mapa demonstrativo do Estado de Sergipe identificando as três mesorregiões utilizadas neste estudo... 41 Figura 2. Resultado do IDGA demonstrando a formação da linha de precipitação entre o soro teste e o antígeno... 44

ix LISTA DE TABELAS Revisão de Literatura Tabela 1. Ocorrência da Leucose Enzoótica Bovina (LEB) no Brasil nas regiões Nordeste, Norte, Sudeste, Centro-Oeste e Sul, segundo o estado, a técnica diagnóstica e o autor... 16 Capítulo 1- Inquérito Soroepidemiológico da Leucose Enzoótica Bovina em Rebanhos Bovinos do Estado de Sergipe Tabela 1. Número de amostras séricas a serem testadas para Leucose Enzoótica Bovina no Estado de Sergipe... 42 Tabela 2. Número de soros bovinos testados para Leucose enzoótica bovina, através da imunodifusão em gel de agarose, no Estado de Sergipe... 45 Tabela 3. Número de propriedades positivas no inquérito sorológico da Leucose enzoótica bovina, no estado de Sergipe... 45 Tabela 4. Frequência de animais soropositivos para Leucose enzoótica bovina, segundo o fator sexo, no Estado de Sergipe... 47 Tabela 5. Frequência de bovinos soropositivos para Leucose enzoótica bovina, segundo o fator faixa etária, no Estado de Sergipe... 48 Tabela 6. Frequência de animais soropositivos para Leucose enzoótica bovina, segundo a raça, no Estado de Sergipe... 49 Tabela 7. Avaliação dos fatores de risco da LEB, na mesorregião do Agreste Sergipano, com os respectivos valores de freqüência e intervalo de confiança... 49 Tabela 8. Avaliação dos fatores de risco da LEB, na mesorregião do Sertão Sergipano, com os respectivos valores de freqüência e intervalo de confiança... 50 Tabela 9. Avaliação dos fatores de risco da LEB, na mesorregião do Leste Sergipano, com os respectivos valores de freqüência e intervalo de confiança... 51 Capítulo 2- Caracterização dos Sistemas de Criação de Bovinos no Estado De Sergipe em Inquérito para Leucose Enzoótica Bovina Tabela 1. Número de propriedades e amostras coletadas de bovinos por mesorregião do Estado de Sergipe... 64 Tabela 2. Características gerais das propriedades visitadas no Estado de Sergipe, 2011... 65

x Tabela 3. Características dos rebanhos bovinos pertencentes às 52 propriedades visitadas no Estado de Sergipe, 2011... 66 Tabela 4. Características do manejo reprodutivo registrado nas 52 propriedades visitadas no Estado de Sergipe, 2011... 67 Tabela 5. Características do manejo sanitário empregado nas 52 propriedades visitadas no Estado de Sergipe, 2011... 68 Tabela 6. Principais enfermidades e alterações clínicas mais freqüentes relatadas em 52 propriedades visitadas no Estado de Sergipe, 2011... 69 Tabela 7. Características do manejo sanitário empregado aos bezerros nas 52 propriedades visitadas no Estado de Sergipe, 2011... 70

xi LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS Anti-VLB anti-vírus da Leucose Bovina C graus Celsius CDP Centro de Desenvolvimento da Pecuária D Dálton DNA Ácido Desoxiribonucléico ELISA Ensaio Imunoenzimático G Unidade de força centrífuga relativa Gp Glicoproteína gag gene viral que codifica as proteínas internas do vírus IDGA Imunodifusão em Gel de Agarose km² Quilômetro quadrado LEB Leucose Enzoótica Bovina OIE Organização Internacional de Saúde Animal Pr Proteína PCR Reação em Cadeia da Polimerase pol gene que codifica as enzimas virais rev gene de regulação viral RS Rio Grande do Sul RNA Ácido Ribonucléico SC Santa Catarina TECPAR Instituto Tecnológico do Paraná UV Ultra violeta VLB ou BLV Vírus da Leucose Bovina WB Western Blotting

xii SUMÁRIO Prevalência de anticorpos séricos anti-vírus da Leucose Enzoótica Bovina em rebanhos bovinos do Estado de Sergipe Página Introdução geral 1 Revisão de literatura geral 3 Objetivos 21 Hipótese 21 Capítulo 01 Inquérito Soroepidemiológico da Leucose Enzoótica Bovina em Rebanhos Bovinos do Estado de Sergipe 36 Resumo 37 Abstract 38 Introdução 39 Material e Métodos 41 Resultados e Discussão 44 Conclusões 52 Agradecimentos 52 Referências Bibliográficas 53 Capítulo 02 Caracterização dos Sistemas de Criação de Bovinos no Estado De Sergipe em Inquérito para Leucose Enzoótica Bovina 58 Resumo 59 Abstract 60 Introdução 61 Material e Métodos 61 Resultados e Discussão 62 Conclusões 68 Agradecimentos 69 Referências Bibliográficas 69 Considerações Finais e Implicações 72 Anexo 73

1 INTRODUÇÃO A Leucose Enzoótica Bovina (LEB) é uma enfermidade infecciosa, de ocorrência mundial, e acomete bovinos adultos com idades entre 3 a 7 anos. Sua transmissão ocorre principalmente por via horizontal através de linfócitos B infectados pelo vírus da leucose bovina (VLB), um oncovírus pertencente à família Retroviridae (FLORES, 1989). A enfermidade foi descrita pela primeira vez na Alemanha, em 1871, por Leisering. Logo após a segunda Guerra Mundial, as migrações intensificaram a movimentação de bovinos, fato este que favoreceu a disseminação da doença para as regiões orientais e ocidentais da Europa e em seguida para os demais continentes (BIRGEL, 1982; GARCIA, 1989). A introdução do VLB em rebanhos brasileiros ocorreu devido à importação indiscriminada de bovinos originários do hemisfério norte por pecuaristas de gado das regiões Sul e Sudeste. E após o estabelecimento da doença nestas regiões, a doença disseminou-se para as regiões Norte e Nordeste favorecida pela ausência de políticas sanitárias (GARCIA et al., 1991) e pelo trânsito intenso de animais (ABREU et al., 1994). Em 1943, Rangel e Machado realizaram os primeiros relatos da LEB no Brasil no Estado de Minas Gerais, seguidos por Santos et al.(1959) e Merck et al.(1959) nos Estados do Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul, respectivamente. A enfermidade apresenta caráter fatal quando há o desenvolvimento de linfossarcomas e aproximadamente 5% dos animais infectados com o VLB desenvolvem a forma tumoral da doença (COCKERELL; REYES, 2000). De 1 a 5% dos bovinos infectados desenvolvem a forma clínica da doença (BARROS, 2007). De acordo com os aspectos anatomopatológicos, a LEB caracteriza-se pela proliferação linfocitária em órgãos hematocitopoiéticos (medula óssea, linfonodos e baço) e em órgãos ricos em tecidos retículohistiocitários (abomaso, coração, rins, fígado e músculos), desencadeando a formação de massas tumorais e infiltração de linfócitos. Estas alterações são responsáveis por um quadro sintomático pleomórfico e alterações hematológicas (leucocitose,

2 linfocitose persistente e aumento de formas linfocitárias atípicas) que ocorrem durante o curso clínico da doença (BIRGEL, 1982; CAMARGOS et al., 2002). Alguns autores sugerem que os bovinos leiteiros são mais acometidos pela LEB do que os bovinos de corte, provavelmente pela predominância de animais adultos e também pela criação intensiva destes animais, considerada fator de risco para a transmissão, já que os animais de corte são abatidos geralmente antes de atingirem a fase adulta (BIRGEL et al.,1994; RADOSTITS et al., 2002). É uma enfermidade de grande importância para a indústria leiteira e setor agropecuário do país por causar prejuízos relacionados à queda na produção de leite (RAJÃO, 2008; FERNANDES et al., 2009). De acordo com estudos realizados sobre a prevalência da doença no Brasil, constatou-se que através dos resultados obtidos, ela está presente em todo o país (CAMARGOS et al., 2002; LEITE et al., 2001). No Nordeste, foram realizados estudos de prevalência, nos Estados da Bahia (SARDI et al., 2002, MATOS et al., 2005), Pernambuco (MELO et al., 1991, MENDES, 2009), Ceará (ABREU et al., 1994), Maranhão (SANTOS, 2010), Paraíba (SIMÕES, 1998), Piauí (SILVA, 2001), Rio Grande do Norte (SIMÕES, et al., 2001) e em Alagoas (BIRGEL et al., 1999). No Estado de Sergipe um levantamento preliminar determinou uma prevalência de 4,07% (11/259) na Mesorregião do Sertão Sergipano. Portanto, diante do presente exposto e considerando a deficiência de informações sobre a ocorrência da LEB em Sergipe, este estudo científico teve como objetivo a realização de um inquérito soroepidemiológico utilizando o teste de Imunodifusão em Gel de Agarose (IDGA) em rebanhos bovinos do Estado de Sergipe para detectar qual o índice de prevalência do VLB.

3 REVISÃO DE LITERATURA GERAL 1. AGENTE ETIOLÓGICO E SUAS CARACTERÍSTICAS O agente etiológico da Leucose Enzoótica Bovina (LEB) é um retrovírus RNA tumoral pertencente ao gênero Deltaretrovírus, família Retroviridae e subfamília Oncovirinae (REBHUN, 2000). Os vírus pertencentes à família Retroviridae são compostos de um envelope medindo de 80 a 100 nm de diâmetro e capsídeo icosaédrico com aproximadamente 60 nm de diâmetro. O material genético é diplóide, composto por duas fitas de RNA simples (MURPHY et al., 1999). Um complexo nucleoprotéico-genômico é encontrado na região interna do capsídio, onde três genes diferentes podem ser identificados: o gene gag que codifica proteínas do núcleo, o gene pol que codifica a enzima transcriptase reversa, e o gene env que codifica as proteínas presentes no envelope viral. Alguns desses genes podem não estar presentes em retrovírus defeituosos (KUFE et al., 2003). Na fase de replicação viral só há a transcrição do ácido ribonucléico (RNA) em ácido desoxirribonucléico (DNA) quando a enzima transcriptase reversa está presente (MURPHY et al., 1999). Uma cópia completa do DNA viral (denominada provírus) pode ser inserida dentro do DNA de células germinativas do hospedeiro. Assim, a replicação viral apenas ocorre no núcleo da célula hospedada e o provírus fica submetido a mecanismos regulatórios celulares do hospedeiro (GILLET et al., 2007). O vírus da LEB é inativado quando em contato com solventes e detergentes lipídicos (álcool, éter e clorofórmio) e quando exposto a uma temperatura de 56 C durante 30 minutos. Quando comparado com outros vírus, o VLB é bastante resistente aos raios UV e radiação X (FERRER et al., 1993). Os retrovírus denominados exógenos são oncogênicos e têm predileção por determinadas áreas, ao contrário dos vírus endógenos que dificilmente desencadeiam doença (GILLET et al., 2007).O VLB infecta preferencialmente os linfócitos, principalmente, os do tipo B embora já tenha sido encontrado em células T, monócitos e granulócitos (BRAGA; LAAN, 2001). Nos linfócitos B

4 pode manter-se por longos períodos (AIDA et al., 1989), apesar do processo de formação de um novo vírion levar cerca de 10 horas (MURPHY et al., 1999). Sua análise bioquímica demonstrou ser composto por várias proteínas, de diferentes massas moleculares, sendo a proteína p-24 presente em maior concentração no capsídeo viral com massa molecular de, aproximadamente, 24.000D (GILDEN et al., 1975). O envelope do BLV é transcrito a partir de DNA do provírus, sendo esta mensagem traduzida em uma proteína precursora do envelope (Pr-72). Este precursor é processado na glicoproteína transmembrana (Gp-30) e uma unidade de superfície a glicoproteína 51 (Gp-51). A Gp-51 do envelope do BLV é responsável pela infectividade do vírus, sendo que a ligação da Gp-51 a um receptor específico na célula é a etapa inicial da infecção (ALTANER et al., 1993). 2. HOSPEDEIROS O VLB tem como hospedeiro primário o bovino, além de ser a espécie mais susceptível. Porém observou-se que, in vitro, o vírus é capaz de infectar células de outras espécies animais, inclusive as do ser humano (DAHLBER, 1988). O efeito patogênico do vírus também foi observado em ovinos, caprinos e não-ruminantes submetidos a infecções experimentais (BURNY et al., 1985; LEITE et al., 2001). As infecções naturais dos bovinos possuem índices de prevalência e incidência menores, principalmente nos animais jovens e aumentam significativamente entre 16 e 24 meses de idade, de acordo com estudos sobre a doença (JOHNSON; KANEENE, 1991). Possivelmente, o maior tempo de contato entre animais saudáveis e contaminados estaria correlacionado com este aumento e não a uma maior susceptibilidade (BIRGEL JÚNIOR et al., 2006). Após a introdução do vírus no rebanho, os animais positivos eliminam continuamente o agente etiológico da doença e, como consequência, disseminam a infecção para o restante do rebanho (VAN DER MAATEN; MILLER, 1979).

5 No entanto, a tecnificação dos rebanhos parece ser o fator responsável pela difusão da infecção de forma mais eficiente. As práticas de manejo adotadas nas propriedades e as que possuem os maiores índices de produção estão estritamente relacionadas com a contaminação pelo VLB, devido a algumas técnicas de manejo adotadas como palpação retal, procedimentos cirúrgicos, transfusão sanguínea e imunização, procedimentos estes que apresentam as maiores taxas de transferência de linfócitos infectados (BRAGA; LAAN, 2001; BURNY et al., 1988; FLORES, 1989; JOHNSON; KANEENE, 1992; HUBNER et al., 1997). Os sistemas tradicionais de criação apresentam prevalências inferiores, devido a reduzida ou ausente tecnificação (FLORES, 1989).Assim, a doença ocorre com maior frequência em bovinos leiteiros (manejo intensivo) do que em bovinos de corte (manejo extensivo), devido ao tipo de manejo adotado (BIRGEL et al., 1994). Adicionalmente, a ação mecânica de tabanídeos nos meses com temperatura elevada e a importação de animais com a finalidade de melhoramento genético contribuem para a disseminação da doença (BRAGA; LAAN, 2001; BURNY et al., 1988; JOHNSON; KANEENE, 1992; HUBNER et al., 1997). 3. TRANSMISSÃO O VLB fica instalado dentro de linfócitos B, devido ao tropismo que o mesmo possui por estas células (AIDA et al., 1989). Assim, a transmissão da LEB seja ativa (transmissão horizontal) ou passiva (transmissão vertical) está relacionada com a integridade dos linfócitos infectados, já que o vírus da LEB, em seu estado livre, é detectado em pequenas quantidades in vivo (JOHNSON; KANEENE, 1991; JOHNSON; KANEENE, 1992). A transmissão horizontal da LEB é considerada a forma mais importante para a disseminação da doença do que a transmissão vertical (REBHUN, 2000). A principal fonte de infecção da LEB é o sangue, porém o vírus pode estar presente em outras secreções como saliva, secreção nasal e uterina (JOHNSON;

6 KANEENE, 1991). Segundo Birgel Júnior et al. (1995), o VLB pode ser transmitido através de quantidades de sangue inferiores a 0,0005 ml, quando inoculado por via intradérmica, subcutânea, intramuscular e endovenosa. Outra importante forma de transmissão da LEB é a via iatrogênica de contaminação através de materiais cirúrgicos, seringas, agulhas, tatuadores, luvas de palpação retal contaminados e reutilizados (JOHNSON; KANEENE, 1992). Procedimentos em que há transferência de sangue podem ser responsáveis por disseminarem a doença (DIMMOCK et al., 1991).A não realização de testes para investigar a sanidade dos animais doadores de sangue objetivando a premunição contra Babesia sp. e Anaplasma sp. exerceu um papel importante na disseminação do VLB (FLORES et al., 1992). Nos países tropicais, as elevadas prevalências da LEB podem estar associadas a fatores como picada de insetos e mordeduras de morcegos hematófagos e carrapatos (CORDEIRO et al., 1994). Uma significativa via de infecção para os bovinos são os insetos hematófagos, principalmente naquele tipo de criação que permite uma maior proximidade entre os animais (JOHNSON; KANEENE, 1991). A transmissão pelo sêmen ocorre quando massagem retal das glândulas anexas é realizada de forma grosseira e incorreta permitindo a contaminação do sêmen com sangue, quando a colheita é realizada em animais positivos (LUCAS et al., 1980). A monta natural também é considerada uma via de infecção quando há a transferência de pequenas quantidades de sangue durante a cópula (WHITTIER, 1990). Uma outra forma de infecção seria o contato direto de secreções de bovinos soropositivos com bovinos soronegativos e a contaminação pode ocorrer em um prazo tão curto quanto dois meses, porém é necessário um íntimo e prolongado contato entre os animais (STRAUB, 1978). Na transmissão vertical (de mãe para filho) a LEB pode ser transferida pela via transplacentária (FERRER, 1979; VAN DER MAATEN et al., 1981; LASSAUZET et al.,1991; HÜBNER et al., 1997) e pelo colostro e/ou leite (MOLNÁR et al., 1998). Uma importante via de disseminação do VLB é o colostro, através de vacas positivas para os lactentes (MOLNÁR et al., 1998).

7 4. PATOGENIA E RESPOSTA IMUNE Uma vez instalado no organismo do hospedeiro, o VLB tem tropismo pelos linfócitos do tipo B (AIDA et al., 1989). No envelope viral há um complexo de glicoproteínas (Gp) que desempenham um importante papel na infecção viral favorecendo a fusão à célula-alvo (ALTANER et al., 1993; SUZUKI; IKEDA, 1998). A glicoproteína externa, Gp51, une o vírus ao linfócito, enquanto que a Gp30 ancora o envelope viral na membrana plasmática da célula infectada (ALTANER et al., 1993; SUZUKI; IKEDA, 1998). O período de viremia é curto, entre 10 a 12 dias pós-infecção, porém após este, um longo período de latência pode ser observado antes do início dos sinais clínicos (PORTETELLE et al., 1978). Durante a infecção inicial, vírions verdadeiros podem ser produzidos a partir do DNA viral codificado (provírus), e quando escapam das células hospedeiras podem infectar outras células (REBHUN, 2000). A expressão do VLB por um linfócito infectado gera um aumento da sobrevivência desta célula por estacionar o ciclo celular, desencadeando um atraso da apoptose fisiológica (STONE et al., 2000). De acordo com Debacq et al. (2002),um componente fundamental, a modulação da apoptose, parece estar envolvido na persistência viral e na progressão para a linfocitose induzida pelos retrovírus. Apenas uma média de 2 a 5% dos animais infectados podem desenvolver os linfossarcomas, enquanto que a maioria (30%) desenvolve um quadro de linfocitose persistente a qual caracteriza-se pelo aumento do número de linfócitos B circulantes (BUEHRING et al., 1994; DOMENECH et al., 2000). Em casos pré-tumorais a persistência da linfocitose caracteriza-se pelo acréscimo de linfócitos B circulantes, ultrapassando os valores normais de referência, em torno de 40 a 80%, e nem sempre precede a forma tumoral (BURNY et al., 1985). A sequência de eventos que desencadeia o aumento do número de linfócitos circulantes ou o desenvolvimento das formas tumorais é pouco conhecida. Da mesma maneira, não está claro o efeito destas alterações na função das células envolvidas na resposta imunológica (AZEDO et al., 2008).

8 A forma tumoral da doença se manifesta cerca de 3 a 10 anos de ocorrida a infecção e tem caráter fatal e caracterizando-se por proliferaçãode linfócitos B e desenvolvimento de linfomas e/ou linfossarcomas (COCKRELL; REYES, 2000). Estes são descritos como uma infiltração linfocitária exarcebada em órgãos linfóides e em diversos órgãos que compõem os vários sistemas do organismo animal (respiratório, circulatório, digestório, genital), colaborando para a grande variedade de sintomatologia clínica da LEB (BIRGEL, 1982; CAMARGOS et al., 2002). Azedo et al. (2008) descreve que a manifestação de linfocitose persistente nos animais doentes leva a uma menor porcentagem de leucócitos, devido a uma maior quantidade relativa de linfócitos. Após o período de viremia tem início a produção de anticorpos contra as proteínas estruturais da cápsula viral (GARCIA et al., 1995), e o vírus pode ser neutralizado por anticorpos dirigidos contra a Gp51 do envelope viral (ALTANER et al., 1993). Porém, depois da produção de anticorpos pelo organismo infectado, o vírus se protege ficando no limbo linfocitário (REBHUN, 2000). Com a persistência da infecção por toda a vida do hospedeiro, o sistema imune será constantemente estimulado, levando à diminuição da resposta humoral e celular após longo período de infecção, podendo resultar na manifestação clínica da doença (GILLET et al., 2007). Assim, a maioria dos animais infectados pode permanecer assintomática por longos períodos de tempo até que a doença se manifeste (BUEHRING et al., 1994; DOMENECH et al., 2000). 5. SINAIS CLÍNICOS De acordo com os aspectos etiológicos e epidemiológicos, a leucose bovina é classificada em enzoótica e esporádica (OSHIMA et al., 1980; DIVERS et al., 1995). A forma enzoótica acomete principalmente os bovinos adultos com idade entre três e sete anos (FLORES, 1989).

9 Já a forma esporádica da leucose acomete os bovinos mais jovens e não é transmissível. Três apresentações clínicas podem ocorrer e sua classificação é feita de acordo com a idade do animal e localização das massas tumorais: tímica, juvenil (Figura 1) e cutânea (OSHIMA et al., 1980; JONES et al., 2000). Figura 1-Leucose bovina multicêntrica juvenil. (A) Linfonodos parotídeo, préescapular e précural aumentados de tamanho (setas). (B) Linfonodos pré-escapulares aumentados de tamanho, apresentando superfície de corte de coloração branco amarelada homogênea. (C) Linfonodos a- noretais aumentados de tamanho e agrupados com aspecto de uma massa multinodular nas superfícies lateral e dorsal do segmento distal do reto. (D) Linfonodo anorretal apresentando superfície de corte de coloração branco-amarelada com áreas vermelho-escuras. Fonte: PEIXOTO, et al., 2008. Nos animais em que está presente o desenvolvimento da forma tumoral, são observados os sinais clínicos da LEB, os quais são resultantes da formação de linfossarcomas, bem como da localização desses tumores (Figura 2) (JOHNSON; KANEENE, 1991; CAMARGOS et al., 2004).

10 Figura 2- Linfossarcoma bovino: linfonodo pré-escapular direito bastante aumentado de tamanho (seta). Fonte: http://www.fmv.utl.pt É comum o aumento de linfonodos superficiais, porém esta hiperplasia pode ocorrer apenas em tecidos linfóides viscerais. Ocorre, com frequência, invasão do sistema digestório, sendo comum no abomaso, causando obstruções ou úlceras que podem manifestar-se clinicamente como anorexia, timpanismo recorrente e perda de peso. As massas tumorais localizadas na medula espinhal desencadeiam perturbações neurológicas como paralisia dos membros pélvicos, e casos de falência cardíaca em bovinos são frequentemente associados àquelas presentes no miocárdio (JOHNSON; KANEENE, 1991). Também foram descritas formações tumorais no pulmão, baço, útero, rins e trato urinário. E os sinais clínicos considerados mais frequentes são inapetência, indigestão, diarréia, perda de peso, partos distócicos, exoftalmia, paralisia de membros e alterações neurológicas por compressão de nervos (CAMARGOS et al., 2004). Há relatos de que a ação direta do VLB na glândula mamária pode comprometer a produção de leite dos animais infectados, uma vez que este já foi encontrado tanto em linfócitos (YOSHIKAWA et al., 1997) quanto nas células epiteliais da glândula mamária (BUEHRING et al., 1994). Estudos realizados in vitro demostraram a capacidade do VLB em promover a transformação de células mamárias, desencadeando uma redução na produção de caseína, e, possivelmente, induzindo modificações na composição do leite (MOTTON; BUEHRING, 2003). Alguns estudos sugerem uma maior produção de leite em vacas infectadas consequente à maior susceptibilidade dos animais de elevado padrão

11 genético à infecção pelo VLB (JACOBS et al., 1991; POLLARI et al., 1992). Por outro lado, Brenner et al. (1990) não verificaram diferenças na produção de leite e nem nos teores da gordura do leite, semelhante as pesquisas desenvolvidas por Huber et al. (1981) e Tiwari et al. (2007). A seguir é apresentado um quadro com os principais sinais clínicos observados nos bovinos infectados (Quadro 1). Quadro 1- Principais sinais clínicos da forma multicêntrica da Leucose Enzoótica Bovina, com sua relação anatomopatológica e prováveis causas. SINAIS CLÍNICOS PROVOCADO POR Perda de peso Diarréia, anorexia, outras causas não determinadas Aumento de linfonodos Presença de linfócitos tumorais superficiais Baixa de produção de leite Anorexia, diarréia, mastite, outras causas não determinadas Anorexia Causas não determinadas Aumento de linfonodos Proliferação de células tumorais (internos) Paresia dos membros Infiltrações tumorais na região epidural da medula pélvicos espinhal Anemia Hemorragia com perda de sangue pelo trato gastrointestinal, principalmente abomaso Febre Necrose tissular, infecções concomitantes, outras causas não determinadas Exoftalmia Infiltração de células tumorais nos tecidos retrobulbares Dispnéia Compressão das vias aéreas por linfonodos aumentados de volume Constipação Compressão do tubo gastrointestinal por linfonodos aumentados Alterações cardíacas Infiltração de células tumorais no miocárdio (insuficiência cardíaca) Edema subcutâneo ventral Insuficiência cardíaca congestiva Pulso venoso positivo Insuficiência cardíaca congestiva Parto distócico Compressão das vias do parto por linfonodos aumentados de volume Morte fetal Infiltração tumoral na parede do útero Hidronefrose Compressão dos ureteres por linfonodos aumentados Fonte: Adaptado de OLIVEIRA (2000) apud AGOTTANI et al., 2010. 6. DIAGNÓSTICO O diagnóstico da LEB é fundamental para o controle e erradicação da doença, podendo ser realizado na patologia clínica e sorologicamente, pela

12 identificação de alterações hematológicas ( chaves leucométricas ) e identificação de anticorpos específicos, respectivamente (EVERMANN, 1992). Em 1916, Knuth e Volkmann realizaram no continente europeu os primeiros estudos sobre as formas de diagnóstico e também de controle da doença. Também foram estudadas as alterações hematológicas causadas pela LEB, nos quais ficou constatado que tanto os animais portadores de linfossarcomas quanto os aparentemente sadios, apresentavam uma alteração no sangue com leucocitose e acentuada linfocitose, além do aparecimento de linfócitos atípicos no sangue periférico. Birgel et al. (1974), foram pioneiros na avaliação de leucogramas de bovinos positivos para o VLB no Brasil. Eles observaram que o comportamento leucocitário dos animais europeus não era semelhante ao dos animais criados em condições climáticas subtropicais devido a fatores raciais, nutricionais, tipo de manejo e adoção de procedimentos utilizados com frequência em nosso país como a premunição contra a Babesia sp. e Anaplasma sp. O VLB é capaz de desencadear um desequilíbrio tanto pelo aumento da proliferação celular (DEBACQ et al., 2002) quanto pela redução da apoptose dos linfócitos infectados (DEBACQ et al., 2003; TAKAHASHI et al., 2005), resultando em uma linfocitose persistente. Esta, por sua vez, deveria ser considerada como o aumento no número de linfócitos circulantes em três ou mais desvios-padrões acima da média e mantidos por pelo menos 90 dias, de acordo com padrões raciais e etários dos animais (MODENA, 1984). No entanto, segundo experimentos realizados por Birgel (1982), foi ressaltada uma limitação desta técnica, uma vez que ela identificava apenas 61,5% de animais infectados. Outros pesquisadores muitas vezes não encontravam diferenças significativas entre o número de linfócitos de animais reagentes e não reagentes, questionando também sobre a fidelidade diagnóstica do teste (SCARCI, 1980; RIBEIRO, 1987). Ainda assim, a principal vantagem das investigações hematológicas seria identificar os animais positivos antes do aparecimento das formações tumorais da doença em cerca de 50% dos casos (SCHWARTZ; LEVY, 1994), ressaltando

13 também que a LEB foi controlada na Alemanha e Dinamarca através da utilização das chaves leucométricas (TOLLE, 1965). Entretanto, com o uso mais acentuado dos exames sorológicos para detecção de anticorpos para o VLB, o diagnóstico hematológico baseado em chaves leucocitárias caiu em desuso, visto que existem diversos fatores que podem interferir nos constituintes sanguíneos dos animais (MODENA, 1984). Dentre as técnicas sorológicas já existentes, as mais comumente utilizadas para a identificação da LEB são: a Imunodifusão em gel de ágar IDGA (MILLER; OLSON, 1972), a fixação de complemento (MILLER; VANDER MAATEN, 1976), a soroneutralização (FERRER et al., 1976), o radioimunoensaio (MACDONALD; FERRER, 1976), o ensaio imunoenzimático - ELISA (ALTANER et al., 1982) e a reação em cadeia da polimerase - PCR (AGRESTI et al., 1993). O teste de imunodifusão em ágar gel (IDGA), o qual utiliza o antígeno glicoprotéico da cápsula viral- Gp51, possibilitou a realização de pesquisas que objetivavam estudar a prevalência dessa enfermidade em rebanhos bovinos (MILLER; VAN DER MAATEN, 1977).Porém, alguns pontos negativos foram detectados no teste de IDGA utilizado para diagnosticar a LEB: o teste teria uma baixa sensibilidade de detectar animais com baixos títulos de anticorpos; animais infectados recentemente; vacas gestantes próximos de três semanas que antecedem o parto e vaca com duas semanas de puerpério (FERRER, 1979; BURRIDGE et al., 1982b; HÜBNER et al., 1996; ERVERMAN; JACKSON, 1997). O teste de IDGA também não teria a capacidade de diferenciar anticorpos transferidos de forma passiva para os bezerros via colostro de anticorpos de uma infecção ativa (BURRIDGE et al., 1982a; VAN DER MAATEN; MILLER, 1990). Entretanto existem algumas vantagens do uso da técnica de IDGA como a praticidade, os baixos custos e a facilidade de leitura dos resultados associados a uma boa especificidade, permitindo que ele seja ainda o teste de eleição para o levantamento epidemiológico da LEB na maioria dos países (EVERMANN; JACKSON, 1997).

14 A prova de IDGA ainda continua sendo a mais utilizada para o diagnóstico da LEB, mesmo após o desenvolvimento de outras técnicas (MILLER; VAN DER MAATEN, 1977), como o ELISA que pode ser utilizado no leite e possui maior sensibilidade (JOHNSON; KANEENE, 1992). Esta sensibilidade superior permite a detecção de anticorpos em rebanhos com prevalência menor que 1%, enquanto que o IDGA detecta apenas 50% de animais positivos em amostras séricas agrupadas (JOHNSON; KANEENE, 1992). Um estudo comparativo entre as técnicas de IDGA e ELISA indireto foi realizado para diagnosticar o VLB, utilizando como teste confirmatório o Western blotting (WB). Os resultados mostraram a semelhança de especificidade entre os testes, porém, o ELISA apresentou uma maior sensibilidade quando comparado ao IDGA (DOLZ; MORENO, 1999). A técnica de ELISA tem como vantagem a possibilidade de análise de um grande número de amostras de forma simultânea. A proteína p24 é o antígeno mais importante para as técnicas de ELISA e de WB enquanto que as glicoproteínas Gp51 e Gp30 são de extrema importância para a técnica de IDGA. A técnica de WB é mais útil em estudos de caracterização antigênica do vírus (DOLZ; MORENO, 1999). Entretanto, em algumas situações as técnicas sorológicas podem falhar, como no periparto e infecções recentes, sendo necessária a utilização de técnicas mais específicas que detectem diretamente o agente, como a PCR, podendo ser utilizada de forma complementar a análise sorológica (MARTIN et al., 2001). A PCR apresentou maior sensibilidade fornecendo resultados positivos em taxas superiores a 10 e 17% aos métodos de ELISA e IDGA, respectivamente e possibilitou também a distinção entre bezerros infectados daqueles animais soropositivos devido a ingestão de anticorpos colostrais (FECHNER et al., 1996). Apesar das muitas técnicas existentes e citadas é importante ressaltar que as técnicas aceitas como teste padrão ouro de diagnóstico pelo Office International des Epizooties, são os testes de IDGA utilizado em soro bovino e ELISA para soro e leite bovino (OIE, 2010b).

15 A realização de exames histopatológicos em bovinos infectados pode ser útil na caracterização da apresentação tumoral (YAMAMOTO et al.,1982). A detecção do antígeno viral por isolamento do vírus não é utilizado na rotina devido à baixa expressão viral e dificuldades de replicação do mesmo (ERVERMAN; JACKSON, 1997). 7. EPIDEMIOLOGIA E IMPORTÂNCIA ECONÔMICA A Leucose Bovina teve como local de origem o continente europeu e a partir daí difundiu-se para o restante dos continentes (OLSON; MILLER, 1987). A Alemanha foi o primeiro país no qual a doença foi identificada pela primeira vez. Em 1983 realizou-se uma investigação epidemiológica onde foi observada uma prevalência de 0,05% (TIERSEUCHENBERICHT, 1983), porém atualmente é relatada a erradicação da doença no país (RADOSTITS et al., 2002). Na América, indícios revelam que a introdução da infecção neste continente ocorreu devido à importação de rebanhos bovinos pelos Estados Unidos logo após a segunda Guerra Mundial (CAMARGOS et al., 2004). No Brasil, em 1943, Rangel e Machado relataram o primeiro caso da doença quando realizavam investigações relacionadas a neoplasias dos animais domésticos em Minas Gerais e descreveram a ocorrência de quatro casos de linfossarcomas em bovinos (SPONCHIADO, 2008). Em 1978, Alencar Filho identificou 24 animais reagentes provenientes da avaliação de 40 amostras séricas bovinas de São Paulo. Desde então, várias pesquisas foram realizadas e seus resultados demonstram a disseminação da LEB em todo o país. As taxas de prevalência da Leucose enzoótica bovina, dependendo do Estado nos quais pesquisas foram desenvolvidas, variaram de 5,1 a 44,3%, de acordo com levantamento bibliográfico realizado por Birgel Júnior et al. (2006). Dos rebanhos examinados verificou-se que 58,9% (656 de um total de 1.113) destes apresentavam animais infectados pelo VLB e pertenciam a 17 estados do

16 país (Acre, Amazonas, Pará, Rondônia, Alagoas, Bahia, Ceará, Paraíba, Pernambuco, Piauí, Rio Grande do Norte, Goiás, Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo, Paraná e Rio Grande do Sul). Também foi descrita a ocorrência de focos da LEB no Espírito Santo, Mato Grosso do Sul e em Santa Catarina (BIRGEL JUNIOR et al., 2006). Tabela 1 Ocorrência da Leucose Enzoótica Bovina (LEB) no Brasil nas regiões Nordeste, Norte, Sudeste, Centro-Oeste e Sul, segundo o estado, a técnica diagnóstica e o autor. (Continua) Estados Nº. de amostras analisadas Nº. de amostras positivas Frequência (%) Técnica utilizada Referência Região Nordeste BA 187 14 7,50 ELISA SARDI et al., 2002 796 326 41,00 IDGA MATOS et al., 2005 CE 3.430 842 24,50 IDGA ABREU et al., 1994 MA 920 495 53,80 IDGA SANTOS, 2010 PB 780 65 8,30 IDGA SIMÕES, 1998 PE 518 72 15,75 IDGA MELO et al., 1991 662 213 32,20 IDGA MENDES, 2009 PI 1.976 333 16,90 IDGA SILVA, 2001 Região Norte AC 1.060 103 9,70 IDGA ABREU et al., 1990 AM 604 58 9,60 IDGA CARNEIRO et al., 2003 PA 668 174 26,00 IDGA MOLNÁR et al., 1999 RR 1.060 244 23,00 IDGA ABREU et al., 1990 TO 881 326 37,00 IDGA FERNANDES et al., 2009 Região Sudeste MG 317 90 28,40 IDGA SANTOS et al., 1985 1.059 308 29,08 IDGA CAMARGOS et al., 2002 SP 1.193 618 52,00 ELISA MEGID et al., 2003 482 20 4,15 IDGA BIRGEL et al., 1994 RJ ROMERO e ROWE, 1.444 769 53,30 IDGA 1981 746 201 26,90 IDGA CUNHA et al., 1982 Região Centro-Oeste GO 670 239 35,67 IDGA ANDRADE e ALMEIDA, 1991

17 Tabela 2 Ocorrência da Leucose Enzoótica Bovina (LEB) no Brasil nas regiões Nordeste, Norte, Sudeste, Centro-Oeste e Sul, segundo o estado, a técnica diagnóstica e o autor. Estados Nº. de amostras analisadas Nº. de amostras positivas Frequência (%) Técnica utilizada (Continuação) Referência Região Sul PR 268 151 56,34 IDGA BARROS FILHO et al., 2010 624 254 40,70 IDGA LEUZZI JÚNIOR et al., 2003 1.089 534 49,04 IDGA SPONCHIADO, 2008 SC CORDEIRO et al., 34 12 35,00 IDGA 1994 250 19 7,60 IDGA LUDERS, 2001 IDGA = Imunodifusão em gel de ágar; ELISA = Ensaio imunoenzimático Fonte: Adaptado de SPONCHIADO, 2008. Segundo dados da Tabela 1, a Região Nordeste possui registros da LEB em praticamente todos os estados e com freqüências variando de 7,5 a 53,80 %, indicando uma ampla disseminação da doença nesta região (MELO et al., 1991; ABREU et al., 1994; SIMÕES, 1998; BIRGEL et al., 1999; SILVA, 2001; SIMÕES et al., 2001; SARDI et al., 2002; MATOS et al., 2005; MENDES, 2009; SANTOS, 2010). No Estado da Bahia, Távora e Birgel (1991) foram os primeiros pesquisadores a investigarem a doença nos rebanhos bovinos leiteiros e verificaram que das 1.084 amostras de bovinos analisadas na região de Itabuna, 174 (16,1%) foram reagentes. Já Matos et al. (2005) verificaram uma prevalência mais elevada (41%) em estudos realizados em 5 diferentes municípios (Salvador, Feira de Santana, Catú, Santo Antônio de Jesus e Entre Rios). A frequência mais elevada da LEB na região Nordeste foi no Maranhão (53,8%), verificada por Santos em 2010, possivelmente pela comercialização intensa de animais com finalidade de melhoramento genético nas bacias leiteiras submetidas a pesquisa. O índice encontrado foi associado a uma comercialização intensa de animais, objetivando melhoria genética, nas bacias leiteiras estudadas.

18 Em Pernambuco a prevalência variou de 0 a 53,5%, sendo este resultado relacionado à criação intensiva e um maior grau de sangue taurino dos animais amostrados (MENDES, 2009). Na região Norte, as investigações realizadas por Fernandes et al. (2009) e por Molnár et al. (1999) na mesorregião Ocidental do Tocantins, utilizando a técnica de IDGA, identificaram as maiores prevalências da região, 37% e 26%, respectivamente. Para o primeiro autor, o elevado índice decorreu da expansão negligenciada da bovinocultura leiteira, com a introdução de animais provenientes de outros Estados. Já Molnár et al. (1999) percebeu que no Pará a doença estava bastante disseminada na bovinocultura de corte, com predomínio da criação extensiva. Na região Sudeste, Megid et al. (2003) identificaram elevada soroprevalência (52%) na microrregião da Serra de Botucatu, utilizando o teste de ELISA em animais mestiços nelore e holandês. Ainda em São Paulo, Birgel Júnior et al. (2006) verificaram em bovinos da raça simental, uma prevalência variando de 0 a 19,04% em sete municípios (Avaré, Nantes, Vargem Grande do Sul, Bragança Paulista, Araçoiaba da Serra, Pindamoiangaba e Jarinu). A região Sul obteve a prevalência mais elevada para LEB no Brasil (56,34%), sendo identificada por Barros Filho et al. (2010), na qual foram avaliados bovinos leiteiros das raças Holandesa Preta e Branca, Jersey, Pardo- Suíço e mestiços da região Metropolitana de Curitiba (PR). O elevado índice obtido, possivelmente está relacionado à ausência de programas de controle da doença e a pouca conscientização por parte de produtores e técnicos sobre os prejuízos desencadeados pela presença do VLB nos rebanhos bovinos. No Rio Grande do Sul, a pesquisa mais abrangente foi realizada por Moraes et al. (1996) na qual foram coletadas amostras de 172 municípios, distribuídos em 9 regiões geográficas. Das 39.799 amostras coletadas, 3.645 (9,2%) foram positivas. No Paraná, a prevalência obtida foi de 49,04% em bovinos leiteiros de 25 municípios (SPONCHIADO, 2008). Já Frandoloso et al. (2008), observaram que a prevalência aumentou para 61,56%, caracterizando uma disseminação mais ampla do vírus.

19 É também na região Sul onde foi observada a menor prevalência nacional (7,6%), no município de Mafra, Santa Catarina. Um fator em especial foi considerado relevante pelos pesquisadores, o fato de propriedades com pequenas criações (menos de 20 animais) apresentarem em média prevalência superior a outras com uma quantidade maior de animais (LUDERS, 2001). A ocorrência da LEB em rebanhos mundiais causa grandes prejuízos à bovinocultura como o descarte de animais com a presença de linfossarcomas, barreiras internacionais ao comércio de animais soropositivos, decréscimo da produção leiteira e da gordura do leite, condenação de carcaças em abatedouros, despesas com medicamentos e serviços veterinários (OIE, 2010a). Com relação às perdas produtivas ocasionadas por alterações na quantidade e qualidade do leite de vacas soropositivas existem discordâncias entre diversos estudos (HUBER et al., 1981; BRENNER et al., 1990; JACOBS et al., 1991; TIUWARI et al., 2007). Embora a coleta de sêmen e transferência de embriões sejam realizadas de maneira adequada, diversos países impõem barreiras à importação desses materiais podendo gerar prejuízos não só para as centrais de inseminação, mas também para as indústrias de leite e carne (MILLER; VAN DER MAATEN, 1982). 8. CONTROLE E PREVENÇÃO Há a necessidade de sensibilizar as autoridades e instituições de pesquisa com a finalidade de implantar programas profiláticos e de controle da Leucose Bovina, pois no Brasil ainda não existem programas específicos para prevenir e controlar a doença e esta não possui tratamento específico, sendo o prognóstico desfavorável. Alguns países já erradicaram a LEB como a Dinamarca, Alemanha (RADOSTIS et al., 2002) e Finlândia (NUOTION et al., 2003), outros estão em processo de erradicação, como o Canadá (VANLEEUWEN, 2004) e Estados Unidos (BRUNNER et al., 1997) e ainda outros que não tem programa de

20 certificação de propriedades livres do VLB, como o Brasil (DEL FAVA; PITUCO, 2003). Três medidas são consideradas para erradicação da LEB do rebanho, sendo elas: i, teste e sacrifício, que só deve ser utilizada em rebanhos com baixa prevalência, porém o custo é elevado; ii, teste e segregação, que pode ser utilizada em rebanhos com elevada prevalência, porém requer espaço amplo; iii, teste e implantação de medidas corretivas, que tem custo reduzido, porém são necessárias várias mudanças no manejo e requer longo período para gerar resultados (SUH et al., 2005). O controle da LEB também é tão difícil quanto a erradicação, e é comprometido pela grande distribuição, pelo elevado número de animais assintomáticos e pela lenta evolução da doença, além da ausência de informação dos produtores (JOHNSON; KANEENE, 1991). Para o controle da disseminação é fundamental a identificação dos soropositivos, uma vez que os bovinos infectados permanecem portadores e eliminam o vírus por toda a vida (FERRER, 1979). Por isso é importante realizar exames sorológicos periódicos (JOHNSON; KANEENE, 1991). Os animais positivos devem ser descartados, porém quando o descarte for inviável existe uma alternativa parar reduzir a difusão da infecção através da segregação dos soropositivos em grupos, com manejo separado (FLORES et al., 1990; DIGIACOMO, 1992). É necessário cuidados ao introduzir novos animais no rebanho e educar os produtores sobre a doença (JOHNSON; KANEENE, 1991), além de prevenir a transmissão iatrogênica através de fômites ou vetores animados, adotando medidas que evitem a transferência de células de um doador infectado para um animal soronegativo. Outra medida importante é a utilização de colostro livre do vírus. Este, ao ser submetido ao processo de pasteurização (BAUMGARTENER et al.,1976) ou de congelamento, é capaz de inativar a infectividade do vírus (MILLER; VAN DER MAATEN, 1982). Não há a existência de vacinas disponíveis no mercado contra a LEB, porém algumas pesquisas continuam avançando para o desenvolvimento de uma vacina para o controle da LEB.

21 A última avaliação nacional sobre a disseminação da doença no Brasil (BIRGEL JÚNIOR et al., 2006), foi observada uma prevalência nacional de 27,6%. De acordo com a classificação de Shetigara et al., (1986), esta era considerada média e nos favorecia no sentido da obtenção de bons resultados desde que, em curto espaço de tempo, fossem criados programas oficias de controle e erradicação da doença. OBJETIVOS Objetivo Geral Determinar a prevalência sorológica da Leucose Enzoótica Bovina (LEB) no rebanho bovino do Estado de Sergipe. Objetivos Específicos Determinar a prevalência da LEB nos municípios com o maior efetivo de bovinos do Estado de Sergipe. Verificar a ocorrência de sintomatologia clínica nos animais soropositivos. Caracterizar os sistemas de criação de bovinos sergipanos. Contribuir para a implantação de medidas sanitárias mais rigorosas voltadas para o controle e prevenção da enfermidade nos rebanhos sergipanos. HIPÓTESE A presença da Leucose Enzoótica Bovina no Estado de Sergipe e a caracterização dos sistemas de criação das propriedades revelaram a necessidade de implantar medidas básicas de controle e prevenção acerca da enfermidade, a qual é responsável por causar prejuízos econômicos na bovinocultura. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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36 CAPÍTULO 1 Inquérito Soroepidemiológico Da Leucose Enzoótica Bovina Em Rebanhos Bovinos Do Estado De Sergipe

37 Inquérito Soroepidemiológico Da Leucose Enzoótica Bovina Em Rebanhos Bovinos Do Estado De Sergipe RESUMO O estado de Sergipe, localizado na região Nordeste do Brasil, é o único Estado desta região com ausência de estudos sobre a soroprevalência da Leucose Enzoótica Bovina, havendo a necessidade da realização de pesquisas para verificação da situação atual da enfermidade. O objetivo do presente estudo foi realizar um inquérito soroepidemiológico da Leucose Enzoótica Bovina em rebanhos bovinos do Estado de Sergipe o qual foi dividido em três mesorregiões: Leste sergipano, Agreste sergipano e Sertão sergipano. Em cada mesorregião foram selecionados os cinco municípios com o maior efetivo bovino, totalizando 780 amostras coletadas, dentre machos e fêmeas, de faixas etárias diversas, provenientes de 52 propriedades dos municípios visitados. Todas as amostras de soro foram submetidas ao teste de imunodifusão em gel de ágar (IDGA), obtendo-se resultados positivos para anticorpos anti-vírus da leucose bovina (anti-vlb) em 11,92% (93/780) dos animais. Dentre as propriedades, 59,61% (31/52) apresentaram animais reagentes, sendo que dos 15 municípios visitados, apenas dois não apresentaram animais sororeagentes. De acordo com os resultados obtidos ficou confirmada a presença de anticorpos contra o agente etiológico nos rebanhos bovinos sergipanos, reforçando a necessidade de instituir medidas de controle e prevenção eficazes contra a Leucose bovina, com o objetivo de controlar a doença no Estado e conhecer melhor a sua epidemiologia. Palavras-chave: bovinos, IDGA, soroprevalência

38 Seroepidemiological Inquiry of Enzootic Bovine Leukosis in Cattle Herds in the state of Sergipe ABSTRACT The state of Sergipe, located in the Northeast of Brazil, is the only state in the region with absence of studies about the seroprevalence of Enzootic Bovine Leukosis. Therefore, there is a need of conducting research to verify the current status of the disease. The aim of this study was to conduct a seroepidemiological inquiry of enzootic bovine leukosis in cattle herds in the state of Sergipe, which was divided into three mesoregions: East Sergipe, Agreste Sergipe and Sertão Sergipe. In each mesoregion we selected the five counties with the largest cattle herd, totaling 780 samples collected from males and females of all ages, from 52 properties of the counties visited. All serum samples were submitted to the test of agar gel immunodiffusion (AGID) and positive results was obtained for antivirus antibodies of bovine leukosis (anti-vlb) in 11.92% (93/780) of the animals. Among the properties, 59.61% (31/52) presented reacting animals, and from the 15 counties visited, only two did not show reactive serum animals. According to the results it was confirmed the presence of the etiologic agent in Sergipeans cattle, reinforcing the need to institute effective measures of control and prevention against Enzootic bovine, in order to control the disease in the state and better understand its epidemiology. Keywords: cattle, AGID, seroprevalence

39 INTRODUÇÃO No Brasil, a bovinocultura apresentou um crescimento nos últimos anos contando atualmente com o efetivo bovino de 212.815.311 cabeças, sendo que na região Nordeste está concentrado 1,39% do rebanho nacional, estando Sergipe com um total de 1.178.771 cabeças distribuídas em 75 municípios (IBGE, 2011). A Leucose enzoótica bovina (LEB) é uma enfermidade infecciosa causada pelo vírus da leucose bovina (VLB), responsável pela ocorrência de linfossarcomas multicêntricos no adulto, em diversos sítios do organismo do animal desencadeando uma grande variedade de sintomas (RADOSTITIS et al., 2002). A primeira descrição da LEB foi realizada na Alemanha em 1871. Somente após a segunda Guerra Mundial foram feitos diversos relatos sobre a doença em praticamente toda a Europa oriental. A introdução do vírus em rebanhos bovinos dos Estados Unidos só ocorreu no final do século 19 com a importação de animais provenientes do continente europeu, e a partir daí disseminando a enfermidade nos rebanhos canadenses. Com a importação de bovinos provenientes destes dois países, a doença se disseminou para o restante do mundo (LEISERING, 1871; FELDMAN, 1928; SCHOTTLER, 1934; SORENSEN, 1961; JOHNSON; KANEENE, 1992). No Brasil, a doença foi inicialmente descrita por Rangel e Machado, em 1943, no estado de Minas Gerais, seguida por relatos nos estados do Rio de Janeiro e Rio Grande do Sul (SANTOS et al., 1959; MERCKT et al. 1959). Desde então, diversas pesquisas vêm sendo realizadas em diversos estados do país. A transmissão iatrogênica com agulha, luva de palpação, material cirúrgico ou qualquer outra forma de procedimento que seja capaz de transmitir linfócitos contaminados de um animal doente para um sadio é considerada a principal fonte de infecção do VLB para os bovinos, ou seja, pequenos volumes de sangue transferidos durante alguns destes procedimentos possuem um grande potencial na transmissão da infecção (DIMMOCK et al., 1991). Os recém-

40 nascidos podem se contaminar através da ingestão de colostro e leite contendo linfócitos contaminados com o agente etiológico (JACOBSEN, 1983). O diagnóstico definitivo da LEB através dos achados clínicos de forma isolada é frequentemente difícil devido a ampla diversidade de sinais clínicos, necessitando de um diagnóstico diferencial para enfermidades como: doença de Johne, pericardite traumática, abscesso da medula espinhal, tuberculose e actinobacilose (RADOSTITIS et al., 2002). Na patologia clínica, a observação do aumento persistente no número de linfócitos B e os testes sorológicos para identificar anticorpos específicos contra os antígenos do VLB são ferramentas de diagnóstico da LEB (EVERMANN, 1992). Inúmeras técnicas imunosorológicas surgiram relacionadas com a produção de anticorpos contra o VLB. Porém as técnicas aceitas como teste padrão ouro de diagnóstico pelo Office Internacional Des Epizooties são os testes de IDGA e ELISA que utilizam o soro bovino e o soro e leite bovino, respectivamente (OIE, 2010). A imunodifusão em gel de ágar (IDGA) é atualmente a técnica mais utilizada devido a sua praticidade, baixo custo e especificidade. Esta técnica foi desenvolvida a partir da gp 51 presente na cápsula viral (MILLER e VAN DER MAATEN, 1976 e 1977). O Estado de Sergipe está cercado por Estados nos quais a soroprevalência da LEB já foi confirmada nos rebanhos bovinos, além de ser uma rota para o trânsito de animais entre vários Estados. Portanto, devido a ausência de estudos sobre a ocorrência da LEB no Estado, há a necessidade de pesquisas, visto que a bovinocultura tem uma importância socioeconômica, além dos prejuízos econômicos desencadeados pela enfermidade. Diante disso, o objetivo desta pesquisa foi realizar um estudo soroepidemiológico da Leucose Enzoótica Bovina avaliando os fatores de risco em rebanhos bovinos do Estado de Sergipe.

41 MATERIAIS E MÉTODOS O Estado de Sergipe é considerado o menor Estado do Brasil, ocupando uma área total de 21.915 km², e constituído por 75 municípios (IBGE, 2010). A área de atuação deste inquérito incluiu as três mesorregiões em que é dividido o Estado: Agreste, Leste e Sertão (Figura 1), sendo que em cada uma destas foram escolhidos os cinco municípios com maior efetivo bovino totalizando 514.471 cabeças (IBGE, 2008). Figura 1 Mapa demonstrativo do Estado de Sergipe identificando as três mesoregiões utilizadas neste estudo. Fonte:<http:/www.baixarmapas.com.br/> O número mínimo de amostras a serem colhidas foi calculado segundo Thrusfield (2004), com nível de confiança de 99% e erro amostral de 5%. Como a prevalência estimada não é conhecida utilizou-se no cálculo a prevalência esperada de 50% com o objetivo de maximizar o tamanho da amostra, totalizando 663 amostras mínimas a serem colhidas. No entanto, em cada propriedade visitada, foram colhidas amostras a mais como forma preventiva a ocorrência de hemólise. Dessa maneira, no período de agosto de 2010 a setembro de 2012, foram colhidas 780 amostras de soro bovino, provenientes de 52 propriedades, selecionadas por método não probabilístico, já que não havia uma lista completa de propriedades rurais de todos os municípios que possibilitasse a amostragem aleatória.