Relatório Anual Projeto: 1216 FILMES DE NANOPARTÍCULAS LUMINESCENTES EM DISPOSITIVO MICROFLUÍDICOS VISANDO O DESENVOLVIMENTO EM MÉTODOS ANALÍTICOS PARA A DETERMINAÇÃO DE SUBSTÂNCIAS DE INTERESSE CLÍNICO BIOLÓGICO Aluna Bolsista PIBIC: MAYARA MARA LEITE DE SOUZA Orientador: Prof. Omar Pandoli Rio de Janeiro, 31 de julho de 2014 1
Resumo A síntese de nanopartículas de prata (NPs-Ag) tem sido de extrema importância nos últimos anos. Essas NPs possuem propriedades físicas, químicas e biológicas únicas e têm sido utilizadas em diversas aplicações, na área da medicina, eletrônica, ciência dos matérias, fotovoltaico, etc. As NPs-Ag possuem uma grande área superficial e elevada energia o que garante excelente reatividade frente a moléculas que possam aderir na superfície metálicas. Quando as NPs são dispersa em solução (solução coloidal) ou depositadas sob substratos sólidos, as nanopartículas podem ser usadas como detectores de analitos de interesse biológicos, neste caso podem ser usada como sensores, denominados hoje em dia nanosondas. O objetivo deste projeto é a síntese de nanopartículas de prata em fluxo contínuo através da tecnologia dos reatores microfluídicos a fim de controlar de uma forma reprodutível, e economicamente sustentável. O segundo objetivo do projeto visa o estudo em solução por via espectrofotométrica UV-Vis da intereração entre um fármaco e as NPs-Ag. O terceiro objetivo é a deposição de monocamadas de NPs-Ag sobre o vidro e avaliação da atividade espectroscópica UV-VIS e SERS na presença de um analito adsorvido na superfície das nanopartículas. Os resultados obtidos mostram que a melhor proporção molar entre ligante/ag + /NaBH 4 para se obter o menor limite de sensibilidade dos fármacos em exame é 1:1:1,25. Em solução o fármaco interage com as NPs-Ag determinando uma variação considerável dos espectro UV-Vis, observando uma diminuição da banda espectroscópica centrada em 400 nm e criando uma nova banda SPR a 520 nm. A partir de um film de NPs sob o vidro foi observado espectrofotometricamente uma interação entre o fármaco e o filme de NPs-Ag e isso abre possibilidade de futuras aplicações analíticas através da espectroscopia SERS. 2
1. Introdução As nanopartículas de prata estão presentes hoje em dia em aplicações tecnológicas mais diversas. Os campos de aplicação são informática, medicina, química analítica, optoeletrônica, biotecnologia, catálise e muitos outros. A preparação de nanopartículas é um desafio de fundamental importância na área da nanociência. Em particular, busca-se a produção de nanopartículas (NPs) com determinadas propriedades físico-químicas, bem como seus tamanhos, formas, monodispersão, pureza e cristalinidade. Todo esse espaço de apicações que se abre é devido às propriedades peculiares das NPs. Em particular, o fenômeno de ressonância plasmônica (SPR- Surface Plasmons Ressonance) se manifesta quando a frequência de oscilação dos elétrons na superfície metálica das NPs entra em ressonância com a freqüência de oscilação da luz incidente [1]. Ressonância Plasmônica de Superfície (do inglês Surface Plasmon Resonance, SPR) é um fenômeno que ocorre na fronteira de um metal na nanoescala, quando excitado por um campo eletromagnético externo (Figura 1 A ). Os elétrons livres na superfície do metal são induzidos pelo campo eletromagnético, gerando uma oscilação máxima em determinada frequências, caracterizando a ressonância com a freqüência de oscilação da luz incidente. Nanopartículas dispersas em solução têm um comportamento interessante em relação à esse fenômeno. Soluções coloidais de nanopartículas de prata (Ag-Nps) apresentam coloração amarelada, enquanto nanopartículas de ouro (Au-Nps) apresentam tons vermelhos. Tal fato é justificado pelas diferentes frêquencias de SPR nos dois metais. Para nanopartículas de prata, ouro e cobre, as ressonâncias ocorrem na região da luz visível, apresentando assim coloração característica. Essa freqüência de ressonância está diretamente ligada a forma, tamanho, organização das nanopartículas e índice de refração do meio. Desse modo, é possível que nanopartículas de mesma natureza apresentem frequências diferentes, através da variação destas propriedades. Através da espectroscopia UV-Vis, é possível analisar as nanopartículas em solução. O resultado são banda de absorção característica da nanopartícula, que representa a superposição das frequêquencias de SPR das partículas examinadas. No caso das Ag-Nps, nanopartículas esféricas entre 10-20 nm possuem uma banda de absorção no espectro em torno de 400 nm. Dependendo do tamanho, uma solução coloidal de NPs-Ag com diâmetros maiores, entre 30 e 100 nm, se apresenta com as seguintes cores: laranja, verde até violeta. Diferentemente, no estado macro e micropartículado a cor da prata aparece cinza ou preto. A figura 1B a seguir mostra a banda característica das NPs-Ag com diferentes morfologia, no caso de NPs esférica apresentam banda SPR centrada a 400nm [2]. 3
Figura 1 A. Esquema da oscilação de um plasmão para uma esfera, e o deslocamento eletrônica dos elétrons. Figura 1B. Espectros UV-Vis para NPs de prata nos formatos: cubo (cube), cubo truncado (TC), octaedro (CO), icosaedro (IH) e esfera (sphere). A síntese de nanopartículas de prata pode ser feita no método clássico em batelada ou em fluxo contínuo através da tecnologia de reatores microfluídicos. O uso de tecnologias em fluxo contínuo pode apresentar uma série de vantagens em comparação a um processo em batelada mais tradicional. Eles permitem uma análise rápida, otimização e escalonamento de uma reação química. Isso leva essencialmente a reduzir o tempo de reação e aumentar a qualidade do processo de produção [3]. O princípio básico de um sistema de fluxo contínuo é mostrado esquematicamente na figura 2 abaixo. Estes reatores são estruturas confeccionadas em aço, polímeros ou vidro contendo pelo menos duas regiões distintas: a zona de micromistura e a zona de residência. Figura 2. Esquema Geral de um Micro reator. Ao alimentar estruturas deste tipo com um reagente pelo ponto A e outro reagente pelo ponto B, o encontro dessas soluções acontece em um ponto diminuto do reator, com elevado grau de mistura e troca térmica, onde o tipo de junção utilizada influencia diretamente a desempenho da zona de micro mistura. Ela pode ser em forma de T o Y [4]. A utilização de micro reatores tem chamado à atenção tanto no ambiente acadêmico quanto no industrial em 4
virtude da sua elevada eficiência no gerenciamento do calor e da cinética reacional. É possível variar a velocidade de fluxo, o tempo de reação, razão molar entre as espécies, a temperatura e a pressão do sistema reacional. Após a síntese das nanopartículas, devido à sua elevada reatividade da superfície metálica, é necessário estabilizá-las, caso contrário elas agregarão em alguns dias. Uma maneira de realizar a estabilização é adicionar excesso de borohidreto de sódio, pois após a redução da prata, ele fica adsorvido na superfície das nanopartículas, dotando-as de cargas negativas, dificultando a agregação por repulsão colombiana, conforme ilustrado a seguir na figura 3 [2]. De outra forma é possível utilizar templantes orgânicos capazes de complexar o íon Ag+ e influenciar o processo de redução a prata metálica até estabilizar as nanoparticulas determinando uma camada orgânica ao redor da superfície metálica externa. Figura 3. NaBH 4 adsorvido na superfície das nanopartículas evitando a agregação das mesmas. Nanopartículas de Ag e Au, em solução ou depositadas sob substratos sólidos, se usadas como detectores de analitos de interesse biológicos são chamadas nanosondas. Quando uma molécula biológica interage sobre a superfície metálica de uma nanopartícula, a propriedade físico-químico muda e assim um fenômeno de ressonância plasmônica pode ser observado. Por exemplo, numa solução coloidal de NPs na presença de um analito é possível observar uma diminuição da banda de absorção característica das NPs, ou um deslocamento do λ max. Estes são sinais espectroscópicos que podem ser monitorados em solução até detectar concentrações mínimas de 10-7 -10-9 mol L -1 da substância em exame. Em particular, fármacos antibióticos aminoglicosídeos, usados no tratamento de vários tipos de infecções bacterianas, são utilizados como modelos para testar o limite de detecção das NPs-Ag sintetizadas no nosso laboratório. Dois fármacos fazem parte do estudo: sulfato de neomicina e sulfato de tobramicina. O interesse pelo desenvolvimento de nanosondas analíticas é devido às características desse fenômeno que facilitam a detecção de espécies químicas diversas e pela multiplicidade de modos de detectar alterações no sinal da sonda. A deposição de monocamadas de NPs-Ag 5
sobre o vidro visa o desenvolvimento de métodos analíticos para a determinação de substâncias de interesse clínico-biológico. Com as nanopartículas de prata ligadas ao vidro, é possível fazer a avaliação da atividade espectroscópica UV-VIS e SERS (Surface Enhanced Raman Scattering) das NPs-Ag em presença de um analito específico adsorvido fisicamente na superfície metálica das nanoparticulas. Espectroscopia Raman amplificada por superfície, ou dispersão Raman amplificada por superfície, frequentemente abreviada na literatura por SERS, é uma técnica sensitiva de superfície que resulta na ampliação da dispersão Raman por absorção de moléculas sobre superfícies. O fator de amplificação pode ser da ordem de 10 14-10 15, o que permite que a técnica seja suficientemente sensível para detectar moléculas isoladas [5]. 2. Objetivo O objetivo desse projeto é a síntese de Nanopartículas de Prata (NPs-Ag) em fluxo constante de AgNO 3 em borohidreto de sódio usando diferentes ligantes orgânicos. Desejamos também testar a sensibilidade das NPs-Ag em solução na presença dos fármacos aminoglicosídeos: sulfato de neomicina e sulfato de tobramicina. A caracterização de camadas de nanopartículas metálicas de prata na superfície de vidro funcionalizado com diferentes ligantes orgânicos (MPTS) e (APTS) também será abordada no projeto, visando desenvolver dispositivo analíticos baseado em filme finos de NPs para a determinação de substâncias de interesse biológico. 3. Métodos procedimentais 3.1 Síntese em fluxo continuo das NPs-Ag A síntese das NPs-Ag foi feita a partir da redução do precursor nitrato de prata AgNO 3 com borohidreto de sódio com auxílio da tecnologia de microreatores em fluxo contínuo. As soluções de AgNO 3, do ligante orgânico específico (citrato monossódico, citrato trisodico ou taratarato de sódio e potássio) e do borohidreto de sódio NaBH 4 foram preparadas a fim de se obter concentração de 10-3 mol L -1. Na etapa de complexação, o nitrato de prata AgNO 3 e o ligante são injetados diretamente no reator microfluídico variando as proporções ligante/ag + em função da velocidade de fluxo de entrada no microreator. A velocidade de fluxo pode variar entre 0,25-1,0 ml min -1. Na saída do microreator, o complexo ligante/ag + é gotejado diretamente na solução de agente redutor 10-3 mol L -1 sob contínua agitação com o auxílio de um agitador 6
magnético. A razão molar entre Ag + e NaBH 4 foi testada com 1:1,5 e 1:1,25. As amostras com diferentes frações molares de ligantes/ag + foram avaliadas com a ajuda do espectrofotômetro UV Vis ao longo de semanas, principalmente para se avaliar a estabilidade das NPs-Ag e a reprodutibilidade da síntese. 3.2 Testes analíticos para a determinação quantitativa dos fármacos aminoglicosídeos em solução. Foram pesadas massas dos fármacos aminoglicosídeos sulfato de neomicina e sulfato de tobramicina dentro de um tubo fálcon de 15 ml e completou-se o volume até a marca de 10 ml a fim de se obter concentrações dos fármacos 10-3 mol L -1. Após isso as soluções foram diluídas até a concentração de 10-7 mol L -1. Com isso foram feitos os testes analíticos para a determinação quantitativa dos fármacos aminoglicosídeos nas soluções coloidais de NPs-Ag. Em recipientes de 5 ml já com 2 ml de solução de NPs-Ag, adicionamos quantidades de água MiliQ e do fármaco até atingir as concentrações mínimas de 10-8, 0,5x10-7, 1x10-7, 2x10-7, 4x10-7 mol L -1 dos fármacos para checar qual o limite de sensibilidade dos fármacos nas NPs-Ag. Os resultados mostram que a maior sensibilidade das NPs-Ag na presença dos fármacos (sulfato de tobramicina e monosulfato de neomicina) se manifesta com uma proporção molar entre ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,25. O diâmetro das NPs-Ag verificado espectrofotometricamente ficou em torno de 10 e 30 nm com uma banda SPR em centrada entre 395-400 nm. A presença dos fármacos influencia o fenômeno de ressonância dos plasmons de superfície das NPs como mostrado nos seguintes espectros UV-Vis. Em solução, o fármaco interage sob a superfície metálica das NPs dando origem a uma novo sistema NPs/Ligante/Fármaco ou a fenômenos de agregação que apresentam uma nova banda plasmônica centrada entre 520-540 nm. Observamos que tanto as amostras analisadas que foram feitas com citrato trisódico e citrato monossódico se comportaram da mesma maneira. Ambos possuem limite de detecção do fármaco em 1x10-7 mol L -1 quando a proporção ligante/ag + /NaBH 4 de é de 1:1:1,5. Quando a proporção citrato monosodico/ag + /NaBH 4 de é de 1:1:1,25 o limite de detecção baixa a 0,5x10-7 mol L -1. Mesmo resultado foi observado no caso dos ligantes L(+) e D(-) Tartarato de K. Os dados mais relevantes dos testes UV-Vis para avaliação do limite de detecção dos fármacos em exame são indicados na tabela 1 abaixo. 7
Tabela1. Resumo das concentrações dos fármacos em exame detectados em solução coloidal de NPs-Ag Limite de detecção do farmaco [mol L -1 ] TriNa + citrato/ /Ag + /NaBH 4 1:1:1,5 MonoNa + citrato /Ag + /NaBH 4 de 1:1:1,5 MonoNa + citrato/ /Ag + /NaBH 4 1:1:1,25. TriNa + citrato/ /Ag + /NaBH 4 1:1:1,25. L(+)/D(-) Tartarato de K/Ag + /NaBH 4 de 1:1:1,25. Sulfato de tobramicina [1,0 x10-7 ] fig.4 [1,0 x10-7 ] fig.8 [0,5 x10-7 ] fig.10 --- -- Sulfato de Neomicina [1,0 x10-7 ] fig.6 --- --- --- [0,5 x10-7 ] fig. 12 e 15 Sulfato de Tobramicina em NPs-Ag na presença do ligante orgânico citrato trisódico Proporção molar ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,5 Figura 4. Variação das bandas SPR ao aumentar a concentração de fármaco sulfato de tobramicina em solução feita com citrato trisódico Ag + /NaBH 4 de 1:1:1,5. Limite: 1x10-7 mol L -1. Figura 5 Absorbância característica das NPs-Ag com λ max =392,95nm versus concentração de sulfato de tobramicina referente a F52-F56 8
Podemos observar na figura 4 que ao adicionar o fármaco, aparece uma nova banda em 520 nm conforme diminui a intensidade da banda de absorção das NPs-Ag em 392,5nm. A figura 5 mostra a variação da banda espectroscópica centrada a 392,5nm versus concentração de sulfato de neomicina e permite evidenciar o comportamento não linear da resposta da nanosonda na presença do fármaco. Neste caso o limite de detecção do fármaco sulfato de tobramicina é de 1x10-7 mol L -1. Monosulfato de Neomicina em NPs-Ag na presença do ligante orgânico citrato trisódico ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,5 Figura 6. Variação dos picos Abs ao aumentar a concentração de fármaco sulfato de neomicina em solução feita com citrato trisódico Ag + /NaBH 4 de 1:1:1,5. Limite: 1x10-7 mol L -1. Figura 7 Absorbância característica das NPs- Ag com λ max =389nm versus concentração de sulfato de neomicina referente a F29-F35 Podemos observar na figiura 6 ao adicionar o fármaco, aparece uma nova banda entre 510 e 520 nm conforme diminui a intensidade da banda de absorção das NPs-Ag em 389nm. A figura 7 mostra a variação da banda espectroscópica centrada a 389nm 9
versus concentração de sulfato de neomicina. Neste caso o limite de detecção do fármaco monosulfato de neomicina é de 1x10-7 mol L -1. Sulfato de Tobramicina em NPs-Ag na presença do ligante orgânico citrato monossódico ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,5 Podemos observar que ao adicionar o fármaco, aparece uma nova banda em 520 nm conforme diminui a intensidade da banda de absorção das NPs-Ag em 394nm. A figura 8 abaixo mostra a variação da banda espectroscópica centrada a 394nm versus concentração de sulfato de tobramicina, o grafico permite evidenciar que o comportamento das NPs sintetizadas com NaBH 4 com razão molar ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,5 é similar ao anterior, assim o limite de sensibilidade na presença do fármaco sulfato de tobramicina é 1x10-7 mol L - 1. Figura 8. Variação dos picos ao aumentar a concentração de fármaco sulfato de tobramicina em solução feita com citrato monossódico/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,5. Limite: 1x10-7 mol L -1. Figura 9 Absorbância centrada a λ max =394nm versus concentração de sulfato de tobramicina referente a F60-F64 ( ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,5) 10
Sulfato de Tobramicina em NPs-Ag na presença do ligante orgânico citrato monossódico ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,25 Na figura 10 e 11 são riportados os espectros UV-Vis e um gráfico para avaliar a concentração mínima necessária para observar uma variação das bandas SPR das soluções coloidais de NPs-Ag. Neste caso a síntese de NPs-Ag foi executada diminuindo a quantidade de agente redutor avaliando assim possíveis influencia do NaBH 4. A razão molar entre ligante/ag + /NaBH 4 é de 1:1:1,25. Figura 10. Variação dos icos ao aumentar a oncentração de fármaco ulfato de tobramicina em olução feita com citrato monossódico gante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,25. Limite: 0,5x10-7 mol L -1. Figura 11 Absorbância centrada a λ max =394,7nm versus concentração de sulfato de tobramicina referente a F65-F69 feita com citrato monossódico ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,25 Também nesse caso, com a adição do fármaco, foi observado o crescimento de uma nova banda em 520 nm concomitantemente com a diminuição da intensidade da banda de 11
absorção das NPs-Ag em 400nm. Neste caso o limite de detecção foi inferior até 0,5x10-7 mol L -1.. Assim concluímos que um leve excesso de NaBH 4 pode diminuir a sensibilidade das NPs-Ag impedindo, por exemplo, ao redor da superfície metálica a interação com o fármaco. Foi observado o mesmo fenômeno para o fármaco Sulfato de Neomicina como os ligantes quirais L(+) e D(-) Tartarato de K, como mostrados nas figuras 12-16. Sulfato de Neomicina em NPs-Ag na presença do ligante orgânico L(+) Tartarato de K, ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,25. Limite de detecção: 0,5x10-7 mol L -1 Figura 12. Variação dos picos espectroscopicos ao aumentar da concentração de fármaco sulfato de neomicina em solução feita com L(+) Tartarato de K. Limite: 0,5x10-7 mol L -1. ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,25. Figura 13. Absorbância versus concentração de sulfato de neomicina referente a R44N 12
Figura 14. Variação do novo pico de Absorbância λ max =540nm versus concentração de sulfato de neomicina Sulfato de Neomicina em NPs-Ag feita com D(-) Tartarato de K ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,25. Limite de detecção: 0,5x10-7 mol L -1 Figura 15. Variação dos picos ao aumentar a concentração de fármaco sulfato de neomicina em solução feita com D(-) Tartarato de K. Limite: 0,5x10-7 mol L -1. ligante/ag + /NaBH 4 de 1:1:1,25 Figura 16. Absorbância versus concentração de sulfato de neomicina referente a R46N Neste ultimas figuras 15 e 16 respeito as figura 12-14 foi trocado somente o ligante orgânico quiral. O objetivo nesse caso foi observar se a quiralidade do ligante orgânico absorvido na 13
superfície das NPs-Ag pudesse influenciar o reconhecimento e o limite de deteção do fármaco em solução. O êxito foi negativo, por ambos os ligantes quirais, D(-) e L (+) Tartarato de K, o resultado observado foi o mesmo, o limite de deteção revelado é de 0,5x10-7 mol L -1. Todas as soluções coloidais em presença dos fármacos mudam de cores em função da concentração limite detectada. Espectrofotometricamente a nova banda SPR entre 520 e 540 nm, revela a interação entre as NPs e o fármaco. Este fenômeno é visível a olho nú aparecendo uma solução de cor rosada como mostrado em figura 17. Figura 17. Set de soluções coloidais em presença de uma concentração crescente de fármaco. A solução de NPs da uma cor amarela passa a uma cor rosada característica pela interação fármaco e NPs associada a uma nova banda SPR entre 520 e 540 nm. 14
3.3 Desenvolvimento de filme de NPs-Ag através a funcionalização do vidro com diferentes grupos funcionais (-SH e NH 2 ). Primeiramente, é feita a limpeza das laminas de vidro com sabão e água ultrapura milliq em um banho ultrasom. Depois o vidro é funcionalizado com 3-mercaptopropiltrimetoxisilano (MPTS) ou 3-aminopropiltrimetoxisilano (APTS) de acordo com as técnicas testadas no laboratório. Posteriormente, o vidro é imerso em uma solução de nanopartículas de prata fazendo com que se crie uma monocamada de NPs-Ag covalentemente ligada ao vidro. No caso da funzionalização do vidro com MPTS, as nanopartículas são quimicamente ligadas ao vidro (SiO 2 ) através da ponte S-Ag com afinidade química pela superfície metálica das NPs de prata previamente funcionalizado como mostra a figura 18 a seguir [4]. Usando a funzionalização com APTS o grupos aminos (-NH 2 ) interagem com a superfície metálica por via eletrostática. Figura 18. Processo de criação de camada de NPs-Ag no vidro funcionalizado Limpeza do vidro Lavou-se as amostras de vidro com água da pia e detergente com a ajuda de uma esponja. Colocou-se os vidros imersos em água MiliQ em uma cuba de vidro e deixar no ultrasson por 10 minutos. Repitiu-se esse processo. Colocou-se os vidros em uma outra cuba de vidro com uma solução Metanol-HCl 1:1 e deixou-se no ultrasson por 30 minutos. Enxaguou-se com água miliq corrente e colocou-se no ultrasson com água miliq por 5 minutos. Após isso secou-se os vidros com N 2. Colocou-se os vidros em uma outra cuba de vidro com H 2 SO 4 e deixou-se no ultrasson por 30 minutos. Enxaguou-se com água miliq corrente e colocou-se no ultrasson com água miliq por 5 minutos. Após isso secou-se os vidros com N 2. 15
Silanização do vidro Preparou-se uma solução 5% MPTS e APTS em tolueno e colocou-a em uma cuba de vidro. Inseriu-se os vidros nessa cuba e depois aqueceu-se até 40 ºC por 4 horas. Ao terminar, enxaguou-se os vidros com Tolueno, Etanol-Tolueno 1:1 e Etanol e colocou-se na estufa a 100 ºC até secar (aproximadamente 10 minutos). Filme de NPs-Ag sob o vidro Os vidros previamente funcionalizados com MPTS ou APTS foram imersos em tubos fálcons em soluções coloidais de NPs-Ag em agitação, variando o tempo e a concentração para criar uma monocamada de nanopartículas mais homogênea possível (figura 19). Os vidros funcionalizados foram posteriormente caracterizados através da microscopia de varredura eletrônica (SEM) como mostrado na figura 20. Através de um software de digitalização da imagem SEM foi possível fazer a análise estatística da distribuição dos diâmetros das NPs. Como mostrado na figura 20 a curva de distribuição gaussiana evidencia que a maioria das NPs apresentam um diâmetro entre 7,5 e 14,5 nm com o máximo da distribuição centrado a 12nm. Pela leitura espectrofotométrica UV-Vis mostrada em figura 21 verificamos que a absorção da monocamada de NPs-Ag no vidro acontece entre 393 e 400 nm e a intensidade do espectro UV-VIS aumenta com o tempo de imersão do vidro na solução de NPs-Ag. Este aumento da intensidade da absorbância é devido ao aumento das NPs-Ag ligada na superfície diretamente proporcional ao tempo de exposição na solução coloidal. Figura 19. Comparação entre um vidro com camada de NPs-Ag e um vidro limpo Figura 20. Imagem SEM do substrado de vidro funcionalizado com NPs com um analise estatística feito por uma analise de digitalização da imagem SEM através de um software Figura 21. Espectroscopia UV-VIS das NPs-Ag sobre substratos de vidro variando o tempo de exposição do vidro funcionalizado com a solução de NPs-Ag. 16
A partir da analise espectróscopica é possível calcular o diâmetro das nanopartículas pela seguinte equação empírica: D = - 0,005441λ 2 max + 5,654λ max 1367 Por um comprimento de onda λ max = 394nm, o diâmetro calculado das NPs é de 16,03 nm. Neste caso os dados empíricos com os dados da analise SEM concordam. Interação filme de NPs-Ag sob o vidro com o fármaco aminoglicosídeo O filme de NPs-Ag foi utilizado para avaliação da atividade espectroscópica UV-VIS e possíveis análises quantitativas do fármaco aminoglicosídeo, Trisulfato de Neomicina. Com o objetivo de estudar por espectroscopia UV-Vis sob o substrato sólido e a interação entre o fármaco e a nanosonda, os substratos Vidro/NPs-Ag foram mergulhados em soluções de Fármaco Trisulfato de Neomicina em tubos fálcons e deixados em agitação durante 2 horas e durante a noite. Após isso, foram feitos os espectros UV-Vis dos vidros em contato com o fármaco (figura 22). Figura 22. Variação dos picos antes e após a imersão do vidro na solução de fármaco, Trisulfato de Neomicina. Foram preparadas soluções de Fármaco Trissulfato de Neomicina a fim de fazer testes de imersão do Filme de NPs na solução de fármaco até algumas horas de contato. Os vidros foram também imersos nas soluções de fármaco durante a noite para aumentar o tempo de exposição. Após isso foram feitos os espectros dos vidros e foi observado que a absorbância das nanopartículas de prata diminuiu como pode ser visto na figura 21. Para excluir a possibilidade de uma perda de NPs. Foi feita a absorbância atômica das soluções de fármaco e foi observado que a quantidade de nanopartícula de prata na solução de fármaco foi da ordem 17
de ppm, ou seja, o fármaco interagiu com o vidro funcionalizado sem lisciviação de NPs-Ag em solução. Foi observado que os vidros funcionalizados com MPTS tiveram uma resposta melhor quando imersos nas soluções de NPs-Ag do que aqueles funcionalizados com APTS. A tabela 2 resume os testes de preparação dos filmes de NPs com diferentes ligantes orgânicos sob vidro previamente funcionalizado com MPTS e APTS. Tabela 2: Teste de formação dos film de NPs mudando ligantes orgânicos e vidro fuzionalizado com diferentes grupos funcionais. Tartarato de Na D- Tartarato de L+ Tartarato de Citrato e K K K MPTS X APTS X X X 4 Conclusões A partir dos experimentos descritos acima foi possível observar que a banda SPR das NPs-Ag é centrada em 395-400 nm quando o diâmetro das nanopartículas é de 10 a 30 nm. Observamos que o limite se sensibilidade dos fármacos na solução de NPs-Ag diminui quando a proporção ligante/ag + /NaBH 4 é de 1:1:1,25 ao invés de 1:1:1,5, pois um excesso de NaBH 4 tem uma grande influência sobre possíveis interações entre fármaco e NPs. Os fármacos interagem com as nanopartículas de prata dando origem fenômeno de agregação surgindo uma nova banda SPR centrada entre 520-540 nm. A nova banda SPR pode mudar de forma e posição en função do ligante orgânico utilizado. As soluções feitas com citrato monossódico e com citrato trisódico, quando tratadas com os fármacos, se comportaram da mesma maneira. Os vidros funcionalizados com MPTS tiveram um melhor rendimento do que os tratados com APTS. Foi possível observar fenômenos espectroscópicos UV-Vis depois da deposição do fármaco trissulfato de neomicina sob o vidro com filme de NPs-Ag, isso abre possibilidade de futuras aplicações analíticas através da espectroscopia SERS já em fase de estudo no nosso laboratório. 18
5 Dificuldades surgidas Surgiram muitas dificuldades ao longo do projeto, como a síntese das nanoparticulas de QDs de Índio e Fósforo (QD-InP). Devido à falta de entrega dos precursores de In e P da empresa Sigma Aldrich, decidimos prosseguir o trabalho usando NPs de prata que desde o principio mostraram dados interessante para a pesquisa em objeto. As Analise SERS foram atrasada a causa da falta da entrega do equipamento Microscópio RAMAN da empresa Oriba que foi contratada já no novembro 2013. O equipamento foi entregado e instalado apenas ao final de Junho 2014. 6 Objetivos futuros para a renovação da bolsa Um objetivo futuro será dar continuidade ao teste das soluções de NPs-Ag com os fármacos sulfato de neomicina e sulfato de tobramicina e possivelmente outros fármacos. O projeto segue testando os filme de NPs-Ag para analise SERS e para o desenvolvimento de materiais nanoestruturados em dispositivos microfluidicos. Outro objetivo será a síntese de nanoparticulas de QDs de Índio e Fósforo (QD-InP) para o desenvolvimento de filme de QD-InP e posteriormente caracteriza-lo através da microscopia de varredura eletrônica SEM e da espectroscopia de fluorecencia. No final serão desenvolvidos novas sonda luminescentes para a determinação de outras moléculas de interesse biológico. 7 Referências (1) I.Z. Zhang, C. Noguez, Plasmonic optical properties and applications of metal nanostructures. Plasmonics. 3, 127 150, (2008). (2) Keating, Christine D.; Musick, Michael D.; Keefe, Melinda H.; Natan, Michael J. J. Chem. Educ. 1999, 76, 949. (3) http://br.mt.com/br/pt/home/applications/l1_autochem_applications/continuous.html (4) Mason, B. P.; Price, K. E.; Steinbacher, J. L.; Bogdan, A. R.; McQuade, D. T. Greener Approaches to Organic Synthesis Using Microreactor Technology. Chemical Reviews 2007, 107, 2300 (5) Nie, S.; Emory, S. R., Probing Single Molecules and Single Nanoparticles by Surface- Enhanced Raman Scattering. Science 1997, 275, (5303), 1102-1106. 19