Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 1/15 Embebição de matriz coloidal e matriz fibrosa Carlos Henrique Britto de Assis Prado 1, Marco Aurélio Bortoni 2, Clara Di Martino 2 1 Professor Associado do Departamento de Botânica da Universidade Federal de São Carlos, 2 Alunos do curso de graduação do Bacharelado em Ciências Biológicas, Universidade Federal de São Carlos Materiais utilizados Vidrarias: Placas de Petri com 14 cm de diâmetro, Becker de 50 ml Drogas: gelatina em folha colorida, água destilada Outros materiais: papel milimetrado, cronômetro, tesoura, régua de 30 cm, pinça, caneta de ponta porosa, lápis, papel sulfite branco (papel A4) Introdução A parede celular é um componente típico das células vegetais, é semi-rígida, fibrosa, e apresenta finos capilares internos 1. A parede celular é denominada corretamente de matriz extracelular, capaz de competir por solutos e água com o solo, proteger mecanicamente a epiderme dos órgãos e proporcionar rigidez às células vegetais. Assim, a matriz extracelular oferece simultaneamente capacidade de competição por recursos no ambiente, proteção e estrutura mecânica aos vários níveis de organização do vegetal (células, tecidos e órgãos). Por outro lado, a matriz extracelular protege a célula contra microorganismo patógenos e contra a abrasão de materiais sólidos na parte aérea e na porção subterrânea da planta. No entanto, a matriz extracelular permite a entrada da água e dos nutrientes minerais dissolvidos até que esses materiais encontrem a 1 Diâmetro médio entre 3,5 e 5,2 nm.
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 2/15 plasmalema (membrana plasmática) antes de alcançar o interior da célula. A matriz extracelular, mais o lúmen das células mortas e os espaços entre as células no corpo da planta perfazem o apoplasto, um ambiente contíguo, mas sem biomembranas. O simplasto é o volume da célula constituído pelos plasmodesmata, o citoplasma e todo o seu conteúdo (citosol e organelas citoplasmáticas) menos o vacúolo. O simplasto está conectado entre células por meio dos plasmodesmata. O volume simplasmático é bem diferente do volume do vacúolo e da parede celular. No simplasma há quantidade significativa de solutos (sais, óxidos e moléculas orgânicas) e de biomembranas que limitam as organelas como as membranas da mitocôndria, dos cloroplastos, do complexo de Golgi, a plasmalema e o retículo endoplasmático. O simplasto e o vacúolo juntos resultam no protoplasto, ou seja, todo o conteúdo interior da célula vegetal livre da matriz extracelular. Apesar de o vacúolo apresentar uma biomembrana delimitando seu exterior com o simplasto o vacúolo não é considerado parte do simplasma. O vacúolo é a maior organela da célula vegetal, ocupando cerca de 90% do protoplasto das células homeohídricas (as células vegetais que apresentam um só vacúolo). O conteúdo do vacúolo é distinto da parede celular e do simplasto e não está conectado diretamente a nenhum outro vacúolo de outra célula. No vacúolo é possível serem encontrados pigmentos, ácidos orgânicos, enzimas digestivas e, principalmente, água. O vacúolo é o principal local de reserva de água da célula vegetal. Portanto, há três volumes bem distintos na célula vegetal, o vacúolo com água e uma grande diversidade de solutos, o
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 3/15 simplasto composto pelo citosol e as organelas e a matriz extracelular composta principalmente de celulose na forma de fibras (parede celular). A concentração significativa de proteínas e açúcares livres e aderidos na interface das biomembranas com o citosol confere ao simplasto um caráter mais viscoso que o vacúolo. O simplasto se comporta como um gel. O gel é caracterizado por conter substâncias coloidais 2 que se dispersam em um solvente, resultando em uma massa que pode ter consistência gelatinosa. O solvente no simplasto é a água e os colóides são principalmente proteínas e açúcares solúveis de diversos tamanhos. A sacarose, por exemplo, é um colóide que apresenta o tamanho reduzido de 1,0 nm. Um sólido ou um semi-sólido capaz de reter quantidade significativa de água no seu interior devido aos colóides (como a gelatina ou o simplasto) ou capilares internos (como o solo ou a matriz extracelular) pode ser considerado uma matriz. A matriz, portanto, se caracteriza por uma grande capacidade de reter água na superfície de seus componentes coloidais que interagem prontamente com a água (no caso do amido e gelatina) ou nas superfícies internas molháveis de seus capilares (no caso da madeira, papel, solo, e tijolo). Portanto, em uma célula vegetal viva há duas matrizes adjacentes e competitivas por água e solutos, o simplasto coloidal (citoplasmas e organelas interligados por plasmodesmata) e a matriz extracelular (a parede celular). Essas matrizes são separadas por uma biomembrana, a plasmalema, denominada também de membrana plasmática. A matriz extracelular é de natureza muito distinta da matriz coloidal (o simplasto). A celulose da parede celular é um polissacarídeo cujas moléculas são formadas por cadeias lineares 2 Sólidos com tamanho reduzido, entre 1,0 nm e 1,0 µm. Os colóides dificilmente decantam em solução aquosa e podem dar consistência gel à solução.
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 4/15 de glicose. Cada molécula de celulose é formada por cerca de 10.000 resíduos de glicose. Os resíduos são ligados mediante uniões β-1,4 glucano, ou seja, o carbono 1 da molécula de glicose é ligado ao carbono 4 da próxima molécula de glicose. A ligação β-1,4 posiciona os resíduos de glicose em um mesmo plano e sem ramificações. As moléculas de celulose formam uma fibra molecular com cerca de 0,8 nm de largura. Na parede celular essas longas moléculas de celulose estão arranjadas em paralelo formando um feixe, a microfibrila. Cada microfibrila é formada por dezenas de longas cadeias de celulose fortemente estruturadas por pontes de hidrogênio entre grupos hidroxila. Essas pontes atribuem coesão ao feixe de celulose. A microfibrila é a unidade básica da construção da parede celular primária e secundária. Portanto, a matriz extracelular é, essencialmente, formada por fibras (matriz fibrosa) em contraste com a matriz simplasmática adjacente no interior da célula, o simplasto (matriz coloidal). A gelatina comercial em folha é constituída por um conjunto de proteínas (cerca de 85% da massa seca) e açucares que se comportam como colóides em solução aquosa, semelhante ao volume simplasmático. Por ser um meio com composição predominantemente protéica, a gelatina se embebe rapidamente, pois as proteínas apresentam cargas e pólos que interagem prontamente com os pólos da água (interação colóide-água). Se estiver na forma comercial de folha seca a gelatina incha e perde a sua forma inicial à medida que a embebição avança. Sem ter como limitar a entrada de solutos e de água na matriz protéica, a gelatina em folha perde paulatinamente a forma inicial devido ao aumento de volume e conseqüente aumento de sua área após a embebição. Assim como no simplasto da célula vegetal, a água entra e
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 5/15 aumenta o volume da lâmina de gelatina. A folha de gelatina cresce conforme a embebição até certo limite, quando a folha pode quebrar e se dissolver na própria solução de embebição. A água entra na gelatina molhando primeiro as bordas de contato. Posteriormente, a água atinge o interior da gelatina com o avanço da franja de embebição. Por outro lado, a estrutura do papel sulfite de impressão é constituída de fibras de celulose obtida do lenho de árvores e se assemelha à estrutura física da matriz extracelular. Durante a fabricação do papel as fibras são depositadas em um arranjo semelhante ao da parede celular secundária. O arranjo de microfibrilas da celulose confere maior rigidez à matriz fibrosa em relação à matriz gelatinosa. As microfibrilas estão interconectadas por vários materiais na parede da célula vegetal: pectina, hemicelulose, íons cálcio e lignina. Apesar da pectina e da lignina serem parcialmente retiradas durante o beneficiamento da polpa para a fabricação do papel, essas substâncias ainda estão presentes no papel de impressão. O papel assume um tom amarelado e se quebra mais facilmente conforme envelhece devido à degradação da pectina e da lignina residual. Celulose, pectina e lignina são substâncias com muitos pólos negativos, capazes de interagir eletronicamente com os pólos positivos da água. Portanto, a água também embebe a matriz fibrosa como a matriz coloidal, formando uma franja de molhamento em direção ao interior da matriz. Diferente da matriz coloidal, a matriz de celulose apresenta capilares formados pelos espaços entre fibras. Quando a água entra na matriz fibrosa como na parede celular ou no papel essa matriz pode se distender somente até certo limite, pois as microfibrilas de celulose estão entrelaçadas, sobrepostas e interconectadas. O grau de adesão entre as microfibrilas pode variar
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 6/15 dependendo da matriz fibrosa. Por exemplo, na parede celular primária as microfibrilas estão interconectadas por pectina, extensina (uma das poucas proteínas da parede celular) e dois tipos de glicanos: o xiloglucano e o glucuronoarabinoxilano. No papel tipo sulfite a adesão das fibras de celulose é limitada pelo grau de entrelaçamento das fibras, pelo conteúdo de pectina e lignina e pelas pontes de hidrogênio eventuais entra microfibrilas. Dessa forma, é possível ocorrer apenas um limitado deslizamento entre as fibras durante a embebição da matriz fibrosa do papel. Assim, a manutenção da integridade física do volume do simplasto durante a entrada de água na célula é realizada por meio da matriz extracelular e não da matriz coloidal do simplasma e nem da membrana plasmática que envolve o volume simplasmático. A água entra no simplasto atravessando a membrana plasmática (plasmalema) por meio do canal protéico denominado de aquaporina. A água que entra no simplasto necessariamente aumenta esse volume de forma correspondente, pois não é possível comprimir água líquida. O simplasto com maior volume pressiona a parede celular (a matriz extracelular) de dentro para fora. A matriz extracelular é deformada até certo ponto, deslizando as microfibrilas em um processo limitado. Se as matrizes coloidal e fibrosa estiverem totalmente separadas (o que não é o caso de uma célula vegetal viva) a água poderá entrar continuamente na matriz coloidal dissolvendo essa matriz, podendo o gel até perder a integridade física após um estágio avançado de embebição. A matriz fibrosa separada da coloidal irá embeber e se deformar até seus capilares internos estarem totalmente preenchidos com água e as microfibrilas deslizarem até certo limite. A embebição logo irá cessar na matriz fibrosa preenchendo todos
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 7/15 os capilares e deslizando um pouco as microfibrilas de celulose. Portanto, dificilmente a matriz fibrosa irá perder os seus contornos e sua integridade física após plena embebição, mesmo estando isolada. A vantagem para a planta é ter uma matriz coloidal interna que se embebe continuamente limitada em volume por uma matriz fibrosa externa que não perde seu contorno após embebição. Na célula vegetal essas matrizes estão em contato íntimo, separadas apenas por uma fina camada de gordura e proteína (a plasmalema). A plasmalema é capaz de manter ambas as matrizes (coloidal e fibrosa) unidas por meio de íons cálcio (Ca 2+ ) que interagem com as proteínas que faceiam as matrizes e por meio dos plasmodesmata que atravessam as matrizes fibrosas e unem os citoplasmas das células vegetais. Nessa aula prática iremos trabalhar com matrizes coloidal e fibrosa separadas fisicamente e submersas independentemente em água. A capacidade e a velocidade de embebição de ambas matrizes serão quantificadas e o significado biológico para a célula dessas matrizes trabalhando em conjunto, lado a lado, mas separadas pela plasmalema, poderá ser visualizado. Objetivos Comparar a velocidade de embebição de uma matriz fibrosa (papel) e de uma matriz protéica coloidal (gelatina) por meio do incremento da área relativa sob água.
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 8/15 Discutir o significado biológico do comportamento da matriz coloidal e da matriz fibrosa por meio da velocidade de embebição e do aumento da área relativa de cada matriz durante o processo de embebição. Evidenciar as propriedades da matriz fibrosa e de uma matriz protéica a partir dos resultados de embebição. Relacionar esses resultados ao sucesso do emprego simultâneo e adjacente da matriz fibrosa como estrutura da parede celular e da matriz coloidal como meio molecular apropriado para reações bioquímicas das rotas metabólicas, separadas em compartimentos delimitados por uma biomembrana, a plasmalema. Experimento a) Desenhar dois retângulos de 3,0 x 6,0 cm em uma folha de papel milimetrado, posicionados lado a lado e distantes em 3,0 cm (Figura 1). Colocar a placa de Petri de 14,0 cm de diâmetro em cima do desenho a ser utilizado como gabarito para determinar o incremento de área das folhas das matrizes coloidal e fibrosa. O aumento da área será registrado minuto a minuto por meio da alteração dos lados dos retângulos durante a embebição.
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 9/15 Figura 1 - Esquerda: desenhos dos retângulos 3,0 x 6,0 cm sobre papel milimetrado, separados por 3 cm de distância. Esses desenhos servirão como gabarito para verificar a alteração do comprimento e da largura dos retângulos das folhas da matriz coloidal e da matriz fibrosa durante a embebição em água na placa de Petri. Direita: Placa de Petri de 14 cm de diâmetro sobre o papel quadriculado com os 2 retângulos desenhados abaixo. A placa de Petri será preenchida com 50 ml de água e a embebição das matrizes poderá ser acompanhada a cada minuto por meio da área delimitada sob a placa. b) Recortar as folhas de gelatina e de papel em retângulos de 3,0 x 6,0 cm (Figura 2). Em cada placa de Petri, haverá um retângulo da matriz coloidal e um retângulo para a matriz fibrosa (Figura 3). A folha de gelatina deve ser completamente submersa desde o início do experimento. Se a matriz de gelatina boiar durante a embebição ocorrerá o aumento de área e de volume somente na parte inferior em contato com a água. Dessa forma, a folha de gelatina se enrola dobrando para cima e inviabilizando o acompanhamento do aumento dos lados do retângulo (Figura 4). Esse tipo de problema dificilmente ocorre com a matriz fibrosa (papel) pois essa matriz é de fácil submersão em água.
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 10/15 Figura 2 - Retângulos com lados de 3,0 x 6,0 cm, de folhas de gelatina (acima) e de papel (abaixo) cortados previamente para serem submersos em água. Figura 3 - Retângulos com lados de 3,0 x 6,0 cm de gelatina (acima) e papel (abaixo) prontos para serem submersos em água. Note a escala entre as diferentes matrizes e o posicionamento exato das matrizes sobre os retângulos desenhados previamente em papel milimetrado. A medição dos lados maior e menor é realizada a cada minuto após o contato das matrizes com a água. Utilize constantemente duas pinças para manter as matrizes submersas e posicionadas durante a embebição. Figura 4 Retângulo de gelatina com lados de 3,0 x 6,0 cm submerso incompletamente (errado) causando o aumento somente da superfície inferior em contato com a água. O resultado é o enrolamento da folha de gelatina (ponta do instrumento) e incapacidade de quantificação dos lados e da área correspondente.
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 11/15 c) Coloque as matrizes na placa de Petri seca e verifique se o tamanho de cada uma corresponde exatamente ao gabarito previamente desenhado sobre o papel milimetrado (Figura 3). Após despejar cuidadosamente a água mantenha as matrizes posicionadas sobre o gabarito desenhado com o auxílio de uma pinça. Com base no molde do gabarito de medidas abaixo de cada matriz é possível verificar minuto a minuto o aumento dos lados das matrizes (aumento da área) por meio do papel milimetrado. Marque em uma tabela o comprimento dos lados maior e menor de cada matriz a cada minuto. Esses valores serão utilizados para o cálculo do aumento da área em função do tempo. As medidas de aumento de lado das matrizes a cada minuto exige atenção. Um aluno poderá cuidar de apenas uma placa de Petri durante o experimento, anotando o aumento dos lados de ambas as matrizes de uma mesma placa. É necessário acompanhar o aumento da matriz durante 20 minutos. d) O aumento da área de cada matriz em função do tempo deve ser calculado multiplicando o valor obtido dos lados do retângulo (lado maior vezes lado menor) a cada minuto. Construir um gráfico do aumento de área de cada matriz em função do tempo (min) para cada placa de Petri. No gráfico a área deve ser expressa em área relativa, ou seja, a porcentagem da área aumentada durante a embebição em relação à área inicial dos retângulos em cada minuto de determinação (Figuras 5 e 6).
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 12/15 Figura 5 - Incremento da área relativa (%) em função do tempo (min) da superfície de uma matriz coloidal (proteína e açucares solúveis) na forma de folha e submersa em água. Figura 6 Incremento da área relativa (%) em função do tempo (min.) da superfície de uma matriz fibrosa na forma de folha (papel) submersa em água.
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 13/15 e) A matriz coloidal (Figura 5) cresce mais rapidamente e atinge uma área relativa 20 vezes maior que a matriz fibrosa (Figura 6). A maior velocidade de crescimento da matriz protéica ocorre pelo motivo de não haver canais a serem preenchidos por água antes de a matriz ganhar volume. Toda a água que entra na matriz coloidal imediatamente aumenta o volume e a área do corpo da matriz. No entanto, essa matriz não é capaz de manter seu contorno e a folha de gelatina facilmente se despedaça após 20 minutos de embebição. No interior da matriz coloidal do experimento não há superfícies fixas onde interações elétricas (reações químicas ou adsorção) podem ocorrer em um plano bidimensional determinado. Essa matriz é um volume coloidal que expõe totalmente as moléculas imersas nas 3 dimensões (profundidade, largura e altura) possibilitando a exposição dos solutos nas rotas metabólicas do simplasto. Por outro lado, a água que expande a matriz coloidal não pode ser comprimida, pois não é possível comprimir água líquida. Dessa forma, essa matriz quando expande pode pressionar os volumes adjacentes durante a embebição. O simplasto com sua matriz coloidal funciona mecanicamente dessa forma, quando recebe água expande seu volume e pressiona a plasmalema e a matriz extracelular (parede celular). Essa força dá origem à pressão de parede. f) A matriz fibrosa não se distende tanto como a matriz protéica e a velocidade de aumento de área é mais lenta (Figuras 5 e 6). As fibras do papel se embebem até um limite de incremento de área de cerca de 10% (Figura 6). A partir desse ganho de área não mais ocorre
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 14/15 afrouxamento (deslizamento) entre fibras. As interações químicas na matriz fibrosa ocorrem freqüentemente entre uma superfície fixa semisólida e polarizada negativamente (superfície das microfibrilas de celulose) os solutos e o solvente da solução que embebe a matriz. Nessa solução os íons e moléculas polarizadas eventualmente são adsorvidos de forma reversível na superfície dos capilares formados pelos espaços entre as fibras. Esse meio com superfícies fixas capazes de adsorver solutos móveis é denominado de meio de Donnan. Essa forma de organização celular com uma matriz extracelular fibrosa, uma matriz intracelular coloidal e ainda uma reserva de água mais interna (vacúolo) é bem sucedida na natureza. Cerca de 90% da biomassa existente sobre os continentes apresenta essa organização estrutural. É interessante notar que a matriz coloidal é construída a partir da polimerização de glicose exatamente na plasmalema, no limite entre as matrizes, a partir de proteínas transmembranares que catalizam a polimerização. Todos os outros componentes da parede celular também são fabricados pelo simplasto. Portanto, há forte interdependência funcional entre as matrizes fibrosa e coloidal na célula vegetal.
Publicado em Março de 2012 em www.viaciencia.com.br Todos os diretos reservados 15/15 Síntese A parede celular fibrosa, também denominada matriz extracelular, oferece às plantas proteção mecânica e biológica. Essa matriz é capaz de aderir água e solutos em sua grande superfície interna. A entrada de água e de nutrientes na matriz extracelular ocorre até a membrana plasmática. Na outra face da membrana plasmática está a matriz intracelular coloidal que também é capaz de aderir água e solutos. Essas duas matrizes adjacentes apresentam comportamentos distintos em relação à velocidade e à capacidade de embebição. Nessa aula é possível comparar essas capacidades das diferentes matrizes (protéica interna e fibrosa externa) discutindo o significado biológico de cada uma e do conjunto matricial separado pela plasmalema.