Boletim de Pesquisa 151 e Desenvolvimento ISSN 1676-340 Dezembro, 2006 DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA ESTUDOS MORFOLÓGICOS DE FUNGOS CULTIVADOS EM MEIO LÍQUIDO POR MEIO DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA
Recursos Genéticos e Biotecnologia ISSN 1676-1340 Dezembro, 2006 Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 151 DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA ESTUDOS MORFOLÓGICOS DE FUNGOS CULTIVADOS EM MEIO LÍQUIDO POR MEIO DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA Lívia Fernandes Solino Andréia Bergamo Estrela José Eustáquio Menêzes Peter W. Inglish Maiquel Scholten Cesca Guy de Capdeville BRASÍLIA DF 2006
Exemplares desta edição podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W/5 Norte (Final) Brasília, DF CEP 70770-900 Caixa Postal 02372 PABX: (61) 448-4600 Fax: (61) 340-3624 http://www.cenargen.embrapa.br e.mail:sac@cenargen.embrapa.br Comitê de Publicações Presidente: Sergio Mauro Folle Secretário-Executivo: Maria da Graça Simões Pires Negrão Membros: Arthur da Silva Mariante Maria de Fátima Batista Maurício Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro Supervisor editorial: Maria da Graça S. P. Negrão Normalização Bibliográfica: Maria Iara Pereira Machado Editoração eletrônica: Maria da Graça S. P. Negrão Fotos da Capa: Paulina Ribeiro Carolina F. C. Yazbeck - Milissoptila cnecomala coletando pólen em algodão 1ª edição 1ª impressão (2006): Todos os direitos reservados. A reprodução não autorizada desta publicação, no todo ou em parte, constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610). D 451 Desenvolvimento de metodologia para estudos morfológicos de fungos cultivados em meio líquido por meio de microscopia eletrônica de varredura / Lívia Fernandes Solino... [et al.]. -- Brasília, DF: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 2006. 10 p. -- (Boletim de pesquisa e desenvolvimento / Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, 1676-1340; 151). 1. Cultivo de fungos metodologia - meio de cultura líquido. 2. Fungos - remoção de micélio do meio. 3. Fungos - células conidiogênicas. I. Solino, Lívia Fernandes. II. Capdeville, Guy de. III. Série. 579.5 CDD 21.
SUMÁRIO RESUMO... 5 ABSTRACT... 6 INTRODUÇÃO... 7 MATERIAIS E MÉTODOS... 7 RESULTADOS E DISCUSSÃO... 8 LITERATURA CITADA... 9
DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA ESTUDOS MORFOLÓGICOS DE FUNGOS CULTIVADOS EM MEIO LÍQUIDO POR MEIO DE MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA Lívia Fernandes Solino 1 Andréia Bergamo Estrela 2 José Eustáquio Menezes 3 Peter W. Inglish 4 Maiquel Scholten Cesca 2 Guy de Capdeville 3 RESUMO O estudo da conidiogênese de fungos cultivados em meios líquidos é um procedimento bastante difícil dado à dificuldade de se recolher tecido fúngico intacto para a realização destes e outros tipos de estudo. O objetivo do presente trabalho foi desenvolver uma metodologia de cultivo de fungos em meio de cultura líquido contendo fragmentos de diferentes materiais que funcionariam com suporte para o crescimento do fungo de forma a facilitar a remoção de micélio do meio sem contudo danificar os esporos e sua respectivas células conidiogênicas. A partir dos resultados ficou claro que os materiais utilizados como o crepe, o crepon, o vual e o papel de filtro whatman são os melhores para obter tecido fúngico preservado. Os demais materiais (papel celofane, cortiça e o TNT) não foram capazes de reter o micélio fúngico. Trabalhos desta natureza, visam facilitar estudos de conidiogênese por garantir a preservação do tecido fúngico. 1 Estudante de Engenharia Agronômica Faculdade da Terra de Brasília 2 Bióloga Universidade Federal do Rio Grande do Sul 3 Engenheiro Agrônomo - Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia 4
ABSTRACT The study of the conidiogenesis of fungi cultivated in liquid media is a procedure very difficult due to the difficulty in recovering intact fungal tissue appropriate for different types of research work. The objective of the present work was to develop a methodology for cultivating fungi in liquid media containing fragments of different tissues and materials to facilitate the recovering of mycelia from the liquid media without damaging the spores and their conidiogenic cells. From the results obtained, it became clear that tissues and materials such as crepe, crepon, vual and Whatman filter paper are the best to obtain preserved fungal tissue. The other tissues and materials (Celofane paper, cork and TNT) tested were not capable of retaining fungal mycelia. Studies of this nature, although simple, facilitate considerably studies of fungal morphology and conidiogenesis due to the preservation of the fungal tissue.
INTRODUÇÃO Com o avanço no desenvolvimento tecnológico dos equipamentos de microscopia eletrônica atualmente no mercado, o grande desafio do microscopista eletrônico passa a ser o desenvolvimento de metodologias que ajudem na análise e interpretação dos fenômenos e processos que se propõe estudar. Um dos desafios que muitos microscopistas na área da fitopatologia enfrentam são os estudos morfológicos e reprodutivos de fungos cultivados em meios líquidos. Ao se cultivar um determinado fungo em meio de cultura líquido, torna-se necessário manter o meio de cultura sob agitação constante, fato este que dificulta a permanência dos esporos presos às suas respectivas células conidiogênicas e, muitas vezes, alteram a morfologia normal das hifas (Dhingra & Sinclair, 1985). Portanto, desafios como os surgidos no estudo da conidiogênese de fungos crescidos em meio de cultura líquido demandam, muitas vezes, o uso da imaginação para se propor protocolos alternativos aos preconizados na literatura pertinente (Bozzola and Russell, 1999; Hayat, 2000). A maioria dos trabalhos visando estudar morfologia de fungos cultivados em meio de cultura líquido não precisam bem como os fungos foram colhidos dos meios de cultura nem como foram realizadas certas etapas do processamento como é o caso da desidratação em equipamento de ponto crítico (Fargues et al., 2001). O presente trabalho teve por objetivo desenvolver uma metodologia eficiente para estudar aspectos da morfologia e conidiogênese de fungos cultivados em meio de cultura líquido utilizando diferentes tipos de tecidos e materiais. MATERIAIS E MÉTODOS Preparação do inóculo do patógeno Para a realização deste trabalho, optou-se por utilizar um isolado do fungo entomopatogênico Metharhizium sp. capaz de crescer e esporular em meio de cultura líquido. O meio de cultura utilizado para crescimento do fungo foi o BDA (Batata Dextrose Agar)., no qual foi inoculado o patógeno. O meio inoculado foi então incubado a 25 o C em câmara BOD por diferentes períodos de tempo incluindo 24, 48, 72 e 96 horas. Metodologia de avaliação da conidiogênese O meio de cultura inoculado com o fungo foi distribuído em frasco erlenmayer de 250 ml e, a estes, foram adicionados fragmentos estéreis de 1 cm 2 de diferentes
tipos de tecidos e materiais entre eles o vual, crepon, crepe, papel celofane, TNT, papel de filtro Whatman e cortiça (obtida de rolhas comerciais) para agirem como suporte para o micélio fúngico de forma a facilitar sua retirada do meio e garantir que esporos ainda estivessem aderidos às suas células conidiogênicas. Os frascos contendo as amostras foram incubados em câmara BOD a 25 o C e, em diferentes tempos após a incubação (0, 24, 48, 72 e 96 horas), foram retiradas amostras para processamento para análise com microscopia eletrônica de varredura. Análise com microscopia eletrônica de varredura Os diferentes tecidos e materiais foram retirados dos frascos nos tempos acima descritos e então processados para análise com microscopia eletrônica de varredura. Para tanto, o procedimento adaptado de Bozzola & Russel (1999) foi utilizado, onde as amostras foram imersas em solução de glutaraldeído 2,5% em tampão cacodilato de sódio 0.1 M por 90 min. Em seguida, as amostras foram lavadas cinco vezes no mesmo tampão e imersas em tretóxido de ósmio 2% em tampão cacodilato 0.1 M. As amostras foram lavadas mais três vezes no mesmo tampão e, então, desidratadas em série alcoólica com etanol a 20, 30, 50, 70, 80, 90% e três passagens em álcool 100%. Ao final da desidratação alcoólica, as amostras foram adicionalmente desidratadas em ponto crítico, montadas em suporte metálico e metalizadas com película de ouro. Ao final do processamento as amostras foram analisadas com auxílio de um microscópio eletrônico de varredura modelo Zeiss DSM 962. RESULTADOS E DISCUSSÃO A análise por microscopia eletrônica de varredura mostrou que dentre os diferentes tipos de materiais e tecidos utilizados como suporte para o crescimento micelial de Metarhizium sp., alguns foram mais adequados à fixação do micélio do fungo permitindo observar-se claramente aspectos do processo de conidiogênese. Dos materiais e tecidos utilizados os que apresentaram resultado mais satisfatório foram o crepe (Fig. 1a), a cortiça (Fig. 1b), o vual (Fig. 1c) e o papel de filtro (Fig. 1d)., pois retiveram uma grande quantidade de micélio fúngico. Os mais efetivos foram o vual e o crepe, seguido do papel de filtro e da cortiça, respectivamente. O papel celofane (Fig. 1e) o crepon (Fig. 1f) e o TNT (dados não apresentados) não foram efetivos em reter o micélio fúngico. O TNT se dissolveu durante o processamento das amostras não permitindo a obtenção de resultados satisfatórios. O papel celofane por ser muito liso não foi capaz de reter o micélio fúngico. Somente em poucas situações
foi possível ver algum micélio preso ao material (Fig. 1e), fato que também ocorreu com o crepon (Fig. 1f). Este tipo de trabalho, apesar de simples, facilita grandemente os estudos microscópicos da conidiogênese de fungos cultivados em meio de cultura. De posse de tal metodologia qualquer fungo capaz de crescer e esporular em meio poderá ser facilmente estudado por meio de microscopia eletrônica de varredura. Além disso, não somente estudos de conidiogênese poderão ser feitos, mas também, estudos sobre o efeito de substâncias químicas, com efetividade para controle de fungos, sobre a integridade do micélio fúngico também poderão lançar mão de tal estratégia. LITERATURA CITADA Bozzola, J.J, & Russel, L.D. 1999. Electron microscopy: Principles and techniques for biologists (2 nd ed.). Jones and Bartlett Publishers, Inc. Sudbury, MA. 670 p. Fargues, J., Smits, N., Vidal, C., Vey, A., Veja, F., Mercadier, G. 2001. Effect of liquid culture media on morphology, growth, propagule production, and pathogenic activity of the Hyphomycete, Metarhizium flavoviride. Mycopathologia 154: 127-138. Hayat, M.A. 2000. Principles and technique of electron microscopy. Biological applications. (4 th ed.) Cambridge University Press, UK. 543p. Dhingra, O.D., Sinclair, J.B., 1985. Basic plant pathology methods. CRC Press, Inc. Boca Raton, Florida.
Figura 1- Micrografias de microscopia de varredura de hifas de Metarhizium sp. cultivado em meio de cultura líquido contendo diferentes materiais. A- crepe, Bcortiça, C- vual, D- papel de filtro Whatman, E- papel celofane e E- crepon.