OCORRÊNCIA DE CROMOSSOMOS B EM PEIXES NEOTROPICAIS E ANÁLISE CITOGENÉTICA EM Iheringichthys labrosus E Megalonema platanum (TELEOSTEI, PIMELODIDAE) Rafael Augusto de Carvalho Maringá PR 2008
RAFAEL AUGUSTO DE CARVALHO OCORRÊNCIA DE CROMOSSOMOS B EM PEIXES NEOTROPICAIS E ANÁLISE CITOGENÉTICA EM Iheringichthys labrosus E Megalonema platanum (TELEOSTEI, PIMELODIDAE) Tese apresentada ao Programa de Pósgraduação em Ciências Biológicas (Área de Concentração Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do título de Doutor em Ciências Biológicas. Maringá PR 2008
Catalogação na publicação elaborada pela Divisão de Processos Técnicos da Biblioteca Central da Universidade Estadual de Londrina. Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) C331o Carvalho, Rafael Augusto de. Ocorrência de cromossomos B em peixes neotropicais e análise citogenética em Iheringichthys labrosus e Megalonema platanum (Teleostei, Pimelodidae) / Rafael Augusto de Carvalho. Maringá, 2008. 89f. : il. Orientador: Isabel Cristina Martins dos Santos. Co-orientador: Ana Lúcia Dias. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas) Universidade Estadual de Maringá, Departamento de Biologia Celular e Genética, Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, 2008. Inclui bibliografia. 1. Peixe neotropical Genética Teses. 2. Pimelodidae Citogenética Teses. 3. Teleosteos Teses. I. Santos, Isabel Cristina Martins dos. II. Dias, Ana Lúcia. III. Universidade Estadual de Maringá. Departamento de Biologia Celular e Genética. Programa
Profa. Dra. Isabel Cristina Martins dos Santos UEM Orientadora Profa. Dra. Ana Lúcia Dias UEL Co-orientadora
BIOGRAFIA Rafael Augusto de Carvalho nasceu em Londrina Paraná, em 11/09/1978. Possui graduação em Ciências Biológicas (2002) e Mestrado em Genética e Melhoramento (2004) pela Universidade Estadual de Londrina. Em setembro de 2004, iniciou o curso de doutorado no Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas (área de concentração Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, tendo como orientadora a Profa. Dra. Isabel Cristina Martins dos Santos da Universidade Estadual de Maringá e como co-orientadora a Profa. Dra. Ana Lúcia Dias da Universidade Estadual de Londrina. Tem experiência na área de Genética Animal, atuando principalmente em Citogenética de Peixes com ênfase na família Pimelodidae e na ocorrência de cromossomos supranumerários.
Muito Obrigado! Muito Obrigado! É importante saber agradecer A quem me fez bem A quem me abençoou Quem esteve comigo Na hora da alegria e da dor Meu Deus nunca me abandonou E amigos fiéis ao meu lado colocou Por isso eu quero agradecer Muito obrigado, Senhor Muito Obrigado! Eu te agradeço, meu Senhor Por todas as bênçãos Tu és o meu Deus, meu Salvador Eu te agradeço! Ana Paula Valadão Bessa
AGRADECIMENTOS Ao Departamento de Biologia Celular e Genética e ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas, da Universidade Estadual de Maringá, que permitiram a concretização deste trabalho. À CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior e à Fundação Araucária, por disponibilizar os recursos financeiros. À Profa. Dra. Isabel Cristina Martins dos Santos, pela orientação, paciência e pela confiança em mim depositada. À Profa. Dra. Ana Lúcia Dias, pela co-orientação, confiança, compreensão, amizade, incentivo e por todo apoio, imprescindíveis para a realização deste trabalho. À Profa. Dra. Lucia Giuliano Caetano, por todos os momentos divertidos no laboratório e pela grande ajuda na realização da técnica de hibridação in situ por fluorescência. À Profa. Dra. Sirlei Terezinha Bennemann, pela ajuda na análise do conteúdo gástrico de alguns exemplares de peixes. À Dra. Maria Mühlmann Díaz (in memorian) e ao Me. Alejandro Laudicina, que permitiram a realização de um estágio e a realização do FISH, no Laboratório de Citogenética Molecular, CONEA, Buenos Aires. Aos membros da comissão examinadora, Prof. Dr. Alberto Sérgio Fenocchio, Profa. Dra. Lucia Giuliano Caetano, Profa. Dra. Ana Luíza de Brito Portela Castro e Profa. Dra. Luciana Andréa Borin, por aceitarem o convite de compor a banca e pelas críticas e sugestões apresentadas. A todos do Laboratório de Citogenética de Peixes da UEL: Ana Cláudia, Rosiley, Renata, Marceléia, Treco, Vivian, Larissa Pires, Tatiana, Vitor, Michelli, Jamille, Angélica, Gabriel, Larissa Lacerda, Stéphany, Tatiane e Tamara, pelo apoio, companheirismo, discussões, críticas, ajuda no laboratório e nas coletas, durante todo o desenrolar do trabalho.
A todos do Laboratório de Citogenética de Peixes da UEM: Ana Luíza, Maria José, Leonardo, Fernanda, Suzana, Gisele, Valéria, Ana Paula, Carla, Kátia, Paulo e todos os outros que passaram por lá, pelo apoio e companheirismo. A todos os professores e colegas de curso, especialmente às amigas Fernanda e Gislaine, pelas horas divertidas e estressantes que passamos estudando. Às amigas Rosiley e Renata, por toda ajuda prestada durante o curso e no laboratório. À amiga Larissa, pelo grande auxílio na preparação das figuras e pelo grande companheirismo no laboratório. Aos amigos Vitor e Gabriel, pela imensa ajuda na coleta dos peixes, momentos muito divertidos. A toda minha família: Lucilene e Darci; Ismênia, João, Isabel, Márcia, Ana Paula e Fernando; Umbelina; Lázaro, Isabel, Ana Rafaela, Bárbara e Luiz Fernando; Ivone, Elias, Bruna, Alessandra, Fábio e Rebeca; Mauro, Neide, Flávio, Willian e Wilson; José Carlos, Lena, Carla e Gustavo; Aparecido, Fátima, Isabela, Kelly, Nicolau e Nicolle; Leninha, Vinícius e Gabriel; Antonio Carlos, Miriam, Nicolas, Caio e Heloísa; Sonia; José Antonio e Rosimara; Marco e Patrícia; pelo carinho, pelas palavras de apoio e incentivo. À minha avó Francisca (in memorian), que partiu recentemente e não pode ver a conclusão deste trabalho. Obrigado Vó Chica, pelo exemplo de vida! Ao meu pai Carlos (in memorian), que sempre acreditou em mim. Saudades eterna! À minha mãe Tereza; aos meus irmãos Eduardo, Rodrigo e André; à Lirian, à Patrícia e ao Lucas; pelo carinho, incentivo, confiança e amor, em mim, depositados. À minha amada mulher Luciana e à minha pequena filha Manuela, presentes de Deus na minha vida. Amo vocês! Incondicionalmente. Muito Obrigado!
À Luciana e à Manuela Meus amores
APRESENTAÇÃO Esta tese é composta de uma revisão e de dois artigos científicos. Inicialmente, há uma revisão sobre cromossomos supranumerários em peixes no artigo intitulado B chromosomes: an update about their occurrence in freshwater Neotropical fishes (Teleostei), que se encontra publicado na revista Journal of Fish Biology. O próximo artigo Localização cromossômica dos DNAs ribossômicos 18S e 5S e análise do cromossomo B de Iheringichthys labrosus (Siluriformes, Pimelodidae) traz uma análise molecular desta espécie evidenciando uma diferenciação citogenética em relação a outras populações. A tese encerra com o artigo Análise cromossômica em Megalonema platanum (Siluriformes, Pimelodidae): ocorrência de cromossomo supranumerário e nota sobre a alimentação que traz pela primeira vez alguns dados preliminares sobre a alimentação e características citogenéticas desta espécie. Em consonância com as regras do Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, os artigos foram redigidos de acordo com as normas das revistas às quais serão submetidos, conforme a seguir: Capítulo I Rafael Augusto de Carvalho, Isabel Cristina Martins dos Santos e Ana Lúcia Dias. B CHROMOSOMES: AN UPDATE ABOUT THEIR OCCURRENCE IN FRESHWATER NEOTROPICAL FISHES (TELEOSTEI). Journal of Fish Biology (2008), 72: 1907-1932. Doi: 10.1111/j.1095-8649.2008.01835.x, disponível on-line em http://www.blackwell-synergy.com. Capítulo II Rafael Augusto de Carvalho, Isabel Cristina Martins dos Santos, Lucia Giuliano Caetano, Alejandro Laudicina e Ana Lúcia Dias. LOCALIZAÇÃO CROMOSSÔMICA DOS DNAS RIBOSSÔMICOS 18S E 5S E ANÁLISE DO CROMOSSOMO B DE Iheringichthys labrosus (SILURIFORMES, PIMELODIDAE). Genetica. Capítulo III Rafael Augusto de Carvalho, Isabel Cristina Martins dos Santos, Sirlei Terezinha Bennemann e Ana Lúcia Dias. ANÁLISE CROMOSSÔMICA EM Megalonema platanum (SILURIFORMES, PIMELODIDAE): OCORRÊNCIA DE CROMOSSOMO SUPRANUMERÁRIO E NOTA SOBRE A ALIMENTAÇÃO. Journal of Fish Biology.
CARVALHO, Rafael Augusto de. OCORRÊNCIA DE CROMOSSOMOS B EM PEIXES NEOTROPICAIS E ANÁLISE CITOGENÉTICA EM Iheringichthys labrosus E Megalonema platanum (TELEOSTEI, PIMELODIDAE). 2008. 89p. Tese (Doutorado em Ciências Biológicas Área de Concentração, Biologia Celular e Molecular). Universidade Estadual de Maringá. RESUMO Em peixes dulcícolas neotropicais, os cromossomos B são encontrados em 61 espécies, distribuídos em 16 famílias de sete ordens diferentes e de distintas bacias hidrográficas. A ordem Characiformes é a que possui mais espécies com estes cromossomos, incluindo 31 de seis famílias. A ordem Siluriformes tem 21 espécies distribuídas em cinco famílias. A ordem Perciformes tem cinco espécies com cromossomos B em apenas uma família. As ordens Beloniformes, Cyprinodontiformes, Gymnotiformes e Synbranchiformes contêm somente uma espécie com cromossomos B em cada uma. Estes cromossomos variam tanto em número como na morfologia. Este trabalho também apresenta dados cromossômicos de Iheringichthys labrosus e Megalonema platanum do rio Tibagi, Paraná. As AgNORs da primeira espécie mostraram-se localizadas na posição terminal de um par de cromossomos st, no braço longo. A coloração com os fluorocromos CMA 3 e DAPI, mostrou correspondência com a AgNOR, ou seja, as NORs mostraram-se CMA 3 positivas e DAPI negativas, sendo portanto ricas em GC. O cromossomo B observado nesta espécie também se mostrou fluorescente para CMA 3, assim como outras regiões cromossômicas. O uso concomitante das sondas de DNAr 18S e 5S mostrou que estas regiões se encontram em cromossomos distintos, estando o sítio 18S no braço longo de um par de cromossomos st enquanto o DNAr 5S foi evidenciado na região intersticial de outro par st. A espécie Megalonema platanum apresentou 54 cromossomos distribuídos em 24m+16sm+2st+12a. O par de cromossomos 15 apresentou uma constrição secundária, no braço curto, em posição terminal e pode ser observada a presença de um pequeno cromossomo B acrocêntrico, com heterocromatina centromérica. Outros blocos heterocromáticos foram evidenciados na posição terminal de alguns pares cromossômicos e um par grande de cromossomos m, provavelmente o primeiro par, mostrou uma marcação heterocromática intersticial. Através da análise das NORs, duas marcações puderam ser observadas no núcleo interfásico e em um par de cromossomos sm, nas regiões terminais do braço curto. Em algumas metáfases pode-se observar apenas um cromossomo marcado pela prata. A utilização da sonda de DNAr 18S, evidenciou os cístrons ribossômicos em um par de cromossomos sm, no braço curto, em posição terminal, coincidentes com AgNOR e com a constrição secundária. O uso concomitante dos fluorocromos CMA 3 e DAPI, revelou um par de marcações fluorescentes CMA 3 -positivas e DAPI-negativas, coincidentes com a AgNOR. A análise preliminar do conteúdo gástrico de Megalonema platanum mostrou que esta espécie se alimenta de peixes e insetos. O presente trabalho, além de trazer uma revisão sobre a ocorrência de cromossomos B em peixes, relata a composição química do cromossomo B de Iheringichthys labrosus e traz pela primeira vez, importantes características sobre a alimentação e dados citogenéticos da espécie Megalonema platanum em rios brasileiros, que é uma espécie bastante rara na bacia do rio Paranapanema e pode estar ameaçada de extinção.
CARVALHO, Rafael Augusto de. OCCURRENCE OF B CHROMOSOMES IN NEOTROPICAL FISHES AND CYTOGENETIC ANALYSIS IN Iheringichthys labrosus AND Megalonema platanum (TELEOSTEI, PIMELODIDAE). 2008. 89p. Thesis (Ph. D. in Biological Science Concentration Area, Cellular and Molecular Biology). Maringá State University. ABSTRACT In freshwater Neotropical fishes, supernumerary chromosomes or Bs have been found in 61 species so far, distributed in 16 families of seven different orders and in distinct hydrographic basins. The order Characiformes is that one that possesses the most species with these chromosomes, including 31 from six families. The order Siluriformes has 21 species from five families. The order Perciformes has five species with Bs in only one family. The Orders Beloniformes, Cyprinodontiformes, Gymnotiformes Synbranchiformes contain only one species each with B chromosomes. These chromosomes vary in morphology as well as number. This paper also shows chromosomic date of Iheringichthys labrosus and Megalonema platanum from Tibagi River, Paraná. The AgNORs of the first species were located in the terminal position of a st chromosomic pair, in the long arm. The coloration with the fluorochromes CMA 3 and DAPI, showed correspondence with AgNOR, i.e., the NORs were positive- CMA 3 and negative-dapi, being so rich in GC. The B chromosome found in this species also showed its fluorescent to CMA 3, and others positive-cma 3. Concomitant use of probes of rdna 18S and 5S evidenced these regions in distinct chromosomes, being the site 18S on the long arm of a pair of st chromosomes while the rdna 5S was evidenced in the interstitial region of another st pair. The species Megalonema platanum showed 54 chromosomes distributed in 24m+16sm+2st+12a. The 15 pair presented a secondary constriction, in the short arm, in terminal position. The presence of a small acrocentric supernumerary chromosome can be observed, with centromeric heterochromatin. Others heterochromatic blocks were evidenced in the terminal position of some chromosomic pairs and one metacentric large chromosomic pair, probably the first pair, showed an interstice heterochromatic marking. Through analysis of NORs, two markings could be observed at the interphasic nuclei and in a sm pair, in the terminal regions of short arm. In some metaphases could be observed just one chromosome marked by silver. The use of the probe of rdna 18S evidenced the ribosomal cistrons in one sm chromosomic par, in the short arm, in terminal position, coincides with AgNOR and secondary constriction. Concomitant use of fluorochromes CMA 3 and DAPI, revealed one pair of fluorescent markings positive-cma 3 and negative-dapi, coincides with AgNOR. The preliminary analysis of stomach contents of Megalonema platanum showed that this species eat fishes and insects. This work bring a review about the occurrence of B chromosomes in fish, reports the chemical composition of B chromosome of Iheringichthys labrosus and brings for the first time, important features on the food and cytogenetic date of Megalonema platanum in Brazilian rivers, which is a very rare species in the Paranapanema river basin and may be endangered.