DIFERENTES VOLUMES DO DILUENTE GEMA DE OVO/GLICOSE NO PROCESSO DE CONGELAÇÃO DO SÊMEN DO VARRÃO (Different volumes of yolk egg/glucose extender in the boar semen freezing process) Ricardo TONIOLLI 1* ; Gilson Hélio TONIOLLO 2 ; Paulo Henrique FRANCESCHINI 2 ; Fernanda Maria de Almeida Celestino MORATO 2 1 Faculdade de Veterinária da UECE, Campus Itaperi, Fortaleza-Ce. 2 Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias da Universidade Estadual Paulista-Campus de Jaboticabal RESUMO O sêmen de oito reprodutores foi coletado utilizando a técnica da mão enluvada, retirando-se de cada ejaculado 0,2 x10 9 sptz. A qualidade do sêmen foi avaliada pela concentração (x10 6 sptz/ml), volume (ml), total de espermatozóides (x10 9 sptz), vigor espermático (0 a 5), porcentagem de células móveis (%), morfologia espermática (%) e integridade de membrana (%). O sêmen foi diluído no BTS e na água de coco em pó. Utilizou-se o teste de Mann Whitney com um intervalo de confiança de p<0,05. Foram testados diferentes volumes do diluidor de congelação, mudando a relação espermatozóide/diluente. A associação da água de coco em pó com o T2 apresentou os melhores resultados. PALAVRAS-CHAVE: Água de coco, sêmen, suíno, conservação. ABSTRACT The semen of eight swine males was collected, being used the total ejaculated. It was separate from each une a total of 10.2 x10 9 sptz. The semen quality was evaluated by the concentration (x10 6 sptz/ml), volume (ml), total of spermatozoas (x10 9 sptz), spermatic vigour (0 to 5), movable cells (%), spermatic morphology (%) and membrane integrity (%).The semen was diluted in BTS and in the coconut water powdered. The Mann Whitney s test was used for the analysis, with a trust interval of p<0.05. Different volumes of freezing extender were tested, changing the relationship spermatozoa/extender. The association of the coconut water powdered with T2, presented the best results. KEYWORDS: Cocconut water, semen, swine, conservation. INTRODUÇÃO O ejaculado suíno tratado pela congelação tem uma utilização bastante restrita (Saraiva et al., 05), estando limitado ao uso em trabalhos de melhoramento visando a difusão de material genético (Scheid & Silveira, 02). A utilização do sêmen sob a forma congelada, ainda traz grandes desafios, necessitando do desenvolvimento de uma nova técnica de congelação, uma vez que o sêmen assim tratado apresenta uma maior sensibilidade ao choque térmico na descongelação (Antunes, 07), devendo ser considerada a curva de abaixamento da temperatura e a descongelação (Johnson et al., 00). A busca *Endereço para correspondência: Faculdade de Veterinária/UECE, Av. Paranjana, 1700, Campus Itaperi, Fortaleza-Ce. CEP 60740-000 e-mail: toniolli@roadnet.com.br 43
de novos diluentes, levou diversos autores a trabalharem com a água de coco em pó na conservação do sêmen do gato doméstico (Silva et al., 07), do cão (Barbosa et al., 07), do carneiro (Salgueiro et al., 07) e do macaco-prego (Araújo et al., 07). O presente trabalho teve como objetivo desenvolver uma nova tecnologia de congelação do sêmen do varrão, com a finalidade de se obter maior número de espermatozóides viáveis pós descongelação. MATERIAL E MÉTODOS O sêmen de oito reprodutores foi coletado (ejaculado total) pela técnica da mão enluvada em recipiente coberto por gaze e protegido por copo térmico (n = 25). Em seguida à coleta, o ejaculado foi avaliado pela concentração (x10 6 sptz/ml), volume (ml), total de espermatozóides (x10 9 sptz), vigor espermático (0 a 5) e porcentagem de células móveis (%). De cada ejaculado foi retirado um total de 10,2 x10 9 sptz/tratamento e testes in vitro. Após a coleta, a temperatura do ejaculado começa a ser abaixada com as amostras de sêmen in natura sendo incubadas a 30 o C durante 30 minutos em banho Maria. Após este período foram diluídas em partes iguais em dois diluentes: Beltsville Thawing Solution (BTS) e Água de coco em pó (ACP-103 ), acrescida de gentamicina (Garamicina Schering) a 80 mg/100ml, permanecendo a esta mesma temperatura por mais 2 horas, visando aumentar a sua resistência ao choque térmico. Após este período, o sêmen foi resfriado a 15 o C por mais 2 horas. Ao final deste tempo, foi centrifugado a 800g por 15 minutos, para retirada do sobrenadante (BTS ou ACP e plasma seminal) e foi adicionado do diluente de resfriamento (gema de ovo / glicose) (Paquiganon, 1984). Foi trocado de geladeira, para continuar o período de resfriamento a 4 o C por mais 1hora, ao final do qual foi acrescido do diluente de congelação (gema de ovo / glicose / glicerol a 4%) e envazado em palhetas de 0,5 ml a uma 44 concentração de 100 x106 espermatozóides/ml. As palhetas foram colocadas em uma ramps de congelação (-60 o C), a 5 cm do vapor de nitrogênio por 4 minutos e em seguida mergulhadas e conservadas em N 2 líquido a -196 o C. Os diluentes de resfriamento e congelação foram adicionados em volumes iguais, o que proporcionou uma concentração final de glicerol de 2% (Polge et al., 1970). A descongelação foi feita a 37 ºC, em aparelho de descongelação Minitub, no qual se imergiu cada palheta por 30 segundos; em seguida o conteúdo foi ressuspenso, permanecendo incubado por 10 minutos à mesma temperatura. Para as análises in vitro, após descongelação, ao volume de cada palheta (0,5 ml) foi adicionado 2 ml do diluente de ressuspensão (BTS ou ACP) sendo as análises feitas após 10 minutos de incubação a 37 o C. Foram testados diferentes volumes do diluente gema de ovo/glicose, formando os seguintes tratamentos: a) T1 = 18 ml, controle (Paquignon, 1984); b) T2 = 9 ml; c) T3 = 6 ml; d) T4 = 4 ml. De cada amostra descongelada, foi avaliado o vigor espermático (Toniolli, 1996) e a porcentagem de células móveis, colocando-se uma gota de sêmen de 15 µl entre lâmina e lamínula, com leitura em aumento de 0x. O exame morfológico foi feito pela qualidade do acrossoma e vitalidade (% de células vivas). Esfregaços foram corados pelo azul de bromo-fenol (azul de bromo-fenol = 0,1 g; citrato de sódio = 0,4 g; água destilada = 10 ml), contando-se 0 células/esfregaço em aumento de 1000x. Homogeneizou-se uma gota de sêmen com outra de corante e após 30 seg. procedeu-se o esfregaço, secado à temperatura ambiente. Os espermatozóides foram classificados: 1) Vivos com acrossoma intacto; 2) Vivos com acrossoma danificado e 3) Mortos. Avaliou-se a integridade de membrana pela coloração fluorescente em campo escuro. O meio de coloração era: µl da solução estoque de formaldeído, µl da solução estoque de diacetato
de carboxi fluoresceína (DIC) e 10µL da solução estoque de iodeto de propídio (IP) para cada mililitro (ml) da solução salina estoque. Um total de 10µL da suspensão de sêmen, contendo 10 x10 6 sptz/ml foram diluídos em 40µL de meio de coloração. Uma alíquota de 5µL foi colocada entre lâmina e lamínula sob aumento de 1000x. Foram contadas 0 células por alíquota as quais foram classificadas: I) Membrana íntegra: célula acumula a DIC (fluorescência verde); II) Membrana danificada: acúmulo de IP ao longo da célula (fluorescência vermelha). O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso com aplicação do teste de Mann Whitney para a comparação entre grupos. A análise das diferenças entre médias foi feita por variância multifatorial usando-se o General Linear Models do programa Statistical Analysis System (SAS 6.03), com um intervalo de confiança de 5% (p<0,05). RESULTADOS E DISCUSSÃO O vigor espermático observado no sêmen diluído em ACP-103, T2 (2,8) apresentou o melhor resultado com diferença significativa em relação ao T1 (2,3) e ao T3 (2,5) (p<0,05), equivalendo-se, entretanto, ao T4 (2,6) (Fig. 1). Para a porcentagem de espermatozóides móveis, houve uma mesma tendência, com valor do T2 (46%), significativamente melhor (p<0,05) do que os T3 (36%) e T4 (31%), e desta feita, equivalendo-se ao T1 (39%) (p>0,05) (Fig. 2). No diluente BTS, o vigor não apresentou diferenças significativas (p>0,05) entre tratamentos (Fig. 1). Na porcentagem de espermatozóides móveis, a exceção do T4 (22%) que apresentou o menor valor, os demais tratamentos se equivaleram (p>0,05) (Fig. 2). Desta forma, quando utilizado o diluente BTS, a variação do volume do diluente gema de ovo, não influenciou nos resultados, devendo se optar preferencialmente pelo ACP-103 com o T2. A procura por novos diluentes para o sêmen do varrão levou a se criar a água de coco em pó, que tem se tornado uma alternativa viável na substituição dos tradicionais diluentes comerciais existentes no mercado (Silva et al., 07), fato este comprovado no presente trabalho. Ela tem se caracterizado pela sua padronização e estabilização na forma em pó (Salgueiro et al., 07). Quando utilizado o ACP-103 para a categoria células vivas com acrossoma intacto e danificado, não houve variação significativa entre tratamentos (p>0,05). 5,0 4,5 T1 T2 T3 T4 4,0 Vigor Espermático (0 a 5) 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 A B A AB A A A A 2,3 2,8 2,5 2,6 2,5 2,5 2,5 2,5 0,5 0,0 ACP BTS Diluidores de Ressuspenção Figura 1: Vigor espermático do sêmen suíno congelado em diferentes volumes do diluente gema de ovo/glicose, após descongelação e ressuspensão nos diluentes ACP e BTS. 45
100 90 T 1 T 2 T3 T4 80 Espermatozóides Móveis (%) 70 60 50 40 30 AB A B B 39 46 36 31 A A A B 35 35 34 22 10 0 ACP BTS Diluidores de Ressuspenção Figura 2: Porcentagem de espermatozóides móveis do sêmen suíno congelado em diferentes volumes do diluente gema de ovo/glicose, após descongelação e ressuspensão nos diluentes ACP e BTS. Apesar disto, o número de vivos com acrossoma intacto ficou sempre acima dos 50% (T1 = 54%, T2 = 55%, T3 = 57% e T4 = 50%), valores considerados bons para sêmen descongelado (Fig. 3A). A mesma tendência foi observada com o diluente BTS, ou seja, sem diferenças significativas entre tratamentos, nas categorias supra-citadas, exceto na menor diluição. Entretanto, os valores para 100 90 A B T1 T2 T3 T4 80 70 A A A A Valores (%) 60 50 40 A A A A AB A AB B A A A A A A A A 30 54 55 57 50 AB AB A B 10 0 38 39 37 32 33 35 34 35 30 26 30 33 30 30 32 33 15 15 11 18 Vivo Intacto Vivo Danificado Morto Vivo Intacto Vivo Danificado Morto ACP BTS Categoria / Diluidor Figura 3: Morfologia acrossomal do sêmen suíno congelado em diferentes volumes do diluente gema de ovo/glicose, após descongelação e ressuspensão nos diluentes ACP e BTS. 46
100 T1 T2 T3 T4 A B A AB AB A AB B 90 80 70 Valores (%) 60 50 40 30 AB A B B AB A AB B 78 68 84 83 81 76 82 85 10 23 32 16 16 25 18 15 0 ACP BTS ACP BTS M. Íntegra M. Danificada Categorias Figura 04: Integridade da membrana espermática do sêmen suíno congelado em diferentes volumes do diluente gema de ovo/glicose, após descongelação e ressuspensão nos diluentes ACP e BTS. vivos com o acrossoma intacto, foram todos inferiores a 50%, com uma queda entre 18 e 25 pontos: T1 = 38%; T2 = 39%; T3 = 37% e T4 = 32% (Fig. 3B). Apesar do efeito negativo da temperatura sobre o espermatozóide (Lima et al., 04), os resultados sugerem uma melhor condição oferecida pelo ACP-103 durante todo processo, sendo este resultado importante, uma vez que o sucesso da reprodução assistida é enormemente influenciado pela qualidade final do gameta (Morrell, 06). Esta ação do diluente refletiu na quantidade de espermatozóides mortos, que dobrou quando estes foram diluídos no BTS, demonstrando sua menor capacidade de preservação espermática em relação ao ACP. Taxas de diluição intermediárias parecem oferecer uma melhor condição de armazenagem aos espermatozóides, resultados estes também obtidos por outros pesquisadores (Piñeyro et al., 04). A maior porcentagem de membrana intacta foi obtida no T2, independente do diluente utilizado (ACP = 32% e BTS = 25%), com diferenças significativas (p<0,05). Para esta característica, o ACP-103 mostrou-se novamente mais eficiente na conservação da célula espermática suína. Quando consideradas as células com membrana danificada, novamente o T2 apresentou os melhores resultados, tendo como valores ACP-103 = 68% e BTS = 76%. As diferenças foram mais evidentes com apenas equivalência ao T3; já no BTS isto se deu com T1 e T3 (Fig. 4). Baseado nos resultados encontrados, comprovou-se a importância da concentração espermática e de sua qualidade morfológica, que juntamente com o número de células na dose inseminante podem influenciar as taxas de fertilidade (Alm et al., 06), apesar de que, mudanças estruturais podem reduzir estas taxas (Antunes, 07). Estudos paralelos sobre a bioquímica de membranas dos espermatozóides suínos são necessários para se esclarecer esta ação lesiva do frio (Guthrie & Welch, 05). Encontrar uma melhor relação diluente/ 47
espermatozóide é importante, pois a concentração espermática tem efeito significativo sobre o número total de leitões nascidos (Darwin, 08). A eficiência comprovada neste trabalho, do ACP-103 em processo biotecnológico tem sido confirmada em diferentes espécies animais e no homem (Nunes, 1998; Nunes et al., 1999; Costa et al., 02), o que abre uma nova perspectiva para o seu uso rotineiro. CONCLUSÕES A melhor motilidade espermática no T2 sugere ser esta relação diluente/sêmen, a melhor para a congelação sendo importante para uma melhor prolificidade. Em diferentes aspectos, o ACP, foi melhor na capacidade de conservar a célula espermática durante o processo de congelação. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALM, K.; PELTONIEMI, O.A.T.; KOSKINEN, E.; ANDERSSON, M. Porcine field with two different insemination doses and the effect of sperm morphology, Reproduction in Domestic Animals, v.41, p.210-213, 06. ANTUNES, R.C. Avanço tecnológico e aplicabilidade da técnica de congelamento de sêmen suíno, Revista Brasileira de Reprodução Animal, Belo Horizonte, v.31, n.1, p.60-63, 07. ARAÚJO, L.L.; OLIVEIRA, K.G.; LIMA, J.S.; PANTOJA, P.S.P.; ARAÚJO, J.B.; DOMINGUES, S.F.S. Preservação de sêmen de Cebus apella (macaco-prego) em diluidor à base de água de coco a 37 o C. In: XVII Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, Curitiba. v.17, p.192, 07. BARBOSA, C.C.; LOPES-NETO, B.E.; MADEIRA, V.L.H.; LIMA, A.H.R.; UCHOA, D.C.; SILVA, L.D.M. Criopreservação de sêmen canino com diluidor à base de água de coco em pó (ACP-106): Efeito da concentração de gema de ovo. In: XVII Congresso Brasileiro de Reprodução Animal, Curitiba. v.17, p.177, 07. COSTA, S.H.F.; SANTOS, R.R.; FERREIRA, M.A.L.; MACHADO, V.P., RODRIGUES, A.P.R.; OHASHI, O.M.; FIGUEIREDO, J.R. Preservation of goat pre-antral follicles in saline or coconut water 48 solution, Brazilian Journal of Veterinary Research and Animal Science v.39, n.6, p.324-330, 02. DARWIN, L. Inseminação: o efeito da baixa concentração espermática e de bactérias na taxa de parição e nascidos totais. Suínos & Cia, n.28, p.54-56, 08. GUTHRIE, H.D.; WELCH, G.R. Impacto f estorage prior to cryopreservation on plasma membrane function and fertility of boar sperm. Theriogenology, v.63, p.396-410, 05. JOHNSON, L.A., WEITZE, K.F., FISER, P. MAXWELL, W.M.C. Storage of boar semen. Animal Reprodution Science, v.62, p.143-172, 00. LIMA, F.P.; ALVARENGA, A.L.N.; MURGAS, L.D.S., LIMA, D.; FIALHO, E.T.; GOMES NETTO, J.C. Morfologia espermática do sêmen suíno submetido a diferentes temperaturas de resfriamento. In: II Congresso Latino Americano de Suinocultura, Foz do Iguaçu, v.1, p.313-314, 04. MORRELL, J.M. Update on semen technologies for animal breeding. Reproduction in Domestic Animals, v.41, p.63-67, 06. NUNES, J.F. Utilização da água de coco como diluidor do sêmen de animais domésticos e do homem. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.22, n.2, p.109-112, 1998. NUNES, J.F.; SALGUEIRO, C.C.M. Utilização da água de coco como diluidor do sêmen de caprinos e ovinos. Revista Científica de Produção Animal, v.1, n.1, p.17-26, 1999. PAQUIGNON M. Semen technology in the pig. Currents Topics on Veterinary Medicin and Animal Science, v.30, p.2-218, 1984. PIÑEYRO, P.; WILLIANS, S.; CARNEVALI, M.E..; DE LA SOTA, R.L. Conservación de semen porcino a diferentes taxas de dilución. In: II Congresso Latino Americano de Suinocultura, Foz do Iguaçu, v.1, p.317-318, 04. POLGE, C.; SALAMON, S.; WILMUT, I. Fertilizing capacity of frozen boar semen following surgical inseminations. Veterinary Record, v.87, p.424-428, 1970. SALGUEIRO, C.C.M; NUNES, J.F.; OLIVEIRA, R.V.; PARENTE, J.C.B.; CAVALCANTE, J.M.M.; MELLO, M.M.C.; BRASIL, O.O.; FAUSTINO, L.R.; GONÇALVES, R.F.B.; BATISTA, C.A.P.M.; SOUZA, D.F.R.; ACCIOLY, M.P. Inseminação artificial de ovelhas com sêmen diluído em meio à
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