ORGANIZAÇÃO SUPRAMOLECULAR DO MATERIAL GENÉTICO

ORGANIZAÇÃO SUPRAMOLECULAR DO MATERIAL GENÉTICO

ORGANIZAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO CELULAR Massa compacta, ocupando um volume limitado As suas variadas actividades, tal como replicação e transcrição, têm que ser efectuadas nesse espaço confinado A organização deste material tem que contemplar transições entre estados activos e inactivos O estado de condensação dos ácidos nucleicos resulta da sua ligação a proteínas básicas, cujas cargas neutralizam as cargas dos ácidos nucleicos A estrutura do complexo nucleoproteico é determinada pelas interacções das proteínas com DNA (ou RNA) Disparidade de dimensões entre o comprimento do DNA como molécula linear e o compartimento que o contém

CADEIAS DE DNA (CONTENDO GENES) CROMOSSOMAS GENOMA

RELAÇÃO ENTRE AS DIMENSÕES DOS ÁCIDOS NUCLEICOS E DOS COMPARTIMENTOS CELULARES ONDE SE ENCONTRAM OBSERVA-SE ENORME DISCREPÂNCIA ENTRE ESTES DOIS PARÂMETROS, QUER EM VÍRUS, PROCARIOTAS OU EUCARIOTAS

O TAMANHO DO GENOMA VARIA COM A COMPLEXIDADE DAS ESPÉCIES

COMPARAÇÃO ENTRE O TAMANHO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS E DOS COMPARTIMENTOS QUE OS CONTÊM

FAGO T2

CÉLULAS EUCARIÓTICAS O material genético localiza-se no núcleo CROMATINA ESTRUTURA FIBROSA DNA HISTONAS (proteínas básicas) PROTEÍNAS NÃO - HISTONAS

O estado de condensação da cromatina varia com o ciclo celular INTERFASE A cromatina encontra-se dispersa pelo núcleo sob a forma de uma massa amorfa METAFASE A cromatina organiza-se em estruturas compactas denominadas CROMOSSOMAS

No núcleo das células em interfase distinguem-se dois tipos de cromatina EUCROMATINA Cromatina activa, que se encontra descondensada, correspondente a regiões do genoma susceptíveis de transcrição e sensíveis à acção da DNase I HETEROCROMATINA Cromatina que mantém o seu elevado grau de condensação ao longo de todo o ciclo celular e se visualiza sob a forma de regiões densas e fortemente coradas (cromómeros)

TIPOS DE HETEROCROMATINA FACULTATIVA O seu estado de condensação varia consoante o tipo de célula e o seu estado de desenvolvimento Exemplo - cromossoma X CONSTITUTIVA Estrutura complexa caracterizada por um estado permanente de condensação e inactivação genética Localiza-se nos centrómeros, telómeros e cromossoma Y

CROMOSSOMA INDIVIDUAL E CONJUNTO DE 46 CROMOSSOMAS DE UMA CÉLULA SOMÁTICA HUMANA O NÚMERO DE CROMOSSOMAS É CARACTERÍSTICO DE CADA ESPÉCIE A SUA ORGANIZAÇÃO EM GRUPOS, DE ACORDO COM NORMAS INTERNACIONAIS, CONSTITUI O CARIOTIPO

REQUISITOS MÍNIMOS PARA EXISTÊNCIA COMO CROMOSSOMA: Telómeros Um centrómero Uma origem para início de replicação

CENTRÓMEROS Região do cromossoma responsável pela sua segregação durante a mitose e a meiose Constituídos por heterocromatina constitutiva, rica em sequências repetitivas TELÓMEROS Sequências presentes nas extremidades dos cromossomas eucarióticos e que ajudam à sua estabilização e sobrevivência 5 (TxGy)n x e y = 1 a 4 3 (AxCy)n n = 20 a 100 nos eucariotas simples; >1500 nos mamíferos

DOIS TIPOS DE CROMOSSOMAS AUTOSSOMAS HETEROSSOMAS (SEXUAIS) Os cromossomas são descritos em função do tamanho e da posição do centrómero. Quando os centrómeros não são medianos, observam-se braços desiguais, designando-se por p o menor e q o maior

A identificação de cada cromossoma tornou-se possível com o aparecimento das técnicas de bandas Cada banda revela grupos de genes, dispostos linearmente no cromossoma e não distribuídos ao acaso Qualquer que seja o método usado, o padrão de marcação é constante para cada cromossoma em cada espécie

CARIOTIPO APÓS COLORAÇÃO DE GIEMSA ESTRUTURA DO CROMOSSOMA X

ESTRUTURA DO GENOMA 1. SEQUÊNCIAS ALTAMENTE REPETIDAS DNA satélite: 1000-3000 pb DNA mini-satélite: < 20 pb DNA micro-satélite: 2-5 pb em grupos de 100 2. SEQUÊNCIAS MODERADAMENTE REPETIDAS a) Funções codificantes: trna, rrna e histonas b) Sem funções codificantes: Família Alu - 300 pb SINES (short interspersed repeats) - 500 pb LINES (long interspersed repeats) - > 1000 pb 3. SEQUÊNCIAS NÃO REPETIDAS Genes e pseudogenes

5 3 RNA Ponto de vista do geneticista: Um gene é uma região do genoma que segrega como uma unidade única durante a meiose e dá origem a uma característica definida (fenótipo) Ponto de vista do biologista molecular: Um gene é qualquer sequência de DNA que é transcrita como unidade única Promotor Gene Transcrição

GENE Unidade fundamental de informação nos organismos vivos Segmento de DNA que possui a informação requerida para a produção de um produto biológico funcional (proteína, RNA)

ESTRUTURA DE UM GENE CODIFICANDO PARA UMA PROTEÍNA

TOPO-ISOMERASES TIPO II EUCARIÓTICAS Enzimas que requerem ATP Relaxam supercoils positivos e negativos MAS NÃO introduzem supercoils negativos PROBLEMA Não existe nenhuma enzima eucariótica que introduza supercoils negativos. Então como é que o DNA eucariótico se torna supercoiled? RESPOSTA Organização supramolecular da cromatina

A cromatina apresenta uma organização compacta, na qual a maioria das sequências de DNA se encontram estruturalmente inacessíveis e funcionalmente inactivas Qual a estrutura geral da cromatina? Qual a diferença entre sequências activas e inactivas? O elevado grau de compactação do material genético sugere que deve haver níveis hierárquicos de organização

NÍVEIS DE COMPACTAÇÃO 1º nível - NUCLEOSSOMA 6x 2º nível - FIBRA DE 30 nm 40x 3º nível - CONDENSAÇÃO DA FIBRA 1.000x eucromatina <> 10.000x cromossomas 10.000x heterocromatina

NUCLEOSSOMA 1º NÍVEL DE ORGANIZAÇÃO DA CROMATINA 200 bp DE DNA ASSOCIADOS COM UM OCTÂMERO DE HISTONAS 2 X (H2A + H2B + H3 + H4) NUCLEOSSOMA + HISTONA H1 CROMATOSSOMA

ESTRUTURA DO NUCLEOSSOMA

ORGANIZAÇÃO DA CROMATINA

DIGESTÃO DA CROMATINA COM NUCLEASE MICROCOCAL FRACCIONAMENTO EM GRADIENTE DE SACAROSE

DNA NUCLEOSSOMAL ANÁLISE COM NUCLEASE MICROCOCAL CORE DNA - 146 pb de comprimento; relativamente resistente à digestão por nucleases LINKER DNA - compreende o resto da unidade de repetição; varia desde 8 pb até 114 pb por nucleossoma

DNA NUCLEOSSOMAL

LOCALIZAÇÃO DA HISTONA H1 A histona H1 perde-se durante a digestão enzimática dos nucleossomas Pode ser retida nos monómeros que ainda têm 165 pb de DNA Desaparece sempre que a digestão atinge os 146 pb da partícula core Este dado sugere que H1 pode estar localizada na região do DNA linker imediatamente adjacente ao DNA core

POSICIONAMENTO DO NÚCLEO DE HISTONAS EM RELAÇÃO AO DNA A ligação do DNA às histonas dá-se em regiões ricas em pares A=T no sulco menor da dupla hélice

COMPARAÇÃO DAS DIMENSÕES DO NUCLEOSSOMA E DA RNA POLIMERASE

OS GENES TRANSCRITOS ORGANIZAM-SE EM NUCLEOSSOMAS? LOCALIZAÇÃO DO NUCLEOSSOMA APÓS PASSAGEM DA RNA POLIMERASE

HISTONAS Proteínas básicas Massa molecular sensivelmente igual à do DNA Massa molecular 10.000-20.000 5 tipos de histonas (60 milhões cópias/célula) Ricas em lisina e arginina Interacções similares entre Histona - DNA, Histona - Histona e Histona - Não-histona em diferentes espécies Acetilação e fosforilação de H4 pode ter papel regulador na replicação e transcrição do DNA

HISTONAS H3 e H4 - proteínas muito conservadas o que sugere funções idênticas em todos os eucariotas H2A e H2B - apresentam variações de sequência entre espécies H1 - apresenta variações de sequência entre tecidos e entre espécies

MODIFICAÇÃO DAS HISTONAS ACETILAÇÃO -Lys METILAÇÃO - Lys, Arg, His FOSFORILAÇÃO - Ser, His A fosforilação de H1 aumenta o grau de condensação da cromatina em metafase

ORGANIZAÇÃO DAS HISTONAS NO NUCLEOSSOMA

CAUDAS N-TERMINAIS DAS HISTONAS E REACÇÕES DE MODIFICAÇÃO

PROTEÍNAS NÃO - HISTONAS Todas as outras proteínas da cromatina Variam entre tecido e entre estirpes Menor massa molecular que as histonas Maior nº de não-histonas que de histona (5), mas em quantidades inferiores à de qualquer histona Ligadas à expressão dos genes e com papel estrutural (RNA polimerase) Aniónicas (acídicas) Responsáveis pela organização estrutural da cromatina e do cromossoma

FIBRA DE 30 nm 2º NÍVEL DE ORGANIZAÇÃO DA CROMATINA Forma-se por interacção cooperativa das moléculas H1 ligadas ao DNA ligante Histonas H1 interagem na junção de 2 nucleossomas e são responsáveis pela estabilidade da fibra de 30 nm Os nucleossomas organizam-se numa estrutura helicoidal, originando um arranjo designado por SOLENÓIDE 6 nucleossomas por volta da hélice

ORGANIZAÇÃO DAS FIBRAS DE 10 nm E DE 30 nm

AS FIBRAS DE 10 E 30 nm

NÍVEIS DE ORGANIZAÇÃO NUM CROMOSSOMA EUCARIÓTICO

GENOMA BACTERIANO O cromossoma bacteriano organiza-se numa estrutura compacta - NUCLEÓIDE -por interacção do DNA com proteínas HU e H-NS e com a participação de catiões, poliaminas, RNA e proteínas não-histonas. O genoma bacteriano ocupa uma larga fracção do volume celular, tem um conteúdo de cerca de 80% de DNA (contra 50% nos eucariotas) e parece encontrar-se ligado à superfície interna da membrana plasmática

NUCLEÓIDES VISUALIZADOS EM CÉLULAS DE E.coli

ORGANIZAÇÃO DO GENOMA BACTERIANO

TÓPICOS IMPORTANTES Os genomas da maioria dos organismos têm dimensões muito superiores às das células que os contêm Grande parte do DNA encontra-se superenrolado (supercoiled) e resulta do desenrolamento da molécula - importante para a condensação e empacotamento e para a função do DNA

TÓPICOS IMPORTANTES O desenrolamento do DNA é quantificado pelo número de ligação (linking number) As enzimas que desenrolam e/ou relaxam o DNA são conhecidas como topo-isomerases Nas células eucarióticas o desenrolamento da cromatina é conseguido pelos diversos níveis de organização do DNA (nucleossomas, etc.)