ESTRUTURA E FUNÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS

Lista de exercícios ESTRUTURA E FUNÇÃO DOS ÁCIDOS NUCLEICOS 1) Quais são as diferenças de composição e estrutura entre RNA e DNA? Escreva os nomes das bases, ribonucleosídeos, desoxirribonucleosídeos, ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos do DNA e RNA. DNA RNA Composição Nucleosídeo Nucleotídeo Nucleosídeo Nucleotídeo Pentose Desoxirribose Desoxirribose Ribose Ribose Adenina Desoxiadenosina Desoxiadenilato Adenosina Adenilato Bases púricas Guanina Desoxiguanosina Desoxiguanilato Guanosina Guanilato Citosina Desoxicitidina Desoxicitidilato Citidina Citidilato Bases Timina Timidina ou Timidilato ou pirimídicas desoxitimidina desoxitimidilato Uracila Uridina Uridilato 2) O que se entende por orientação anti-paralela das fitas de DNA? Significa que as duas cadeias polinucleotídicas de uma mesma molécula de DNA são invertidas uma em relação à outra, isto é, se em uma extremidade de uma delas se encontrar o radical fosfato (que ocupa a posição 5 do nucleotídeo), na mesma extremidade da outra fita será encontrado o radical hidroxila (da posição 3 ). 3) Num organismo diploide um pesquisador verificou que uma molécula de DNA continha 22% de guanina. Com base nesta informação determine qual o percentual de cada uma das outras bases. %Guanina= %Citosina G = 22%; C = 22% (44% G + C). Assim, 100 44 = 56% para A + T. Como %Adenina= %Timina, teremos T = 28%; A = 28%. 4) Se o conteúdo de AT em uma molécula de DNA é de 36%, quais são os conteúdos de todas as bases? A+T= 36%. Como %Adenina= %Timina, teremos: A = 18%; T = 18%. Assim, 100 36 = 64% para G + C. %Guanina= %Citosina G = 32%; C = 32%. 5) Um vírus, cujo material consiste de uma fita de RNA, tem aproximadamente 22% de seus RNA nucleotídeos consistindo de uracila. E possível determinar o conteúdo de adenina? Justifique. Não há como determinar, uma vez que o RNA viral é de fita simples, não sendo as bases pareadas. 6) Escreva a sequência de bases da fita complementar do DNA dupla fita que apresenta uma fita com a sequência: (5') ATGCCGTATGCATTGCATTC (3') (3') TACGGCATACGTAACGTAAG (5') Exprima, em porcentagem, a composição de bases do DNA de fita dupla. Total de bases das 2 fitas = 40 Gabarito Exercícios Estrutura e Função dos Ácidos Nucleicos_1º Bimestre 2014.doc Então, 40 = 100%. Aplicando a regra de 3, teremos: %Adenina= %Timina X= 27,5% de cada 11 X %Guanina= %Citosina X= 22,5% de cada 9 X 7) Uma molécula de ácido nucleico tem a seguinte composição de bases: C=24,1%; G=18,5%; T=24,6% e A=32,8%. O que se pode afirmar sobre a natureza desta molécula? Justifique para validar a questão. É uma molécula de DNA fita simples. Como tem timina, é DNA; porém no DNA fita dupla as quantidades de guanina e citosina e de adenina e timina são iguais. 8) RNA é facilmente hidrolizado por álcali, enquanto DNA não o é. Por quê? O grupamento 2 hidroxila do açúcar (ribose) do RNA está diretamente envolvido neste processo, pois os grupamentos hidroxila são os primeiros a serem rapidamente hidrolisados pela ação de um álcali, produzindo uma mistura de nucleosídeos 2 e 3 monofosfatos. Como o DNA não possui o grupamento 2 hidroxila (desoxirribose), não é facilmente hidrolisado em condições alcalinas, o que torna o esqueleto do DNA mais estável quando comparado ao RNA. 1 6

9) O valor de Tm para o DNA pode ser calculado usando-se a fórmula: Tm = 69,3 + 0,41 (%GC), onde GC é a porcentagem de Guanina + Citosina. Sobre o tema e assuntos correlatos, responda: a) O que é Tm? Qual o seu significado? Tm= temperatura de fusão (melting) ou desnaturação, ou seja, a temperatura na qual 50% da dupla fita do DNA encontra-se desnaturada em fita simples. b) DNA de E. coli contém 50% GC. Calcular o Tm para o DNA desta bactéria. Tm (E.coli) = 69,3 + 0,41 (GC%) = 69,3 + 0,41 (50) = 69,3 + 20,5 = 89,8 C c) As curvas de fusão da maioria dos DNAs que ocorrem naturalmente revelam que o Tm é normalmente maior do que 65 o C. Por que isto é importante para a maioria dos organismos? Visto que a estabilidade da dupla hélice resulta em parte do grande número de pontes de hidrogênio entre os pares de bases, o valor de Tm indica a estabilidade da dupla fita do DNA. Como Tm é a temperatura necessária para desnaturar 50% da fita dupla do DNA e isto ocorre pelo rompimento das pontes de hidrogênio, isto indica que o DNA da maioria dos organismos se mantém estável a temperaturas superiores a 65 C, o que é muito importante pois, exceto em alguns vírus, o DNA contém os genes, responsáveis pelo comando da atividade celular e pelas características hereditárias. d) Explique por que o DNA é desnaturado quando submetido a altas temperaturas ou phs extremos. Como estas moléculas podem ser renaturadas? As duas fitas da dupla hélice do DNA podem ser reversivelmente separadas por altas temperaturas ou por exposição a ph elevado (ph 13). Isto porque ocorre ruptura das pontes de hidrogênio entre os pares de bases. Esse processo é denominado desnaturação. Durante a desnaturação nenhuma ligação covalente é desfeita, ficando, portanto, as duas fitas de DNA separadas. Quando o ph e a temperatura voltam ao normal, as duas fitas de DNA espontaneamente se hibridizam, formando novamente o DNA dupla fita, o que chamamos de renaturação. Este processo envolve duas etapas: a primeira é mais lenta pois envolve o encontro casual das fitas complementares de DNA, formando um curto segmento de dupla hélice. A segunda etapa é mais rápida e envolve a formação das pontes de hidrogênio entre as bases complementares reconstruindo a conformação tridimensional. Lembrete: os agentes desnaturantes têm maior facilidade em romper as duas pontes de hidrogênio que ligam as bases A e T, do que as três pontes de hidrogênio que ligam as bases C e G. Portanto, são necessárias temperaturas mais elevadas, ph mais alcalino e maiores concentrações de agentes desnaturantes para romper as bases C e G, do que as bases A e T. 10) Abaixo são apresentadas duas sequências de DNA que flanqueiam o gene humano da eritropoetina (EPO), hormônio secretado pelos rins e essencial para a diferenciação terminal dos glóbulos vermelhos do sangue na medula óssea. (5') GTCCATTGTGCAGGACACAC (3') (5') ATCCTTTGAGCCCAGGAGTT (3') a) Escreva a sequência de bases da fita complementar do DNA dupla fita das sequências apresentadas em e. (3') CAGGTAACACGTCCTGTGTG (5') (3') TAGGAAACTCGGGTCCTCAA(5') b) Exprima, em porcentagem, a composição de bases do DNA dupla fita de e. Demonstre seus cálculos para validar o item. Total de bases = 40 (100%) %Adenina= %Timina 9 X X= 22,5% de cada %Guanina= %Citosina 11 X X= 27,5% de cada Total de bases = 40 (100%) %Adenina= %Timina 10 X X= 25% de cada %Guanina= %Citosina 10 X X= 25% de cada 2 6

c) Sabendo-se que o valor de Tm de é de 91,85 e de é de 89,8, qual das duas sequências é mais estável? Por quê? Considere na sua resposta o significado de Tm. A sequência é mais estável. Visto que Tm é a temperatura necessária para desnaturar 50% da fita dupla do DNA e isto ocorre pelo rompimento das pontes de hidrogênio, o valor de Tm indica a estabilidade da dupla fita do DNA. Como são necessárias temperaturas mais elevadas para romper as 3 pontes de hidrogênio entre as bases C e G, do que as 2 pontes de hidrogênio entre as bases A e T, e a sequência tem maior porcentagem de CG, ela é mais estável. 11) Em relação à estrutura dos ácidos nucleicos, responda ao que se pede: a) Escreva as polaridades e as sequências de bases das fitas complementares dos DNAs dupla fita que apresentam fitas com as sequências especificadas em e. 5' ATGCCGTATGCATTGCATTC 3' 3' TACGGCATACGTAACGTAAG 5' 5 TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA 3 3' ACTTCCTCTTCCACAGACGCCCT 5' b) Calcule o valor de Tm do DNA dupla fita de e. Demonstre seus cálculos para validar o item. Tm = 69,3 + 0,41 (%GC), onde GC é a porcentagem de Guanina + Citosina. Assim, teremos: Total de bases do DNA= 40 CG = 18 x= 45% 18 x Tm = 69,3 + 0,41(45) = 87,75 C Total de bases do DNA= 46 CG = 26 46 100% x= 56,52% 26 x Tm = 69,3 + 0,41(56,52) = 92,47 C c) A partir dos valores de Tm calculados no item b, responda: Qual das duas sequências é mais estável? Por quê? Considere na sua resposta o significado de Tm. A sequência é mais estável. Visto que Tm é a temperatura necessária para desnaturar 50% da fita dupla do DNA e isto ocorre pelo rompimento das pontes de hidrogênio, o valor de Tm indica a estabilidade da dupla fita do DNA. Como são necessárias temperaturas mais elevadas para romper as 3 pontes de hidrogênio entre as bases C e G, do que as 2 pontes de hidrogênio entre as bases A e T, e a sequência tem maior porcentagem de CG, ela é mais estável. 12) A extração de DNA de células eucariontes consta de algumas etapas, as quais incluem: 1- Desorganização das membranas celulares e ruptura das células para liberação dos ácidos nucleicos. 2- Desnaturação das proteínas e dissociação dos complexos ácidos nucleicos-proteínas (que formam os cromossomos), resultando no isolamento de ácidos nucleicos mais puros. 3- Desnaturação das enzimas Dnases presentes nos lisossomos, evitando a degradação do DNA. 4- Separação do DNA dos demais componentes celulares. 5- Precipitação e "pescagem" do DNA. A incubação a 60 C e a adição de etanol gelado referem-se respectivamente, e mais particularmente, às etapas 3 e 5. 13) Que propriedades do DNA e da DNA polimerase sugerem que as duas fitas não podem ser replicadas pelo crescimento no mesmo sentido? As duas fitas que compõem a molécula de DNA são antiparalelas, ou seja, têm polaridade invertida: 5 3 em uma fita e 3 5 na outra. Como a DNA polimerase só adiciona nucleotídeos no sentido 5 3, porque precisa da extremidade 3 -OH livre para que ocorra a ligação fosfodiéster, a fita utilizada como molde só pode ser lida da extremidade 3 para a extremidade 5, e a síntese das duas fitas ocorre em sentidos opostos. Desta forma, uma das fitas é sintetizada continuamente, sendo denominada fita líder, enquanto a outra se faz em pequenos fragmentos, sendo chamada de fita tardia. Estes fragmentos são denominados de fragmentos de Okasaki. 14) Diferencie a replicação do DNA de procariotos e eucariotos quanto a: a. Origem de replicação. Procariotos têm somente uma origem de replicação, enquanto eucariotos têm várias. 3 6

b. DNAs polimerases envolvidas no processo. Procariotos Eucariotos DNA polimerase Função DNA polimerase Função I Principal enzima de reparo do DNA (alfa) Replicação da fita contínua II Reparo do DNA (delta) Replicação da fita descontínua III Principal enzima de replicação do DNA (épsilon) Reparo do DNA (beta) Reparo do DNA (gama) Replicação e reparo do mtdna 15) Quais são as principais enzimas envolvidas na replicação do DNA em eucariotos? Cite e explique suas funções. Helicases Enzima Topoisomerases Iniciases ou primases DNA polimerase (alfa) DNA polimerase (delta) DNA polimerases (épsilon) e (beta) DNA polimerase (gama) DNA ligase Função Desenovelam a dupla hélice e separam as duas fitas do DNA (reconhecem a origem de replicação, quebram as pontes de hidrogênio entre as bases complementares e separam as duas fitas do DNA, formando-se uma bolha de replicação que é constituída por duas forquilhas de replicação). Reduzem a tensão da molécula de DNA, criada pelo superenovelamento provocado pela abertura da dupla hélice pela helicase, por introduzirem uma quebra temporária em uma das fitas (Topoisomerase 1) ou em ambas as fitas do DNA (Topoisomerase 2), promoverem a rotação de uma fita em torno da outra, e religarem as fitas temporariamente quebradas. Sintetizam os iniciadores (primers), que consistem em uma pequena sequência de bases de RNA que fornecem uma extremidade 3 -OH livre para as DNA polimerases iniciarem a adição de nucleotídeos durante a replicação do DNA. Replicação da fita contínua. Replicação da fita descontínua. Reparo do DNA. Replicação e reparo do DNA mitocondrial (mtdna). Sela os corte da fita descontínua, após remoção dos iniciadores e substituição dos iniciadores (primers) por nucleotídeos de DNA pela DNA polimerase (delta). 16) Três diferentes RNA polimerases sintetizam RNA em eucariotos. Quais são os produtos de cada uma delas e suas respectivas funções? RNA polimerase Produto Função RNA-polimerase I pré-rrna O rrna é componente estrutural dos ribossomos, os quais servem de sítio para a tradução da sequencia de mrna em uma sequência específica de aminoácidos ou cadeia polipeptídica. mrna: codificam cadeias polipeptídicas (veículo pelo qual a RNA-polimerase II informação genética é transferida do DNA aos ribossomos mrna e alguns pequenos para a síntese de cadeias polipeptídicas). RNA nucleares pequenos RNAs nucleares: participam do splicing de RNA-polimerase III trna, rrna 5S e vários outros RNAs estáveis relativamente pequenos mrnas. trna: moléculas adaptadoras que traduzem a informação presente no mrna em uma sequencia específica de aminoácidos. rrna 5S: é um componente da subunidade maior dos ribossomos de procariotos (50S) e eucariotos (60S). Outros pequenos RNAs: fornecem uma extremidade 3 -OH livre para a DNA polimerase iniciar a adição de nucleotídeos 4 6

durante a replicação do DNA (RNA iniciador ou primer), ou estão envolvidos nos processamento do mrna ou rrna. 17) Quais são os tipos de modificações pós-transcricionais que ocorrem nos mrnas de eucariotos? Explique resumidamente cada um deles. 1- adição de uma estrutura chamada cap 5 para selar a extremidade 5 : consiste na adição de um nucleotídeo extra na terminação 5, na adição de um grupo metil à base do nucleotídeo recém-adicionado e na adição de um grupo OH no açúcar de um ou mais nucleotídeos. 2- poliadenilação na extremidade 3 : consiste na adição de uma série de nucleotídeos de ácido adenílico (ácido poliadenílico ou poli na extremidade 3, conferindo estabilidade ao RNA, e com isto, aumentando o tempo pelo qual o mrna permanece intacto e disponível para a tradução antes da degradação. 3- splicing: processo em que são removidos os íntrons do RNA mensageiro, tornando-o maduro (gera um mrna menor contendo uma sequência codificadora intacta). 4- edição do mrna: inserções, deleções, alteração de bases. Durante o processamento, determinados transcritos primários podem receber a inserção, deleção ou modificação de nucleotídeos em sua sequência (gerando, por exemplo, um códon de parada precoce). Tal processo é denominado edição do RNAm. A regulação pós-transcricional realizada via edição de RNAm permite que um mesmo gene codifique proteínas diferentes em função do tecido onde se expressa. A regulação do processo, portanto, dependerá da presença ou ausência das enzimas responsáveis pela edição daquele transcrito em cada tecido. OBS: Tanto o cap quanto o poli-a têm a função de proteger o mrna da ação de exonucleases. Um encurtamento do poli-a, leva a remoção do cap e rápida degradação da molécula o mrna. A cauda poli A mantém a integridade da região 3 (com um nível normal de adenilação) e auxilia na exportação do mrna para o citoplasma. 18) Em que consiste o terminal 5' cap do mrna e qual o seu papel? Qual a característica do terminal 3' encontrado na maioria dos mrnas de eucariotos e como eles são formados? O terminal 5' cap consiste na adição de um nucleotídeo extra na terminação 5, na adição de um grupo metil à base do nucleotídeo recém-adicionado e na adição de um grupo OH no açúcar de um ou mais nucleotídeos. Proteínas reconhecem o cap 5 e se ligam; um ribossomo liga-se a proteína e se move ao longo do RNA até que o start codon é atingido e a transcrição se inicia. A presença do cap 5 também aumenta a estabilidade do mrna e influencia a remoção dos íntrons. O RNA maduro contém entre 50 a 250 adeninas no terminal 3 ; esta estrutura é chamada cauda poli. Estes nucleotídeos não são codificados no DNA, mas são adicionados após a transcrição em um processo chamado poliadenilação, que consiste na adição de uma série de nucleotídeos de ácido adenílico (ácido poliadenílico ou poli) na extremidade 3. 19) O produto final da transcrição de alguns genes presentes nas células não resulta na produção final de proteínas, mas sim em moléculas de RNA com outras funções, ou seja, não são traduzidas diretamente a proteínas. Que moléculas são essas? Quais as suas funções? RNA mrnas (RNAs mensageiros) rrnas (RNAs ribossômicos) trnas (RNA transportador ou de transferência) snrnas (pequenos RNA nucleares do inglês small nuclear RNA) scrnas (pequenos RNA citoplasmáticos do inglês small cytoplasmic RNA) RNA SL (spliced leader RNA ou RNA-líder) SnoRNAs (pequenos RNAs encontrados nos nucléolos) Função Informacional: codificam cadeias polipeptídicas (veículo pelo qual a informação genética é transferida do DNA aos ribossomos para a síntese de cadeias polipeptídicas). Componente estrutural dos ribossomos, os quais servem de sítio para a tradução da sequencia de mrna em uma sequência específica de aminoácidos ou cadeia polipeptídica. Moléculas adaptadoras que traduzem a informação presente no mrna em uma sequência específica de aminoácidos. Partículas ribonucleoproteicas envolvidas no processamento do mrna (splicing). Envolvido no processamento do mrna em diversas espécies de tripanossomos e no nematódeo Caernohabditis elegans. Envolvidos no processamento do rrna. 5 6

RNA I (RNA iniciador ou primer) Fornece uma extremidade 3 -OH livre para a DNA polimerase iniciar a adição de nucleotídeos durante a replicação do DNA. 20) Foi observado que em um determinado órgão de um animal (mamífero) uma proteína estava presente com um certo tamanho mas, em outro órgão, a mesma proteína era menor que o tamanho esperado. Suponha que um só gene codifica as duas isoformas desta proteína e que os dois órgãos possuam as mesmas proteases. Ofereça uma explicação biologicamente plausível para o fato do mesmo gene codificar proteínas de tamanhos diferentes. Visto que os dois órgãos possuem as mesmas proteases, as modificações pós-traducionais por clivagem proteolítica seriam as mesmas, não explicando as diferenças nos tamanhos das proteínas. Assim, a explicação mais plausível seria a de modificação pós-transcricional, via edição do mrna. Durante o processamento, determinados transcritos primários podem receber a inserção, deleção ou modificação de nucleotídeos em sua sequencia (gerando, por exemplo, um códon de parada precoce). Tal processo é denominado edição do RNAm. A regulação póstranscricional realizada via edição de RNAm permite que um mesmo gene codifique proteínas diferentes em função do tecido onde se expressa. A regulação do processo, portanto, dependerá da presença ou ausência das enzimas responsáveis pela edição daquele transcrito em cada tecido. OBS.: Antes que um polipeptídeo recém-sintetizado possa começar a sua existência como proteína funcional, frequentemente sofre outro processamento chamado de modificação pós-traducional. Estas modificações podem ter uma variedade de formas, incluindo a clivagem em unidades polipeptídicas menores, ou uma combinação com outros polipeptídeos para formar uma proteína maior. Outras modificações possíveis incluem a adição de cadeias laterais de carboidratos ao polipeptídeo. Estas modificações são necessárias, por exemplo, para produzir o dobramento apropriado da proteína final, ou para estabilizar sua estrutura. A cadeia polipeptídica que é o produto primário da tradução é dobrada e associada em uma estrutura tridimencional especifica que é determinada pela própria sequência de aminoácidos. Duas ou mais cadeias polipeptídicas, produtos do mesmo gene ou de genes diferentes, podem se combinar para formar um único complexo proteico final. Os produtos proteicos também podem ser modificados quimicamente por, por exemplo, adição de fosfato ou carboidratos em sítios específicos. Outras modificações podem envolver a clivagem da proteína, seja para remover sequências amino-terminais especificas após terem direcionado uma proteína para o seu local correto dentro da célula, ou para dividir a molécula em cadeias polipeptídicas menores. 21) Explique resumidamente como um pré-mrna contendo sítios alternativos de adição da cauda poli pode contribuir para uma maior diversidade de proteínas em uma célula eucariótica. O processamento diferencial da extremidade 3 é uma forma de gerar diferentes mrna maduros por splicing alternativo, podendo ocorrer a adição da cauda poli em dois ou mais sítios, de acordo com o sítio de poliadenilação do éxon incluído no splicing alternativo. OBS.: Tanto o cap quanto o poli-a têm a função de proteger o mrna da ação de exonucleases. Um encurtamento do poli-a, leva a remoção do cap e rápida degradação da molécula o mrna. A cauda poli A mantém a integridade da região 3 (com um nível normal de adenilação) e auxilia na exportação do mrna para o citoplasma. 22) Uma fita de um fragmento de DNA isolado de E. coli tem a seguinte sequência: 5'...AGGTTACCTAGTTGC...3'. Suponha que um mrna seja transcrito a partir deste DNA usando a fita complementar como molde. a. Qual será a sequência deste mrna? Visto que a fita complementar do DNA que será usada como molde terá a sequência 5...TCCAATGGATCAACG...3, a sequência do mrna será: 5...AGGUUACCUAGUUGC...3. b. Qual é a sequência do polipeptídeo que seria codificado pelo mrna sintetizado? arginina (Arg) leucina (Leu) prolina (Pro) serina (Ser) cisteína (Cys) 23) Durante a síntese proteica 5 aminoácidos foram adicionados à uma cadeia polipeptídica. Os anticódons dos trnas que entraram sequencialmente no ribossomo foram: 5 CAU3 ; 5 AGG3 ; 5 UAG3 ; 5 UCC3 ; 5 AUU3 a. Qual a sequência do pentapeptídeo assim formado? códons: GUA UCC AUC AGG UAA aminoácidos: valina (Val) serina (Ser) isoleucina (Ile) arginina (Arg), pois o códon UAA é um códon de parada. b. Qual a sequência da fita codante do DNA que codifica este pentapeptídeo? CAT AGG TAG TCC ATT c. Qual a sequência do mrna? GUA UCC AUC AGG UAA 6 6