ATIVIDADE PREDATÓRIA DOS FUNGOS ARTHROBOTRYS CONOIDES E MONACROSPORIUM THAUMASIUM SOBRE LARVAS INFECTANTES DE HAEMONCHUS CONTORTUS DE CAPRINOS

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1 Ciência Animal 2000, 10(1):37-41 ATIVIDADE PREDATÓRIA DOS FUNGOS ARTHROBOTRYS CONOIDES E MONACROSPORIUM THAUMASIUM SOBRE LARVAS INFECTANTES DE HAEMONCHUS CONTORTUS DE CAPRINOS (Trapping ability of fungi Arthrobotrys conoides and Monacrosporium thaumasium on goats infective larvae of Haemonchus contortus) Marcelo de Andrade MOTA 1,2, Claudia Maria Leal BEVILAQUA 2 & Jackson Victor de ARAÚJO 2 * 1 Universidade Estadual do Ceará, 2 Universidade Federal de Viçosa RESUMO Em ensaios in vitro testou-se a capacidade predatória dos fungos predadores de nematóides das espécies M. thaumasium e A. conoides sobre larvas infectantes (L3) de H. contortus. Foram formados três grupos, com três repetições: Grupo 1, conídios de A. conoides e L3 de H. contortus. Grupo 2, conídios de M. thaumasium e L3 de H. contortus e Grupo 3, L3 de H. contortus. Diariamente, as placas dos grupos 1 e 2 foram observadas ao microscópio óptico, sendo quantificados os números de larvas capturadas pelos fungos. Ao final de 20 dias, as L3 dos grupos 1, 2 e 3 foram recuperadas pelo método de Baermann. A comparação entre as médias de larvas predadas, na presença dos dois isolados fúngicos, demonstrou que M. thaumasium foi mais eficaz na predação das larvas de H. contortus (P<0,05). Os números de larvas recuperados dos grupos 1, 2 e 3 foram respectivamente 2.730, 690 e PALAVRAS-CHAVE: caprinos, nematódeos gastrintestinais, Haemonchus contortus, controle biológico, fungos. ABSTRACT An in vitro assay was performed to test the predatory activity of nematode trapping fungi Monacrosporium thaumasium and Arthrobotrys conoides against Haemonchus contortus infective larvae (L3). Three groups for each isolates with three repetitions were formed: group 1, conidia of Arthobotrys conoides and L3, group 2, conidia of Monacrosporium thaumasium and L3 and group 3, 10,000 L3. The petri dishes of group 1 and 2 were observed daily under an optic microscope and the trapped larvae quantified. After 20 days, infective larvae from groups 1, 2 and 3 were recovered by the Baermann s method. Comparison between means of trapped larvae in the presence of the fungi isolates show M. thaumasium was more effective in the control of H. contortus infective larvae (P<0.05). The numbers of larvae recovered from groups 1, 2 and 3 were 2,730, 690 and 8,520 respectively. KEY WORDS: goat, gastrintestinal nematodes, Haemonchus contortus, biological control, fungi. * Autor para correspondência Departamento de Medicina Veterinária- Universidade Federal de Viçosa, CEP , Viçosa- MG jvictor@mail.ufv.br 37

2 INTRODUÇÃO As helmintoses gastrintestinais ocupam um lugar de destaque dentre os fatores que interferem no desenvolvimento da caprinocultura. Até o presente momento o controle destes parasitos, tem sido feito quase exclusivamente com a utilização de fármacos, que atuam sobre a fase adulta do parasita no hospedeiro. O aparecimento de resistência a estas drogas (VIEIRA & CAVALCANTE, 1997), seu impacto ecotóxico (HERD, 1995) e a presença de resíduos químicos detectados na carne e leite (BLUTHGEN & HEESCHEN, 1997) vêm restringindo o uso dos anti-helmínticos disponíveis no mercado. O controle biológico é a redução da densidade de um patógeno, através da utilização de um microorganismo sem provocar alteração no ambiente (WALLER et al., 1994). Os fungos nematófagos são organismos amplamente encontrados na natureza e possuem a habilidade de produzir armadilhas ao longo das hifas, responsáveis pelo aprisionamento e morte das larvas de nematóides (HASHIMI & CONNAN, 1989). A diferenciação das hifas para produção de armadilhas ocorre nas primeiras 24 horas e acontece em resposta ao contato do fungo com substâncias excretadas pela cutícula dos nematóides (PRAMER, 1964). Um grande número de espécies de fungos tem sido estudados como possíveis agentes no controle de nematóides parasitas de plantas e animais. O gênero Arthrobotrys tem sido amplamente pesquisado por seu comportamento predatório contra larvas de nematóides parasitos de animais domésticos (GRONVOLD et al., 1993; WALLER & LARSEN, 1996; WOLSTRUP et al., 1996). No Brasil, alguns estudos foram feitos sobre a atividade predatória de fungos do gênero Arthrobotrys e Monacrosporium sobre larvas infectantes de parasitos de bovinos (ARAUJO,1996; 1997; SANTOS et al., 1997). No entanto ainda não foram realizados estudos da aplicação de fungos no controle biológico de nematóides gastrintestinais de pequenos ruminantes. O objetivo deste trabalho foi comparar a capacidade predatória in vitro, dos fungos das espécies Arthrobotrys conoides e Monacrosporium thaumasium sobre larvas infectantes de Haemonchus contortus, parasito de caprinos. MATERIAL E MÉTODOS Cultivo de larvas infectantes de Haemonchus contortus Larvas infectantes de H. contortus, foram obtidas através de coproculturas feitas com fezes de caprinos que desenvolviam infecção pura para este parasito. As larvas infectantes foram recuperadas pelo método de ROBERTS & O SULLIVAN (1950), identificadas, tomandose três alíquotas de 50 µl do volume total obtido, tirando-se uma média para estimativa do número total de larvas. Cultivo de larvas de vida livre Larvas de Panagrellus redivivus foram cultivadas em placas de Petri com meio de aveia, em seguida foram recuperadas do meio pelo método de Baermann e armazenadas em tubos de hemólise contendo solução de água destilada. Isolamento e cultivo de material fúngico Isolados dos fungos das espécies A. conoides e M. thaumasium foram mantidos em tubos de ensaio contendo ágar batata dextrose (DIFCO) a 2% em temperatura de 4 º C e na ausência de luz. De cada espécie fúngica, foram isolados 10 discos de cultura de aproximadamente 5 mm que foram transferidos para placas de Petri de 15 cm de diâmetro, contendo ágar fezes (ARAUJO, 1996). A estas placas foram adicionadas soluções de 1mL contendo larvas de Panagrellus redivivus, duas vezes intervalados de dois dias. Quando as placas se tornaram completamente preenchidas pelos isolados fúngicos, 10 ml de água destilada foram adicionados a cada placa de Petri onde os conídios e micélios foram retirados com o auxílio de um pincel de cerdas macias. A quantificação foi feita tomando-se três alíquotas de 10 µl, tirando-se a média e extrapolando para o volume 38

3 total. Os fragmentos de isolados fúngicos foram armazenados em pequenos frascos, a 4 o C e no escuro. Teste de atividade predatória dos isolados fúngicos Todo o experimento foi realizado em placas de Petri de 8,5 cm de diâmetro, contendo 10 ml de ágar água a 2 %, previamente marcadas em sua superfície com vários campos de 4 mm de diâmetro, com o auxílio de um perfurador de ágar. As placas foram mantidas a temperatura de 25 º C. Foram formados três grupos, com três repetições: Grupo 1, constituído de conídios da espécie A. conoides e larvas infectantes (L3) de H. contortus. Grupo 2, constituído de conídios da espécie M. thaumasium e L3 de H. contortus e grupo 3 com L3 de H. contortus. Diariamente, por um período de 20 dias, as placas dos grupos 1 e 2 foram observadas ao microscópio óptico, escolhendo-se aleatoriamente 10 campos sendo anotados os números de larvas aprisionadas pelos fungos. As placas do grupo 3 serviram para confirmar a habilidade das larvas de se movimentarem e sobreviverem no meio e foram observadas também por um período de 20 dias, como descrito anteriormente. O número de L3 capturadas observados nos grupos 1 e 2, foram transformados em médias por campos de 4mm de diâmetro, e posteriormente, tomada a média das três repetições dos grupos. Ao final dos 20 dias, as L3 dos grupos 1, 2 e 3 foram recuperadas pelo método de Baermann, em tubos de hemólise. Foram contadas com auxílio de microscópio óptico, tirando-se a média de três repetições de alíquotas de 50 µl e extrapolando-se para o volume total. Análise estatística A comparação da evolução das médias de larvas predadas por campo de 4mm, nos 20 dias foi feita pela análise de Spearman (P<0,05). RESULTADOS Após o período de 20 dias, as placas do grupo 2 possuíam toda a superfície do ágar recoberta por micélios, produzindo um maior número de hifas e com armadilhas dispostas em intervalos regulares. O crescimento fúngico das placas do grupo 1 foi menos abundante. As larvas foram visualizadas aderidas as estruturas em forma de anéis e em alguns casos se moviam Número de larvas predadas A. conoides M. thaumasium Dias Figura 1. Média de larvas infectantes de Haemonchus contortus predadas por campos de 4mm por dia, na presença dos fungos Monacrosporium thaumasium e Arthrobotrys conoides. 39

4 vigorosamente na tentativa de escapar das armadilhas, porém sem sucesso. A comparação entre as médias de larvas predadas por campo de 4mm por dia, na presença dos dois isolados fúngicos, demonstrou que M. thaumasium foi mais eficaz na predação das larvas de H. contortus (P<0,05). Os resultados da recuperação de larvas dos grupos 1, 2 e 3 foram respectivamente de 2.730, 690 e DISCUSSÃO A atividade predatória in vitro de diferentes fungos nematófagos sobre larvas de nematóides parasitos de ruminantes tem sido mencionada em alguns trabalhos (GRONVOLD et al., 1985; MENDONZA et al., 1994; NANSEN et al., 1995). Este é o primeiro trabalho sobre a interação dos fungos A. conoides e M. thaumasium sobre larvas infectantes de H. contortus. Os resultados mostraram haver uma maior atividade in vitro de M. thaumasium, sobre larvas de H. contortus. Há pouca informação sobre a atividade de fungos nematófagos sobre larvas deste parasito. Outras espécies do gênero Arthrobotrys têm sido reportadas como fortes predadores de H. contortus (MENDONZA et al., 1992), porém demonstraram fraca habilidade predatória sobre os parasitos quando adicionado a cultura de fezes. Variações no potencial de captura destes fungos também têm sido estudados (GALPER et al., 1995). A cutícula dos nematóides está envolvida em inúmeros processos biológicos, incluindo a interação com fungos nematófagos (SPIEGEL & McCLURE, 1995). A interação entre os nematóides e os fungos nematófagos envolve complexos processos que envolvem polímeros de superfície, atividade enzimática e um complexo lectinacarboidrato entre as armadilhas fúngicas e os nematóides (DIJKSTERHUIS et al., 1994). CONCLUSÃO O teste de atividade predatória, demonstrou que os isolados do fungo M. thaumasium, foram mais eficazes, nos testes in vitro, em predar larvas infectantes de H. contortus. Este fungo porém deve ainda ser testado quanto a sua capacidade de passagem no trato gastrointestinal de pequenos ruminantes. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem a Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa (FUNCAP) pelo suporte financeiro destinado a este projeto. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ARAÚJO, J. V Interação entre as larvas infectantes de Cooperia punctata e os fungos predadores do gênero Arthrobotrys, caracterização dos isolados de Arthrobotrys e seu uso no controle biológico de nematóides gastrintestinais de bovinos. Belo Horizonte, Universidade Federal de Minas Gerais p. (Tese de Doutorado). ARAÚJO, J. V Captura de larvas infectantes de Cooperia punctata pelo fungo predador de nematóides Arthrobotrys. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 6: 211 BLUTHGEN, A. & HEESCHEN, W. H Parasiticides. Int. Dairy Feed 97: DIJKSTERHUIS, J., VEENHUIS, M., HARDER, W. & NORBRING-HERTZ, B Nematophagous fungi: Physiological aspects and structure-functions relationship. Adv. Microbial Physiol., 36: GALPER, S., EDEN, M. L., STIRLING, G. R. & SMITH, J. L Simple screening methods for asseing the predacious activity of nematodetrapping fungi. Nematol., 41: GRONVOLD, J., KORSHOLM, H., WOLSTRUP, J., NANSEN, P. & HENRIKSEN, A. S Laboratory experiments to evaluate the ability of Arthrobotrys oligospora to destroy infective larvae of Cooperia species, and to investigate the effect of physical factors on the growth of the fungus. J. Helm., 59: GRONVOLD, J., WOLSTRUP, J., NANSEN, P., HENRIKSEN, S.A., LARSEN, M. & BRESCIANI, J Biological control of nematodes parasites in cattle with nematode trapping fungi: a survey of danish studies. Vet. Parasitol., 48: HASHMI, H. A. & COONAN, R.M Biological control of ruminants trichostrongylids by Arthrobotrys oligospora, predacious fungus. Parasitol. Today, 5:

5 HERD, R Edoctocidal drugs: Ecological risks and counter-measures. Int. J. Parasitol., 25: MENDONZA, de G. P., ZAVALETA, M. E., HERRERA, R. D., QUIROZ, R. H. & PERDOMO, R. F Interaction between the nematode destroying fungus Arthrobotrys robusta and Haemonchus contortus infective larvae in vitro. Vet. Parasitol., 41: MENDONZA, de G. P. & VASQUEZ, P. V. M Reduction of Haemonchus contortus infective larvae by three nematophagous fungi in sheep fecal cultures. Vet. Parasitol., 55: NANSEN, P., LARSEN, M., GRONVOLD, J., WOLSTRUP, J., ZORN, A. & HENRIKSEN, S Prevention of clinical trichostrongylidiosis in calves by strategic feeding with predacious fungus Duddingtonia flagrans. Parasitol. Res 81: PRAMER, D Nematode trapping fungi. Science, 144: ROBERTS, F. H. S. & O SULLIVAN, J. P Methods for egg counts and larval cultures for strongyles infesting the gastrintestinal tract of cattle. Aust. Agric. Rec., 1: SANTOS, C. P., PADILHA, T. & SAMUEL, C.A Persistência de Arthrobotrys cladodes à passagem pelo sistema digestivo de bovino. Rev. Bras. Parasitol. Vet. 6:184. SPIGEL, Y. & McCLURE, M. A The surface coat of plant parasitic nematodes: chemical composition, origin and biological role. A review. J. Nematol., 27: VIEIRA, L.S. & CAVALCANTE, A.C.R Resistência anti-helmíntica em rebanhos caprinos no Estado do Ceará. Rev. Bras. Parasitol. Vet., 6: 229. WALLER, P.J., LARSEN, M., FAEDO, M. & HENESSY, D. R The potencial of nemathofagus fungi to control the free living stages of nematodes parasites of sheep: in vitro and in vivo studies. Vet. Parasitol., 51: WALLER, P. J. & LARSEN, M Workshop sumary: biological control of nematodes parasites of livestock. Vet. Parasitol.,64: WOLSTRUP, J., NANSEN, P., GRONVOLD, J., HENRIKSEN, S.A. & LARSEN, M Towards practical biological control of parasitic nematodes in domestic animals. J. Nematol., 28: