Departamento de Biologia de Água Doce e Pesca Interior, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia INPA. 2. Bio-Manguinhos, Fundação Oswaldo Cruz.

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1 Revista Novo Enfoque: Caderno de Saúde e Meio Ambiente - ISSN: ARTIGO ORIGINAL CARACTERÍSTICAS HEMATOLÓGICAS, DE ESPÉCIMES MANTIDOS EM LABORATÓRIO, DA ESPÉCIE DE PEIXE AMAZÔNICA Astronotus ocellatus (AGASSIZ, 1831) (Perciformes, Cichlidae), INTRODUZIDA EM OUTRAS BACIAS HIDROGRÁFICAS BRASILEIRAS Hematological characteristics, of specimens kept in laboratory conditions, of an Amazonian fish species Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831) (Perciformes, Cichlidae), introduced at other Brazilian watersheds Patrícia Oliveira Maciel ¹, *, Luiz César Cavalcanti Pereira da Silva 2, Ana Paula de Castro Rodrigues³, Francie Santos de Lima 4, Renato Clapp do Rego Barros 5, Nádia Regina Pereira Almosny 5, Edison Dausacker Bidone 3, Zuleica Carmen Castilhos 4 1 Departamento de Biologia de Água Doce e Pesca Interior, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia INPA. 2 Bio-Manguinhos, Fundação Oswaldo Cruz. 3 Departamento de Geoquímica, Universidade Federal Fluminense. 4 CPAA, Centro de Tecnologia Mineral. 5 Faculdade de Veterinária, Universidade Federal Fluminense. * patyguana@gmail.com Data da submissão: 10/11/2015 Data de aceite do artigo: 15/02/2016 Resumo A espécie de ciclídeo Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831) (Perciformes, Cichlidae), conhecido popularmente como apaiari, ocorre naturalmente no Brasil nas bacias hidrográficas da região Amazônica, mas por ser utilizada para fins comerciais (espécie ornamental / consumo de carne), foi uma das primeiras a ser introduzida nas regiões nordeste e sudeste. Além da sua importância econômica, os apaiaris são ecologicamente importantes devido a sua posição trófica. Entretanto pouco se sabe sobre a sua fisiologia, em especial sobre a sua hematologia. Na criação animal e também para espécimes de vida livre, a hematologia é uma poderosa ferramenta para inferir a saúde dos espécimes, auxiliando na gestão de recursos naturais. O objetivo deste trabalho foi descrever a morfologia de células sanguíneas de Astronotus ocellatus oriundos de criatório comercial e aclimatados condições laboratoriais. Foram identificados eritrócitos, três formatos de trombócitos e quatro populações de leucócitos, os granulócitos neutrófilos e eosinófilos, e os agranulócitos linfócitos e monócitos. Os neutrófilos mostraram reação positiva para a peroxidase. Estes resultados estão subsidiando estudos nos campos da toxicologia, imunidade e saúde de A. ocellatus. Palavras-chave: Cichlidae, Astronotus ocellatus, morfologia celular, citoquímica. Abstract The cichlid species Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831) (Perciformes, Cichlidae), commonly named apaiari, occurs naturally in Brazil at Amazonian Region watersheds. It has been used for commercial interests (ornamental species / fish consumption), in consequence, it was one of the first cases of introduced fish species at northeast and southeast regions. Besides its economic importance, A. ocellatus are also important ecologically due to its position in trophic chain. However, this species physiology is poorly understood, especially its hematology. In both aquaculture and wild life, hematology is a powerful tool to deduce animals health, supporting natural resources management. The aim of this work was to describe the morphology of blood cells of Astronotus ocellatus from a commercial hatchery and acclimated in laboratory conditions. Were identified erythrocytes, three forms of thrombocytes, and four populations of leucocytes: the granular leukocytes neutrophils and eosinophils, and the agranulars lymphocytes and monocytes. Neutrophils showed a positive reaction to peroxidase. These results are subsidizing studies in the fields of toxicology, immunity and health of A. ocellatus. Keywords: Cichlidae, Astronotus ocellatus, cells morphology, cytochemistry.

2 Introdução O sangue é responsável pelo transporte de substâncias em vertebrados, inclusive peixes, estando este tecido diretamente ligado à dinâmica fisiológica e às respostas imunológicas do organismo. O estudo de seus componentes celulares, especialmente o estudo dos leucócitos, pode fornecer informações importantes sobre estresse e imunidade inata de peixes [1,2,3]. A hematologia auxilia no diagnóstico da saúde de animais de vida livre, como também no prognóstico e no acompanhamento de tratamentos de inúmeras enfermidades que atingem pisciculturas [4]. Entretanto, para que a hematologia possa ser utilizada plenamente, torna-se fundamental o conhecimento dos componentes celulares e também dos valores de referência do hemograma de animais sadios, bem como dos fatores causadores de suas variações [5, 6, 7, 8, 9]. A compreensão sobre aspectos comportamentais, bioquímicos e fisiológicos de peixes frente a desafios que imitam as condições ambientais tem se ampliado graças a estudos em laboratório. Alguns estudos sobre hipóxia em peixes amazônicos e sobre efeitos do mercúrio em peixes devido a atividades de garimpo de ouro foram desenvolvidos utilizando-se a espécie de ciclídeo amazônico Astronotus ocellatus [10, 11, 7]. Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831) (Perciforme, Cichlidae) é originário de rios da bacia Amazônica. Alcançam tamanho máximo entre 25 e 30 cm de comprimento e em média 1,5 Kg. Têm preferência por águas com ph entre 6,0 a 8,0 e temperatura entre 22 e 25 o C [12]. São territorialistas e têm hábito alimentar onívoro com tendência à carnivoria. Na Amazônia, principalmente, são apreciados como alimento devido a [13,14, 15, seu sabor, firmeza da carne e poucas espinhas 16, 17]. Atualmente tem distribuição em todo o Brasil, devido à introdução da espécie em outras bacias hidrográficas. O primeiro registro no país desta introdução foi em 1938, na região Nordeste, sendo em [18] seguida introduzido na região Sudeste. A translocação de peixes amazônicos para estas regiões do Brasil foi comum nas décadas de 60 e 70, devido ao estímulo na produção de peixes, geração de benefícios econômicos e recreação [19]. Atualmente o Brasil lista a produção de 151 espécies de peixes não-nativas, sendo criadas na maioria dos casos, sem análise dos impactos ecológicos e sócio-econômicos. Dos 26 estados do Brasil, Minas Gerais é o principal local de introduções no Brasil/América do Sul com 79 espécies de peixes não-nativas, sendo 52 espécies consideradas ornamentais [20]. A ocorrência de A. ocellatus já foi observada no rio Paraíba do Sul [19, 20], no rio Doce [20], no rio São Francisco [20], no rio Mucuri [20], no rio Jequitinhonha [20], no rio Guandu [19], além de relatos de sua introdução em bacias hidrográficas dos Estados de Pernambuco, Bahia, Paraíba e Rio Grande do Norte [21]. Esta espécie também é considerada invasora na Austrália, em Porto Rico e no Havaí [21]. Em várias lagoas no Estado de Minas Gerais houve uma redução de 50% na riqueza de peixes nativos após 10 anos da introdução do tucunaré (Cichla ocellaris), do apaiari (Astronotus ocellatus) e da piranha-vermelha (Pygocentrus nattereri) [Reaser et al., 2005 apud 21]. O Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis [22] estabeleceu normas para a introdução, reintrodução e transferência de peixes, crustáceos, moluscos, e macrófitas aquáticas para fins de aquicultura, excluindo-se as espécies animais ornamentais através da Portaria nº 145/1998. Considerando o exposto, o objetivo deste trabalho foi descrever as características morfológicas das células sanguíneas da espécie Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831) (Perciformes, Cichlidae), utilizando-se como base espécimes mantidos em condições controladas em laboratório. Adicionalmente, este estudo visou gerar informações de referência para animais sadios desta espécie, que poderão ser utilizadas posteriormente em estudos ambientais ou em pisciculturas. Métodos Peixes Foram obtidos 10 espécimes juvenis de A. ocellatus (~ 4,0 cm), de um mesmo criador legalizado de peixes ornamentais, no Estado do Rio de Janeiro. Os peixes só foram medidos e pesados após o período de aclimatação de 6 meses, no Laboratório de Hidrobiologia e Pesca da Faculdade de Medicina Veterinária, Universidade Federal Fluminense (UFF), Niterói-RJ, Brasil. Este estudo faz parte de um projeto que foi submetido para avaliação do Comitê de Ética, sendo aprovado com o número de protocolo 89/2011. Os peixes foram mantidos em aquários de 30 litros individuais e independentes, com filtro biológico e aeração constante, sendo mantidos com dieta comercial contendo 40% de proteína bruta, duas vezes ao dia, ad libitum. Os aquários foram limpos semanalmente. A temperatura foi checada através de termômetro digital Boyu adesivo BT-05 (25±2 C). O ph foi medido usando kits comerciais Labcon Test ph Tropical 2

3 3 (6,2±0,2). Após o período de aclimatação, os espécimes alcançaram 16,4±1,0cm de comprimento total (14,8 17,6cm) e pesavam 76,8±10,0g (65,1 91,9g). Esta biometria foi considerada adequada para coleta de amostras sanguíneas sem comprometer a saúde e sobrevivência dos espécimes. Análises sanguíneas Não foi aplicada anestesia no momento da coleta de sangue para evitar estresse adicional e alterações hematológicas devido a este procedimento [23]. Amostras de sangue foram colhidas por punção do vaso caudal utilizando agulhas hipodérmicas (calibre 13x4,5-27Gx½ ) e anticoagulante EDTA 10%. Esfregaços sanguíneos foram confeccionados imediatamente após a coleta para evitar alterações na morfologia das células [9, 2], fixados em metanol e corados com Giemsa [24] para avaliação morfológica dos diferentes tipos celulares. Para evitar contradições na nomenclatura das células sanguíneas foram utilizados como critérios de classificação os aspectos morfológicos, como tamanho, formato e coloração do núcleo das células; a distribuição e coloração dos grânulos (quando visíveis) e a coloração e formato do citoplasma [25, 23], utilizando como base o estudo realizado por Tavares-Dias e Moraes [24]. Além disso, estudos citoquímicos pelo método da Benzidina-Peroxidase foram aplicados para auxiliar na classificação celular [26]. Os esfregaços sanguíneos foram examinados em microscopia ótica (microscópio binocular Olympus BX40) com lente de imersão (1.000x). Resultados e Discussão As células identificadas nos esfregaços sanguíneos de A. ocellatus foram eritrócitos, trombócitos, e quatro populações de leucócitos: os leucócitos granulares neutrófilos e eosinófilos, e os agranulares linfócitos e monócitos (Fig.1). Os basófilos não foram observados nos esfregaços sanguíneos dos animais examinados. A presença de basófilos tem sido descrita como rara em sangue de peixes [27, 28]. Tavares-Dias e Moraes [28] reportaram a ausência de basófilos em contagens específicas de leucócitos em A. ocellatus. Reforçando tal achado, Tavares-Dias [29] não registrou basófilos no sangue circulante desta espécie mesmo utilizando esfregaços sanguíneos corados por métodos citoquímicos específicos para basófilos. Os eritrócitos apresentaram a forma do núcleo predominantemente elíptica (Figura 1a). O núcleo com localização central apresentou-se com heterocromatina densamente basofílica. O citoplasma ocupou a maior área da célula, e apresentou coloração eosinofílica com regiões dispersas descoradas. Áreas do citoplasma com regiões vacuoladas e/ou pálidas são comuns em eritrócitos e têm sido associadas à degeneração de organelas celulares [27]. Foram observados ainda, eritrócitos com formas irregulares ou diferenciadas das descritas acima, contudo de acordo com Fijan [23], tratase de hemácias envelhecidas. Trombócitos de peixes são células completas envolvidas em funções imunológicas (fagocitose) e hemostáticas, e são produzidas principalmente no baço, rim e fígado de peixes teleósteos [28, 29]. Em A. ocellatus foram observados trombócitos com três aspectos morfológicos distintos: elíptico (Fig. 1i), fusiforme (Fig. 1h) e esférico (Fig. 1e), como havia sido descrito também para Maccullochella peelii peelii [1] e espécies de trutas [29]. Estes diferentes formatos de trombócitos têm sido relacionados ao estágio de maturação da célula, ao seu grau de ativação ou habilidades de realizar fagocitose ou agregação [27, 29, 2]. Os trombócitos fusiformes, menos abundantes nos esfregaços sanguíneos de A. ocellatus, apresentaram núcleo ligeiramente arredondado e corado com intensa basofilia, evidenciando sua heterocromatina densa, enquanto o escasso citoplasma apresentou-se ligeiramente eosinofílico. Os trombócitos elípticos apresentaram o citoplasma e núcleo acompanhando este formato, sendo o núcleo localizado centralmente e de coloração basofílica, e o citoplasma levemente eosinofílico. Os trombócitos esféricos, mais abundantes nos esfregaços de A. ocellatus, apresentaram citoplasma escasso e hialino, e núcleo com intensa basofilia. Muitas vezes os trombócitos esféricos revelaram uma ou mais inclusões basofílicas em seu citoplasma. Trombócitos são frequentemente observados em agregados celulares [1], e neste estudo, os de formato esférico foram os mais abundantes nos aglomerados (Fig. 1e). Segundo Tavares-Dias e Oliveira [29] os trombócitos esféricos são consideradas células jovens e mais ativas na formação dos coágulos sanguíneos. Em contrapartida, Campbell [27] descreveu como formas ativas em aglomerados os trombócitos fusiformes. Quanto à frequência de ocorrência no sangue circulante, Tavares-Dias e Oliveira [29], ao contrário deste estudo, relataram os trombócitos fusiformes sendo mais abundantes em esfregaços de outras espécies de peixes brasileiros e exóticos. Estes mesmos

4 autores sugeriram que A. occelatus têm tempo de coagulação lento, uma vez que apresentam número reduzido de trombócitos comparado com outros peixes. Linfócitos grandes e pequenos foram observados nos esfregaços sanguíneos de A. ocellatus. Os grandes linfócitos mostraram núcleo basofílico e citoplasma ligeiramente basofílico apresentando projeções (Figura 1a), denominadas de blebs por Ueda et al. [30]. Os pequenos linfócitos apresentaram citoplasma escasso e ligeiramente basofílico, e o núcleo com heterocromatina densa e basofilia intensa. Silva [31] afirma que um problema comum na identificação de tipos celulares sanguíneos de peixes é determinar quando pequenas células esféricas mononucleares são pequenos linfócitos ou trombócitos arredondados, o que pode gerar um conflito na avaliação da leucometria específica, sendo assim necessária uma análise criteriosa deste tipo celular. Os monócitos (Fig.1a), células com baixa relação núcleo:citoplasma, apresentaram formato predominantemente esférico, porém de contorno irregular. O núcleo revelou variados formatos e corou-se em leve basofilia. No citoplasma abundante e basofílico encontraram-se, eventualmente, vacúolos de diferentes tamanhos. A vacuolização citoplasmática geralmente ocorre em células que apresentam atividade fagocítica, como os monócitos [9]. As amostras de A. ocellatus revelaram dois tipos de granulócitos, que devido a suas características tintoriais, foram chamados de neutrófilos e eosinófilos. Apenas estes granulócitos foram observados em estudos com A. ocellatus [28] e com Oreochromis niloticus, espécie da mesma família [32]. Células granulocíticas especiais (CGE) e heterófilos não foram observadas. Os neutrófilos estão envolvidos na resposta inflamatória aguda em teleósteos, e depois da vasodilatação, os neutrófilos marginais entram na circulação periférica por diapedese [33, 3]. Neutrófilos são um importante componente da defesa contra infecções bacterianas, virais e fúngicas em peixes [33, 28]. Os neutrófilos recebem esta denominação, pois têm o citoplasma com aparência granular [3], mas os grânulos não são corados pelos corantes de rotina como o Giemsa, sendo então caracterizados como grânulos neutrofílicos. O neutrófilo (Fig. 1a, 1b e 1d), maior leucócito de A. ocellatus, apresentou núcleo arredondado localizado na periferia da célula, heterocromatina frouxa que resultou em coloração levemente basofílica. Alguns granulócitos, possivelmente neutrófilos, mostraram um núcleo mais basofílico e com formato levemente alongado. Sugere-se que esta variação morfológica esteja relacionada à ativação destes neutrófilos com início de segmentação nuclear. A presença de neutrófilos com núcleos multilobados na circulação sanguínea de Thymallus arcticus, Oncorhynchus clarki lewisi, Chasmistes liorus foi relatada recentemente [3]. Os eosinófilos (Fig. 1c) de A. ocellatus eram menores quando comparado com os neutrófilos, e apresentaram-se arredondados, com núcleo excêntrico e com leve basofilia. Na outra extremidade, o citoplasma apresentou-se repleto de grânulos acidófilos. Os grânulos eram pequenos e de formato principalmente arredondado. Embora, eosinófilos geralmente sejam direcionados para infecções parasitárias e na inflamação, quando peixes estão com escassez de eosinófilos, os neutrófilos podem responder às infecções por helmintos [33]. Os estudos citoquímicos em A. ocellatus (tab. 1) demonstraram a presença de grânulos peroxidasepositivos (POX positivos) no citoplasma dos neutrófilos, que adquiriram coloração amarronzada após a realização da técnica. Isto confirma a presença de mieloperoxidase nos grânulos citoplasmáticos dos neutrófilos, indicando a capacidade desta célula em realizar degranulação e bust oxidativo [3]. Este padrão de coloração compara-se com aquele visto em neutrófilos de outras espécies, como C. liorus, T. arcticus e O. clarki lewisi [3]. Nas últimas espécies citadas a coloração dos neutrófilos após a técnica citoquímica apresentou-se mais forte do que em A. ocellatus. Os eosinófilos e as demais células sanguíneas de A. ocellatus foram POX-negativas. Estes resultados corroboram com os observados por Tavares-Dias e Moraes [28] and Tavares-Dias [28], e indicam a participação de neutrófilos de A. ocellatus no processo de digestão intracelular, modulação da atividade fagocítica e microbicida, envolvendo reações de oxidação que estão relacionadas à enzima peroxidase [34, 2, 32]. A ausência de peroxidase em algumas espécies de peixes parece estar compensada pelo desenvolvimento de outros componentes microbicidas, como as proteínas catiônicas [34]. Em Maccullochella peelii os leucócitos descritos com funções fagocíticas são os heterofilos que apresentaram grânulos POX-positivos [2]. 4

5 5 Tabela 1. Citoquímica de células sanguíneas de Astronotus ocellatus. Leucócitos Neutrófilos Eosinófilos Linfócitos Monócitos Trombócitos Eritrócitos Peroxidase Legenda: +: fortemente corado; -: não corado. Figura 1: Células sanguíneas de Astronotus ocellatus. a b d c e f g h i Legenda: (a) Eritrócito (Er), Monócito (Mn), Neutrófilo (Nt) e Linfócito com projeções citoplasmáticas (Lf); (b) Neutrófilo; (c) Eosinófilo; (d) Neutrófilo com reação citoquímica de peroxidase positiva; (e) Aglomerado de trombócitos esféricos; (f) Linfócitos; (g) Trombócito esférico com inclusão basofílica no citoplasma; (h) Trombócito fusiforme e (i) Trombócito elíptico. Coloração: Giemsa. Barra = 6,5µm.

6 Conclusão A presença de duas populações de granulócitos (neutrófilos e eosinófilos) em A. ocellatus, além de linfócitos e monócitos, indica que esta espécie tem um sistema imune formado [2]. As diferenças presentes no sangue das diversas espécies de peixe orientam a necessidade de caracterizar as células sanguíneas e suas funções em cada espécie, separadamente, reforçando a importância do presente relato. Sugere-se maior investigação incluindo um número maior de indivíduos, bem como outros tipos de coloração para aprofundamento da citoquímica e, consequentemente, uma melhor compreensão das células sanguíneas desta espécie. Agradecimentos Os autores agradecem o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela bolsa de iniciação científica concedida à primeira autora. Referências leukocytes of goldfish sample (Carassius auratus auratus Linnaeus, 1758) with bacterial hemorrhagic septicemia: case report. Revista Brasileira de Ciência Veterinária. 2010; (17)1. 7. Rodrigues APC. Biomarcadores para avaliação de risco ecológico de mercúrio em peixes: sistema costeiro do estado do Rio de Janeiro e bioensaios. (Tese de Doutorado). Universidade Federal Fluminense, Niterói, 2010, 216f. 8. Damatta RA, Ribeiro MLS, Carvalho TMU, Nascimento JLM. Caracterização morfológica e funcional de leucócitos de peixes. In: Tavares-Dias M. Manejo e Sanidade de Peixes em Cultivo. Recurso eletrônico. Macapá, Embrapa Amapá. 2009; Satake F, Pádua SB, Ishikawa MM. Distúrbios morfológicos em células sanguíneas de peixes em cultivo: uma ferramenta prognóstica. In: TAVARES- DIAS, M. Manejo e Sanidade de Peixes em Cultivo. Recurso eletrônico. Macapá, Embrapa Amapá. 2009; Almeida-Val VMF, Val AL, Duncan WP, Souza FCA, Paula-Silva MN, Land S. Scaling effects on hypoxia tolerance in the Amazon fish Astronotus ocellatus (Perciformes: Cichlidae): contribution of tissue enzyme levels. Comparative Biochemistry and Physiology. 2000; Part B; (125); Shigdar S, Cook D, Jones P, Harford A, Ward AC. Blood cells of Murray cod Maccullochella peelii peelii (Mitchell). Journal of Fish Biology. 2007; Shigdar S, Harford A, Ward AC. Cytochemical characterisation of the leucocytes and thrombocytes from Murray cod (Maccullochella peelii peelii, Mitchell). Fish & Shellfish Immunology. 2009; Palić D, Beck LS, Palić J, Andreasen CB. Use of rapid cytochemical staining to characterize fish blood granulocytes in species of special concern and determine potential for function testing. Fish & Shellfish Immunology. 2011; Drumond GVF, Caixeiro APA, Tavares-Dias M, Marcon JL, Affonso EG. Características bioquímicas e hematológicas do pirarucu Arapaima gigas Schinz, 1822 (Arapaimidae) de cultivo semi-intensivo na Amazônia. Acta Amazonica. 2010; (40)3; 5. Almosny NRP, Santos L. Laboratory support in wild animal medicine. In: Fowler M, Cubas Z. Biology, medicine, and surgery of South American wild animals, Iowa, Iowa State University Press Pádua SB, Pilarski F, Neto JD, Ishikawa MM, Satake F, Tavares-Dias M. Morphologic disorders in 11. Almeida-Val VMF. et al. Metabolic and physiological adjustments to low oxygen and high temperature in fishes of the amazon. In: Val AL, Almeida-Val VMF, Randall J. The Physiology of Tropical Fishes, Academic Press, Elsevier. 2006; Beerli EL, Logato PVR. Peixes de importância para a piscicultura brasileira. Boletim técnico. Núcleo de Estudos em Aquacultura, Universidade Federal de Lavras, Disponível em: %20de%20importancia.pdf Acesso em junho Val AL, Honczaryk A. Criando Peixes na Amazônia. Manaus, Amazonas: Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Santos G, Ferreira E, Zuanon J. Peixes Comerciais da Amazônia. Manaus: Ibama/AM, ProVárzea, Silva JWB. Biologia e cultivo do apaiari (Astronotus ocellatus Cuvier, 1829) Swainson, In: Baldisserotto B, Gomes LC. Espécies nativas para a piscicultura no Brasil. Santa Maria: 2. Ed., Editora da UFSM. 2010; Froeser R. Astronotus ocellatus (Agassiz, 1831) - Oscar. Fishbase, Disponível em <

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