RELATÓRIO DE ACTIVIDADES 2015

Transcrição

1 RELATÓRIO DE ACTIVIDADES 2015 Nome: Joana Filipa de Paiva dos Santos Madureira Documento de identificação: Cartão do Cidadão Nº Morada: Estrada dos Álamos, nº41, 1ºdto, Almada Bolsa: Bolsa de Investigação (Mestre) Início da bolsa: 1 de Junho de 2015 Fim da bolsa: 30 de Novembro de 2015 Projeto / Centro de custo: RECI/AAG-TEC/0400/2012/ARIAS (RD0261) / ARIAS (RECI) CR9310 Unidade: Campus Tecnológico e Nuclear Orientador científico: Sandra Cabo Verde O presente trabalho está inserido no âmbito do projecto RECI/AAG-TEC/0400/2012/ARIAS Aplicações da Radiação Ionizante para um Ambiente Sustentável (ARIAS).

2 OBJECTIVOS PROPOSTOS: o Continuar o estudo de degradação de ácidos fenólicos (antioxidantes) presentes nas águas de cozedura de uma Indústria de Cortiça, através do tratamento com radiação gama. Adicionalmente, identificar os seus produtos radiolíticos. o Caracterizar a amostra real de água de cozedura de cortiça, particularmente a sua actividade antioxidante, antes e após irradiação. o Identificar os compostos presentes nas águas de cozedura de cortiça e os seus produtos radiolíticos. o Avaliar a toxicidade das águas de cozedura de cortiça através de ensaios de ecotoxicidade e citotoxicidade, antes e após irradiação. o Avaliar a viabilidade técnica destas metodologias para valorização das águas de cozedura da Indústria da Cortiça. METODOLOGIAS: 1. Continuação dos estudos de degradação de compostos fenólicos, utilizando soluções-padrão de ácido gálico, ácido protocatecuico, ácido siríngico e ácido vanílico (isolados e em mistura). Estes foram identificados em estudos elaborados pelo grupo como os principais compostos fenólicos presentes nas águas de cozedura da cortiça. Estudar e identificar os produtos radiolíticos resultantes do tratamento com radiação gama por Cromatografia Líquido de Alta Eficiência (HPLC) e Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas (LC-ESI-MS, LC-ESI-MS/MS). 2. Estudos analíticos de caracterização e identificação dos compostos fenólicos presentes em amostras de águas de cozedura de cortiça, antes e após irradiação gama, utilizando HPLC e LC- MS. Para este estudo, foram utilizados métodos de eluição optimizados.

3 3. Caracterização do potencial antioxidante da amostra de água de cozedura de cortiça, recorrendo a ensaios com mecanismos de acção diferentes: Sequestro de radicais livres (DPPH), Poder redutor e Inibição do branqueamento do β-caroteno. 4. Ensaios de ecotoxicidade e citotoxicidade das águas de cozedura de cortiça, antes e após irradiação utilizando dois métodos: inibição do crescimento bacteriano e viabilidade de linhas celulares in vitro. As irradiações foram realizadas na fonte experimental de Cobalto-60, Precisa 22, localizada no Centro de Ciências e Tecnologias Nucleares do IST, a um débito de dose de 1.6 kgy h -1. Para a degradação dos compostos fenólicos e identificação dos seus produtos radiolíticos foram usadas doses entre 10 e 50 kgy. Para a caracterização físico-química das amostras de água de cozedura de cortiça e ensaios de toxicidade foram usadas doses entre 20 e 100 kgy. A identificação dos compostos presentes nas águas de cozedura de cortiça e seus produtos radiolíticos, bem como a avaliação do seu poder antioxidante, foi realizada usando doses entre 10 e 50 kgy. RESULTADOS: Na continuação do trabalho desenvolvido e para se confirmar e validar os resultados obtidos em ensaios anteriores, foi efectuada uma nova caracterização físico-química das águas de cozedura de cortiça. Determinou-se a Carência Química de Oxigénio (CQO) que mede a quantidade de matéria orgânica presente na amostra, a Carência Bioquímica de Oxigénio (CBO) que mede a quantidade de oxigénio dissolvido consumida durante a decomposição aeróbia das substâncias presentes na amostra, a quantidade de Sólidos Suspensos Totais (SST) e o conteúdo em compostos fenólicos (pelo método de Folin-Ciocalteau). Nas Figuras 1, 2, 3 e 4 estão presentes os resultados obtidos para estes parâmetros antes e após exposição a várias doses de radiação gama.

4 CBO (mgo 2 /L) CQO (mgo 2 /L) 4000, , , ,00 0,00 Amostras de água de cozedura de cortiça 0 kgy 20 kgy 50 kgy 100 kgy FIGURA 1 - Carência Química de Oxigénio das amostras de água de cozedura de cortiça antes e após o tratamento a várias doses de radiação gama. 500,00 400,00 300,00 200,00 100,00 0,00 Amostras de água de cozedura de cortiça 0 kgy 20 kgy 50 kgy 100 kgy FIGURA 2 - Carência Bioquímica de Oxigénio das amostras de água de cozedura de cortiça antes e após o tratamento a várias doses de radiação gama.

5 Fenólicos Totais (mg EAG / L) Sólidos Suspensos Totais (mg/l) 200,00 160,00 120,00 80,00 40,00 0,00 Amostras de água de cozedura de cortiça 0 kgy 20 kgy 50 kgy 100 kgy FIGURA 3 Solidos Suspensos Totais das amostras de água de cozedura de cortiça antes e após o tratamento a várias doses de radiação gama. 1000,00 800,00 600,00 400,00 200,00 0,00 Amostras de água de cozedura de cortiça 0 kgy 20 kgy 50 kgy 100 kgy FIGURA 4 - Conteúdo em compostos fenólicos das amostras de água de cozedura de cortiça antes e após o tratamento a várias doses de radiação gama.

6 Pelos resultados obtidos, é possível concluir que a quantidade de matéria orgânica oxidável na água de cozedura da cortiça aumenta aproximadamente 18% após exposição a uma dose de 20 kgy (Figura 1). Este facto pode dever-se à degradação das moléculas maiores em outras mais pequenas e que contribuem para este aumento. No entanto, para doses mais elevadas, este aumento não é tão acentuado. Por outro lado, é visível uma diminuição significativa dos valores de CBO, o que sugere uma diminuição da matéria orgânica presente na amostra de cerca de 85% a 50 kgy (Figura 2). Na Figura 3 pode-se observar uma diminuição de cerca de 22% na quantidade de sólidos suspensos na amostra irradiada a 50 kgy quando comparada com a amostra não irradiada. Este resultado corrobora os obtidos anteriormente, indicando que a radiação gama provoca um aumento da quantidade de espécies químicas que são solúveis em água (aumenta o CQO). Na Figura 4 estão representados os resultados obtidos para o conteúdo em fenólicos totais. Como se pode observar, a radiação gama potencia o aumento da concentração destes compostos nas amostras, o que se pode dever à degradação de moléculas maiores em outras mais pequenas. Esta tendência nos parâmetros físico-químicos dos efluentes foi observada igualmente em trabalhos anteriores do grupo para amostras de outras indústrias, nomeadamente suiniculturas e indústrias de lacticínios, bem como em estudos realizados pela bolseira com o mesmo tipo de amostras descrito aqui. 1. Estudos de degradação de compostos fenólicos e identificação dos seus produtos radiolíticos No seguimento dos resultados obtidos anteriormente durante o período da bolsa, nomeadamente na identificação dos ácidos fenólicos presentes nas águas de cozedura de cortiça, tornou-se necessário perceber quais são os produtos radiolíticos através do estudo dos compostos padrão. Além da identificação pretendia-se caracterizar toxicologicamente os produtos de degradação

7 destes compostos fenólicos. A degradação destes compostos padrão foi analisada por Cromatografia Líquido de Alta Eficiência (HPLC). Os estudos de degradação iniciais foram realizados com soluções aquosas dos compostos fenólicos isolados e em mistura. As Figuras 5 e 6 apresentam a variação da concentração dos compostos fenólicos estudados, isolados e em mistura, com a irradiação a doses incrementais de radiação gama. 1,40 [Ác. Fenólico]/[Ác. Fenólico] 0 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0, Dose (kgy) ácido gálico ácido protocatecuico ácido vanílico ácido siríngico FIGURA 5 - Variação da concentração dos compostos fenólicos estudados, isolados, com o tratamento por radiação gama.

8 [Ác. Fenólico]/[Ác. Fenólico] 0 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0, Dose (kgy) ácido gálico ácido protocatecuico ácido vanílico ácido siríngico FIGURA 6 Variação da concentração dos compostos fenólicos numa mistura quaternária, com o tratamento por radiação gama. Os resultados obtidos não indicaram uma tendência na variação da concentração dos ácidos fenólicos estudados com a dose de radiação gama. Se por um lado é evidente que a degradação é muito maior para as soluções dos compostos isolados (aproximadamente 100%), por outro, quando os compostos se encontram em mistura, a decomposição destes não é tão elevada e nunca é completa. No caso do ácido protocatecuico não existe variação da concentração entre a amostra não irradiada e irradiada a 50 kgy, quando em mistura, sugerindo que os outros compostos fenólicos se degradam nele. Tendo em conta estes resultados, a próxima fase seria estudar e identificar quais são os produtos radiolíticos dos compostos padrão em estudo. Para tal, foram realizados estudos por Cromatografia Líquida acoplada à Espectrometria de Massas (LC-ESI-MS, LC-ESI-MS/MS), com amostras não irradiadas e irradiadas a 20 e 50 kgy. Os compostos foram identificados por comparação com os

9 tempos de retenção, bandas de UV-Vis e espectro de massas com os obtidos pelos compostos padrão ou por comparação com resultados descritos na literatura. A Figura 7 esquematiza alguns dos produtos formados pela degradação de cada um dos compostos estudados, ácido protocatecuico, ácido vanílico e ácido siríngico.

10 1 2 3 O O O O CH 3 C H 3 O O CH 3 HO HO O 4 HO O 5 6 O HO 4 O 1 HO O 5 HO O 4 O 1 HO O O CH Ácido Protocatecuico (m/z 153) 2 Ácido Vanílico (m/z 167) 3 Ácido Siríngico (m/z 197) 4 Ácido Gálico (m/z 169) 5 Ácido 2,4,6-tri-hidroxibenzóico (m/z 169) 6 Estrutura proposta (m/z 143) 7 Estrutura proposta (m/z 183) FIGURA 7 Diagrama esquemático dos produtos formados pela degradação de cada ácido fenólico.

11 Os resultados obtidos parecem demonstrar que os produtos de degradação poderão ser também ácidos fenólicos, uma vez que se observa a perda de 44 u (CO2) dos iões [M-H] - quando fragmentados. O ácido gálico e ácido protocatecuico são identificados como produtos do ácido vanílico e ácido siríngico, e o ácido gálico como produto do ácido protocatecuico. O composto 5 foi identificado como ácido 2,4,6-tri-hidroxibenzóico uma vez que a sua fragmentação (m/z 151, 125 e 107) é semelhante à apresentada por outros autores. As estruturas dos compostos 6 e 7 foram propostas baseadas no ião molecular e na sua fragmentação. Como exemplo, na Figura 8 é apresentado o espectro de massa relativo ao composto 5 apresentado na Figura 7, com as respectivas fragmentações u - 44 u FIGURA 8 Espectro de massa do composto 5 apresentado na Figura 7, com as suas fragmentações.

12 Como se pode observar, o espectro mostra que o ião m/z = 169 quebra, perdendo H2O (18 u) e CO2 (44 u). O mesmo tipo de raciocínio foi utilizado para tentar propor as estruturas 6 e 7 que são apresentadas na Figura Caracterização e identificação dos compostos fenólicos presentes em amostra de águas de cozedura de cortiça Uma vez estudada a degradação por radiação gama dos compostos fenólicos mais abundantes nas águas de cozedura de cortiça, o objectivo seguinte é identificar os produtos de degradação dos compostos fenólicos nas amostras de água de cozedura de cortiça, de forma a verificar se os resultados obtidos para as soluções padrão são replicados para as amostras reais. A identificação dos compostos presentes na amostra real foi realizada recorrendo a técnica de LC-MS e LC-MS/MS. A Figura 9 mostra o cromatograma de uma amostra de água de cozedura da cortiça, monitorizada a um comprimento de onda de 280 nm. Os compostos foram identificados por comparação com os tempos de retenção, bandas de UV-Vis e espectro de massas com os obtidos pelos compostos padrão ou por comparação com resultados descritos na literatura.

13 1- Ácido Quínico 2- Ácido Gálico 3- Ácido Protocatecuico 4- Ácido p-hidroxibenzóico 5- Desconhecido 6- Ácido Elágico FIGURA 9 Cromatograma da amostra de água de cozedura de cortiça, monitorizado a 280 nm. É possível concluir que os compostos identificados são compostos fenólicos. Estes compostos foram também identificados em outros estudos semelhantes e com a mesma amostra. Para finalizar a identificação dos produtos de degradação dos compostos é necessário analisar e identificar os produtos radiolíticos formados a diferentes doses de radiação gama. 3. Potencial antioxidante das amostras de água de cozedura de cortiça Para avaliar o efeito da radiação gama na actividade antioxidante das amostras de água de cozedura de cortiça, foram utilizados métodos com mecanismos de acção diferentes: Sequestro de radicais livres (DPPH), Poder redutor e Inibição do branqueamento do β-caroteno.

14 Na Tabela 1 estão representados os resultados obtidos para a actividade antioxidante, expressos em EC50 e calculados a partir dos gráficos de percentagens de actividade antioxidante (quanto menor o valor de EC50 maior é a actividade antioxidante). TABELA 1 Actividade antioxidante das amostras de água de cozedura de cortiça, não irradiadas e irradiadas a diferentes doses de radiação gama. Amostras 0 kgy 10 kgy 20 kgy 50 kgy Actividade antioxidante (EC50, µg/ml) Sequestro de radicais livres (DPPH) 184 ± 2 a 181 ± 3 a 168 ± 4 b 133 ± 3 c Poder Redutor 145 ± 1 a 142 ± 1 a 139 ± 1 b 119 ± 2 c Inibição do branqueamento do β-caroteno 130 ± 9 b 200 ± 10 a 129 ± 9 c 93 ± 5 d Para cada linha, letras diferentes correspondem a diferenças significativas entre espécies (p<0.05). Como se pode observar na Tabela 1, as amostras irradiadas tendem a ter maior actividade antioxidante do que as não irradiadas, uma vez que o EC50 diminui. O tratamento com radiação gama a uma dose de 50 kgy aumenta significativamente a actividade pelo sequestro de radicais livres e pela inibição do β-caroteno em cerca de 28% e o poder redutor em cerca de 18%. Estes resultados podem estar relacionados com a quantidade de espécies radicalares geradas durante a irradiação, nomeadamente radicais hidroxilo, que levam a um aumento do número de compostos antioxidantes. O ataque do radical hidroxilo às moléculas maiores de compostos fenólicos (por exemplo, taninos e outros compostos fenólicos mais complexos) pode não ser suficiente para

15 quebrar o anel aromático. No entanto, a quebra destes compostos leva ao aumento da concentração de moléculas mais pequenas que podem ter elevada actividade antioxidante. Por outro lado, o aumento na inibição da peroxidação lipídica pode estar associada com o conteúdo em tocoferóis, que são fortes antioxidantes lipofílicos e podem ser produtos radiolíticos das amostras de água de cozedura de cortiça. Estes resultados estão de acordo com outros descritos na literatura, publicados anteriormente pela bolseira. 4. Ensaios de toxicidade das amostras de água de cozedura de cortiça Após caracterização dos produtos de degradação radiolítica das águas de cozedura da cortiça, o objectivo é estudar o efeito da radiação gama na toxicidade destes efluentes, ou seja verificar se o produtos de degradação são mais ou menos tóxicos do que os seus originários. Este parâmetro foi avaliado pelo método de inibição de crescimento da bactéria Pseudomonas fluorescens em microplaca, um microrganismo que persiste no ambiente, incluindo solos e plantas. Para os ensaios de toxicidade as amostras de água de cozedura da cortiça foram irradiadas às doses de 20, 50 e 100 kgy. A Figura 10 exemplifica uma microplaca de 96 poços, onde se realizam os ensaios de toxicidade para várias concentrações de amostra de água de cozedura de cortiça (100%, 50%, 10% e 1%).

16 FIGURA 10 Microplaca de 96 poços onde é realizado o ensaio de toxicidade. Os resultados obtidos para o microrganismo em estudo estão apresentados na Figura 11, para o caso da amostra real de água de cozedura de cortiça (concentração 100%). FIGURA 11 Inibição do crescimento bacteriano nas amostras de água de cozedura de cortiça.

17 Os resultados obtidos sugerem que a água de cozedura de cortiça é ligeiramente tóxica para a bactéria Pseudomonas fluorescens. No entanto, o tratamento por radiação gama (a doses elevadas 50 e 100 kgy) torna as amostras mais tóxicas para o microrganismo em estudo. Isto sugere que os produtos radiolíticos dos compostos presentes nas amostras são mais tóxicos do que os compostos originários. Paralelamente, foi efectuado um estudo de citotoxicidade das mesmas amostras estudadas, para as mesmas doses de irradiação. Foram utilizadas duas linhas celulares, uma linha humana (A549) e outra de rato (Raw264.7), de modo a comparar o efeito citotóxico das amostras em diferentes sistemas celulares. A Figura 12 mostra o efeito da radiação gama na citotoxicidade das amostras de água de cozedura de cortiça em células. FIGURA 12 Inibição do crescimento celular nas amostras de água de cozedura de cortiça.

18 Como se pode observar, as amostras de água de cozedura de cortiça são tóxicas para as células eucarióticas utilizadas, uma vez que a sua viabilidade celular diminui (19% para Raw264.7 e 50% para A549). No entanto, nas condições estudadas, as células humanas são mais sensíveis do que as células de rato. A radiação gama parece induzir a toxicidade das amostras, uma vez que a doses mais altas (50 e 100 kgy) a inibição do crescimento celular atinge os 100%, o que significa que as células não sobrevivem. Assim, parece confirmar-se a hipótese de que os produtos radiolíticos serão mais tóxicos do que os compostos presentes na amostra, embora este facto tenha de ser confirmado com trabalho futuro.

19 CONCLUSÃO: Com o trabalho realizado durante o período da bolsa, foi possível identificar os compostos presentes nas amostras de água de cozedura de cortiça, uma das principais indústrias representativas em Portugal. Os principais compostos presentes nestas amostras são: ácido gálico, ácido protocatecuico, ácido vanílico, ácido siríngico, ácido elágico e ácido quínico, anteriormente identificados no mesmo ipo de amostras. Estes compostos são conhecidos pelo seu poder antioxidante, mas também são recalcitrantes e tóxicos para o ambiente em concentrações mais elevadas. Realizaram-se estudos sobre os efeitos da radiação gama na actividade antioxidante e na toxicidade das amostras de água de cozedura de cortiça com células eucarióticas e procarióticas. Se por um lado, foi notório o aumento da actividade antioxidante para doses mais elevadas, por outro observou-se um aumento na toxicidade com o aumento da dose (tanto para a bactéria Pseudomonas fluorescens, como para as células humanas e de rato), pois a viabilidade das células diminuiu. Estes resultados sugerem que os produtos radiolíticos, embora apresentem maior actividade antioxidante, possam ser mais tóxicos do que os compostos originários presentes nas amostras. Assim, torna-se crucial identificar os produtos formados pela radiação gama de modo a estudar e compreender quais os produtos que contribuem para o aumento da actividade antioxidante e os que são responsáveis pelo efeito tóxico das amostras, para se implementarem métodos de extracção de compostos com maior valor acrescentado (isto é, maior actividade antioxidante e menor toxicidade). Tendo em conta esta linha de investigação, foram iniciados os estudos com compostos padrão. Os resultados parecem demonstrar que os produtos de degradação poderão ser também ácidos fenólicos e é evidente que a degradação das moléculas maiores (ácido vanílico e siríngico) induz a formação dos compostos mais pequenos (ácido gálico e protocatecuico), entre outros identificados.

20 CONFERÊNCIAS E PUBLICAÇÕES: Artigos Científicos C. Lima, J. Madureira, R. Melo, M.M. Carolino, J.P. Noronha, F.M.A. Margaça, S. Cabo Verde (2016) "A biodegradation bench study of cork wastewater using gamma radiation", Journal of Advanced Oxidation Technologies, 19, 1. R. Melo, J. Madureira, J.P. Leal, M.L. Botelho, W.J. Cooper, Esculetin degradation under radiation, Journal of Advanced Oxidation Technologies (aceite para publicação). D. Guerreiro, J. Madureira, T. Silva, R. Melo, P.M.P. Santos, A. Ferreira, M.J. Trigo, F.M.A. Margaça, S. Cabo Verde, "Effects of gamma radiation on microbial and physicochemical parameters of cherry tomatoes" (submetido ao Food Control). Conferências Internacionais Joana Madureira, Andreia I. Pimenta, Maria I. Dias, Rita Melo, Pedro M.P. Santos, António N. Falcão, Sandra Cabo Verde, Isabel C.F.R. Ferreira, Fernanda M.A. Margaça, Assessment of gamma radiation effects on antioxidant activity of cork wastewater, 2nd EuCheMS Congress on Green and Sustainable Chemistry, Lisboa, Portugal, 4-7 Outubro, 2015 (apresentação em poster) A.I. Pimenta, J. Madureira, J. Ribeiro, L. Popescu, A. Besleaga, R. Melo, P.M.P. Santos, A.N. Falcão, S. Cabo Verde, F.M.A. Margaça, Evaluation of the gamma radiation effects on cork wastewater toxicity, 2nd EuCheMS Congress on Green and Sustainable Chemistry, Lisboa, Portugal, 4-7 Outubro, 2015 (apresentação em poster) J. Madureira, A.I. Pimenta, J. Ribeiro, L. Popescu, A. Besleaga, R. Melo, P.M.P. Santos, A.N. Falcão, S. Cabo Verde, F.M.A. Margaça, Effects of gamma radiation on cork wastewater

21 toxicity, Congress of Microbiology and Biotechnology, Évora, Portugal, Dezembro, 2015 (apresentação em poster) Joana Madureira, Lillian Barros, R. Melo, Pedro M.P. Santos, António N. Falcão, Sandra Cabo Verde, Isabel C.F.R. Ferreira, Fernanda M.A. Margaça, Degradation of compounds present in cork boiling water by gamma radiation, 9º Encontro Nacional de Cromatografia (9ENC), Lisboa, Portugal, 5-9 Janeiro, 2016 (aceite para comunicação oral) FORMAÇÃO DE ALUNOS: De 06/2015 a 09/ Co-orientadora do trabalho das alunas Larisa Popescu e Alexandra Besleaga (Programa ERASMUS) da Universidade de Iasi (Universidade Alexandru Ioan Cuza, Roménia). De 04/2015 a 07/ Co-orientadora do estágio curricular do aluno João Ribeiro, da Escola Superior de Tecnologia do Barreiro (Instituto Politécnico de Setúbal, Portugal). Joana Filipa de Paiva dos Santos Madureira