Aumento de neutrófilos no diestro gestacional associado com eventos pré e durante implantação embrionária em cadelas

Transcrição

1 Aumento de neutrófilos no diestro gestacional associado com eventos pré e durante implantação embrionária em cadelas Adriana Gradela Tatiana dos Anjos de Oliveira Hornos RESUMO O início da gestação depende de muitas interações biológicas entre o concepto e a mãe e sua compreensão beneficia os conhecimentos relacionados à implantação e o desenvolvimento de tratamentos contra a infertilidade ou drogas contraceptivas. Objetivo deste estudo foi relacionar alterações os achados colpocitológicos durante o diestro gestacional em cadelas com eventos pré e durante a implantação embrionária. Seis cadelas foram selecionadas e acompanhadas até o início do estro, quando foram ou não acasaladas com machos férteis. Esfregaços vaginais foram colhidos nos dias 7, 14 e 21 do diestro gestacional (GI, N= 3) e normal (GII, N= 3) e os achados colpocitológicos relacionados com eventos pré e durante a implantação embrionária. Em todos os dias estudados houve maior número de neutrófilos (p<0,01) e de células intermediárias (p<0,05) no GI em ralação ao GII. Células parabasais não deferiram (p>0,05) entre os grupos em nenhum dia estudado. O maior número de neutrófilos observados no diestro gestacional está relacionado com a resposta imune materna à cobertura, à migração transcornual dos embriões e à implantação embrionária. Palavras-chave: Cadelas. Células intermediárias. Neutrófilos. Diestro gestacional. Increase of neutrophils in the pregnant associated with events pre and during embryonic implantation in bitches ABSTRACT The beginning of pregnancy depends of many biological interactions between the conceptus and the mother and its understanding benefits the knowledges related to implantation and the development of treatments against infertility or contraceptive drugs. The objective of this study was to make a list the colpocitologics finds during the pregnant diestrus in bitches with events pre and during embryonic implantation. Six bitches were selected and accompanied up to the beginning of the estrus, when they were or done not mated with fertile males. Vaginal smears were gathered in the days 7, 14 and 21 of the pregnant (GI, N= 3) or normal (GII, N= Adriana Gradela é Professora Adjunta do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Camilo Castelo Branco, Campus de Descalvado-SP, Doutora em Zootecnia pela FCAV-UNESP em agradela@hotmail.com Tatiana dos Anjos de Oliveira Hornos é Aluna de Iniciação Científica do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Camilo Castelo Branco, Campus de Descalvado-SP. t.a.o.hornos@hotmail.com. Veterinária em Foco Veterinária Canoasem Foco, v.6 v.6, n.1, jul./dez. p jul./dez

2 3) diestrus and the colpocitologics finds were related with events pre and during the embryonic implantation. In every day studied there was bigger number of neutrófilos (p<0,01) and intermediary cells (p<0,05) in the GI in relation to GII. Parabasal cells didn t differ (p>0,05) between the groups in any studied day. The bigger number of neutrophils observed at the pregnant diestrus connected with the immune motherly answer to the covering, to the transcornual migration of the embryos and to the embryonic implantation. Keywords: Bitches. Intermediate cells. Neutrophils. Pregnant diestrus. INTRODUÇÃO A manutenção da gestação depende de muitas interações biológicas entre a fêmea gestante e o embrião ou feto, cujo entendimento pode beneficiar o desenvolvimento de tratamentos contra a infertilidade, assim como de drogas contraceptivas. Antes da implantação, os fluidos tubárico e uterino dão o suporte ao desenvolvimento embrionário inicial, pois estes ambientes são inóspitos à sobrevivência dos embriões (GIGLIOLA, 2006). Mortes embrionárias que ocorrem antes ou durante a implantação não são detectadas porque os embriões são perdidos antes que a gestação possa ser reconhecida e suas causas são difíceis de serem identificadas (FELDMAN; NELSON, 1996). Dentre os animais domésticos, a cadela apresenta em seu ciclo reprodutivo aspectos únicos, recebendo a classificação de monoéstrico (único), o qual compreende uma fase folicular (proestro e estro), sob influência do estrógeno (E2) e uma fase luteal (diestro), sob influência da progesterona (P4) (OLSON; NETT, 1986). Após o diestro a cadela entra no estágio de anestro, no qual persiste a não aceitação sexual, o qual difere das outras espécies, pois não é sazonal (SMITH; REESE JR, 1968; SOKOLOWSKI, 1977). A cadela é a única que ovula em um ambiente progesterônico, ao contrário do estrogênico em outras espécies domésticas e seus óvulos não são prontamente fertilizados após a ovulação, pois necessitam de um tempo mínimo de três dias após a ovulação para que a divisão meiótica se complete (ETTINGER, 1992; FELDMAN; NELSON, 1996; BYSTED, 1999; FARSTAD, 2000). O diestro marca o fim do período de estro, quando a cadela torna-se não mais receptiva ao macho (CHRISTIANSEN, 1988; FELDMAN; NELSON, 1996) e tem sua duração, baseada na função lútea, similar para cadelas não-gestantes e gestantes (OLSON; NETT, 1986). Pode-se estudar a citologia vaginal através da citologia esfoliativa ou colpocitologia, a qual consiste no estudo das células descamadas ou retiradas artificialmente da superfície tecidual. Isto ocorre porque o epitélio vaginal é do tipo estratificado pavimentoso, sendo bastante sensível às alterações hormonais, em especial à ação do E 2 (MIALOT, 1984). Seu uso na prática da reprodução em cadelas é bastante difundido, pois é umas alternativas diagnóstica simples e rápidas, que permite a determinação do período sexual do ciclo estral, saber se infecções estão presentes no trato genital (OLSON et al., 1984), se as cadelas foram cobertas e assim evitar um tratamento abortivo desnecessário ou o momento ótimo para a cobertura ou inseminação artificial (MIALOT, 1984), além de permitir a observação da presença de agentes microbiológicos específicos como fungos e outros microorganismos (DA MOTTA et al., 2001). 52

3 Este trabalho foi conduzido com o objetivo de relacionar alterações os achados colpocitológicos durante o diestro gestacional e normal em cadelas com eventos pré e durante a implantação embrionária. MATERIAL E MÉTODOS Animais O presente estudo foi realizado no Hospital Veterinário de Descalvado com cadelas de diferentes raças, as quais foram submetidas a exame clínico prévio, antes de serem incluídas no experimento. O exame clínico englobou anamnese, exame físico e exames complementares, tendo a anamnese sido realizada com ênfase para o sistema reprodutivo. Os animais foram então submetidos a uma triagem, buscando-se confirmar sinais clínicos característicos de proestro (edema vulvar, atração de machos e secreção vulvar sanguinolenta), os quais foram comprovados por colpocitologia (CONCANNON; DIGREGORIO, 1986; CHRISTIANSEN, 1988, WRIGHT, 1990). Seis cadelas foram selecionadas e acompanhadas até o início do estro, o qual foi determinado quando a colpocitologia evidenciou a presença de mais de 80% de células superficiais com ausência de núcleo ou núcleo picnótico (CONCANNON; DIGREGORIO, 1986; CHRISTIANSEN, 1988, WRIGHT, 1990) em associação ao comportamento de receptividade ao macho. Três cadelas foram submetidas ao acasalamento com machos férteis (Grupo I, GI, N= 3) e as demais não foram acasaladas (Grupo II, GII, N= 3). Colpocitologia: técnica de preparo e coloração dos esfregaços O material para a colpocitologia foi colhido através de um swab de algodão estéril (OSBALDISTON, 1978). Para tanto, efetuou-se a limpeza da vulva com gaze e a abertura dos lábios vulvares para introdução, em um ângulo de 45 em relação ao solo, do espéculo vaginal bivalve. O swab, previamente umedecido com uma gota de solução salina, foi introduzido até atingir a região dorso-cranial da vagina, onde foram executados 2 a 3 movimentos circulares (OLSON et al., 1984). Imediatamente após a retirada, o swab foi rotacionado, com dois traços paralelos, sobre uma lâmina previamente identificada com o nome da cadela, a data e o tipo de coloração empregada. Após secagem ao ar o esfregaço foi corado pelo método Romanoski Modificado, denominado Panótico-rápido (Newprov, Brasil) e observado em microscópio com aumento de 100, 400 e de 1000 X. As amostras foram colhidas a partir do sétimo dia após o fim do estro, confirmado pelo fim da aceitação ao macho e pelos achados colpocitológicos (CONCANNON; DIGREGORIO, 1986; CHRISTIANSEN, 1988, WRIGHT, 1990) e repetidas a cada sete dias (dias 7, 14, 21 do diestro). 53

4 Colpocitologia: interpretação Segundo a morfologia, as células epiteliais diferenciam-se em células parabasais, intermediárias e superficiais. Conforme descrito na literatura, as células parabasais são as menores dentre as células vaginais, redondas ou ligeiramente ovais, com 15 a 25 μm, apresentam um núcleo central vesicular e relativamente pouca quantidade de citoplasma; as células intermediárias variam em tamanho podendo ser classificadas em células intermediárias pequenas e grandes, apresentam bordos irregulares e núcleos geralmente menores que aqueles das parabasais e as células superficiais são poligonais e achatadas, às vezes dobradas ou enroladas, com citoplasma abundante, azul-esverdeado e queratinizado e podem ter núcleos pequenos, redondos e picnóticos ou perderem o núcleo quando estão queratinizadas (CHRISTIANSEN, 1988; OLSON et al., 1984). Os neutrófilos aparecem em número variável dependo da fase do ciclo estral, de modo que no proestro inicial eles são comumente encontrados embora não abundantemente, no proestro médio eles desaparecem voltando a aparecer no diestro e no anestro podem ou não estar presentes (FELDMAN; NELSON, 1996). No caso de piometra aberta ou vaginite, os campos são repletos de neutrófilos degenerados e bactérias (FELDMAN; NELSON, 1996; JOHNSTON et al., 2001). Confirmação da gestação A confirmação da gestação foi realizada pela detecção da vesícula gestacional, aos 21 e 31 dias após o final do estro, utilizando-se ultra-sonografia trans-abdominal, modo-b, com um aparelho de marca Aloka Modelo SSD 500 e probe de 7,5MHz. Para tanto, as cadelas foram posicionadas em decúbito dorsal, os pêlos foram tosados com auxílio de uma máquina de tosa, e um gel ecográfico a base de água foi utilizado como agente de contato. Não houve necessidade de jejum ou bexiga repleta para a realização dos exames ultra-sonográficos, pois o líquido amniótico forneceu a janela acústica adequada para o exame. Análise dos dados Os achados da colpocitologia foram analisados utilizando-se o teste do χ 2 que comparou as freqüências das células parabasais, intermediárias e de neutrófilos durante o diestro gestacional e o diestro normal com as freqüências esperadas. Como os resultados referem-se à variável de contagem, supôs-se que a distribuição é normal. RESULTADOS Em todos os dias analisados (dias 7, 14 e 21) do diestro gestacional (GI) o número de neutrófilos (p<0,01) e de células intermediárias grandes e pequenas (p<0,05) foram 54

5 maiores que os observados no diestro normal (GII). O número de células parabasais não diferiu (p>0,05) entre os grupos estudados (Tabela 1). TABELA 1 Resultado da avaliação das lâminas colhidas de cadelas no diestro gestacional (GI) e no diestro normal (GII) por colpocitologia. Lâmina Cadelas A Cadelas B Cadelas C GI GII GI GII GI GII Neutrófilos L1 16,6+8,6 4,9+4,7 49,0+12,4 5,5+5,3 14,0+7,7 5,9+5,4 L2 69,2+14,2 5,0+4,1 61,6+11,5 5,9+5,7 59,4+9,8 4,9+4,4 L3 67,6+12,9 4,8+4,1 63,4+11,5 32,7+8,7 58,2+10,1 5,8+4,7 Total 153,4+35,7 ** 14,7+12,9 174,0+35,4 ** 44,1+19,7 131,6+27,6 ** 16,6+14,5 Células Intermediárias L1 16,7+10,4 5,0+4,7 16,0+7,2 5,0+4,4 16,1+9,4 6,9+6,5 L2 3,8+1,8 4,8+3,8 14,1+8,2 5,7+4,1 25,5+9,6 8,4+4,9 L3 11,6+7,9 4,9+4,3 12,7+9,1 12,3+8,6 12,6+6,9 4,7+4,0 Total 32,1+20,1* 14,7+12,8 42,8+24,5* 23,0+17,1 54,2+25,9* 20,0+16,8 Células Parabasais L1 4,8+2,6 5,0+4,2 4,7+2,2 4,9+4,5 4,8+2,6 4,9+4,2 L2 3,9+2,3 4,9+4,2 12,2+8,4 4,9+4,7 3,8+2,6 4,8+4,0 L3 9,3+6,7 4,9+4,0 3,4+1,8 6,1+5,8 10,4+6,4 4,7+4,0 Total 18,0+11,6 14,8+12,4 20,3+12,4 16,0+15,0 19,0+11,6 14,4+12,2 Valores em Média + Desvio padrão. L1-07 dias pós-estro; L2-14 dias pós-estro; L3-21 dias pós-estro. Valores diferiram estatisticamente a p<0,01 (**) e a p<0,05 (*) pelo teste do χ 2. As Figuras 1 e 2 exibem lâminas representativas da colpocitologia de cadelas em diestro gestacional (GI) e em diestro normal (GII), respectivamente. FIGURA 1 Lâmina representativa da colpocitologia de cadelas em diestro gestacional. A célula parabasal, B neutrófilos e C célula intermediária. 55

6 FIGURA 2 Lâmina representativa da colpocitologia de cadelas em diestro normal. A célula parabasal, B neutrófilos e C célula intermediária. Todas as cadelas do GI tiveram suas gestações confirmadas aos 21 e 31 dias após o fim do estro pelo exame ultra-sonográfico. DISCUSSÃO Células parabasais, intermediárias e superficiais e neutrófilos têm sido relatados como tipos celulares comuns entre os dias 7 e 11 após a onda de LH em cadelas (BURKE, 1986; CONCANNON, 1987), enquanto que no diestro tardio as células parabasais e intermediárias são as que predominam (JOHNSON et al., 2001). Ozyurtlu et al. (2006) observaram que células intermediárias foram mais dominantes nas cadelas gestantes do que naquelas com pseudoprenhez (declarada ou encoberta), como observado nas cadelas em diestro gestacional em relação àquelas com diestro normal. Segundo Holst (1986) e Wright (1990), neutrófilos são esperados por reaparecer no final do estro e início do diestro, devido ao rompimento do epitélio corneificado que faz com os mesmos sejam liberados no lúmen uterino através da migração da vascularização subepitelial a partir do epitélio vaginal. Christiansen (1988) relatou que, em algumas cadelas o número de neutrófilos no início do diestro pode ser tão grande que o esfregaço pode relembrar um pus quando da presença de vaginite, entretanto nestes casos os neutrófilos são degenerados na aparência e tóxicos e apresentam debris com bactérias abundantes ingeridas ao contrário do observado no esfregaço diestral normal, onde os neutrófilos não mostram sinais de reatividade ou toxidade apesar de sua abundância. Os neutrófilos observados em todos os dias e grupos analisados não apresentavam sinais de reatividade ou toxicidade e as cadelas não apresentaram nenhuma alteração patológica, não tendo sido relacionados com nenhum tipo de infecção. 56

7 Na cadela gestante o intervalo entre uma cobertura fértil e o parto é de 57 a 68 dias, com média de 64 dias (FELDMAN; NELSON, 1996) e várias diferenças endócrinas têm sido relatadas entre cadelas gestantes e não gestantes no estágio de diestro (CONCANNON, 2008). A confirmação da gestação aos 21 e 31 dias do diestro gestacional nas cadelas do GI concorda com os achados de diversos autores (BARR, 1988; ENGLAND et al., 1990; ENGLAND; ALLEN, 1990; YEAGER; CONCANNON, 1990; YEAGER et al., 1992; ENGLAND; YEAGER, 1993; KÄHN, 1994; FELDMAN; NELSON, 1996; ENGLAND, 1998; LUVONI; GRIONI, 2000 e KUTZLER et al., 2003), que relataram que a vesícula gestacional é a primeira estrutura a ser detectada ultra-sonograficamente sendo um bom indicador do desenvolvimento embrionário no terço médio da gestação. Intenso influxo de polimornucleares neutrófilos para dentro do útero tem sido relatado 30 minutos após a cobertura (KOTILAINEN et al., 1994) como uma conseqüência de uma reação inflamatória normal pós-inseminação, possuindo uma ação imunomoduladora na cadela (RIBEIRO et al., 2006). A estes achados, soma-se o fato de que espermatozóides caninos podem sobreviver no interior do sistema reprodutivo da cadela por até seis a sete dias (RIBEIRO et al., 2006) e por mais de 11 dias pós-cobertura no útero (LINDE-FOREBERG, 2000). Portanto, o maior (p<0,01) número de neutrófilos observados no início do diestro gestacional (dia 7) foram o resultado de uma tentativa do organismo de eliminar o excesso de espermatozóides após a cobertura ou mesmo aqueles mortos ou defeituosos, como relatado em éguas por Troedsson et al. (1998). Quimoquinas são uma família de citoquinas envolvidas na regulação da migração, aposição e adesão inicial do blastocisto em ruminantes, as quais desempenham uma função chave na migração e ativação de diferentes subpopulações de leucócitos (MACKAY, 2001) e têm sido implicadas na atração do blastocisto (SHUFARO; NADJARI, 2001). O aumento dos neutrófilos observado nas cadelas em diestro gestacional no dia 14 relacionou-se à migração transcornual dos embriões, a qual é observada em 50% das cadelas (TSUTSUI, 1975; SHIMIZU et al., 1990) entre os dias 12 e da gestação (SHIMIZU et al., 1990; CONCANNON et al., 2001). Fisiologicamente, a gestação caracteriza-se pela persistente tolerância local do sistema imune materno aos antígenos de histocompatibilidade paternos expressados pelo feto (HEAD; BILLIMGHAM, 1983, TAFURI et al., 1995; AIT-AZZOUZENE et al., 1998; JIANG; VACCHIO, 1998; AIT-AZZOUZENE et al., 2001), havendo uma íntima interação entra os sistemas endócrino e imune durante a implantação e manutenção da prenhez (VACCHIO; JIANG, 1999; MELLOR; MUNN, 2000; RUKAVINA; PODACK, 2000; GAUNT; RAMIN, 2001; MEEUSEN et al., 2001; SZEKERES-BARTHO et al., 2001, DOSIOU; GIUDICE, 2005). Quando a supressão da resposta imune materna não é suficiente, o útero lança mão dos linfócitos para manter a gestação (HUNT et al., 1997). Um dos mais fortes exemplos desta comunicação é a que ocorre ao nível da decídua humana (KING, 2000) e de roedores (HEAD, 1996/7; CROY et al., 1998; CROY; KISO, 2000), que apresentam um aumento numa população única de linfócitos no início da gestação, as células killer naturais uterinas (NKu), que juntamente com 57

8 macrófagos difundem-se e são instruídas pelos hormônios uterinos (progesterona) a secretarem citoquinas para promover e facilitar a implantação e o desenvolvimento embrionário (CARLINO et al., 2008). Os macrófagos representam 20-30% das células deciduais presentes no local da implantação e persistem por toda a gestação (ABRAHAMS et al., 2004), enquanto que as células NKu declinam com o avançar da mesma e, no final, estão ausentes (LE BOUTEILLER, 2004). O aumento dos neutrófilos observados nas cadelas em diestro gestacional no dia 21 corrobora estas teorias, pois parece estar relacionado a uma tentativa de defesa do organismo materno ao material alogênico e antigênico resultante da implantação embrionária (THATCHER et al., 1994, GONZÁLEZ, 2002), que na cadela inicia-se por volta dos dias 16 a 18 e completa-se até o dia 23 da gestação (THATCHER et al., 1994) e aos materiais secretados pelo embrião entre os dias 19 e 20 da gestação (THATCHER et al., 1994). CONCLUSÃO O maior número de neutrófilos observados no diestro gestacional de cadelas está relacionado com a resposta imune materna à cobertura, à migração transcornual dos embriões e à implantação embrionária. O melhor entendimento destas interações pode beneficiar os conhecimentos relacionados à implantação e, conseqüentemente, o desenvolvimento de tratamentos contra a infertilidade ou drogas contraceptivas. AGRADECIMENTOS A Dra. Selma de Fátima Grossi, Zootecnista, CRMV SP nº 1167/Z, Doutora em Produção Animal pela FCAV-UNESP e Professora Adjunta do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Camilo Castelo Branco, Campus de Descalvado-SP pela elaboração das análises estatísticas. A Unicastelo Campus de Descalvado pelo material necessário à realização da colpocitologia. REFERÊNCIAS ABRAHAMS, V. M.; KIM, Y. M.; STRASZEWSKI, S. L. et al. Macrophages and apoptotic cell clearance during pregnancy. American Journal of Reproductive Immunology, New Jersey, v.51, n.4, p , AIT-AZZOUZENE, D. et al. Transgenic major histocompatibility complex class I antigen expressed in mouse trophoblast affects maternal immature B cells. Biology of Reproduction, Madison, v.65, p , AIT-AZZOUZENE, D. et al. Maternal B lymphocytes specific for paternal histocompatibility antigens are partially deleted during pregnancy. The Journal of Immunology, Bethesda,v.161, p , BARR, F.J. Pregnancy diagnosis and assessmente of viability in the dog: A review. Journal of Small Animal Practice, New York, v.29, p ,

9 BURKE, T.J. Small animal reproduction and fertility. Philadelphia: Lea e Febiger, BYSTED, B. V. Aspects of oocyte maturation, ovulation, fertilization and early embryonic development in the dog. In: REPRODUCTION hos. Dansk Veterinaerforening for Husdyrreproduktion. Proceedings... Escandinávia, p CARLINO, C. et al. Recruitment of circulating NK cells through decidual tissues: a possible mechanism controlling NK cell accumulation in the uterus during early pregnancy. Blood, Washington, v.111, p , CHRISTIANSEN, I. J. Reprodução do cão e no gato. São Paulo: Manole, p.8-15; CONCANNON, P. W. Physiology and clinical parameters of pregnancy in dogs. Proceedings of 27 th WSAVA CONGRESS. Disponível em: proceedings/proceedings.plx?cid=wsava2002&pid=2681. Acesso em: 18 jul CONCANNON, P. W.; TSUTSU, T.; SHILLE, V. Embryo development, hormonal requirements and maternal responses during canine pregnancy. Journal of Reproduction and Fertility, Cambridge, v.57, p , CONCANNON, P. W.; DIGREGORIO, G. B. Canine vaginal citology. In: Burke TJ. Small animal reproduction and infertility: A clinical approach to diagnosis and treatment. cap.2. Philadelphia: Lea e Febiger, p CROY, B. A.; WHITELAW, P. F.; ENGELHARDT, H. E. The influences of immune cells of the success of pregnancy. In: BAZER, F. W. (ed.). Endocrinology of pregnancy. New Jersey: Human Press, pp, CROY, B. A.; KISO, Y. Granulated metrial gland cells: a natural killer subset of the pregnant murine uterus. In: KING, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update, Oxford, v.6,..1, p.28-36, DA MOTTA, E. V. et al. Colpocitologia em ambulatório de ginecologia preventiva. Revista da Associação Médica Brasileira, São Paulo, v.47, n.4, p , DOSIOU, C.; GIUDICE. L. C. Natural killer cells in pregnancy and recurrent pregnancy loss: Endocrine and immunologic perspectives. Endocrine Reviews, Chevy Chase, v.26, n.1, p.44 62, ENGLAND, G. C. W. Ultrasonographic assessment of abnormal pregnancy. Veterinary Clinics of North America: Small Animal Practice. New York, v. 28, p , ENGLAND, G. C.; YEAGER, A. E. Ultrasonographic appearance of the ovary and uterus of the bitch during oestrus, ovulation and early pregnancy. Journal of Reproduction and Fertility, Cambridge, v. 47, , ENGLAND, G. C. W.; ALLEN, W. E.; PORTER, D. J. Studies on canine pregnancy using B-mode ultra-sound: Development of the conceptus and determination of gestational age. Journal of Small Animal Practice, New York, v.31, p , ENGLAND, G. C. W.; ALLEN, W. E. Studies on canine pregnancy using B-mode ultrasound: diagnosis of early pregnancy and the number of conceptuses. Journal of Small Animal Practice, New York, v.31, p , ETTINGER, S.J. Tratado de medicina interna veterinária. 3.ed. São Paulo: Manole, v.4, p FARSTAD, W. Current state in biotechnology in canine and feline reproduction. Animal Reproduction Science, New York, v.60-61, p ,

10 FELDMAN, E. C.; NELSON, R. W. Ovarian cycle and vaginal cytology. In:. Canine and feline endocrinology and reproduction. 2.ed. Philadelphia: W. B. Saunders, p , , GAUNT, G.; RAMIN, K. Immunological tolerance of the human fetus. American Journal of Perinatology, New York, v.18, p , GIGLIOLA, S. The embryo-maternal dialogue and preparation for implantation. In: ASSEMBLEA GENERALE CONGRESSO INTERNAZIONALE L EMBRIONE UMANO NELLA FASE DEL PREIMPIANTO, 12, 2006, Città Del Vaticano. Disponível em: httphttp:// relaz/sicauno/sicauno&lang=italiano. Acesso em: 18 jul GONZÁLEZ, F. H. D. Introdução à endocrinologia reprodutiva veterinária. Porto Alegre: UFRGS p.vi-12. HEAD, J. R. Uterine natural killer cells during pregnancy in rodents. Nature Immunology, New York, v.15, p.7-21, 1996/7. HEAD, J. R.; BILLIMGHAM, R. E. Immunological aspects of the maternal feto-placental relationship. In: LACHMANN, P. J.; PETERS, D. K. (eds.). Clinical aspects of immunology. vol.1. London: Blackwell Scientific Publications, p HOLST, P. A. Vaginal cytology in the bitch. In: MORROW, D.A. Current terapy in theriogenology: Diagnosis, treatment and prevention of reproductive diseases in small and large animals. Philadelphia: Saunders Company. pp , HUNT, J. S. et al. Expression of the inducible nitric oxide synthase gene in mouse uterine leukocytes and potential relationships with uterine function during pregnancy. Biology of Reproduction, Madison, v.57, p , JIANG, S. P.; VACCHIO, M. S. Multiple mechanisms of peripheral T cell tolerance to the fetal allograft. The Journal of Immunology, Bethesda, v.160, p , JOHNSON, G. A. et al. Muc-1, Integrin, and Osteopontin Expression During the Implantation Cascade in Sheep. Biology of Reproduction, Madison, v.65, p , JOHNSTON, S. D. et al. (eds.). Canine and feline theriogenology. Philadelphia: Saunders, KÄHN, W. Veterinary reprodutive ultrasonography. In:. Ultrasonography in dogs and cats. Philadelphia: Saunders, p KING, A. Uterine leukocytes and decidualization. Human Reproduction Update, Oxford, v.6, n.1, p.28-36, KOTILAINEN, T.; HUHTINEN, M.; KATILA, T. Sperm-induced leucocytosis in the equine uterus. Theriogenology, New York, v.41, p , KUTZLER, M. A. et al. Accuracy of canine parturition date prediction using fetal measurements obtained by ultrasonography. Theriogenology, New York, v.60, p , LE BOUTEILLER, P. The role of HLA-G expression in the embryo during implantation. Journal de Gynecologie Obstetrique et Biologie de la Reproduction, Paris, v.33, p.9-12, LINDE-FOREBERG, C. Fertility data from 2041 controlled artificial inseminations in the dog. In: INTERNATIONAL SYMPOSIUM ON CANINE AND FELINE REPRODUCTION, 4 th, Oslo, Proceeding p

11 LUVONI, G. C.; GRIONI, A. Determination of gestational age in medium and small size bitches using ultrasonographic fetal measurements. Journal of Small Animal Practice, New York, v.41, p , MACKAY, C. Chemokines: immunology s high impact factors. Nature Immunology, South San Francisco v.2, p , MEEUSEN, E. N.; BISCHOF, R. J.; LEE, C. S. Comparative T-cell responses during pregnancy in large animals and humans. American Journal of Reproductive Immunology, Malden, v.46, p , MELLOR, A. L.; MUNN, H. Immunology at the maternal-fetal interface: lessons for T cell tolerance and suppression. Annual Review of Immunology, Palo Alto, v.18, p , MIALOT, J. P. Patologia da reprodução dos carnívoros domésticos. A Hora Veterinária, Caçapava do Sul, v.4, p.17-27, OLSON, P. N., NETT, T. M. Reproductive endocrinology and physiology of the bitch. In: MORROW, D. A. Current therapy in theriogenology: Diagnosis, treatment and prevention of reproductive diseases in small an large animals. Philadelphia: W.B. Saunders Company. pp , OLSON, P. N. et al. Vaginal Cytology: Part I. A useful tool for staging the canine estrous cycle. Compendium on Continuing Education for the Practicing Veterinarian, Yardley, v.6, p , OSBALDISTON, G. W. Bacteriological studies of reproductive disorders of bitches. Journal of American Animal Hospital Association, Denver, v.14, p , OZYURTLU, N.; AY, S. S.; ALAÇAM, E. Evaluation of vaginal smears, and progesterone and relaxin levels in pregnant, and overt and covert pseudopregnant bitches. Turkish Journal of Veterinary and Animal Sciences, Kavaklýdere, v.30, p , RIBEIRO, A. P. et al. Uterine leukocyte infiltration after artificial insemination in bitches. Theriogenology, New York, v.66, n.6-7, p , RUKAVINA, D.; PODACK, E. R. Abundant perforin expression at the maternal-fetal interface: guarding the semiallogeneic transplant? Immunology Today, New York. v,21, p , SHIMIZU, T. et al. Incidence for transuterine migration of embryos in the dog. The Japanese Journal of Veterinary Science, Tokyo, v.52, p , SHUFARO Y.; NADJARI, M. Implantation of a gestational sac in a cesarean section scar. Fertility and Sterility, New York, v.75, p.1217, SMITH, W. C; REESE, W. C Jr. Characteristics of a Beagle colony I. Estrous cycle. In: MORROW, D. A. Current Terapy in Theriogenology: Diagnosis, treatment and prevention of reproductive diseases in small and large animals. Philadelphia: Saunders Company, p.455. SOKOLOWSKI, J. H. Reproductive patterns in the bitch. Veterinary Clinics of North America, New York, 1977, v.7, p.653. SZEKERES-BARTHO J. et al. The role of gamma/delta T cells in the feto-maternal relationship. Seminars in Immunology, New York, v.13, p , TAFURI, A. et al. T cell awareness of paternal alloantigens during pregnancy. Science, Washington, v.270, p ,

12 THATCHER, M-J. D. et al. Canine conceptus appearance and the new protein synthesis in relation to the time of implantation. Theriogenology, New York, v.41, p , TROEDSSON, M. H. T.; LIU, I. K. M.; CRABO, B. G. Sperm transport and survival in the mare: a review. Theriogenology, New York, v.50, p , TSUTSUI, T. Studies on the reproduction in the dog. VI. Ovulation rate and transuterine migration of the fertilized ova. The Japanese journal of animal reproduction, Saitama, v.28, p , VACCHIO, M. S.; JIANG, S. P. The fetus and the maternal immune system: pregnancy as a model to study peripheral T-cell tolerance. Critical Reviews in Immunology, Redding, v.19, p , YEAGER, A. E. et al. Ultrasonography appearance of the uterus, placenta, fetus, and fetal membranes throughout accurately timed pregnancy in beagles. American Journal of Veterinary Research, Lenexa, v.53, p , YEAGER, A. E.; CONCANNON, P. W. Association between the preovulatory luteinizing hormone surge and the early ultrasonographic detection of pregnancy and fetal heartbeats in Beagle dogs. Theriogenology, New York, v.34, p , WRIGHT, P. J. Application of vaginal cytology and plasma progesterone determinations to the management of reproduction in the bitch. Journal of Small Animal Practice, New York, v.31, n.7, p , Recebido em: 4/8/08 Aceito em: 2/10/08 62