ATIVIDADE OVICIDA E LARVICIDA IN VITRO DAS PLANTAS SPIGELIA ANTHELMIA E MOMORDICA CHARANTIA CONTRA O NEMATÓDEO HAEMONCHUS CONTORTUS RESUMO

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1 Ciência Animal 1999, 9(2):67-73 ATIVIDADE OVICIDA E LARVICIDA IN VITRO DAS PLANTAS SPIGELIA ANTHELMIA E MOMORDICA CHARANTIA CONTRA O NEMATÓDEO HAEMONCHUS CONTORTUS (In vitro ovicidal and larvicidal effect of the plants Spigelia anthelmia and Momordica charantia against the nematode Haemonchus contortus) Luiz Matos BATISTA 1 *, Claudia Maria Leal BEVILAQUA 1, Selene Maia de MORAES 2 & Luiz da Silva VIEIRA 3 1 Universidade Estadual do Ceará/Faculdade de Veterinária, 2 Departamento de Física e Química-UECE, 3 EMBRAPA/ CNPC RESUMO O desenvolvimento de resistência anti-helmíntica tem sido uma conseqüência do uso intensivo e incorreto de anti-helmínticos. Na busca de alternativas, experimentos foram realizados com as plantas medicinais Spigelia anthelmia e Momordica charantia para avaliar a ação das mesmas sobre a eclosão de ovos e motilidade de larvas do nematódeo Haemonchus contortus. Larvas do parasito foram obtidos de coproculturas e a recuperação de ovos foi feita em tamises, a partir de fezes de um carneiro com infecção pura de H. contortus. As plantas foram usadas sob a forma de extratos nas concentrações de 50, 10, 2, 0,4 e 0,08% no teste de eclosão de ovos e 50, 25, 12,5 e 6,25% no teste de motilidade de larvas. O teste de eclosão de ovos foi analisado pelo teste t de Student e o de motilidade de larvas pelo teste de Duncan, a um nível de significância de 5%. A eclosão de ovos foi significativamente diferente apenas entre as concentrações de uma mesma planta, mas não entre plantas. A dose inibidora de 50% (DI 50) da eclosão de ovos, às 48 horas de incubação, foi de 0,173 mg/ml para S. anthelmia e de 0,101 mg/ml para M. charantia. Diferenças nas concentrações de M. charantia não provocaram diferenças significativas na contagem de larvas imóveis, enquanto o efeito de S. anthelmia, no mesmo teste, variou significativamente com a concentração desta planta. Estudos adicionais in vivo necessitam ser realizados para ratificar a validação científica demonstrada in vitro, neste trabalho. PALAVRAS-CHAVE: anti-helmínticos, Haemonchus contortus, Momordica charantia, nematódeo, ovino, plantas, Spigelia anthelmia. ABSTRACT The development of anthelmintic resistance has been a consequence of the intensive and incorrect use of anthelmintics. In the search for alternatives, the medicinal plants Spigelia anthelmia and Momordica charantia were used to evaluate egg hatching and paralisation of larvae from the nematode Haemonchus contortus. Larvae and eggs from the parasite were obtained by coproculture and recovery of eggs using sieves, respectively, from the faeces of a sheep infected with H. contortus. Concentrations of 50, 10, 2, 0.4 and 0.08% of extracts of the plant were used in the egg hatch test *Autor para correspondência Av. Paranjana, 1700, Fortaleza, Ceará claudiam@uece.br 67

2 and 50, 25, 12.5 and 6.25% in the test of larvae motility. The results were analyzed by comparison of the averages of hatched eggs and paralyzed larvae; using a Duncan s to evaluate significance at the 5% level. The egg hatching was different among the concentrations of a same plant, but very similar between the two plants. The 50% inhibitory doses of egg hatching were: mg/ml for S. anthelmia and mg/ml for M. charantia. In the test of larvae immobilization, there were no significant differences between the effects of the various concentrations of M. charantia, while the effect of S. anthelmia varied significantly with the concentration of this plant. Additional in vivo studies are important to validate the in vitro properties of the plants evaluated in this study. KEY WORDS: anthelmintic, Haemonchus contortus, Momordica charantia, nematode, plants, sheep, Spigelia anthelmia. INTRODUÇÃO O nordeste concentra cerca de 36% do rebanho ovino nacional. Entretanto, baixos índices produtivos são verificados motivados por problemas sanitários, stress alimentar e erros no manejo reprodutivo dos rebanhos. Entre os problemas sanitários, são considerados de grande importância as nematodeoses gastrintestinais (COSTA & VIEIRA,1983). Nesta região, os criadores tentam aumentar a produção ovina controlando nematódeos gastrintestinais, apenas com o uso de anti-helmínticos(charles, 1989). Este procedimento leva ao desenvolvimento de cepas de nematódeos resistentes, determinando a necessidade da renovação do estoque de antihelmínticos disponíveis comercialmente. Enquanto isto ocorre, não há previsão do aparecimento de novos anti-helmínticos com novos modos de ação, na próxima década (WALLER et al., 1995). Ao mesmo tempo, inúmeros relatos são feitos sobre as diversas atividades farmacológicas de plantas medicinais, usadas empiricamente (HAMMOND et al., 1997). Portanto, plantas medicinais podem ser a fonte de novos anti-helmínticos com novos modos de ação. No entanto, a falta de estudos científicos, que comprovem a atividade antihelmíntica de plantas, dificulta os seus usos em Medicina Veterinária. Este trabalho teve por objetivo pesquisar in vitro as atividades antihelmínticas das plantas Spigelia anthelmia e Momordica charantia contra o nematódeo de ovinos Haemonchus contortus, usando como modelo experimental o desenvolvimento de ovos e a motilidade das larvas L3, ambos originados de ovino com mono-infecção do parasita citado. MATERIAL E MÉTODOS Obtenção de extratos aquosos de plantas Exemplares de S. anthelmia foram colhidos inteiros e suas folhas separadas das outras partes da planta. As folhas de um exemplar foram adicionadas às folhas de outros exemplares, até somarem um peso suficiente para comporem uma repetição do experimento. Uma repetição de M. charantia foi composta de ramos e folhas colhidas em um só ponto de ramificação da planta. Folhas frescas de S. anthelmia, ou ramificações totais de M. charantia, foram postas a desidratar em estufa a 105ºC, durante duas horas e em seguida, água destilada fervente foi acrescentada às folhas ou ramificações totais. Após uma hora, quando a água já estava fria, as folhas ou ramificações totais foram comprimidas em um cálice graduado com auxílio de um pistilo e feita uma filtração em papel de filtro qualitativo, formando-se uma solução chamada inicial, cuja concentração foi de mg da planta por ml da solução. Esta primeira concentração foi diluída seqüencialmente, usando como fator de diluição o número 5, resultando diluições iguais a 1.000, 200, 40, 8, e 1,6 mg de planta por cada ml de solução, para o ensaio de eclosão de ovos. No ensaio de motilidade de larvas, o fator de diluição foi 2 e as concentrações resultantes foram 1.000, 500, 250 e 125 mg de cada planta para cada ml de solução. Todo este procedimento foi repetido 10 vezes. 68

3 Obtenção de ovos Ovos de H. contortus foram obtidos de fezes de um carneiro portador de infecção pura. As fezes foram maceradas em gral e diluídas com agua potável. Em seguida, foram passadas através de quatro tamises, dispostos em ordem decrescente de abertura de malha (500 µm; 100 µm 75 µm e 32 µm). Os ovos do nematódeo foram recuperados do tamis com menor abertura entre malhas e diluídos com água destilada de modo a comporem uma suspensão, com aproximadamente ovos por ml. Obtenção de larvas de terceiro estádio (L3) Larvas de terceiro estádio de H. contortus foram obtidas de larvaculturas realizadas segundo UENO & GONÇALVES (1998). Teste de eclosão de ovos O teste de eclosão de ovos foi realizado em tubo de hemólise. O tempo decorrido entre a coleta de fezes na ampola retal do carneiro portador de infecção pura de H. contortus e o início da incubação dos ovos, sob a ação dos extratos das plantas, foi de duas horas. Foram adicionados 0,25 ml da suspensão de ovos, com aproximadamente 250 ovos de H. contortus, a 0,25 ml do extrato de cada planta, obtendo-se concentrações finais sobre ovos iguais a 50, 10, 2, 0,4 e 0,08% da planta. Um tubo de hemólise com suspensão de ovos e água destilada constituiu o controle. O exame do efeito de cada uma das diluições dos extratos das plantas foi repetido dez vezes, portanto foram usadas dez soluções diferentes de cada diluição dos extratos das plantas. Ao todo foram analisadas 110 unidades experimentais. Duas alíquotas de 0,05 ml, de cada unidade experimental, foram colocadas entre lâmina e lamínula e examinadas ao microscópio ótico, para calcular as médias de ovos em desenvolvimento e larvas, às 48 h de incubação. As variáveis quantificadas foram: ovo em desenvolvimento celular (DC, Fig. 1), ovo diferenciado (OD, Fig. 2), ovo larvado (OL, Fig. 3) e eclosão de larva (EL, Fig. 4). DC: O ovo do nematódeo apresenta uma massa arredondada formada por um grande número de células. OD: O ovo contém uma formação interna mais alongada do que arredondada, dobrada ao meio e de aspecto grosseiro. OL: Ovo apresentando uma larva fina, de corpo enovelado e com movimentos. EL: Larva fora do ovo, imóvel ou não. Teste de motilidade de larvas O teste de motilidade foi realizado com as larvas submetidas a nove tratamentos, sendo cinco diluições dos extratos de cada planta e tratamento controle, que constou da suspensão de larvas sob a ação de água destilada. A unidade experimental constou de uma placa de Petri com a suspensão de larvas, à qual foi adicionado o extrato da planta ou água destilada (controle). As concentrações dos extratos das plantas foram de 50, 25, 12,5 e 6,25%. O total de unidades experimentais examinadas foi de 90. A contagem de larvas móveis e imóveis foi realizada às 24 h do início do teste e a quantidade de larvas em cada placa foi de aproximadamente 300. Análise estatística Os dados de desenvolvimento de ovo foram transformados (log(x+1)), submetidos à analise de variância e comparados pelo teste t de Student, segundo diferenças mínimas significativas (dms) entre médias de percentagens de ovos nas cinco diluições, em cada um dos estádios de desenvolvimento de ovos quantificados, com um nível de significância de 5%. A análise de regressão foi feita pelo programa CASIO FC100. A análise estatística do teste de motilidade de larvas constou de análise de variância feita com as médias das percentagens das larvas imóveis de cada diluição e teste de Duncan (dms), a nível de 5% de significância. RESULTADOS Teste de eclosão de ovos de H. contortus O teste de eclosão de ovos foi realizado para verificar o efeito anti-helmíntico de S. anthelmia e M. charantia. A Tab. 1 e 2 mostram as médias transformadas das contagens de ovos nos estádios quantificados. Diferenças significativas (p<0,05) foram observadas entre as médias transformadas de ovos nos estádios 69

4 Tabela 1. Médias transformadas (log(x+1)) do número de ovos nos vários estádios de desenvolvimento às 48 h de incubação sob ação de S. anthelmia. S. anthelmia Estádios de desenvolvimento de ovos DC OD OL EL 0 1,00 bc 1,00 bc 1,00 bb 6,92 aa 0,08 1,00 bc 1,00 bc 1,00 bb 5,87 ab 0,4 1,04 bc 1,04 bc 1,08 bb 5,81 abc 2 1,14 cc 1,08 cc 2,93 ba 5,57 ac 10 1,45 cb 3,96 ab 2,93 ba 1,12 dd 50 2,54 ba 4,73 aa 1,27 cb 1,11 cd DC = Desenvolvimento celular. OD = Ovo diferenciado. OL = Ovo larvado. EL = Eclosão de larva. Letras minúsculas comparam médias nas linhas e maiúsculas, nas colunas. Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes (P>0,05). A diferença mínima significatica é de 0,2754. DC e LE. Em uma mesma concentração, um número médio elevado de ovos no estádio DC corresponde a um valor médio baixo no estádio LE, e vice-versa. Na concentração de 50% de S. anthelmia e de M. charantia os ovos do nematódeo permaneceram, em sua grande maioria, nos estádios iniciais de desenvolvimento, enquanto que na concentração de 0,08% foi vista uma quantidade significativamente maior (p<0,05) de larvas do que de ovos nos estádios iniciais de desenvolvimento. Quando as concentrações dos extratos das plantas são diminuídos os ovos evoluem até à eclosão, e sob altas concentrações ocorre uma diminuição do desenvolvimento dos ovos de H. contortus. A dose inibidora de 50% (DI50) da eclosão dos ovos foi de 0,173 mg/ml para S. anthelmia e 0,101 mg/ml para M. charantia. A análise de regressão das percentagens de eclosão de ovos revelou r de 0,68 para S. anthelmia e 0,76 para M. charantia. Teste de motilidade de larvas O teste de motilidade de larvas Tabela 2. Médias transformadas (log(x+1)) do número de ovos nos vários estádios de desenvolvimento às 48 h de incubação sob ação de M. charantia. S. anthelmia Estádios de desenvolvimento de ovos DC OD OL EL 0 1,00 bb 1,00 bd 1,00 bc 6,92 aa 0,08 1,00 bb 1,00 bd 1,00 bc 5,07 ac 0,4 1,00 cb 1,00 cd 1,54 bb 5,46 ab 2 1,00 cb 1,56 bc 3,79 aa 3,54 ad 10 1,00 bb 4,00 ab 3,73 aa 1,11 be 50 2,31 ba 4,73 aa 1,33 cbc 1,01 ce DC = Desenvolvimento celular. OD = Ovo diferenciado. OL = Ovo larvado. EL = Eclosão de larva. Letras minúsculas comparam médias nas linhas e maiúsculas, nas colunas. Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes (P>0,05). A diferença mínima significatica é de 0,

5 Tabela 3. Médias de larvas móveis às 24 h de incubação pela ação de M. charantia e S. anthelmia. Plantas Concentração das plantas (%) 6,25 12, M. charantia 55,22 ba 53,38 ba 55,30 bb 58,21 ab S. anthelmia 36,16 db 41,63 cb 82,28 aa 68,15 ba Controle 33,11 33,11 33,11 33,11 Letras diferentes indicam valores significativamente diferentes (P>0,05). A diferença mínima significatica é de 3,3 mostrou que M. charantia foi mais efetiva do que S. anthelmia nas concentrações de 6,25 e 12,5%, enquanto S. anthelmia foi mais efetiva do que M. charantia, nas concentrações de 25 e 50% (Tab. 3). Estes resultados significam que a ação de S. anthelmia, para inibir a motilidade de larvas de H. contortus, foi dependente da concentração da planta, ao passo que a ação de M. charantia não foi dependente da dose. DISCUSSÃO No presente trabalho foram usados modelos experimentais que tm como variáveis mudanças bem definidas em estádios de vida de uma espécie parasitária com hospedeiros perfeitamente caracterizados. Além disso, as plantas usadas são bem conhecidas na medicina popular humana e veterinária e têm ações fisiológicas e farmacológicas conhecidas (ACHENBACH et al., 1995; PESALBA & RITA, 1988; El GENGAIHI et al., 1996). Portanto, a exemplo dos trabalhos realizados por AMORIM et al. (1987, 1991, 1992, 1993, 1994, 1995, 1996) que usaram plantas anteriormente referidas e modelos experimentais com hospedeiros e parasitas bem definidos, este experimento pretende dar uma contribuição no sentido de validar, cientificamente, o uso popular das duas plantas. Os extratos de S. anthelmia e M. charantia apresentaram resultados semelhantes no teste de desenvolvimento de ovos, mas diferiram de modo evidente no teste de motilidade de larvas, sugerindo que princípios ativos existentes nas duas plantas agem de modo diverso sobre larvas. Isto corrobora com relatos anteriores de seus usos: enquanto S. anthelmia tem aplicação como potente veneno para várias espécies de vertebrados e invertebrados (JEFFERIES et al., 1985). M. charantia é usada em alguns países na alimentação humana (ZURLO & MITZI, 1989). No teste de motilidade de larvas o efeito de S.anthelmia é previsto, se for levado em consideração que S. anthelmia possui um princípio ativo, que tem conformação estereoquímica semelhante e função fisiológica igual a um grupo de compostos chamados rianoides (ACHENBACH et al., 1995; JEFFERIES et al., 1985; PESSAH et al., 1985). Estes compostos interagem com receptores em células de muitas espécies de vertebrados e invertebrados e, experimentalmente, diminuíram a motilidade do nematódeo de vida livre Caenorhabditis elegans (MARYON et al., 1998). Portanto, é possível supor que os compostos rianóides existentes em S. anthelmia provocaram a diminuição da percentagem de larvas móveis, verificada neste experimento. WATERHOUSE et al. (1987) verificaram que rianodine, disponível comercialmente, inibia o desenvolvimento de ovos de espécies como o ouriço do mar, enquanto ACHENBACH et al. (1995) demonstraram que S. anthelmia possui um princípio ativo estereoquímica e funcionalmente relacionado a rianodine. Por isso, presumivelmente, a ação inibidora de S. anthelmia sobre ovos de H. contortus pode ser creditada a este princípio ativo. GIRÃO et al. (1998) encontraram diminuição do número de larvas L3 de H. contortus recuperadas em coprocultura, sob a 71

6 ação de M. charantia. Esta citação corrobora com os dois ensaios descritos neste trabalho, pois a recuperação de larvas infectantes em coproculturas pode ser afetada por distúrbios no desenvolvimento dos ovos ou por diminuição da motilidade das larvas L3. No teste de motilidade de larvas, a eficácia de S. anthelmia aumenta significativamente, quando a concentração da planta varia de 6,25 para 12,5 e 25%, mas, de modo surpreendente, diminui com a variação de 25 para 50%. Relato semelhante foi feito por COLES et al. (1988) usando anti-helmínticos disponíveis comercialmente. No decorrer dos testes com S. anthelmia e M. charantia verificou-se que o tempo decorrente entre a coleta de fezes e o início da incubação dos ovos nos extratos das plantas influía no desenvolvimento dos ovos. Este fato não está expresso em números, nos resultados apresentados, mas motivou o reinício do experimento mais de uma vez, para padronização do tempo entre a coleta de fezes e o início da incubação dos ovos sob a ação das plantas. Observações semelhantes foram feitas por JOHANSEN & WALLER (1989). S. anthelmia mostrou ação sobre o desenvolvimento dos ovos e a motilidade das larvas L3. Estas duas ações conferem grande importância a testes com plantas para comprovar atividade anti-helmíntica, especialmente se existem possibilidades de ação tóxica da planta usada. Esta importância foi verificada por PATEL & CAMPBELL (1998) que encontraram ação simultânea de um anti-helmíntico sobre larvas e ovos em uma mesma geração de um nematódeo: a percentagem de larvas que eclodia morria sob a ação do anti-helmíntico. Assim, o retardamento da eclosão de ovos e atuação sobre larvas podem resultar numa inviabilização do total de ovos eliminados pelo parasita. A planta tida como tóxica, S. anthelmia (BRAGA, 1976), pode ser usada numa concentração menor que as doses 100% letais individuais para ovos e larvas, diminuindo o perigo de ação tóxica sobre o hospedeiro. Muitos trabalhos são feitos para testar plantas medicinais, usando métodos de testes de resistência anti-helmíntica, quase sempre com muitas modificações. No entanto, os métodos para teste de resistência anti-helmíntica usados, podem não ser adequados para testar atividade anti-helmíntica de plantas medicinais, devido às diferenças entre os constituintes de antihelmínticos e extratos de plantas. Por isto, faz-se necessário a padronização de métodos para comprovar a existência de atividade antihelmíntica em plantas medicinais. A validação científica do uso popular das plantas S. anthelmia e M. charantia, verificada neste trabalho, precisa ser ratificada e complementada em experimentos in vivo, a fim de que as duas plantas possam ser usadas no controle dos nematódeos gastrintestinais de ovinos, contribuindo para diminuir o desenvolvimento da resistência anti-helmíntica e facilitar o desenvolvimento da ovinocultura nordestina. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem ao Dr. Sergio Horta da Universidade Federal do Ceará, pelo fornecimento das plantas utilizadas neste trabalho. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACHENBACH, H., HUBNER, H., VIERLING, W., BRANDT, W. & REITER, M Spiganthine, the cardioactive principle of Spigelia anthelmia. J. Nat. Prod., 7: AMORIM, A., BORBA, H. R. & SILVA, W. J Ação anti-helmíntica de plantas. Rev. Bras. Farm., 68: AMORIM, A., BORBA, H. R. & AMANO, L. M Ação anti-helmíntica de plantas IV. Influência da casca do caule de cipó-cravo (Tynnanthus fasciculatus Miers; Bignoniaceae) na eliminação de Vampirolepis nana de oxiurídeos em camundongos. Rev. Bras. Farm., 72: AMORIM, A. & BORBA, R. H Ação antihelmíntica de plantas VI. Sobre a influência da semente de abóbora (Cucurbitaceae) na eliminação de Vampirolepis nana em camundongos. Rev. Bras. Farm., 73: AMORIM, A., BORBA, H. R. & SILVA, L. M Ação anti-helmíntica de plantas VIII. Influência de extratos de Carica papaya L. (mamão) na eliminação de oxiurídeos e de Vampirolepis nana em camundongos. Rev. Bras. Farm., 74:

7 AMORIM, A. & BORBA, H. R Ação antihelmíntica de plantas X. Testes in vivo com extratos brutos de Cocus nucifera L. (Palmae). Rev. Bras. Farm., 75: AMORIM, A. & BORBA, H. R Ação antihelmíntica de plantas XI. Influência de extratos brutos de Cocus nucifera L. (Palmae) na eliminação de Vampirolepis nana em camundongos. Rev. Bras. Farm., 76: AMORIM, A., RODRIGUES, M. L. A. & BORBA, H. R Ação anti-helmíntica de plantas XII. Influência de extratos vegetais in vitro na viabilidade de larvas de nematóides gastrintestinais de bovinos. Rev. Bras. Farm., 77: BRAGA, R Plantas do Nordeste, Especialmente do Ceará. Coleção Mossoroense, XLII, 3ª edição. CHARLES, T. P Seasonal prevalence of gastrointestinal nematodes of goats in Pernambuco state, Brazil. Vet. Parasitol. 30: COLES, G. C., TRITSCHLER II, J. P., GIORDANO, D. J., LASTE, N. J. & SCHMIDT, A. L Larval development test for detection of anthelmintic resistant nematodes. Res. Vet. Sci., 45: COSTA, C. A. F. & VIEIRA, L. S Evolução do parasitismo por nematódeos gastrintestinais em caprinos no sertão dos Inhamuns, Ceará. Sobral. EMBRAPA/CNPC, Pesquisa em andamento, 9) 4p. EL GENGAIHI, S., KARAWYA, M. S., SELIM, M. A., MOTAWE, H. M. & IBRAHIM, N. A Chemical and biological investigation of polypeptides of Momordica and Luffa spp. fam. Cucurbitaceae. Bull. Nat. Res. Center Cairo, 21: GIRÃO, E. S., CARVALHO, J. H. de, LOPES, A. S., MEDEIROS, L. P. & GIRÃO, R. N Avaliação de plantas medicinais com efeito antihelmíntico para caprinos. Pesquisa em andamento-embrapa, 9pp. HAMMOND, J. A., FIELDING, D. & BISHOP, S. C Prospects for plant anthelmintic in tropical veterinary medicine. Vet. Res. Comm. 21: JEFFERIES, P. R., TOIA, R. F., BRANNIGAN, B., PESSAH, I. & CASIDA, J. E Ryania insecticide: Analysis and biological activity of 10 natural ryanoids. J. Agric. F. Chem., 40: JOHANSEN, M. V. & WALLER, P. J Comparison of three in vitro techniques to estimate benzimidazole resistance in Haemonchus contortus of sheep. Vet. Parasitol., 34: MARYON, E. B., SAARI, B. & ANDERSON, P Muscle-specific functions of ryanodine receptor channels in Caenorhabditis elegans. J. Cell Sci., 19: PATEL, M. R. & CAMPBELL, W. C Inhibitory effect of chlorpromazine on nematode eggs and larvae. J. Parasitol., 84: PESALBA, T. & RITA, M Efectos de los extractos liofilizados de Momordica charantia sobre la glucemia en preparaciones caninas anestesiadas y conscientes. Scientia, 3:7-16. PESSAH, I. N., WATERHOUSE, A. L. & CASIDA, J. E The calcium-ryanodine receptor complex of skeletal and cardiac muscle. Biochem. Biophys. Res. Commun., 128: UENO, H. & GONÇALVES, P. C Manual para diagnóstico das helmintoses de ruminantes. Japan International Cooperation Agency, 144 p. WALLER, P.J., DASH, K.M., BARGER, I.A., LEJAMBRE, L. F. & PLANT, J Anthelmintic resistance in nematode parasites of sheep: learning from the Australian experience. Vet. Rec. 136: WATERHOUSE, A. L., PESSAH, I. N., FRANCINI, A. O. & CASIDA, J. E Structural aspects of ryanodine action and selectivity. Med. Chem., 30: ZURLO, C. & MITZI, B Ervas daninhas do Brasil. Editora Globo, 96p. 73