SARA DE ALMEIDA RIOS. COMPRIMENTO DE EXPLANTES E PROTOCOLOS DE ASSEPSIA PARA MICROPROPAGAÇÃO DE BANANEIRA (Musa sp.) PRATA ANÃ

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2 SARA DE ALMEIDA RIOS COMPRIMENTO DE EXPLANTES E PROTOCOLOS DE ASSEPSIA PARA MICROPROPAGAÇÃO DE BANANEIRA (Musa sp.) PRATA ANÃ Monografia apresentada à Universidade Estadual de Montes Claros, como parte das exigências curriculares do curso de Agronomia, para obtenção do título de ENGENHEIRA AGRÔNOMA. Aprovada: 12 de janeiro de 2006 Adelica Aparecida Xavier Professora - UNIMONTES (Co - orientadora) Marlon Cristian Toledo Pereira Professor - UNIMONTES (Co - orientador) Silvia Nietsche Professora - UNIMONTES (Orientadora) JANAÚBA MINAS GERAIS - BRASIL JANEIRO

3 A DEUS, Aos meus pais, irmãs, sobrinhos e ao meu noivo Samuel, que me incentivaram e me deram força para concluir este projeto de vida. DEDICO. 2

4 AGRADECIMENTOS A DEUS por sempre me dar forças e iluminar o meu caminho. Aos meus pais Nelci Rios e Celma Almeida pelo amor e apoio infinitos. Às minhas irmãs Cíntia, Soraia e Solange Rios pela força e carinho. Ao meu noivo Samuel pelo amor, dedicação e paciência, mesmo a 600 km. À minha família de Janaúba: Marikinha e Bruna e seus familiares. À Universidade Estadual de Montes Claros UNIMONTES. À Doutora Silvia Nietsche pela orientação incondicional, apoio, e, principalmente, agradeço sua indicação para o mestrado na UFV. Obrigada! Aos meus conselheiros Marlon Pereira e Adelica Xavier, pelos ensinamentos e orientações durante o curso e pelo apoio na realização deste experimento. Aos estagiários (Tiago, Márcia, Cynthia, Janaína, Telma, Roberto, Manoel e Lidiane), funcionários do laboratório de Micropropagação (Tatielle, Renata e Dona Ana) e Bill, pelo apóio técnico. A todos os meus colegas de turma. Ao pesquisador da EPAMIG/CTNM, Doutor Mário Sérgio Carvalho Dias, meu mestre, agradeço de coração. Aos demais professores e funcionários do curso de Agronomia. A EPAMIG/ CTNM de Nova Porteirinha/MG. E a todos que direta ou indiretamente colaboraram para o sucesso deste trabalho. OBRIGADA. 3

5 SUMÁRIO Pg. RESUMO... v 1 INTRODUÇÃO OBJETIVO REVISÃO DE LITERATURA IMPORTÂNCIA ECONÔMICA E SOCIAL DA BANANA PRODUÇÃO DE MUDAS E PROPAGAÇÃO DA BANANEIRA MÉTODOS DE PROPAGAÇÃO FRACIONAMENTO DO RIZOMA PROPAGAÇÃO ACELERADA IN VIVO PROPAGAÇÃO IN VITRO MICROPROPAGAÇÃO MÉTODOS DE ASSEPSIA TAMANHO DE EXPLANTES MATERIAL E MÉTODOS CULTIVAR SELECIONADA PREPARO DO EXPLANTE PROTOCOLOS DE ASSEPSIA IMPLANTAÇÃO DO EXPLANTE CARACTERÍSTICAS AVALIADAS DELINEAMENTO EXPERIMENTAL E ANÁLISE ESTATÍSTICA RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÕES REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

6 RESUMO O aprimoramento constante dos processos de multiplicação in vitro tem sido essencial para a sua aceitação no mercado. O objetivo do presente trabalho foi avaliar dois protocolos de assepsia na micropropagação de explantes de bananeira Prata-Anã de três comprimentos distintos. Meristemas apicais de diferentes comprimentos, 1,5 cm, 3,0 cm e 6 cm, submetidos a dois protocolos de assepsia, Des1 e Des2, foram cultivados in vitro, no Laboratório de Cultura de Tecidos do Campus da UNIMONTES, em Janaúba, por três subcultivos, em intervalos de 30 dias, em meio MS (MURASHIGE & SKOOG, 1962) suplementado com 6- BAP (7 mg/l), sacarose (30 g/l), ágar (7 g/l), vitaminas MS e ph 5,8. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com cinco tratamentos e quatro repetições. Foram realizadas avaliações de porcentagem de contaminação, número de plântulas produzidas e taxa multiplicativa. O protocolo Des2 proporcionou menores porcentagens de contaminação (45,83 %), comparado ao protocolo de Des1, com 77,08 %. A produção média foi de 74,55 explantes por ápice meristemático após 3 5

7 subcultivos. Os explantes de 3 cm e 6 cm de comprimento, proporcionaram maior acúmulo de plântulas até o 2º subcultivo. A taxa média multiplicativa acumulada por explante viável foi de 3,34 durante o cultivo in vitro, independente do tratamento utilizado. 1. INTRODUÇÃO A banana (Musa spp.) é a fruta mais produzida e consumida em todo o mundo. No Brasil, é a fruteira mais plantada, respondendo por 17% da produção mundial, porém participa com apenas 0,4% do volume das exportações mundiais (MASCARENHAS, 1999). A produtividade no Brasil é considerada baixa, inferior a 10t/ha/ano, devido à falta de variedades melhoradas, condução e manejos adequados dos plantios e, principalmente, a incidência de doenças e pragas (PEREIRA et. al., 1999). O grande crescimento da bananicultura, ocorrido nos últimos anos, acarretou uma forte demanda por mudas, muitas vezes de origem e qualidade duvidosa (SILVA et. al., 1999). No estado de Minas Gerais são cultivados 42 mil hectares de banana, com uma produção de 430 mil toneladas em 1999, e 584 mil 6

8 toneladas em Os principais municípios produtores do estado, Porteirinha, Jaíba, Janaúba, Nova Porteirinha, forneceram aproximadamente um terço do volume comercializado em 1997 nas seis unidades da CEASA MG - Central de Abastecimento de Minas Gerais (EPAMIG, 2001). Vale ressaltar o crescimento da banana Prata Anã no mercado mineiro, em relação às demais variedades, com aumento significativo no volume total que passou de 41% em 1990 para 57,1% em O estado de Minas é o principal produtor nacional desta variedade, sendo o maior fornecedor dos mercados mineiros, carioca e paulista, com participação na oferta destes estados em 95%, 56% e 64%, respectivamente (FRUTISÉRIE, 2000). Segundo Pereira et. al., 1999, citado por RIOS et. al., 2005, a expansão para novas áreas de cultivo tem sido limitada, principalmente pela oferta insuficiente de mudas, assim como pelo baixo padrão fitossanitário das mesmas. Tendo em vista que o sistema de propagação convencional é lento e de baixo rendimento, recentes estudos têm mostrado que a adoção da micropropagação é uma boa alternativa (SOUZA et. al., 1997). A utilização desta técnica em âmbito comercial já é realidade em diversos países do mundo. Os laboratórios comerciais trabalham com o objetivo de satisfazer as necessidades internas de material de propagação livre de doenças, ou de acelerar os métodos convencionais de propagação vegetativa (GRATTAPAGLIA, & MACHADO, 1998). A micropropagação da banana, ou propagação in vitro, consiste no cultivo de explantes em meio artificial sob condições específicas de luminosidade, temperatura e fotoperíodo, em laboratório. Entretanto, o êxito ou fracasso deste método depende de diversos fatores que devem ser controlados durante este processo (SOUZA, et. al., 2000). As principais vantagens deste método são: alta taxa de multiplicação em comparação aos métodos tradicionais e a alta qualidade fitossanitária das mudas. Além disso, a micropropagação é muito utilizada para produção de mudas básicas de novos cultivares de bananeira desenvolvidos pelos programas de melhoramento genético. Dessa forma, é possível atender com maior rapidez e eficiência as necessidades dos produtores (BRAGA et. al., 2001). 7

9 O aprimoramento constante dos processos de multiplicação in vitro e o controle de qualidade das mudas, aliado à redução de custos, têm sido essenciais para a sua aceitação no mercado (ASSIS et. al., 2000). 2. OBJETIVO O objetivo do presente trabalho foi avaliar dois protocolos de assepsia na micropropagação de explantes de bananeira Prata Anã, de três comprimentos distintos. 8

10 3. REVISÃO DE LITERATURA 3.1. Importância econômica e social da banana Explorada quase exclusivamente por pequenos agricultores, a cultura da banana exerce importante papel socioeconômico em muitos países emergentes, contribuindo não só para geração de renda, mas também para a fixação da mão-de-obra no meio rural. Colhem-se em todo o mundo cerca de 69 milhões de toneladas de bananas por ano, respondendo a Ásia e as Américas por quase 90% desse total. O Brasil é o segundo maior produtor mundial e a cultura se desenvolve em todos os estados, desde a faixa litorânea até o planalto central. Calcula-se que a área ocupada com a bananicultura no país alcance 513 mil hectares, com produção aproximada 9

11 de 6,5 milhões de toneladas, o que representa 9,4% do total mundial (FAO, 2005). A bananicultura brasileira apresenta diferenças, tanto pela diversidade climática dos locais onde é explorada, quanto pelo uso de cultivares, forma de comercialização e exigências do mercado consumidor. Geralmente, os cultivos são tradicionais, com baixos índices de capitalização e tecnologia. Em 2003, São Paulo foi o maior produtor de bananas, produzindo 17,5% do total nacional, seguindo-se Bahia (11,1%) e Pará (10,4%). A maioria das plantações apresenta baixo potencial de produtividade, com média nacional em torno de 13,2 t/ha/ano (AGRIANUAL 2005). O cultivo de bananeiras exerce um importante papel sócioeconômico para a região semi-árida do norte de Minas Gerais. Atualmente, são cultivados cerca de 15 mil hectares com bananeiras irrigadas. Considerando que cada três hectares de bananeira geram um emprego direto, podemos ter a dimensão de sua importância para a região (LAENDER, 2002). A bananicultura foi introduzida na região após os primeiros testes realizados pela EPAMIG, posteriormente, pelos produtores do Perímetro Irrigado do Gorutuba, situados em Porteirinha-MG. Os primeiros plantios ocorreram já no início da década de 80, com a variedade Nanicão, que sofreu intenso ataque de nematóides, comprometendo a sua viabilidade na região. Gradativamente, esta cultivar foi substituída pela Prata-Anã, devido a sua grande aceitação, melhor remuneração e qualidade de frutos (SOUTO et. al., 2001) Produção de mudas e propagação da bananeira As mudas constituem um dos componentes mais importantes na implantação do bananal, pois além de influenciarem de forma direta o desenvolvimento e produção, têm papel fundamental na qualidade fitossanitária do pomar. A propagação da bananeira se dá normalmente por via vegetativa, por meio de mudas, providas de uma ou mais gemas vegetativas 10

12 e cujo desenvolvimento forma uma nova bananeira. O ideal é que as mudas sejam oriundas de viveiros, que são áreas estabelecidas com a finalidade exclusiva de produção de material propagativo de boa qualidade. Segundo Alves, 1986, citado por SOUZA et. al., 2000, no caso de inexistência de viveiros, as mudas devem ser obtidas de bananal com plantas bem vigorosas e em ótimas condições fitossanitárias, cuja idade não seja superior a quatro anos e que não apresente mistura de variedades e presença de plantas daninhas de difícil erradicação, a exemplo da tiririca. Apesar de encontrarem-se em diferentes estádios de desenvolvimento (Figura 1), os vários tipos de mudas podem ser sintetizados em apenas duas categorias, segundo Moreira (1987), citado por ALVES (1997): rizomas inteiros e pedaços de rizoma. As mudas tipo rizoma se classificam em: (1) chifrinho: brotos de 20 a 30 cm de comprimento, com 2 a 3 meses de idade e peso variando entre 1000 e 2000 g; (2) chifre: brotos de 50 a 80 cm de comprimento, com folhas rudimentares na extremidade superior; (3) chifrão: mudas de 6 a 9 meses de idade, com folhas estreitas e peso entre 2000 e 3000 g e (4) muda alta (adulta): plantas jovens, com folhas inteiras ou definitivas, rizoma desenvolvido e bem enraizado, pesando acima de 5000 g. Os pesos citados referem-se à mudas com rizomas escalpelados e aparados, porém com os pseudocaules secionados na altura da roseta foliar. 11

13 Figura 1: Diferentes tipos de mudas. (A) chifrinho, (B) chifre, (C) chifrão, (D) guarda-chuva, (E) muda adulta, (F) rizoma com filho aderido, (G) pedaço de rizoma, (H) muda micropropagada Métodos de propagação A cultura da bananeira enfrenta dificuldades na sua propagação convencional, pois, além de ser lenta e apresentar uma baixa taxa de multiplicação, pode constituir uma forma de disseminação de pragas e doenças. Novos métodos de propagação vêm sendo desenvolvidos e aperfeiçoados, com o objetivo de elevar a taxa de multiplicação e de incrementar a produção de mudas de melhor qualidade. Entre esses métodos destacam-se o fracionamento de rizoma, a propagação rápida e os métodos de cultura de tecidos Fracionamento do rizoma: consiste no fracionamento do rizoma em vários pedaços, conforme o número de gemas existentes no mesmo, e posterior plantio dos pedaços de rizoma; Propagação acelerada in vivo: é um método de propagação intermediário entre a produção tradicional de mudas no campo e a 12

14 produção in vitro nos laboratórios de cultura de tecido. Este método foi inspirado na tendência natural que tem a bananeira de produzir mudas adventícias, a partir de ferimentos em meristema de gemas laterais. Possibilita a produção em áreas menores, de uma grande quantidade de mudas livres de doenças e de ciclos mais curtos Propagação in vitro: a micropropagação da bananeira pode contribuir para uma melhora da sanidade e uniformidade do material cultivado em campo, bem como para a propagação de clones que apresentem melhores características agronômicas. É uma ferramenta útil para o melhoramento genético desta cultura por meio de indução e exploração da variação somaclonal espontânea ou induzida através de mutagênicos químicos ou físicos, além de apresentar um rendimento de 150 a 300 mudas por matriz, num período de 6 a 8 meses (CRONAUER et al. 1984; NOVAK et al. 1987; GODINHO, 1994; SOUZA et al., 1997) Micropropagação No Brasil, a demanda por mudas de qualidade tem aumentado muito, tanto para a renovação de bananais de regiões produtoras como também para novas áreas, especialmente nos estados de São Paulo, Minas Gerais e Rio Grande de Norte (OLIVEIRA & SILVA, 1997). Com isso tem havido expansão dos laboratórios de micropropagação no país. A multiplicação in vitro consiste na melhor alternativa para se obter quantidade suficiente de mudas para o estabelecimento de novos plantios, principalmente com cultivares/híbridos recém lançados por Centros de Pesquisa. Além desse aspecto, as mudas de bananeiras micropropagadas apresentam as vantagens de serem multiplicadas em qualquer época do ano, em pequeno espaço físico; serem isentas de patógenos e pragas, necessitando serem verificadas no caso de viroses; proporcionarem uma homogeneidade nos tratos culturais e colheita devido a sua uniformidade; promoverem aumento na produção, além de alcançarem taxas de multiplicação diversas vezes mais elevadas que aquelas obtidas 13

15 com os métodos convencionais (ANGARITA & PEREA, 1991; ORELLANA et al., 1991; SANADA, 1993; OLIVEIRA & SILVA, 1997). A produção de mudas de bananeira por meio da micropropagação vegetativa tem apresentado amplo desenvolvimento, nos últimos anos, em diversos países. ISRAELI et al., (1995) estimam que, em 1991, foram micropropagadas de 15 a 20 milhões de mudas de bananeira no mundo. O êxito ou o fracasso da aplicação da micropropagação em bananeira, a exemplo de outras culturas, dependerá de diversos fatores, que devem ser controlados adequadamente durante o processo. O genótipo dos cultivares multiplicados, os meios de cultura, as condições ambientais, o explante, no que diz respeito à fonte, tipo, tamanho, fase e manejo empregado, exercem forte influência nas subseqüentes respostas obtidas in vitro (SANDOVAL et al., 1991; ZAFFARI et al., 1995; SOUZA & GONÇALVES, 1996). Segundo Hwang et al. (1984); Krikorian & Cronauer (1984); Hwang et. al. (1984); Vuylsteke & de Langhe (1985); Jarret (1986); Cronauer & Krikorian (1986); Novak & Micke (1988); Krikorian (1988); Krikorian (1989); Vuylsteke (1989), citados por ISRAELI et. al. (1995) muita informação tem sido acumulada sobre a cultura de Musa spp. in vitro e progressos significativos têm sido feitos, além das aplicações práticas introduzidas para o manejo da bananeira. Porém grande parte dos inúmeros trabalhos relacionados à obtenção de mudas de bananeira in vitro têm enfocado, principalmente, o tipo de explante, composição dos meios de cultura e condições físicas do ambiente que propiciam maiores taxas de multiplicação, assim como métodos distintos para o enraizamento (LAMEIRA et al., 1990; DOMINGUES et al., 1995; OLIVEIRA & MACHADO, 1997), sem considerar outros fatores como mão-de-obra, freqüência, tamanho de explantes a serem utilizados para a inoculação e contaminações microbianas, que ocorrem em altas porcentagens nas empresas de micropropagação. Em laboratórios da Alemanha, Inglaterra e Holanda, do total das contaminações, as perdas causadas por fungos, leveduras e bactérias foram de 10-35%, 10-35% e 20-55%, respectivamente. Nas biofábricas brasileiras, já foram registradas porcentagens de contaminação superiores a 30%, 14

16 causadas tanto por fungos como por bactérias. Em condições normais, as contaminações dos explantes de bananeira têm sido mais elevadas na fase de estabelecimento in vitro do que nas demais subculturas. Diversos protocolos de desinfestação de explantes de bananeira têm sido propostos, apresentando variações em função do tipo e concentrações da substância utilizada, tempo de tratamento e número de tratamentos (BERG & BUSTAMANTE, 1974; CRONAUER & KRIKORIAN, 1984; VUYLSTEKE, 1989; OLIVEIRA & SILVA, 1997) Métodos de Assepsia Na micropropagação de plantas, as contaminações causadas por fungos, bactérias e leveduras constituem as principais causas de perdas de material vegetal (LONG et al., 1988; LEIFERT & WOODWARD, 1998; DANTAS et al., 2000; PEREIRA et al., 2003). Embora alguns contaminantes como o Lactobacillus plantarum possam agir de forma direta sobre o crescimento e desenvolvimento dos explantes, a maioria compromete o desenvolvimento normal dos cultivos de forma indireta, pois compete por nutrientes e vitaminas do meio de cultura e produz metabólitos fitotóxicos, tais como os ácidos láctico e acético, cianeto, além de certos reguladores de crescimento e antibióticos, que intoxicam os tecidos vegetais podendo leválos à morte (BAKKER & SCHIPPERS, 1987; STANIER et al., 1987; KLOEPPER et al., 1989; LEIFERT et al., 1989, 1991). A ocorrência de fungos e leveduras pode ser mais facilmente percebida no meio de cultura após poucos dias de cultivo, o que, de certo modo, facilita a eliminação de material. Porém, a presença das bactérias, por serem, muitas vezes, de difícil visualização, nem sempre é evidenciada no início do cultivo, podendo, desta forma, serem disseminadas facilmente de um material para outro durante as etapas de multiplicação. Além disso, algumas estirpes não crescem prontamente no meio de cultura até que determinadas condições, nutrição e ph, sejam favoráveis ao seu desenvolvimento, permanecendo latentes no interior dos vegetais e tornando-se uma fonte importante de contaminação nos estádios mais 15

17 avançados de multiplicação do material vegetal (LEIFERT et al., 1991; LEIFERT & WOODWARD, 1998; MARINO et al., 2003). Segundo Salehi & Khosh-Khui, 1997, citados por PEREIRA & FORTES (2003) para o controle das contaminações bacterianas, normalmente são utilizadas substâncias antibióticas que são incorporadas ao meio de cultura ou usadas diretamente sobre os explantes. Mesmo que se utilize antibióticos de amplo espectro, o controle bacteriano na cultura de tecidos é problemático. Na maioria dos trabalhos in vitro, a freqüência de descontaminação não é total pois, os tecidos vegetais podem interferir no controle, por meio da destoxificação destas substâncias ou servindo como habitat para os contaminantes que se translocam por seus tecidos. É comum que as concentrações de antibióticos devam ser elevadas quando estes são adicionados ao meio nutritivo juntamente com o explante, no entanto a fitotoxicidade dessas substâncias é fator limitante dessas concentrações (PEREIRA & FORTES, 2003). Em virtude da fitotoxicidade e do alto custo do tratamento, os antibióticos devem ser utilizados apenas em contaminantes específicos das culturas, pois, somente as bactérias que estiverem dentro do espectro de ação de cada antibiótico serão controladas (LEIFERT et al., 1991; TENG & NICHOLSON, 1997; PEREIRA et al., 2003). Outros tipos de contaminação, particularmente por bactérias não endógenas e alguns fungos, são provenientes do campo, e neste caso devem ser feitos rigorosamente todos os tratamentos de desinfecção inicial dos explantes. A desinfecção deve ser feita em câmara de fluxo laminar, em condições assépticas, o que nem sempre impede que contaminações possam ocorrer. Várias substâncias com ação germicida são utilizadas para fazer a desinfestação dos explantes. As mais comuns são metanol, compostos à base de cloro, bases concentradas, isopropanol, algumas bases quaternárias, fenol, entre outros (LAMEIRA, et. al., 1988; MENDES, et. al., 1996; OLIVEIRA & SILVA, 1997; DAQUINTA, et. al., 2000; OLIVEIRA, et. al., 2000). 16

18 O hipoclorito de sódio ou o hipoclorito de cálcio podem ser utilizados em concentrações que vão de 0,05% (CRONAUER & KRIKORIAN, 1984), 5% (GRATTAPAGLIA & CALDAS, 1987) até 6% (SOUZA et al.1996), adicionado de algumas gotas de detergente liquido, como Tween 20 (CRONAUER & KRIKORIAN, 1986), Tween 80 (WONG, 1986) ou Teepol (CRONAUER & KRIKORIAN, 1986), para melhorar o contato das substâncias germicidas com os tecidos vegetais. Outro aspecto a ser considerado é o tempo de tratamento dos explantes, que apresenta inúmeras variações já propostas por diversos autores, tempos de tratamento que variam de 5 minutos (CRONAUER & KRIKORIAN, 1984), 10 minutos (SOUZA et al., 1996), 15 minutos (VUYLSTEKE et al., 1989) ou 20 minutos (SANDOVAL FERNANDEZ, 1985) de imersão. O metanol além de agir como germicida, possui ação surfatante, facilitando a ação de outros produtos. Em banana, SOUZA et al. (1996) indicam uma concentração de etanol de 70%, acima disso pode ocorrer rápida desidratação dos tecidos. Porém, VUYLSTEKE (1989) usou a concentração de 95% e não observou problemas dessa ordem. O fenol, ou ácido carbólico, um dos primeiros químicos utilizados como anti-séptico, lesa células microbianas pela alteração da permeabilidade seletiva de membrana citoplasmática, causando perda das substâncias intracelulares vitais. As concentrações utilizadas são mais elevadas que outros desinfetantes. Indica-se uma concentração de 5% para desinfecção em geral (DARIS, et. al., 1973; PELCZAR et. al., 1996). O peróxido de hidrogênio a 3%, é tóxico às bactérias anaeróbias, destruindo os componentes vitais da célula. Essa toxicidade deve-se a certas moléculas produzidas durante as reações envolvendo oxigênio, resultando na formação do radical superóxido, que causa danos às células bacterianas (PELCZAR et. al., 1996). Para cada etapa do processo de assepsia, exceto no caso da flambagem, recomenda-se realizar a tríplice lavagem com água destilada autoclavada, a fim de eliminar ou reduzir a quantidade de resíduos dos agentes desinfectantes, para os trabalhos in vitro (CARVALHO, 2004) Tamanho de explantes 17

19 Para eliminar microrganismos sistêmicos como vírus, bactéria ou micoplasma, quanto menor o explante, ou quanto mais isolado das regiões subjacentes vascularizadas, maior a chance de sucesso. Mesmo considerando microrganismos contaminantes superficiais, o fato de possuir menos tecido, para condições assépticas, reduz a quantidade desses microrganismos. SANDOVAL & MULLER (1987) e SOUZA et al., (1996) cultivaram ápices caulinares de bananeira com 1 mm e 2 mm de tamanho, observando, entretanto, que os tecidos desses explantes, após adquirirem certo desenvolvimento, tiveram o crescimento paralisado, sem lograrem diferenciação de plântulas. Diversos protocolos são propostos pela literatura para otimizar as condições de produtividade em laboratório de cultura de tecidos. SILAYOI, et. al. (1985) quando cultivaram ápices caulinares e LAMEIRA, et. al. (1988) obtiveram, em média, 3 brotos até 1 cm de comprimento, em sete semanas de incubação, utilizando explante com 0,5 cm 3 de tamanho. DOMINGUES et. al. (1995) trabalhando com cultura de ápices caulinares de Musa sp. var. Maçã, observaram que aqueles com 0,7 cm de diâmetro basal por 1 cm de comprimento, com remoção das bainhas foliares, apresentaram o maior número médio de brotos. ZAFFARI et al. (1995) observaram que a utilização de explantes grandes (7 a 8 mm) da cv. Grand Naine resultou em um aumento na taxa regenerativa quando a gema, empregada como explante, foi secionada longitudinalmente em duas partes e quando sofreu três incisões longitudinais eqüidistantes. Por outro lado, LAMEIRA et al. (1988), trabalhando com as cvs. Prata e Nanicão, relataram que o tamanho do explante não influenciou no número de brotos formados. As informações geradas por diversos trabalhos, LAMEIRA, PINTO & PASQUAL (1988); SANDOVAL FERNANDÉS (1985); ORELLANA, et.al. (1991) têm apresentado respostas diferentes, principalmente no número de plântulas e brotos obtidos, quando são utilizados explantes maiores para o estabelecimento. 18

20 4. MATERIAL E MÉTODOS 19

21 4.1. Cultivar selecionada Foi selecionada a cultivar Prata Anã, um triplóide do grupo genômico AAB, que apresenta pseudocaule vigoroso, porte de 2 a 3,5 metros, roseta compacta, frutos com formato de gargalo, tolerante ao frio, dispensa o uso de escoramento e pode atingir toneladas/ ha/ ciclo, suscetível a Sigatoka-negra, Sigatoka-amarela e ao Mal-do-Panamá (CARVALHO, 2004) Preparo do explante Rizomas de bananeira, tipo chifre, foram retirados do matrizeiro da UNIMONTES, localizado no município de Janaúba, região norte de Minas Gerais. Após seleção das mudas, estas foram conduzidas para a primeira etapa de limpeza mecânica, a qual consistiu na retirada das bainhas foliares e parte do seu rizoma, utilizando material cortante do tipo facão. Ao final do processo, os explantes apresentaram comprimento médio de 12, 10 e 6 cm por 3 cm de diâmetro. Em seguida, os explantes foram conduzidos ao laboratório de Cultura de Tecidos e Células Vegetais da UNIMONTES. Na segunda etapa de limpeza e assepsia, com auxílio de um bisturi, foi efetuada nova limpeza mecânica, reduzindo os explantes para comprimento de 8, 6 e 3 cm Protocolos de Assepsia Após a etapa da limpeza mecânica, foram aplicados, de forma individualizada, dois diferentes protocolos de assepsia. O primeiro tratamento (Des 1), constou da seguinte seqüência: solução de Sulfato de Estreptomicina (SSEP), (0,3 g/l), por 20 minutos, solução fungicida de Derosal (SFD), na concentração de 0,6% p.a. por 20 minutos, álcool comercial (AC), a 92,8% por 60 segundos e agitação por 25 minutos em solução de hipoclorito de sódio (HS), na concentração de 2% PV, adicionada 20

22 de três gotas de tween para um litro de solução, sempre intercalando tríplice lavagem com água estéril e deionizada. No segundo tratamento (Des 2), o processo foi alterado de acordo com a seguinte seqüência: SSEP, por 20 minutos, SFD, por 20 minutos, AC por 60 segundos, solução em agitação com fenol a 10%, por 10 minutos e em seguida agitação por 25 minutos em solução de HS, adicionada de três gotas de tween para um litro de solução. Após os tratamentos, os explantes foram conduzidos à câmara de fluxo laminar para finalizar o processo de limpeza e redução dos explantes. Nesta fase, os explantes destinados ao protocolo Des 2, foram mergulhados em peróxido de hidrogênio p.a., por 10 segundos Implantação do explante Na câmara de fluxo laminar, os explantes foram lavados três vezes com água deionizada e autoclavada, reservando-os em água estéril. A seguir efetuou-se a terceira etapa de limpeza mecânica, utilizando pinça e bisturi cirúrgico, deixando gemas com 1,5 cm (E1), 3 cm (E2) e 6 cm (E3) de comprimento. Estas foram inoculadas em tubos de ensaio com 8 ml do meio MS (MURASHIGUE & SKOOG, 1962) suplementado com sacarose (30 g.l - 1 ), 6-Benzilaminopurina (BAP)(7 mg.l -1 ), carvão ativado (2,5 g.l -1 ), Vitaminas do Witte (10 mg.l -1 ), Mio inositol (0,1 g.l -1 ) e Ágar (7 g. L -1 ). Na fase de estabilização os explantes permaneceram em ambiente totalmente escuro durante sete dias, e em seguida, foram mantidos vinte e um dias em sala de cultivo com lâmpadas fluorescentes do tipo super luz do dia de 40 Watts, intensidade luminosa de 25 W. m -2, temperatura de 25 3 C e fotoperíodo de dias longos (16 horas de luz e oito horas no escuro). Para a fase de multiplicação, foram utilizados frascos com 10 cm de altura por 6 cm de diâmetro, com 20 ml de meio MS (MURASHIGUE & SKOOG, 1962) suplementado com sacarose (30 g.l -1 ), 6-benzilaminopurina (BAP)(7 mg.l -1 ), vitaminas do Witte (10 mg.l -1 ), mio inositol (0,1 g.l -1 ) e Ágar (7 g. L -1 ). Esta fase foi composta de 3 subcultivos, cada um com duração média de 30 dias. No primeiro subcultivo de multiplicação, os explantes E1 foram retirados e cortados longitudinalmente ao meio e as duas metades subcultivadas para novo meio. Já os explantes E2 e E3, foram 21

23 cortados longitudinalmente ao meio por duas vezes, originando 4 partes. A partir do segundo subcultivo, o processo de multiplicação foi realizado por meio de subcultivos das gemas laterais, sendo efetuada a divisão longitudinal dos explantes sempre que possível, 2; 3 ou 4 partes, conforme o tamanho do ápice meristemático. Em cada frasco foram dispostos 4 segmentos de meristema Características avaliadas Durante a fase de multiplicação in vitro, foram avaliadas as porcentagens de contaminações. Avaliou-se, ainda, ao final de cada subcultivo, o número de explantes produzidos, obtendo-se a taxa multiplicativa para cada tratamento Delineamento experimental e análise estatística O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com cinco tratamentos e quatro repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste Tukey a 5% de probabilidade. 22

24 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO As maiores porcentagens de contaminação foram encontradas para os explantes de 1,5 e 3 cm no protocolo de assepsia Des 1 e para o maior explante, de 6 cm, no protocolo de assepsia Des 2, 62,5%, 75% e 62,5%, respectivamente (Figura 1). Os elevados índices de perdas durante a fase de estabelecimento in vitro dos explantes de bananeira, estão de acordo com os resultados obtidos por OLIVEIRA et al. (1999). Segundo OLIVEIRA & SILVA (1997) em condições normais, as contaminações dos explantes de bananeira têm sido mais elevadas nesta fase que nas demais subculturas. LAMEIRA, et. al. (1988) obtiveram até 73% de contaminação, utilizando explantes de 1,5 cm 3. OLIVEIRA & MACHADO (1997) obtiveram taxas de contaminação de até 61,38% durante a fase de estabelecimento da cultivar Prata Comum em um laboratório comercial no Brasil. Os protocolos de desinfestação foram 100% eficientes no controle de fungos. As contaminações foram causadas exclusivamente por bactérias em todas as fases da cultura in vitro, apresentando coloração esbranquiçada a creme, sendo freqüentes em cultura de tecidos de bananeira (OLIVEIRA & SILVA, 1997; OLIVEIRA et al., 1999). Segundo LEIFERT et al. (1994), apesar da perda inicial, fungos e leveduras crescem bem em meio de cultura, podendo ser identificada sua presença logo no início do cultivo. Entretanto, as contaminações bacterianas, especialmente aquelas que permanecem latentes in vitro, ou seja, não apresentam crescimento visível no meio nem sintomas nos tecidos, tornam-se mais agravantes (PEREIRA, et. al., 2003). BORGES et al. (1997) sugerem que o tratamento que as matrizes recebem antes de entrar no laboratório é mais determinante na redução da porcentagem de contaminação do que o tratamento de desinfestação. Desta forma, recomenda-se a condução de um banco de matrizes com adequada drenagem, fertilização, tratamento fitossanitário e tratos culturais, além da assepsia durante a coleta das matrizes. Segundo Leifert et al. (1994), citados por OLIVEIRA, et. al. (2000) tem sido bastante difícil distinguir quando a contaminação é 23

25 proveniente do explante ou do laboratório. Porém, os indícios sugerem que essas bactérias sejam provenientes dos tecidos de bananeira, devido, principalmente, à freqüência com que se manifestam. As bactérias aptas à multiplicação podem ser encontradas nas cavidades subestomatais ou nos espaços intercelulares das plantas, onde ficam protegidas da ação dos agentes de desinfestação, ou, ainda, latentes nos tecidos vasculares de plantas aparentemente sadias. Isto pode explicar o seu aparecimento ao longo da fase de multiplicação dos tecidos de bananeira. Não foi possível avaliar, estatisticamente, o comportamento do explante com 6 cm de comprimento, utilizando o protocolo de assepsia Des1. A alta porcentagem de contaminação na fase de estabelecimento in vitro, 94%, eliminou o tratamento. A utilização do protocolo de assepsia Des 2 promoveu redução nos índices de contaminação de 62,5% para 37,5%, utilizando-se o explante de 1,5 cm e de 75% para 37,5%, utilizando-se o explante de 3 cm. A utilização do fenol, por alterar a permeabilidade seletiva da membrana citoplasmática, causando perda das substâncias intracelulares vitais, e do peróxido de hidrogênio, destruindo componentes vitais da célula, influenciou positivamente no menor índice de contaminação durante o estabelecimento in vitro (PELCZAR et. al., 1996) ,5 b 75 b 62,5 b 40 37,5 a 37,5 a 20 0 E1Des1 E1Des2 E2 Des1 E2 Des2 E3 Des2 Figura 1. Porcentagem de contaminação dos explantes E1, E2 e E3, durante a fase de estabelecimento, nos protocolos de assepsia Des 1 e Des 2. CARVALHO (2004) trabalhando com diferentes variedades de bananeira, detectou porcentagens médias de contaminação dos explantes de Prata Anã, FHIA-18 e SH-3640, de, respectivamente, 33,33%, 45,83% 24

26 e 29,16%, independentemente do tratamento asséptico utilizado. Segundo este mesmo autor, a maior porcentagem de contaminação por bactérias gram negativas foi observada para as variedades Prata Anã e SH Enquanto que para a variedade FHIA-18, grande parte das bactérias detectadas foi do tipo Gram positiva. De maneira geral, vários são os fatores que podem influenciar os índices de contaminação na fase de estabelecimento in vitro, dentre os quais podemos citar, o tamanho do explante, a qualidade da muda, a metodologia de assepsia e o manipulador. De acordo com LAMEIRA (1987) quanto menor o tamanho do explante, menor a porcentagem de contaminação. Durante a fase de multiplicação, as taxas de contaminações foram menores, sendo, em média, de 3,75%, 1,02% e 3,19% no 1º, 2º e 3º subcultivos, respectivamente (Tabela 1). Estes valores foram bastante inferiores aos obtidos por OLIVEIRA & MACHADO (1997) com média de 18,90% e por OLIVEIRA et. al. (1999) com 13,10%. A tabela 1 apresenta as porcentagens médias de contaminação em cada subcultivo para os explantes E1, E2 e E3, nos dois protocolos de assepsia, Des1 e Des2. As menores porcentagens de contaminação foram obtidas com explantes de 1,5 e 3 cm de comprimento, associados ao protocolo de desinfecção 2. A utilização do fenol e do peróxido de hidrogênio também influenciou positivamente no menor índice de contaminação durante a fase de multiplicação. As porcentagens de contaminação aumentaram no 3º subcultivo, em relação aos demais. Segundo LEIFERT et al. (1991); LEIFERT & WOODWARD (1998); MARINO et al. (2003) algumas estirpes não crescem prontamente no meio de cultura até que determinadas condições, nutrição e ph, sejam favoráveis ao seu desenvolvimento, permanecendo latentes no interior dos vegetais e tornando-se uma fonte importante de contaminação nos estádios mais avançados de multiplicação do material vegetal. PEREIRA & FORTES (2003) relatam que, na maioria dos trabalhos in vitro, a freqüência de descontaminação não é total, pois, os tecidos vegetais podem interferir no controle, por meio da destoxificação destas substâncias ou servindo como habitat para os contaminantes que se translocam por seus tecidos. 25

27 Tabela 1: Porcentagens médias de contaminação (%) nos três subcultivos (1º, 2º e 3º), para os explantes E1 (1,5 cm), E2 (3 cm) e E3 (6 cm), de bananeira Prata-Anã, nos dois protocolos de assepsia, Des1 e Des2. Tratamentos Subcultivos 1º 2º 3º E1 Des E1 Des E2 Des E2 Des E3 Des Média A produção média foi de 74,55 explantes por ápice meristemático após 3 subcultivos. MENDES et al. (1996) obtiveram 676 plantas/explante (variando de 143 a 1850) para a variedade Nanicão, após seis subcultivos, enquanto OLIVEIRA & SILVA (1997) obtiveram uma eficiência de 190 plântulas/explante viável, após o mesmo período e utilizando a mesma variedade. Considerando a taxa multiplicativa média do presente trabalho, 3,34 explantes nos três subcultivos, estima-se uma produção final de 2777,71 plântulas após o sexto subcultivo. Segundo JARRET (1986) são significativas as variações em relação à capacidade proliferativa in vitro dentre as cultivares de banana. Ao final de cinco subcultivos, SANDOVAL et al. (1991) obtiveram valores acumulados médios de 95 brotos por explante para a cv. Curraré; 211 para a cv. Dominico; 366 para a cv. Gran Enano e 93 para a cv. Valery. Já OLIVEIRA & SILVA (1997) obtiveram médias de 189,2 para a cv. Nanicão e OLIVEIRA et al. (1999) obtiveram 68,38 para a cv. Prata-Anã. Os explantes com 3 e 6 cm de comprimento, proporcionaram maior acúmulo de plântulas até o 2º subcultivo (Tabela 2). Porém, no 3º subcultivo, não foram detectadas diferenças significativas para número de plântulas produzidas, em função do comprimento do explante utilizado como matriz. ZAFFARI et al. (1995) observaram que a utilização de explantes grandes (7 a 8 mm) da cv. Grand Naine resultou em um aumento na taxa regenerativa quando a gema, empregada como explante, foi secionada longitudinalmente em duas partes e quando sofreu três incisões longitudinais eqüidistantes. Por outro lado, LAMEIRA et al. (1988), trabalhando com as 26

28 cvs. Prata e Nanicão, relataram que o tamanho do explante não influenciou no número de brotos formados. Houve um aumento do número de explantes com o avanço dos subcultivos (Tabela 2). Segundo ANGARITA & PEREA (1991) este crescimento exponencial do número de plântulas continua nas subculturas posteriores à sexta geração, e poderia representar um aumento substancial no número de mudas produzidas por matriz, não fosse a ocorrência de variação somaclonal. O fenômeno da variação somaclonal pode ser definido como uma variabilidade genética gerada durante a cultura in vitro, o que corresponde ao aparecimento de plantas anormais durante o processo de multiplicação, principalmente relacionado à estatura, cor, forma e arquitetura das folhas (LARKIN & SCOWCROFT, 1981; ISRAELI, et. al., 1991). A taxa média multiplicativa acumulada por explante viável foi de 3,34 durante o cultivo in vitro, independente do tratamento utilizado (Tabela 3). Segundo Banerjee & De Langhe (1985), Vuylsteke & De Langhe (1985) e Wong (1986), citados por OLIVEIRA, et. al. (2000) a taxa de multiplicação apresenta uma grande variação em função do genótipo e de outros fatores relativos à cultura de tecidos, sendo, em geral, obtidas de 2 a 10 plântulas por subcultivo de 4 a 5 semanas. No entanto, segundo JARRET et al. (1985) podem ser obtidas até 31 plântulas por subcultivo. A literatura cita que taxas mais elevadas de multiplicação ocorrem entre o 2º e o 6º subcultivo, quando os explantes já se encontram mais adaptados às condições in vitro (OLIVEIRA & SILVA, 1997; OLIVEIRA et al., 1999), porém, para o presente trabalho, as maiores taxas multiplicativas foram encontradas no 2º subcultivo, para o tamanho de explante de 1,5 cm utilizando-se os protocolos de assepsia Des1 e Des2, 5,45 e 6,19, respectivamente. Os tratamentos com os explantes maiores, 3 e 6 cm de comprimento, nos protocolos Des 1 Des 2 (Tabela 3), apresentaram menores taxas multiplicativas no 2º subcultivo. 27

29 Tabela 2 - Número de explantes de bananeira Prata-Anã nos subcultivos 1, 2 e 3 para os explantes E1 (1,5 cm), E2 (3 cm) e E3 (6 cm), nos dois protocolos de assepsia, Des1 e Des2. Número de explantes Tratamento Subcultivos E1Des1 4 b b 59 a E1Des2 4 b b 79 a E2Des a 67 a 76.5 a E2Des a a 87.5 a E3Des a 59 a a CV (%) Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo Teste Tukey a 5% de probabilidade. Tabela 3 - Taxas multiplicativas durante o cultivo in vitro de bananeira Prata- Anã nos subcultivos 0, 1 e 2 para os explantes E1 (1,5 cm), E2 (3 cm) e E3 (6 cm), nos dois protocolos de assepsia, Des1 e Des2. Taxa multiplicativa Tratamentos Subcultivos E1Des1 2 b 2.69 b 5.45 a E1Des2 2 b 3.19 b 6.19 a E2Des a b 5.62 a 1.15 b E2Des a 4.24 a b 1.33 b E3Des a b 3.8 b 1.21 b CV (%) Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si, pelo Teste Tukey a 5% de probabilidade. Para o 1º subcultivo, o explante com 3 cm de comprimento, apresentou maior taxa média multiplicativa, 4.93, independente do protocolo de assepsia utilizado, porém, a taxa para o 2º subcultivo foi reduzida para uma média de 1,24. Isto pode ser devido a uma aceleração na fase de crescimento ativo destes explantes, advinda das altas taxas multiplicativas no subcultivo anterior. Segundo GRATTAPAGLIA & MACHADO (1998) se uma planta entra, precocemente, nesta fase de crescimento ativo, é provável que com 3 semanas ela entre em senescência ou não apresente mais a mesma taxa de proliferação anterior. Nesse caso, uma repicagem a cada 2,5 semanas com uma taxa de 1:3 é melhor do que uma repicagem a cada 4 semanas com uma taxa de 1:4, ou seja, num período de 20 semanas, o primeiro sistema produziria 3 8 produziria apenas 4 5 ou plantas. ou plantas, enquanto o segundo 28

30 Apesar das porcentagens de contaminação na fase de multiplicação terem sido menores com o uso do protocolo de descontaminação 2, não houve diferença estatística para o número de explantes produzidos após o 3º subcultivo. O uso do fenol e do peróxido de hidrogênio permitiram redução nos índices de contaminação, porém podem ter prejudicado o desempenho das plântulas. A maior porcentagem de contaminação, de 12,5%, foi encontrada no 1º subcultivo, para o explante de 3 cm utilizando-se o protocolo de descontaminação 1. Porém este tratamento foi o que apresentou a maior taxa multiplicativa, de 5,62. Isto pode estar relacionado à presença de microrganismos benéficos nos tecidos vegetais. Segundo PEIXOTO NETO et. al., 2006, é possível que bactérias epifíticas ou endofíticas possam promover o aumento de produtividade da planta por sintetizar substâncias que atuam na regulação do crescimento e/ou no seu metabolismo. ARAÚJO, 2000, apresentou resultados de Burkholderia cepacia com potencial para controle biológico de F. oxysporum f. sp. cubense em bananeira. 6. CONCLUSÕES O protocolo de assepsia, com utilização do fenol e peróxido de hidrogênio, foi mais eficiente na redução da porcentagem de 29

31 contaminação na fase de estabelecimento in vitro, na micropropagação da bananeira Prata-Anã. O explante de 3 cm de comprimento apresentou a maior média de plântulas produzidas por matriz e a maior taxa multiplicativa média até o 3º subcultivo. No terceiro subcultivo de explantes de bananeira Prata-Anã, houve uma produção de 74 novos explantes, a partir de uma única plântula, independente do comprimento inicial do explante. O explante com 6 cm de comprimento apresentou mais de 60% de contaminação na fase de estabelecimento, o dobro quando comparado aos comprimentos 1,5 cm e 3 cm, os quais não diferiram entre si. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AGRIANUAL Anuário Estatístico da Agricultura Brasileira p.,

32 ÁLVARES, M. C. & CALDAS, L.S. Crescimento, produção e variação somaclonal em bananeiras micropropagadas. Disponível em: Acesso em: 05 de fevereiro de ALVES, E. J., ORG. A cultura da banana: aspectos técnicos, socioeconômicos e agroindustriais. Brasília: Embrapa-SPI/Cruz das Almas: Embrapa-NPMF 585p., ANGARITA, A.; PEREA, M. Micropropagación de plátanos y bananos. In: ROCA, W.M.; MROGINSKI, L.A. (Ed.) Cultivo de tejidos en la agricultura. Cali: CIAT. p , ARAÚJO, W.L. A comunidade bacteriana endofítica de citros e sua interação com Xylella fastidiosa, agente causal da Clorose Variegada dos Citros (CVC). Piracicaba: ESALQ/USP, p. Tese de Doutorado. ASSIS, M. de; PAIVA, M.; ARAMANI, O. C. Micropropagação de plantas: histórico de uma empresa comercial. Informe Agropecuário. Belo Horizonte, v.21, n.204, p , BAKKER, A. W.; SCHIPPERS, B. Microbial cyanide production in the rhizosphere in relation to potato yield reduction and Pseudomonas spp.- mediated plant growth-stimulation. Soil Biology and Biochemistry, Oxford, v. 19, n. 4, p , BERG, L. A.; BUSTAMANTE, M. Heat treatment and meristem culture for the production of virus free bananas. Phitopathology, St Paul, v.64, p , BORGES, A.L.; ALVES, E.J.; SILVA, S. de O. e; SOUZA, L. da S.; MATOS, A.P. de; FANCELLI, M.;OLIVEIRA, A.M.G.; CORDEIRO, Z.J.M.; SILVEIRA, J.R.S.; COSTA, D. da C.; MEDINA, V.M.; OLIVEIRA, S.L. de; SOUZA, J. da S.; OLIVEIRA, R.P. de; CARDOSO, C.E.L.; MATSUURA, F.C.A.U.; ALMEIDA, O. de. O cultivo da banana. Cruz das Almas : EMBRAPA- CNPMF. 109 p. (Circular Técnica, 27), BRAGA, M. F; LISEI DE SA, M. E; MUSTAFÁ, P. C. Avaliação de um protocolo para multiplicação in vitro da bananeira (Musa sp.) cv. caipira (AAA). Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 23, n. 2, p , CARVALHO, S.V.M. Metodologias de assepsia para produção de mudas micropropagadas de diferentes variedades de bananeira (Musa spp.). Janaúba, p. Monografia Universidade Estadual de Montes Claros. CRONAUER, S.S.; KRIKORIAN, A.D. Banana (Musa spp.). In: BAJAJ, Y.P.S. (Ed.) Biotechnology in agriculture and forestry. Berlin: Springer Verlag. v.1, p ,

33 CRONAUER, S. S.; KRIKORIAN, A. D. Multiplication of Musa from excised stem tips. Annals of Botany, London, v. 53, n.3, p , DAQUINTA, M.; LEZCANO, Y. ESCALONA, M. & SANTOS, R. Multiplicación in vitro del banano FHIA-18 com paclobutrazol y thiadiazuron en diferentes formas de cultivo. Revista Brasileira de Fruticultura, Jaboticabal, v. 22, n. 1, p , DANTAS, A. C. M.; PEREIRA, J. E. S.; FORTES, G. R. L. Descontaminação e efeito do fungicida benomil sobre a multiplicação do porta-enxerto de macieira M. 9. Agropecuária Clima Temperado, Pelotas, v. 3, n. 2, p , DARIS, B.D.; DULBECO, R.; EISEN, H.N.; GINSERG, H.S. & WOOD JUNIOR, W.B. Microbiologia: fisiologia bacteriana. v.1, p , DOMINGUES, E. T.; TULMANN NETO, A.; MENDES, B. M. J. Cultura de ápices caulinares de Musa sp., var. maca: estabelecimento, micropropagação e enraizamento in vitro. Scientia Agrícola. Piracicaba, v.52, n.2, p , EPAMIG, Anais 1º Simpósio Norte Mineiro sobre a cultura da banana. Montes Claros. Ed. UNIMONTES, 279p., FAO. Disponível: Site: FAO. URL: http. /apps.fao.org. Acesso em : 20 de setembro de FRUTISÉRIE, Ministério da Integraçao Nacional MI Secretaria de Infraestrutura Hídrica SIM & Departamento de Projetos Especiais DPE; Brasília DF. (Publicação avulsa). Agosto de GODINHO, F.P. de. Mudas de Bananeira: Tecnologia de produçao. Belo Horizonte: EPAMIG. 44p. Boletim Técnico, 44, GRATTAPAGLIA, D.; CALDAS, L.S. Micropropagação do porta enxerto tangerina Sunki (Citrus sunki) a nível comercial. In: SIMPÓSIO NACIONAL DE CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS, 2., 1987, Brasília, DF. Resumos... Brasília. P10, GRATTAPAGLIA, D. & MACHADO, M.A. Micropropagação. In: TORRES, A.C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J.A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília: EMBRAPA/SPI, p , ISRAELI, Y.; LAHAV, E.; REUVENI, O. In vitro culture of bananas. In: GOWEN, S., (ed) Bananas and plantains, London: Champman & Hall, cap.6, p , ISRAELI, Y.; REUVENI, O; LAHAV, E. Qualitative aspects of somaclonal variation by in vitro techniques. Scientia Horticulturae, Amsterdan, v. 48, p ,

34 JARRET, R.L.; RODRIGUEZ, W.; FERNANDEZ, R. Evaluation, tissue culture, propagation and dissemination of 'Saba' and 'Pelipita' plantains in Costa Rica. Sciencia Horticulturae, Amsterdan, v.25, p , JARRET, R. L. In vitro propagation and concervation of bananas and plantains. In: IBPGR Advissory Committee on in vitro Storage, Report of the meeting (Appendix). Roma, Italy, KLOEPPER, J. W.; LIFSHITZ, R.; ZABLOTOWICZ, R. M. Free-living bacterial inocula for enhancing crop productivity. Trends in Biochemical Science, Amsterdam, v. 7, p , LAENDER, F.C.; Diagnóstico nutricional da bananeira Prata Ana para o Norte de Minas. Silva, J.T.A.; Borges, L.A.; Dias, M.S.C.; Costa, E. L. & Prudencio, J.M. Belo Horizonte: EPAMIG, Boletim técnico, 70, 16p, LAMEIRA, O.A. Propagação in vitro da bananeira Musa sp. através da cultura de ápice caulinar. Lavras. 39p. Dissertação (Mestrado) - Escola Superior de Agricultura de Lavras, LAMEIRA, O.A.; PINTO, J.E.B.P.; PASQUAL, M. Efeito do tamanho do explante no desenvolvimento in vitro da bananeira (Musa acuminata Colla) cultivares prata e nanicão. Ciência Prática, Lavras, v.12, n.2, p , LAMEIRA, O A; PINTO, J. E. B. P.; PASQUAL, M. Propagação in vitro da bananeira Prata através da cultura de tecidos. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v.25, n.11, p , LEIFERT, C.; CAMOTTA, H.; WRIGHT, S. M.; WAITES, B.; CHEYNE, V. A.; WAITES, W. M. Elimination of Lactobacillus plantarum, Corynebacterium spp., Staphylococcus saprophyticus and Pseudomonas paucimobilis from micropropagated Hemerocallis, Choisya and Delphinium cultures using antibiotics. Journal of Applied Bacteriology, London, v. 71, n. 4, p , LEIFERT, C.; MORRIS, C.E.; WAITES, W. M. Ecology of microbial saprophytes and pathogens in tissue culture and field grown plants; reasons for contamination problems in vitro. Critical Reviews in Plant Sciences, Boca Raton, v.13, n.2, p , 1994 LEIFERT, C.; WAITES, W. M.; NICHOLAST, J. R. Bacterial contaminants of micropropagated plant cultures. Journal of Applied Bacteriology, London, v. 67, p , LEIFERT, C.; WOODWARD, S. Laboratory contamination management: the requirement for microbiological quality assurance. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Dordrecht, v. 52, p ,