Sarna comum da Batata (Streptomyces spp.): resultados preliminares de levantamento e caracterização de isolados no Brasil.

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1 Sarna comum da Batata (Streptomyces spp.): resultados preliminares de levantamento e caracterização de isolados no Brasil. Suzete A.L. Destéfano 1 ; Júlio Rodrigues Neto 1 ; Denise Salomão 1 ; Rafaela P. Massucato 1 ; Natalino Shimoyama 2. 1 Instituto Biológico, LABORATÓRIO DE C.P. 70, CEP , Campinas, SP; 2 ABBA, Itapetininga, SP. ABSTRACT: Potato scab (Streptomyces spp.): preliminary results of survey and characterization of isolates from Brazil. A collection of over 72 Streptomyces spp. strains isolated from different geographic regions of Brazil, including the states of Bahia, Goiás, Minas Gerais, Paraná and São Paulo, were established. Preliminary results of morphological characterization showed high heterogeneity in respect to the morphology, colony colours and melanin production (dark pigment) of the strains. Genetic characterization data of the 16S-23S rdna spacer region indicated five distinct restriction patterns with 43% of strains belonging to the S. scabiei species and the remaining strains showing homology of profiles with S. acidiscabiei, S. caviscabiei and S. turgidiscabiei species. However, some strains showed major differences in banding patterns in comparison with the type strains of Streptomyces associated to potato scab, suggesting the occurrence of undescribed species. The next step will be the sequencing of the spacer region of the strains in order to clarify the classification of these strains. Keywords: Solanum tuberosum, spacer region, nec1 gene INTRODUÇÃO A sarna comum da batata é uma doença de ocorrência generalizada nas regiões produtoras do Brasil e reduz consideravelmente a comercialização do produto devido aos sintomas externos causados nos tubérculos. Várias espécies de Streptomyces têm sido associadas a essa doença em batata (Park et al., 2003). A bactéria pode causar desde lesões superficiais ou corticosas, lesões em forma de rede (reticulada) ou lisas, erumpentes ou profundas. Estes sintomas têm sido, historicamente, atribuídos a Streptomyces scabiei e, aparentemente, formam um complexo patógeno/batata/ambiente, devido à diversidade de sintomas e do agente causal.

2 Atualmente, cerca de 10 espécies de Streptomyces têm sido associadas à sarna da batata: S. scabies, S. acidiscabies (Lambert & Loria, 1989a, 1989b), S. caviscabies (Goyer et al., 1996), S. turgidiscabies (Miyajima et al., 1998), S. euroeiscabiei, S. stelliscabiei, S. reticuliscabiei (Bouchek-Mechiche et al., 2000), S. luridiscabiei, S. puniciscabiei, S. niveiscabiei (Park et al., 2003). Fatores relacionados à indução da doença também foram estudados (Bukhalid et al., 1998), indicando a correlação da presença da taxtomina A como fator determinante da patogenicidade de S. scabiei, S. acidiscabies e S. ipomoeae em batata, bem como o gene nec1 responsável pela biossíntese dessa fitotoxina. Estudos para a identificação de isolados nacionais são de extrema importância para o conhecimento das populações de Streptomyces que ocorrem no país, indispensáveis tanto em estudos epidemiológicos bem como para o desenvolvimento de metodologias para o controle da doença. Assim, o presente trabalho visa o levantamento e a caracterização de isolados de Streptomyces spp. oriundos de diferentes regiões do país, por meio de métodos moleculares (análise da região espaçadora 16S-23S e presença do gene nec1) e caracteres fenotípicos e morfológicos. MATERIAL E MÉTODOS Isolamento As lesões características de sarna foram recortadas, lavadas, colocadas em microtubos contendo 1,5 ml de água destilada, e mantidas em banho-maria a 56 C por 40 minutos. A seguir, as lesões foram maceradas em água destilada esterilizada e a suspensão resultante foi semeada em placas de Petri contendo meio Ágar-água (Agar 18g; Cicloheximida 100ppm; Água destilada q.s.p. 1000mL; ph9,5). As placas foram incubadas a 28 ºC. Após o aparecimento de colônias típicas de Streptomyces, estas foram selecionadas e transferidas para meio YME (Extrato de Levedo 4g; Extrato de Malte 10g; Glucose 4g; Ágar 18g; Água Destilada q.s.p. 1000mL; ph7,0) e incubadas a 28ºC pelo período de 7 a 14 dias. Posteriormente, as linhagens de Streptomyces isoladas foram preservadas por meio de liofilização ou por ultracongelamento ( 80ºC). Caracterização Morfológica As características morfológicas e bioquímicas das linhagens de Streptomyces spp. foram avaliadas de acordo com o protocolo do Projeto Internacional de Streptomyces

3 (ISP) (Shirling & Gottlieb, 1966). Estruturas de micélio (hifas) foram observadas em microscopia óptica. A produção de melanina foi observada em meio YME. Extração de DNA genômico em pequena escala As culturas de Streptomyces spp. foram submetidas à extração de DNA de acordo com a metodologia descrita por Pitcher et al. (1989), com algumas modificações. Na caracterização molecular foram incluídas as 10 linhagens Tipo de Streptomyces spp. associadas à sarna da batata para comparação com os isolados nacionais. As linhagens Tipo e os isolados obtidos estão depositados na Coleção de Culturas de Fitobactérias do Instituto Biológico (IBSBF), Campinas. Amplificação da região espaçadora 16S-23S DNAr e gene nec1 O par de primers utilizado para a amplificação da região espaçadora 16S-23S foi phr (Massol-Deya et al., 1995) e p322-anti (Honeycutt et al., 1995). O gene nec1 foi amplificado com os pares de primers Nf e Nr (Bukhalid et al., 1998). Digestão dos produtos de PCR com endonucleases de restrição (PCR-RFLP) Os produtos de PCR correspondentes à região espaçadora 16S-23S DNAr foram digeridos com enzimas de restrição. Os perfis apresentados pelos isolados brasileiros foram comparados com os perfis obtidos das diferentes linhagens Tipo de Streptomyces spp. para possível identificação das linhagens que ocorrem no Brasil. Os isolados de cada grupo, considerados idênticos no perfil, foram selecionados para sequenciamento. RESULTADOS E DISCUSSÃO Foram obtidas 72 linhagens de Streptomyces spp., isoladas de materiais de batata coletados por produtores, técnicos do Instituto Agronômico de Campinas (IAC) e ABBA, sendo 10 linhagens do Estado da Bahia, 11 de Goiás, 17 de Minas Gerais, 11 do Paraná e 23 de São Paulo. Resultados preliminares da caracterização morfológica mostraram alta heterogeneidade com relação à morfologia e coloração das colônias, bem como da produção de melanina (pigmento escuro), indicando, provavelmente, a ocorrência de diferentes espécies de Streptomyces em nosso meio. A comparação dos perfis das linhagens Tipo de Streptomyces spp. com os dos isolados das diversas regiões produtoras do Brasil indicou a presença de cinco diferentes padrões de restrição, sendo que cerca de 43% de linhagens apresentaram perfis semelhantes à espécie Streptomyces scabiei, e o restante delas assemelharam-se às espécies S. acidiscabiei, S. caviscabiei e S. turgidiscabiei, indicando a provável ocorrência dessas espécies. Entretanto, um número razoável de isolados apresentaram perfis

4 genéticos totalmente diferentes das espécies Tipo descritas, podendo tratar-se de espécies ainda não caracterizadas e/ou identificadas. Devido às diferenças encontradas, será realizado o sequenciamento da região espaçadora 16S-23S dessas linhagens para a confirmação da existência ou não de novas espécies. CONCLUSÕES foi estabelecida uma coleção de isolados de Streptomyces spp. representativa das principais regiões produtoras do país; foi verificada alta heterogeneidade morfológica das linhagens isoladas; a análise da região espaçadora permitiu a separação das linhagens em pelo menos 5 grupos distintos; não houve correlação entre o perfil genético e a origem geográfica dos isolados. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS BOUCHEK-MECHICHE, K.; GARDAN, L.; NORMAND, P.; JOUAN, B DNA relatedness among strains of Streptomyces pathogenic to potato in France: description of three new species, S. europaeiscabiei sp. nov. and S. stelliscabiei sp. nov. associated with common scab, and S. reticuliscabiei sp. nov. associated with netted scab. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 50: BUKHALID, RA; CHUNG, SY; LORIA, R nec1, a gene conferring a necrogenic phenotype, is conserved in plant-pathogenic Streptomyces spp. And linked to a transposase pseudogene. Molecular Plant-Microbe Interactions 11: GOYER, C; FAUCHER, E; BEAULIEU, C Streptomyces caviscabies sp. nov., from deep-pitted lesions in potatoes in Québec, Canada. International Journal of Systematic Bacteriology 46: HONEYCUT, RJ, SOBRAL, BWS.; MCCLELLAND, M trna intergenic spacers reveal polymorphism diagnostic of Xanthomonas albilineans. Microbiology 141: LAMBERT, DH; LORIA, R Streptomyces scabies sp. nov., nom. rev. International Journal of Systematic Bacteriology 39: LAMBERT, DH; LORIA, R Streptomyces acidiscabies sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 39: MASSOL-DEYA, AA; ODELSON, DA; HICKEY, RF; TIEDJE, JM Bacterial community fingerprinting of amplified 16S and 16S-23S ribosomal DNA gene sequences and restriction endonuclease analysis (ARDRA). In: ADL. AKKERMANS, JD. VAN ELSAS; FJDE BRUIJN (eds.) Molecular microbial ecology manual Kluwer Academic Publishers, Dordrecht 3.3.2:1-8. MIYAJIMA, K; TANAKA, F, TAKEUCHI, T.; KUNINAGA S. Streptomyces turgidiscabies sp. nov. International Journal of Systematic Bacteriology 48: PARK, DH; KIM, JS; KWON, SW; WILSON, C; YU, YM; HUR, JH; LIM, CK Streptomyces luridiscabiei sp.nov., Streptomyces puniciscabiei sp. nov. and Streptomyces niveiscabiei sp. nov., which cause potato common scab disease in Korea. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 53:

5 PITCHER, DG; SAUNDERS, NA; OWEN, RJ Rapid extration of bacterial genomic DNA with guanidium thiocyanate. Lett. Appl. Microbiol 8: SHIRLING, R; GOTTLIEB, D Methods for characterization of Streptomyces species. International Journal of Systematic Bacteriology 16 : AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Associação Brasileira da Batata (ABBA) pelo suporte financeiro à pesquisa realizada e à concessão de bolsa para os estagiários Otávio Mendes de Albuquerque e Denise Salomão. Ao Pesquisador Científico Hilário Miranda Filho, do IAC/APTA), produtores e ABBA pelo envio de amostras.