GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE BRAÚNA EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA

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1 GERMINAÇÃO IN VITRO DE SEMENTES DE BRAÚNA EM DIFERENTES MEIOS DE CULTURA Ingridh Medeiros Simões, Elisa Regina da Silva, Kelly Nery Bighi, Rodrigo Sobreira Alexandre, Marcos Vinicius Winckler Caldeira. Universidade Federal do Espírito Santo/Departamento de Ciências Florestais e da Madeira, Avenida Governador Lindemberg, 316, Centro Jerônimo Monteiro-ES, Brasil, simoes.ingridh@gmail.com, elisa_agronomia@hotmail.com, kellyneryb@yahoo.com.br, rodrigosobreiraalexandre@gmail.com, mvwcaldeira@gmail.com. Resumo A braúna, Melanoxylon brauna, é uma espécie arbórea pertencente a família Fabaceae e ocorre naturalmente na Floresta Atlântica. Devido seu alto valor comercial a braúna encontra-se na lista oficial das espécies da flora brasileira ameaçadas de extinção. A maioria das espécies florestais são propagadas por sementes, contudo, existem inúmeros problemas, tais como, a baixa porcentagem e germinação, ataque de pragas e doenças, dificuldades de obtenção e coleta em quantidade considerável para produção de mudas. A propagação in vitro se tornou uma grande alternativa para propagação de espécies com dificuldades de multiplicação via seminal. Objetivou-se com esse trabalho estudar o efeito do meio de cultura e seus suplementos na germinação in vitro e vigor de sementes Melanoxylon brauna. Os tratamentos foram os meios de cultura WPM e MS completo; ½ de WPM e MS e água + ágar. Não ocorreu diferença estatística significativa na porcentagem de germinação e no índice de velocidade de germinação. O meio WPM completo se mostrou o mais adequado para germinação de sementes de Melanoxylon brauna. Palavras-chave: Cultura de tecidos, Melanoxylon brauna, Meio de cultura. Área do Conhecimento: Engenharia agronômica Introdução Melanoxylon brauna, conhecida popularmente como braúna, é uma espécie arbórea pertencente a família Fabaceae. Ocorre naturalmente na Floresta Atlântica dos estados de Minas Gerais, Rio de Janeiro, São Paulo, Bahia e Espírito Santo (LORENZI, 2009). Sua madeira possui alta densidade, sendo muito utilizada para construção civil, mourões e postes (CARVALHO, 2003). Além de sua grande utilização na arborização urbana (SANTOS; RAMALHO, 1996). Devido seu alto valor comercial a braúna encontra-se na lista oficial das espécies da flora brasileira ameaçadas de extinção, restando poucos fragmentos florestais com a espécie (CARVALHO et al., 2007; CREPALDI; PEIXOTO, 2010; VERSIEUX et al., 2011). Grande parte das espécies florestais são propagadas por sementes, principalmente devido à carência de informações silviculturais (DIAS et al., 2012). Contudo, existem inúmeros problemas quanto à propagação seminífera das espécies florestais nativas, tais como, a baixa porcentagem e germinação, dificuldades de obtenção e coleta em quantidade considerável para produção de mudas (DEBNATH, 2004). Além do lento crescimento e, consequentemente, longo período para obtenção da muda (NEPOMUCENO et al., 2009). A cultura de tecidos consiste na propagação a partir de célula, órgão ou tecido vegetal sob condições assépticas em ambiente controlado e tem como princípio a totipotência celular (TERMIGNONI, 2005; BARRUETO CID, 2010). A propagação in vitro se tornou uma grande alternativa para propagação de espécies com dificuldades de multiplicação via seminal (XAVIER et al., 2009), e apresenta vantagens como, multiplicação em larga escala e em menor tempo. Os meios de cultura e seus suplementos são essenciais para o estabelecimento e propagação de uma determinada espécie in vitro. Alguns foram formulados para determinada espécie trabalhada e são largamente utilizados atualmente, como o meio básico MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962), desenvolvido a princípio para tecido medular de Nicotiana tabacum e o Woody Plant Medium WPM (LLOYD; MCCOWN, 1980), para multiplicação de espécies lenhosas. Portanto, se faz necessário realizar estudos para determinar qual composição é mais adequada para a espécie trabalhada. 1

2 Objetivou-se com esse trabalho estudar o efeito do meio de cultura e seus suplementos na germinação in vitro de sementes Melanoxylon brauna. Metodologia O experimento foi conduzido no Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais do Departamento de Ciências Florestais e da Madeira, Centro de Ciências Agrárias e Engenharias, Universidade Federal do Espírito Santo, no município de Jerônimo Monteiro. Utlizou-se como explante sementes maduras de braúna provenientes de matrizes do município de Linhares ES e Viçosa MG. Inicialmente, em câmara de fluxo laminar, as sementes foram imersas em álcool 70% durante 1 minuto, e em hipoclorito de sódio (NaClO) à 2,5% de cloro ativo por 10 minutos. O resíduo de NaClO do explante foi retirado com tríplice lavagem em água destilada e autoclavada, em seguida imersão em fungicida Captan 2% p.a. por 20 minutos. Posteriormente, as sementes foram individualmente colocadas em tubos de ensaio contendo 10 ml de meio de cultura autoclavados a 121 C e 1,5 atm, por 20 minutos. O ph do meio foi ajustado para 5,7 ± 0,2. Utilizou-se meio de cultura MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) (Sigma ) e o WPM Wood Plant Medium (LLOYD; MCCOWN, 1980) (Sigma ), suplementado com diferentes concentrações de sacarose (Dinâmica ), mio-inositol (Sigma ) e ágar (Kasvi ), de acordo com os seguintes tratamentos: T1) 1 WPM + 30 g L -1 de sacarose + 0,1 g L -1 de mio-inositol + 6 g L -1 de ágar; T2) 1 MS + 30 g L -1 de sacarose + 0,1 g L -1 de mio-inositol + 6 g L -1 de ágar; T3) ½ WPM + 15 g L -1 de sacarose + 0,05 g L -1 de mio-inositol + 6 g L -1 de ágar; T4) ½ MS + 15 g L -1 de sacarose + 0,05 g L -1 de mio-inositol + 6 g L -1 de ágar; T5) Água + 6 g L -1 de ágar. Os tubos foram mantidos por 30 dias em sala de crescimento sob temperatura de 27 ± 2 C, com o fotoperíodo de 12 horas promovido por lâmpadas LED tubular 20W. O experimento foi conduzido em delineamento experimental inteiramente casualizado, com quatro repetições por tratamento, onde cada repetição foi constituída de 10 tubos. Os dados foram sumetidos à análise de variância, procedendo-se à comparação entre médias pelo teste de Tukey a 5% de significância. As análises foram: germinação (%); índice de velocidade de germinação (IVG); tempo médio de germinação (dias); comprimento da parte aérea (cm); comprimento da raiz (cm); Número de folhas; Massa seca da parte aérea (mg) e Massa seca da raiz (mg). Resultados Os tratamentos não apresentaram diferença estatística significativa na porcentagem de germinação e no índice de velocidade de germinação (Tabela 1). Tabela 1 Porcentagem de germinação (G), índice de velocidade de germinação (IVG) e tempo médo de germinação (TMG) in vitro das sementes de Melanoxylon brauna Tratamentos G (%) IVG TMG (dias) 1 WPM 82,5 A (1) 1,43 A 5,84 A 1 MS 82,5 A 1,32 A 7,46 C ½ WPM 72,5 A 1,33 A 5,13 A ½ MS 82,5 A 1,40 A 6,36 B Água + Agar 72,5 A 1,50 A 5,09 A (1) As médias seguidas de mesma letra não diferem entre si estatisticamente pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade. Fonte: os autores. O tempo médio de germinação apresentou foi menor ao utilizar o meio WPM completo, WPM reduzido à metade e água + ágar. Já quando o meio MS foi adicionado o tempo médio de germinação apresentou valores inferiores (Tabela 1). 2

3 As plântulas apresentaram maior comprimento, 5,48 e 5,26 cm, quando se utilizou 1 MS completo e ½ WPM, respectivamente, e o menor comprimento observado no meio que continha apenas água + ágar (4,27 cm) (Tabela 2). O comprimento da raiz foi maior no tratamento com água + ágar (7,65 cm), sendo quase duas vezes superior ao meio MS completo. Os meios completos foram os que apresentaram maior massa seca da parte aérea e massa seca raiz. Tabela 2 Comprimento da parte aérea (CPA), comprimento da raiz (CR), massa seca da parte aérea (MSPA) e massa seca da raiz (MSR) de plântulas de braúna obtidas in vitro sob diferentes meio de cultura CPA (cm) CR (cm) MSPA (mg) MSR (mg) 1 WPM 4,92 BC 3,97 D 656,4 A 185,0 A 1 MS 5,48 A 4,55 CD 601,1 AB 210,9 A ½ WPM 5,26 AB 4,94 C 369,8 BC 135,2 B ½ MS 4,56 CD 5,54 B 472,2 B 93,5 C Água + Agar 4,27 D 7,65 A 301,6 C 89,0 C (1) As médias seguidas de mesma letra não diferem entre si estatisticamente pelo Teste de Tukey a 5% de probabilidade. Fonte: os autores. Discussão A porcentagem de germinação e o índice de velocidade de germinação não diferiram entre os tratamentos, ou seja, o tipo de meio e as concentrações utilizadas não influenciou na expressão do vigor das sementes de Melanoxylon brauna. No cultivo in vitro diferentes elaborações de meios básicos tem sido utilizadas (NOGUEIRA et al., 2004). Portanto, não existe uma formulação padrão para diversas espécies. O meio MS (MURASHIGE; SKOOG, 1962) com suas diversas modificações e diluições, tem sido o mais utilizado. Contudo, o meio de cultura WPM - Wood Plant Medium tem sido o mais empregado no cultivo in vitro de espécies florestais (TAIZ; ZEIGER, 2013). Os tratamentos em que se utilizou meio de cultura MS, o tempo médio de germinação (TMG) foi maior, tanto no meio 1 MS e ½ MS. Isso pode ser explicado pela maior concentração de sais no meio. Sais em altas concentrações no meio cultura interferem no potencial osmótico e, assim, na disponibilidade de água na embebição da semente na germinação. Taiz e Zeiger (2013) afirmam que em pressões osmóticas muito altas há uma limitação na absorção hídrica, e que sua diluição aumenta a água disponível e reduz a oxigenação. Quando se analisa o comprimento da parte aérea, pode-se observar que os melhores resultados foram obtidos com 1 MS e ½ WPM, seguido de 1 WPM, ½ MS e água e ágar, porém ao se relacionar com a massa seca da parte aérea pode-se verificar que embora as de 1 WPM não tenha sido estatisticamente igual ou superior ao 1 MS no comprimento da parte aérea, suas massas secas de parte aérea são estatisticamente iguais, evidenciando que embora se tenha um menor comprimento as plântulas provinda do 1 WPM tem a parte aérea melhor desenvolvida. Conforme observado na figura 1 e tabela 2, o comprimento da raiz e sua massa seca possuem relação negativa, uma vez que com o aumento do comprimento sua massa seca é reduzida, devido a uma menor formação de raízes secundárias. Visto que tratamentos com menores concentrações nutricionais apresentam a formação de apenas raiz pivotante que se desenvolve a procura de nutrientes, assim como ocorre no ambiente ex vitro. Os resultados corroboram com os obtidos por Assis; Teixeira (1998) que afirmam que a redução da concentração de sais estimula a emissão e o alongamento das raízes. Geralmente, há uma relação positiva no desenvolvimento da parte aérea e do sistema radicular, ou seja, um maior crescimento do sistema radicular resulta em uma maior a interceptação de nutrientes (PÉREZ-HARGUINDEGUY et al., 2013). Essa idéia corrobora com o encontrado nesse estudo, que os maiores valores de parte aérea e sistema radicular foram no meio 1 MS. 3

4 Figura 1: Plântulas de Melanoxylon brauna provenientes do cultivo in vitro em (A) 1 WPM; (B) 1 MS; (C) ½ WPM; (D) ½ MS; (E) Águar + Agar. Conclusão Fonte: os autores. O meio WPM completo se mostrou o mais adequado para germinação de sementes de Melanoxylon brauna, além da obtenção de plântulas normais. Agradecimentos À Fapes e SEAG pelo financiamento da pesquisa do edital Nº 06/ PPE AGROPECUÁRIA. Referências ASSIS, T. F.; TEIXEIRA, S. L. Enraizamento de lenhosas. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. Cultura de tecidos e transformação genética de plantas. Brasília, EMBRAPA-SPI/ EMBRAPA- CNPH, v.1, p , BARRUETO CID, L. P. (Ed.). Cultivo in vitro de plantas. Brasília, DF: Embrapa Informação Tecnológica: Embrapa Recuros Genéticos e Biotecnologia, p. 303,

5 CARVALHO, F. A. NASCIMENTO, M. T.; BRAGA, J. M. A. Estrutura e composição florística do estrato arbóreo de um remanescente de Mata Atlântica submontana no município de Rio Bonito, RJ, Brasil (Mata Rio Vermelho). Revista Árvore, v. 31, n. 4, p , CARVALHO, P. E. R. Espécies florestais brasileiras: recomendações, silviculturas, potencialidades e uso da madeira. Colombo: Embrapa-CNPF; Brasília: Embrapa-SPI, p. 638p, CREPALDI, M. O. S.; PEIXOTO, A. L. Use and knowledge of plants by ''Quilombolas''as subsidies for conservation efforts in an area of Atlantic Forest in Espírito Santo State, Brazil. Biodiversity and Conservation, v. 19, n. 1, p , DEBNATH, S. C. Clonal propagation of dwarf raspberry (Rubus pubescens Raf.) through in vitro axillary shoot proliferation. Plant Growth Regulation, v. 3, n. 4, p , DIAS, P. C.; OLIVEIRA, L. S.; XAVIER, A.; WENDLING, I. Estaquia e miniestaquia de espécies florestais lenhosas do Brasil. Pesquisa Florestal Brasileira, v. 32, p. 72, p , LLOYD, G.; McCOWN, B. Commercially-feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot-tip culture. Combined Proceedings International Plant Propagators Society, v. 30, p , LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas do Brasil. Nova Odessa: Instituto Plantarum, v. 1, p. 368, MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and biossay with tobacco tissue cultures. Physiologia Plantarum, v. 15, p , NEPOMUCENO, C. F.; SOUZA, A. P. de; QUEIROZ, S. R. O. D.; PELACANI, C. R.; SANTANA, J. R. F. de. Respostas morfofisiológicas in vitro de plântulas de Anadenanthera colubrina (Vell.) Brenan var. cebil (Griseb) Altschul. Revista Árvore, v. 33, n. 3, p , NOGUEIRA, R. C.; PAIVA, R.; CASTRO, A. H. D.; VIEIRA, C. V.; ABBADE, L. C.; ALVARENGA, A. A. In vitro germination of (Byrsonima intermedia A. Juss.). Ciência e Agrotecnologia, v. 28, n. 5, p , PEÌREZ-HARGUINDEGUY, N.; Díaz, S., GARNIER, E.; LAVOREL, S.; POORTER, H.; JAUREGUIBERRY, P. New handbook for standardised measurement of plant functional traits worldwide. Australian Journal of Botany, v. 61, p , SANTOS, E.; RAMALHO, R. S. Caracterização dendrológica e potencialidades paisagísticas de Ouratea polygyna Engl. (Ochnaceae) e Melanoxylon brauna (Caesalpinoideae) na arborização urbana. Revista Árvore, v. 20, n. 4, p , TAIZ, L.; ZEIGER, E. Fisiologia Vegetal. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, p. 918, TERMIGNONI, R. R. Cultura de tecidos vegetais. Porto Alegre: Editora da UFRGS, p. VENGADESAN, G., GANAPATHI, A., AMUTHA, S., SELVARAJ, N. of Acacia species - a review. Plant Science, v. 163, n. 4, p , In vitro propagation VERSIEUX, L. M.; MEDEIROS, M. C. M. P.; SPOSITO, T. C. S.; STEHMANN, J. R. Characterization of the tree component in a semideciduous forest in the Espinhaço Range: a subsidy to conservation. Revista Caatinga, v. 24, n. 2, p , XAVIER, A.; OTONI, W. C.; Aplicações da micropropagação na clonagem de Eucalyptus no Brasil. Agronomía Costarricense, v. 33, n. 2, p ,