Tráfego intracelular, montagem e maturação de vírus. Arantes et al., 2016 JVI

Transcrição

1 Tráfego intracelular, montagem e maturação de vírus Arantes et al., 2016 JVI Prof. Luis Lamber/ P. da Silva Maio 2018

2 Tráfego e intracelular e Montagem viral - Processos de transporte intracelular de componentes virais são etapas chave do ciclo replica/vo de qualquer vírus. - Macromoléculas dis/ntas são transportadas (geralmente por diferentes vias) a um mesmo local na célula onde estas montam uma parncula viral nascente. - Os vírus u/lizam vias existentes na célula para esse processo de transporte.

3 Vírus de DNA geralmente montam no núcleo celular (proteínas estruturais são importadas para o Nucleo) Vírus envelopados o si@o de montagem é definido pelo local onde suas glicoproteínas se concentram Compartimentos celulares como sítios de montagem viral Exs: Adenovirus: Núcleo / Herpexvirus (DNA): núcleo + MP / Influenza vírus: membrana apical

4 Direcionamento intracelular e montagem de componentes virais - Vírus não envelopados montam núcleo ou no citoplasma Proteínas estruturais virais e ácido nucleico genômico devem ser direcionados ou re@dos no domínio subcelular onde a montagem ocorre. Carapaça (capsídeo) icosaédrica que protege o material gené/co de degradação. - Vírus envelopados devem adquirir uma bicamada lipídica da célula Envelopamento pode ocorrer: Após a montagem do capsídeo (Herpesvírus e alguns retrovírus) Simultaneamente a montagem do capsídeo Envelopamento transitório e re-envelopamento durante a montagem. Em vírus envelopados a estrutura do nucleocapsídeo é menos crí@ca pois a membrana provê o vírus com uma barreira contra enzimas degrada@vas.

5 Processo de montagem requer Interações entre macromoléculas viras e celulares - Proteínas virais-celulares - Proteínas virais- lipídeos celulares - Proteínas virais e ácidos nucleicos virais - Proteínas virais proteínas virais U@lização de vias e maquinaria de transporte já existentes na célula

6 Compartimentos celulares e transporte de macromoléculas

7 O Envelope Nuclear Tráfego de moléculas entre o citoplasma e o núcleo é bidirecional e continuo. Aprox NPCs

8 Os complexos de poro nuclear - NPCs Complexo é composto por ~ 30 proteínas: AS NUCLEOPORINAS ~120 nm em diametro 70 nm de comprimento Filamentos de 50nm (lado citopl.) e 150 nm (nuclear) Cada NPC transporta 500 macromoléculas por segundo em ambas as direções.

9 Importação e exportação nuclear Sinais de Localização Nuclear Seletividade na importação NLS Antígeno T de Simian Virus (SV) 40 NLS mais comuns consistem de uma ou duas sequencias curtas ricas em aa carregados positivamente (R, K)

10 Sinais de localização e exportação nuclear em proteínas virais (NLS, NES)

11 Ran-GEF preso a cromatina (chave para impulsionar o transporte) Ran-GAP

12 Ran-GAP Ran-GEF Ran-GDP também é importada para o núcleo por seu próprio receptor de importação (omitido aqui)

13 Montagem de vírus não envelopados no núcleo: Adenovirus: nm Um dos vírus não envelopados mais complexos montagem exclusivamente no núcleo DNA fita dupla 36kb codifica mais de 40 proteínas destas são encontradas no virion O DNA viral é condensado pelas proteínas V, VII e X (Nucleoproteína core) e é empacotado em um capsídeo icosaédrico. Proteína Hexon (trímeros da proteína II) é a mais abundante 720 copias por virion Poteína Penton Fiber: Fibras saindo dos 12 ver/ces do capsideo

14 Montagem Adenovírus no Núcleo celular - Fibras se dissociam do capsídeo - Desmontagem parcial do capsídeo nos endossomos e durante o escape dos endossomos (a/vidade lí/ca da Proteína VI) - O capsídeo parcialmente desmontado é transportado por microtubulos para a periferia do núcleo Interação com o NPC desmontagem completa - Importação do DNA para o nucleoplasma

15 Montagem Adenovírus no Núcleo celular - Adenovírus atraca no NPC através da interação de hexon com o domínio N-terminal de Nup214 - O capsídeo se liga a kinesina1 (ligada a Nup358) - Desmontagem total do capsídeo - Genoma + proteína do core viral entram no núcleo - A infeção por adenovírus aumenta permeabilidade de NPCs. - Porém, requer proteínas celulares: hsp70, impor/na-β, impor/na 7.

16 Montagem Adenovírus no Núcleo celular - RNAm virais deve ser exportados - Proteínas virais traduzidas devem ser importadas. - Importação de Hexon ou do polipep/deo I, depende do NLS de pvi. - Penton (cada monômero parece ter um NLS) e Fiber (tem um NLS mas precisa formar trímeros para ser transportada eficientemente)

17 Processamento/ clivagem de precursores proteicos.

18 Montagem de vírus no citoplasma: - A maioria dos vírus (mesmo os não envelopados) iniciam ou completam sua montagem em associação a uma membrana da via secretória ou endocí/ca Flavivirus

19 A via secretória celular Bonifacino and Glick (2004). Cell

20 Fornecer suporte, restringir acesso a moléculas intracelulares de defesa Fonte de membrana Modificações pós-traducionais (pontes disulfeto, glicosilação, formação de mul[metros, clivagem/processamento) Modificação de processos celulares: inibir defesa intrínseca da célula (fatores de restrição viral) ou inibir o sistema imune

21 Translocação de proteínas no RE: peptídeo sinal Exemplo: influenza HA - /po I Influenza neuroaminidase - /po II. Coronavirus proteína M - múl/plas passagens. + + Topologia de proteínas transmembrana

22 A via secretória celular: localização de proteínas Bonifacino and Glick (2004). Cell Sinal di-lisina (KKXX) COP-I Ex. Primate foamy virus concentra as glicoproteinas do envelope gp80/gp48 no ERGIC montagem viral. Sinais no próprio domínio transmembrana Proteína M do coronavirus

23 Estratégias para brotamento em membranas Fatores virais essenciais para brotamento Alphavirus : Sindbis virus Retrovirus: HIV Coronavirus Orthomyxovirus Glicoproteinas do envelope e capsideo interno Gag Glicoproteinas do envelope Brotamento dirigido pela proteína de matrix, mas brotamento correto depende de outras proteínas (envelope e RNPs)

24 Montagem e brotamento polarizado de vírus Alguns virus envelopados brotam de forma assimétrica Células epiteliais: Influenza A vírus brota a par/r da membrana apical- Proteína: HA Vírus da estoma/te vesicular (VSV) brota da membrana basolateral Proteina: G (YXXΦ)

25 Montagem em compartimentos intracelulares Bonifacino and Glick (2004). Cell

26 Montagem de vírus envelopados em membranas celulares envelope nuclear: Herpes Simplex Virus (HSV1) - Capsídeo icosaedrico 120nm - Genoma: DNA fita dupla - Tegumento - Envelope Montagem capsídeo (UL1/ UL38, UL18) Tegumento Envelopamento primário (UL31/UL34 ausentes no virus maduro) De-Envelopamento Re-envelopamento (proteinas do envelope estariam nesse local)

27 Montagem de vírus envelopados em membranas celulares ERGIC Coronavirus RNA+ 30 kb 3 proteínas de envelope - Spike (S) proteína de membrana /po I - M três passagens (não a/nge a MP) - E (minoritária), glicoproteína /po I

28 Coronavírus A glicoproteína E localiza-se no ERGIC (man/da no ER por um mo/vo de retrieval RDKLYS) e localiza M neste sí/o por interação. M por sua vez direciona a incorporação de nucleocapsideo contendo o genoma viral

29 Montagem de vírus envelopados em membranas celulares Complexo de Golgi Ordem: Bunyavirales Famílias: Hantaviridae, Peribunyaviridae (ex. Oropouche) Structure: Enveloped ssrna (-) Trisegmented Genome: L: RNA dep. RNApol M: Gc, Gn e NSm ~ 110 nm S: protein N and NSs Elliott. Nat Rev Microbiol. 2014

30 Montagem de vírus envelopados em membranas celulares Complexo de Golgi Peribuniavirus Envelope duas glicoproteínas do /po I (Gc e Gn) que determinam o si/o de brotamento viral. Gc expressa na ausência de Gn é re/da no RE enquanto que Gn expressa sozinha é direcionada para o Golgi. O sinal de localização de Gn fica no CT. Interação com componentes do lado citosólico do Membrana do C. Golgi? Durante a montagem o nucleocapsideo com os três segmentos de RNA + nucleoproteínas (N) acumulam no Golgi através da interação com os heterodímeros de Gn-Gc

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32 Time course of OROV infection in HeLa cells 1-3h p.i. 7-12h p.i h p.i h p.i. Replica/on compartments? Natalia da Silva Barbosa

33 O Virus Oropouche monta nas cisternas do Complexo de Golgi Barbosa et al., Plos Pathogens (2018)

34 Em decorrência da infecção as cisternas do Golgi mudam de morfologia e ficam com aparência de um endossomo multivesicular Barbosa et al., Plos Pathogens (2018)

35 Endosomal Sorting Complexes Required for Transport MVB Alix ESCRT0 ESCRTI Ubq HRS STAM TSG101 VPS37 VPS28 VPS36 ESCRTII Alix VPS25 ESCRTIII VPS4 ESCRT disassembly Ubiquitinated Cargo VPS22 VPS2 VPS22 VPS24 VPS32 Intracellular vesicle (ILV) Endosome Lumen Silva-Januario et al., Exosome Biogenesis (book chapter) 2016

36 A proteína VPS4 é recrutada para as fábricas virais do Oropouche

37 Tsg101 e Alix são cruciais para a produção de OROV Barbosa et al., Plos Pathogens (2018)

38 ESCRTs

39 Ciclo replicativo de HIV-1: manipulando o sistema de endomembranas (próxima aula) CXCR4 (T-cells) CCR5 (macrophages) modificado de Freed and Mouland, 2006