IV-Kunz-Brasil-1. Palavras Chave: Anammox, dejetos de suínos, remoção biológica de nitrogênio, SPACs.

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1 IV-Kunz-Brasil-1 ACLIMATAÇÃO E ACOMPANHAMENTO DA ATIVIDADE DE LODOS DE EFLUENTES DE SUINOCULTURA PARA REMOÇÃO DE NITROGÊNIO PELO PROCESSO DE OXIDAÇÃO ANAERÓBIA DE AMÔNIA (ANAMMOX) Guilherme Francisco Schierholt Neto Mestrando em Engenharia Química do Departamento de Engenharia Química e Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina. Engenheiro Ambiental graduado pela Universidade Federal de Viçosa. Airton Kunz (1) Dr. em Química. Pesquisador III da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária. Mestre e Doutor em Química ambiental pela Universidade Estadual de Campinas. Matias B. Vanotti Dr. em Ciências do Solo. Pesquisador do Agricultural Research Service, United States Department of Agriculture, Coastal Plains Research Center, Florence, CS, EUA. Hugo Moreira Soares Prof. Dr. do Departamento de Engenharia Química e Alimentos da Universidade Federal de Santa Catarina. Mestre em Engenharia Química pela Universidade de São Paulo e Ph. D. em Engenharia Ambiental pela University of Massachusetts, EUA. Rosemari Martini Mattei Técnica de Nível Superior da Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária Embrapa Suínos e Aves. Formada em Ciências Biológicas pela Universidade do Contestado em Santa Catarina. Endereço: Embrapa Suínos e Aves CEP BR 153, km 110, Concórdia SC Brasil. Fone: (55)- (049) airton@cnpsa.embrapa.br RESUMO O dejeto de suíno é um passivo ambiental de grandes proporções, sendo capaz de causar grande impacto ambiental em rios e corpos d água, quando lançados sem um tratamento adequado. Embora técnicas de remoção da matéria carbonácea já estejam bem adaptadas a este tipo de matriz, a remoção das altas cargas de nitrogênio presentes neste tipo de efluente ainda carece de sistemas adequados para uma remoção eficiente. Desta forma, o processo ANAMMOX (Oxidação Anaeróbia de Amônio) se justifica. Este é um sistema autotrófico que consiste na remoção anaeróbia de amônia via nitrito. Tais microrganismos podem estar presentes naturalmente em meios ricos em amônio, como, por exemplo, em sistemas de tratamento de dejetos de suínos. Assim, submeteram-se duas amostras de lodos provenientes de dois sistemas de tratamento de dejetos de suínos, com históricos distintos, a um processo de aclimatação, com subseqüente inoculação em reatores tubulares, contendo meio suporte não biodegradável e, submetido às condições ideais de desenvolvimento de microrganismos com atividade ANAMMOX. Um dos inóculos foi proveniente de uma lagoa de nitrificação desativada e o outro proveniente de um sistema de lodos ativados. Após 63 dias de aclimatação e 150 dias sob condições ideais, obteve-se uma remoção de 140 mg N/L. d e uma relação de NH 4 + :NO 2 - :NO 3 - de 1:1,43:0,37 para o lodo proveniente da lagoa de nitrificação, o que fica muito próximo dos valores encontrados na literatura (1:1,31:0,26). Porém, o lodo proveniente do sistema de lodos ativados não apresentou remoção de nitrogênio satisfatória ou coeficientes estequiométricos que evidenciassem o estabelecimento do processo ANAMMOX. Palavras Chave: Anammox, dejetos de suínos, remoção biológica de nitrogênio, SPACs.

2 1 INTRODUÇÃO O dejeto de suíno é um passivo ambiental de grandes proporções, sendo capaz de causar grande impacto ambiental em rios e corpos d água quando lançados sem um tratamento adequado. A tecnologia para remoção de matéria carbonácea já está bem desenvolvida. No entanto, a questão da remoção de nutrientes carece ainda de tecnologias que sejam realmente eficientes. Para o efluente em questão, encontram-se concentrações de até 4000 mg/l de nitrogênio total Kjedhal (STEINMETZ et al, 2005), enquanto que a legislação brasileira, segundo o CONAMA, exige que os efluentes sejam lançados com uma concentração máxima de 20 mgn-nh 4 +/L. No processo convencional de remoção de nitrogênio (nitrificação/ desnitrificação), microrganismos autotróficos nitrificantes e heterotróficos desnitrificantes crescem em reatores separados e otimizados sob condições diferentes de aerobiose e anaerobiose. Este processo envolve um alto custo de implantação e operação, mesmo em plantas de tratamento de um único reator (TOH et al, 2002). Muitos processos alternativos para remoção de nitrogênio têm sido desenvolvidos desde o inicio da década de 90. Dentre eles, destaca-se o sistema ANAMMOX (Anaerobic Ammonium Oxidation). Este sistema consiste na remoção de amônia do efluente sob condições anaeróbias, onde o amônio é levado a N 2 utilizando Nitrito como aceptor final de elétrons. Sendo ainda um processo autotrófico, não necessita de adição de fontes extras de carbono orgânico (VAN DONGEN et al, 2001). Devido a sua elevada eficiência de remoção, chegando a índices de 8,90 Kg N/ m 3. dia (KHIN T., et al. 2004), sua aplicação se viabiliza para efluentes com elevadas concentrações de nitrogênio, como o dejeto de suíno. Porém, caso o efluente a ser tratado necessite de adição de carbono orgânico, o sistema convencional se inviabiliza economicamente frente ao sistema ANAMMOX, que pode reduzir o custo operacional na remoção de nitrogênio em até 90%. O processo é indicado para efluentes com elevadas concentrações de amônio e pouca matéria orgânica, sendo capaz de substituir completamente o estágio de desnitrificação, economizar metade dos custos de aeração na etapa de nitrificação e não necessitando de adição de carbono orgânico (JETTEN et al, 2000; FUJI et al, 2002). A Equação 1 mostra a estequiométrica global do processo ANAMMOX, segundo STROUS M., et al. (1998): 1NH ,32NO ,066HCO ,13H + 1,02N 2 + 0,26NO ,066CH 2 O 0,5 N 0,15 + 2,03H 2 O Equação(1) Citoplasma Anammoxosome Figura 1: Mecanismo da oxidação anaeróbia de amônio. NR= enzima redutora de nitrito; HH= (hidrazina hidrolase) forma hidrazina a partir da amônia e da hidroxilamina; HZO= é uma enzima oxidadora de hidrazina (JETTEN M.S.M., et al. 2000).

3 Quanto à rota metabólica, acredita-se que o aceptor de elétrons, nitrito, é reduzido a hidroxilamina e a hidroxilamina de alguma maneira reage com o doador de elétrons amônio, culminando com a produção de nitrogênio gasoso. Já JETTEN et al (2000), postulou que a hidrazina é o intermediário desta última etapa e que a oxidação da hidrazina a N 2 gera os elétrons pra redução inicial de nitrito a hidroxilamina. A Figura 1 apresenta um desenho esquemático representando as reações do processo ANAMMOX no citoplasma. Parte desta rota metabólica ocorre dentro de um compartimento peculiar dessas bactérias, chamado Anammoxosome, que ocupa de 30 a 60% do volume da célula. As características de crescimento da cultura ANAMMOX foram determinadas em vários trabalhos, sendo o ph ideal entre 6,7 e 8,3, com o ótimo em 8 e a temperatura variando entre 20 e 43 C, sendo a ótima de 40±3 C. (STROUS M., et al. 1999b; JETTEN M.S.M., et al. 1999). O tempo de duplicação dos microrganismos fica entre 9 e 11 dias (STROUS et al, 1999b; STROUS et al, 1998; JETTEN et al, 2000). Porém, ISAKA et al, (2005), apresentam um valor de 1,8 dias, deixando evidente que ainda existem lacunas para encontrar as melhores condições de cultivo. Estes autores afirmam que os microrganismos aderem facilmente a qualquer superfície sólida, não existindo de forma uniforme dentro dos reatores, fazendo com que um tempo de duplicação correto jamais seja obtido caso apenas parte do reator seja retirada para amostragem. Devido a este lento crescimento, a partida desse tipo de processo pode ser extremamente lenta, sendo necessário de 3 meses (JETTEN et al, 1999) a mais de 1 ano (TOH et al, 2002) de operação para obter uma cultura enriquecida e estabilizada. O microrganismo responsável pela transformação anaeróbia de amônio em nitrogênio gasoso era um mistério até bem pouco tempo atrás. Porém, STROUS et al (1999a), identificaram o mesmo como uma bactéria autotrófica da ordem Planctomycetales. Foram encontradas e identificadas primeiramente na Holanda (STROUS et al, 1999b), porém, microrganismos já foram identificados em várias outras partes do mundo (DAPENA-MORA et al, 2006; TOH et al, 2002; FUJI et al, 2002), inclusive no Brasil (REGINATTO et al, 2005), evidenciando uma característica de fácil desenvolvimento nos mais diversos habitats e, portanto, justificando sua busca no dejeto de suíno. Desta forma, este trabalho teve como objetivo principal verificar o estabelecimento do processo ANAMMOX em reatores com crescimento aderido, utilizando como inóculos duas amostras lodo proveniente de sistemas de tratamento de dejetos de suínos. Partiu-se de um processo de aclimatação e, procedeu-se a inoculação em reatores tubulares contendo meio suporte não biodegradável e alimentado com meio de cultura apropriado. 2 MATERIAIS E MÉTODOS 2.1 ARRANJO EXPERIMENTAL FONTE DE INÓCULOS Para verificar a presença de microrganismos ANAMMOX em dejeto de suínos, procurou-se obter inóculos provenientes de locais propícios ao desenvolvimento de tais organismos. Segundo (JETTEN et al, 1999) a interface de ambientes óxicos e anóxicos de sedimentos, fornece o habitat ideal para microrganismos oxidadores anaeróbios de amônio. Desta forma, elegeu-se duas fontes distintas de inóculos: Lodo UD: retirado do fundo de uma lagoa experimental desativada por dois anos na unidade demonstrativa (UD) da Embrapa Suínos Aves. Neste local se desenvolveu um sistema de aeração intermitente a fim de se promover a remoção de nitrogênio. Estas condições de aerobiose e anaerobiose, somadas a uma elevada carga de nitrogênio sugerem um ambiente favorável ao desenvolvimento de ANAMMOX. Lodo RBA: o lodo do decantador secundário de de um reator biológico aeróbio (RBA) de uma estação de tratamento de dejetos suínos da Embrapa Suínos e Aves. Este decantador é a última etapa de um sistema composto de um reator anaeróbio do tipo UASB seguido por um sistema de lodo ativado (aeróbio). Investigar esta fonte como uma possível fonte de inóculo é desejável, visto a abundancia da mesma.

4 2.1.2 ACLIMATAÇÃO Os lodos utilizados como inóculo ainda continham matéria orgânica (MO). DAPENA-MORA et al. (2006), afirmam que esta condição pode inibir fortemente o processo ANAMMOX, mesmo em baixas concentrações. Procedeu-se então a etapa de aclimatação do lodo, de forma a lavar e eliminar o máximo possível da MO e assim, facilitar o desenvolvimento das bactérias oxidadoras anaeróbias de amônio. Desta forma, os lodos coletados foram dispostos em béqueres de 1L, lavados com água destilada em abundância e posteriormente a matéria orgânica remanescente foi degradada biologicamente através da adição de várias alíquotas de KNO 3 (promovendo a desnitrificação). Esta forma de remoção de matéria orgânica foi escolhida pelo fato de o nitrato não ser inibidor do processo, mesmo em altas concentrações (DAPENA-MORA et al, 2006). Sempre que era verificado o consumo de NO 3 -, eram retirados 500mL de sobrenadante e adicionado o mesmo volume da solução de KNO 3 a 100mg/L e 0,375g de NaHCO 3, para manter o ph constante. O período de aclimatação se estendeu por 63 dias, até que não se verifica-se consumo de NO CONFIGURAÇÃO DOS REATORES As bactérias ANAMMOX possuem uma tendência à formação de grumos e biofilme (TOH et al, 2002), sendo que as maiores taxas de remoção obtidas se deram em meio suportado e em sistemas de fluxo contínuo, evitando assim uma inibição dos microrganismos por parte de seus produtos metabólicos (ISAKA et al, 2005). Tendo em vista estes fatos, foram utilizados dois reatores tubulares de vidro totalmente fechados, com dimensões de 52 cm de altura por 7 cm de diâmetro interno, com volume útil de 2L. Foi introduzido um meio suporte polimérico não biodegradável em forma de rede, que foi enrolada de forma a preencher uniformemente o reator. O fluxo de alimentação era contínuo e ascendente com tempo de detenção hidráulica (TRH) de 1 dia e imersos em banho-maria a uma temperatura constante de 35 C. Os reatores foram inoculados com os lodos de forma a atingir 4g/L de sólidos suspensos totais na partida dos mesmos. A nomenclatura dos reatores foi determinada conforme a fonte de inóculo utilizada, assim o lodo UD inoculou o Reator UD e o lodo RBA o Reator RBA. Quanto às cargas aplicadas, procedeu-se da seguinte maneira: inicialmente aplicou-se uma carga de choque de 100mg/L. d de NO - 2 e 100mg/L. d de NH + 4 por 75 dias; após este período, reduziu-se a alimentação para 30mg/L. - d de NO 2 e de NH + 4 e deu-se inicio à progressão de carga, que ocorreu sempre que a - concentração de saída de um dos reatores fosse inferior à 30mg/L de NO 2. As progressões, foram com aumentos de 30mg/L. d de NO - 2 e de NH + 4, realizadas através de modificações da concentração do efluente sintético. 2.2 EFLUENTE SINTÉTICO O efluente sintético utilizado para alimentar os reatores foi adaptado de ISAKA, et al, (2005), correspondendo a: KHCO 3, 0,125g/L; KH 2 PO 4, 0,027g/L; CaCl 2. 2H 2 O, 0,143g/L; MgSO 4. 7H 2 0, 0,24g/L; FeSO 4. 7H 2 0, 0,009g/L; EDTA, 0,005g/L e; 0,3mL/L de elementos traço, cuja composição é: EDTA, 0,975g/L; ZnSO 4. 7H 2 O, 1,247g/L; CoCl 2. 6H 2 O, 0,03g/L; MnSO 4. H 2 O, 1,119g/L; CuSO 4. 5H 2 O, 0,044g/L; NaMoO 4. 2H 2 O, 0,129 g/l; Al 2 (SO 4 ) 3. 14H 2 O, 0,202g/L; KCl, 0,1g/L. As fontes de amônio e nitrito foram o NH 4 Cl e NaNO 2, cujas concentrações variaram conforme especificado no item Após a mistura dos reagentes o efluente sintético era desoxigenado pelo borbulhamento de N 2 até atingir concentração igual ou inferior a 0,5mgO 2 /L. O meio era preparado semanalmente e estocado em recipiente completamente vedado, ligado a um balão de gás N 2 que preenchia o espaço deixado pelo efluente alimentado. Caso fosse evidenciada uma contaminação de O 2, procedia-se a desoxigenação novamente. O oxigênio dissolvido exerce uma inibição reversível mesmo em concentrações de 2 μm (KHIN et al, 2004), o que explica o cuidado em manter baixas concentrações do mesmo no meio sintético.

5 2.3 PROCEDIMENTOS ANALÍTICOS Para evidenciar o estabelecimento de uma cultura ANAMMOX, Foi acompanhada a remoção/ produção de Nitrito, Amônio e Nitrato. A determinação de Amônio (NH 4 + ) foi utilizado o método kjedhal segundo a APHA (1998). Para o Nitrato (NO 3 - ), a amostra era conduzida por uma coluna de 10g de cádmio metálico, que reduzia o ânion NO 3 - a NO 2 -, sendo o Nitrito (NO 2 - ) determinado pelo método colorimétrico da sulfanilamida (APHA, 1998). Desta forma, a concentração de Nitrato era obtida, indiretamente, pela diferença de concentração de nitrito da mesma amostra antes e depois da coluna de cádmio. As leituras foram realizadas em um espectrofotômetro UV-Vis Varian Cary 50 Probe (software Varian CaryWin) a 540 nm. 3 RESULTADOS E DISCUSSÕES As Figuras 2 a 5 apresentam os resultados do acompanhamento analítico dos ensaios com os reatores UD e RBA. Observa-se nas 3 primeiras figuras que os reatores foram operados em 4 estágios, diferenciados pela carga aplicada: O primeiro foi do dia 76 ao dia 102 com uma carga total de 60mg N/L. dia. Do dia 102 ao dia 109 desenvolveu-se o segundo estágio, a uma carga total de 120mg N/L. dia. O terceiro foi do dia 109 ao 116, a 180mg N/L. dia. Por fim, o quarto estágio se deu do dia 116 até o fim do período de observação, sendo aplicado 240mg N/L. dia. Nestas figuras, também fica evidente que o nitrito e amônio foram constantemente alimentados na proporção de 1:1. Como observado na Figura 2, o Reator UD apresentou uma boa resposta à progressão de carga até uma carga de 120mg N/L. dia para NO 2 - e NH 4 -, atingindo no último estágio uma eficiência de 63% de remoção de nitrogênio. Observando a tendência dos resultados, em pouco tempo poderia ser realizada uma nova progressão. A rápida resposta inicial pode ser explicada pela aplicação da carga de choque(que era de 200mg N/L. dia), que permitiu um crescimento de microrganismos adaptados e em quantidade suficiente para remover toda a carga alimentada nos três primeiros estágios. 120 Concentração (mg N/L) Dias de operação Entrada N-NO2 Entrada N-NH4 Saída N-NO2 Saida N-NH4 Produção N-NO3 Figura 2: Acompanhamento das concentrações de entrada e saída de NO 2 -, NH 4 + e da produção de NO 3 - para o Reator UD. Já o Reator RBA, não apresentou resultados satisfatórios (Figura 3), apresentando uma baixa eficiência de remoção durante todo o período observado e, nos três primeiros estágios ainda ficou evidente um residual de matéria orgânica, o que permitiu a conversão do nitrito a nitrato sem remover amônio. Esta suspeita se confirma no momento em que grande parte da matéria orgânica ainda disponível foi consumida (dia 134), com a conseqüente queda na concentração de nitrato produzido, assim como do consumo de nitrito.

6 120 Concentração (mg N/L) Dias de operação Entrada N-NO2 Entrada N-NH4 Saída N-NO2 Saida N-NH4 Produção N-NO3 Figura 3: Acompanhamento das concentrações de entrada e saída de NO 2 -, NH 4 + e da produção de NO 3 - para o Reator RBA. De maneira geral, a Figura 4 permite comparar a evolução das duas fontes de inóculo. Fica evidente a baixa remoção de nitrogênio no Reator RBA, frente aquela promovida no Reator UD. Este resultado indica a presença, em quantidades muito maiores, de microrganismos oxidadores anaeróbios de amônio no Lodo UD frente ao Lodo RBA mg N/ Lreator. Dia Dias de operação UD - Carga de N Removida RBA - Carga de N Removida Carga de N aplicada Figura 4: Variação das cargas de Nitrogênio removida e aplicada a ambos os reatores no período de progressão de carga. Com o intuito de confirmar a presença de ANAMMOX, procurou-se estabelecer os coeficientes estequiométricos para o consumo de nitrito e amônio e para produção de nitrato, comparando os resultados obtidos com aqueles encontrados na literatura especializada. A Figura 5 mostra a evolução do consumo de nitrito e produção de nitrato em relação ao consumo de amônio, fornecendo assim os coeficientes estequiométricos para NO 2 - e NO 3 -, já que o coeficiente do NH 4 + é de 1,0. Esses valores são comparados com aqueles obtidos por STROUS et a, (1998).

7 1,6 Coeficiente 1,4 1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0, Dias de operação NO2 NO3 NO2 Literatura NO3 Literatura Figura 5: Evolução dos coeficientes estequiométricos de Nitrito e Nitrato no Reator UD durante a progressão de carga em comparação com os coeficientes encontrados na literatura, segundo STROUS et al, (1998). Como o Reator RBA apresentou desnitrificação durante grande parte do período observado, não se obteve uma evolução dos coeficientes próxima àquela encontrada na literatura. A Tabela 1 apresenta uma média dos coeficientes obtidos entre os dias 130 e 145 para ambos os reatores, evidenciando novamente a possível presença de ANAMMOX no Lodo UD e os valores atípicos para o Lodo RBA. Tabela 1: Valores estequiométricos da reação global de um sistema ANAMMOX encontrados nos reatores (período de estabilidade entre os dias 130 e 145) e aqueles referenciados na literatura. Nitrito (NO - 2 ) Nitrato (NO - 3 ) Amônio (NH + 4 ) (STROUS et al, 1998) 1,32 0,26 1,00 Reator UD 1,43 0,37 1,00 Reator RBA 2,07 0,90 1,00 4 CONCLUSÕES Os resultados obtidos indicam que realmente bactérias oxidadoras anaeróbias de amônio estão presentes em diferentes habitats naturais e podem ser encontrada até mesmo em dejetos de suínos. Observou-se que o lodo da lagoa desativada se mostrou como um inóculo mais promissor que o lodo de decantador do sistema de lodos ativados, haja vista que a estequiometria para o lodo da lagoa ficou mais próxima da estequiometria de uma reação ANAMMOX. Além disso, com pouco mais de 100 dias de operação atingiram-se valores de remoção de nitrogênio superiores a 140mg/L. dia, confirmando a elevada capacidade de remoção de nitrogênio deste tipo de sistema. Embora os resultados mostrem que aparentemente não tenha se detectado atividade significativa das bactérias ANAMMOX no reator RBA, novos experimentos devem conduzidos, promovendo uma progressão de carga mais lenta para estimular o crescimento da flora deste habitat, confirmando se realmente as bactérias ANAMMOX não se encontram presentes.

8 5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 1. APHA. Standard Methods for the Examination of Water and Wasterwater. 19 ed., Washington D. C., DAPENA-MORA, A., FERNÁNDEZ, I., CAMPOS, J.L., MOSQUERA-CORRAL, A., MÉNDEZ, R., JETTEN, M.S.M. Evaluation of activity and inhibition effects on Anammox process by batch tests based on the nitrogen gas production. Enzyme Microbial Technol, Accepted Manuscript, p. 29, DIESEL, R., MIRANDA, C.R., PERDOMO, C.C. Coletânea de tecnologias sobre dejetos suínos. Bipers nº14, Embrapa Suínos e Aves, FUJI, T., SUGINO, H., ROUSE, J.D., FURUKAWA, K. Characterization of the microbial community in an anaerobic ammonium-oxidizing biofilm cultured on a nonwoven biomass carrier. J. Biosci. Bioeng, v.94, p , ISAKA, K., DATE, Y., SUMINO, T., YOSHIE, S., TSUNEDA, S. Growth characteristic of anaerobic ammonium-oxidizing bacteria in an anaerobic biological filtrated reactor. Appl Microbiol Biotechnol, v.70, p , JETTEN, M.S.M., STROUS, M., VAN DE PAS-SCHOONEN, K.T., SCHALK, J., VAN DONGEN, U.G.J.M., VAN DE GRAAF, A.A., LOGEMANN, S., MUYZER, G., VAN LOOSDRECHT, M.C.M., KUENEN, J.G. The anaerobic oxidation of ammonium. FEMS Microbiol Rev, v22, p , JETTEN, M.S.M., WAGNER, M., FUERST, J., VAN LOOSDRECHT, M., KUENEN, G., STROUS, M. Microbiology and application of the anaerobic ammonium oxidation ( anammox ) process. Curr Opinion Biotechnol, v12, p , KHIN, T., ANNACHHATRE, A.P. Novel microbial nitrogen removal processes. Biotechnology Advances, v.22, p , REGINATTO, V. ; TEIXEIRA, R. M. ; PEREIRA, F. ; SCHMIDELL, W. ; MENES, J. ; ETCHEBERERE, C. ; FURIGO JUNIOR, A. ; SOARES, H. M. Anaerobic Ammonium Oxidation in Bioreactor Treating Slaughterhouse Wastewater. Brazilian Journal of Chemical Engineering, v.22, n.4, p , STEINMETZ, R., KUNZ, A., MENOZZO, G.F., BORTOLI, M. Utilização de biodigestão anaeróbia para o tratamento de dejetos de suínos. In: Livro de resumos da 28 a reunião anual da sociedade brasileira de química, Poços de caldas, STROUS, M., FUERST, J., KRAMER, E., LOGEMANN, S., MUYZER, G., VAN DE PAS, K., WEBB, R., KUENE, J., JETTEN, M.S.M. Missing lithotroph identified as new planctomycete. Nature, v.400, p , 1999a. 12. STROUS, M., HEIJNEN, J.J., KUENEN, J.G., JETTEN, M.S.M. The sequencing batch reactor as a powerful tool for the study of slowly growing anaerobic ammonium oxidizing microorganisms. Appl Microbiol Biotechnol, v.50, p , STROUS, M., KUENEN, J.G., JETTEN, M.S.M. Key physiology of anaerobic ammonium oxidation. Appl Environ Microbiol, v.65, p , 1999b. 14. TOH, S.K., WEBB, R.I., ASHBOLT, N.J. Enrichment of Autotrophic Anaerobic Ammonium-Oxidizing Consortia from Various Wastewaters. Microb Ecol, v.43, p , VAN DONGEN, L.G.J.M., JETTEN, M.S.M., VAN LOOSDRECHT, M.C.M. The Combined Sharon/ Anammox Process. IWA Publishing. London, 2001.