MICROPROPAGAÇÃO DE GEMAS LATERAIS DE MANGUEIRA: CONTROLE DO CRESCIMENTO DE FUNGOS Solange Rocha Monteiro de Andrade 1, Welmo Costa de Oliveira 2, Maria José D Avila Charchar 1, Juliana Dias Lopes 2, Fábio Gelape Faleiro 1, José de Ribamar Nazareno dos Anjos 1, José Ricardo Peixoto 2 ( 1 Embrapa Cerrados, BR 020, Km 18, Caixa Postal 08223, 73010-970 Planaltina, DF. e- mail: Solange@cpac.embrapa.br, 2 Universidade de Brasília, Campus Universitário Darcy Ribeiro, 70910-900 Brasília, DF) Termos para indexação: cultura de tecidos, descontaminação de explantes, organogenese, Mangifera indica Introdução Um dos grandes desafios encontrados para a micropropagação de gemas laterais e apicais de mangueira, além da intensa exsudação de fenóis, é a alta contaminação por microrganismos. Desde 2001, o Laboratório de Biologia Celular e Cultura de Tecidos da Embrapa Cerrados tem estudado diferentes metodologias para solucionar esse problema. Os resultados iniciais demonstraram que para diminuir a contaminação por fungos exógenos os explantes precisavam de uma limpeza inicial em água de torneira com detergente neutro, seguido de tratamento em solução de hipoclorito de sódio 1% e Tween 80, finalizando com sonicação de 15 segundo em 500 mg.l -1 Benomyl e suspensão de 15 minutos na mesma solução (Andrade et al., 2005). No entanto, os resultados também demonstraram que existe efeito altamente significativo da matriz doadora do explante, que apresenta diferentes concentrações de inóculos. Assim, diversos autores recomendam o tratamento fitossanitário das matrizes, bem como a criação de um banco de matrizes em viveiros ou casas de vegetação (Oliveira et al., 2000; Grattapaglia e Machado, 1998; Leifert e Cassels, 2001). Para desinfestação superficial de explantes utilizava-se o Benomyl, entretanto, devido descontinuidade da produção pelo fabricante por problemas legais, é a necessário a substituição do Benomyl por outro princípio ativo. Esse trabalho visa apresentar os resultados do processo de aprimoramento dos protocolos de controle do crescimento de fungos em meio de cultura inoculados com gemas laterais de mangueira. Material e Métodos Identificação de fungos Os explantes foram coletados no campo experimental da Embrapa Cerrados, descontaminados superficialmente conforme protocolo (Andrade et al., 2005) e inoculados em meio
MS. Aos 10 a 15 dias após a inoculação os fungos visualizados foram isolados e transferidos para placas de Petri contendo o meio de cultura batata-dextrose-ágar com estreptomicina, e o gênero foi identificado pela avaliação morfológica das estruturas dos fungos. Visando observar a origem do foco de contaminação por fungos em segmentos nodais, foram obtidos fragmentos de tecido interno e externo dos explantes de estacas de diferentes idades (jovens e adultas), em três cultivares (Alfa, Roxa e Tommy Atkins). Os fragmentos foram submetidos a desinfestação superficial em álcool 70%, seguido de 2 minutos em hipocloríto de sódio 1% e lavados com água estéril, cujo excesso foi removido em papel de filtro esterilizado. Em seguida, as amostras foram incubadas em meio BDA com 12 horas de luz a 25º C, durante uma semana. Avaliação do efeito de fungicidas nas matrizes do campo experimental Estacas das matrizes da cultivar Tommy Atkins foram submetidas as seguinte tratamento de pré-assepsia no campo: poda dos ápices e das folhas, lavagem superficial com solução de água e detergente, enxágüe e tratamento com fungicidas: 1) 20 g.l -1 Tebuconazole (Folicur ), 2) 20 g.l -1 Mancozeb (Manzate ) e 3) 20 g.l -1 Procimidona (Sialex ). Dois dias após o tratamento, as estacas foram coletadas e submetidas à descontaminação superficial (Andrade et al., 2005), os explantes inoculados em meio MS 3% líquido, acrescido de 1mg.L -1 BAP, 25 mg.l -1 CuSO 4, 150 mg.l -1 canamicina, 80 mg.l -1 sulfametaxazol e 32 mg.l -1 trimetroprima. Depois de três dias, foram transferidos para o mesmo meio contendo ágar 0,8%, e transferidos para câmara de crescimento 25 C 16 h de fotoperíodo. A porcentagem de contaminação por fungos foi avaliado aos 7, 10, 12, 14, 17, 19 e 21 dias após a inoculação em meio de cultura. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados, com quatro repetições, em arranjo de parcela subdividida, 7 épocas de avaliação e 3 fungicidas. Avaliações do efeito de fungicidas na descontaminação superficial dos explantes Segmentos nodais da cultivar Palmer foram descontaminados conforme o protocolo desenvolvido por Andrade e colaboradores (2005), testando os seguintes fungicidas 500mg.L -1 Benlate (benomyl), 500mg.L -1 Cerconil (clorotalonil + tiofanato-metílico) e 500mg.L -1 Derosal (carbendazim). Após a descontaminação, os explantes foram transferidos para meio MS, conforme descrito no experimento anterior. O delineamento experimental foi de blocos inteiramente casualizados com 3 repetições.
Avaliações do efeito de fungicidas acrescidos em meio de cultura Segmentos nodais da cultivar Tommy Atkins foram descontaminados conforme o protocolo (Andrade et al., 2005), e os explantes foram inoculados em meio de cultura MS 3% semi-sólido com os seguintes tratamentos: 1) 2 g.l -1 de fungicida Tebuconazole (Folicur 200CE ); 2) 2 g.l -1 de Mancozeb (Manzate 800 ); 3) 2 g.l -1 de Procimidona (Sialex 500 ); 4) 2 g.l -1 de Carbendazim (Derosal ) e 5) testemunha sem fungicida. As avaliações foram feitas aos 24 dias após inoculação em meio semi-sólido, de acordo com o percentual de contaminação por fungos. O delineamento experimental utilizado foi o de blocos casualizados, com quatro repetições, em arranjo de parcela subdividida,. Resultados e Discussão Identificação de fungos Os fungos identificados pertenciam aos seguintes gêneros: Curvularia sp., Fusarium sp., Aspergillus sp., Alternaria sp., Helminthosporium sp., Cladosporium sp., Colletotrichum sp, Gliocadium sp., Penicillium sp. e fungos do grupo de leveduras. O tipo de microrganismo encontrado no meio nutritivo pode ser um indicador do tipo de problema durante o processo de desinfestação (Leifert e Cassels, 2001). No entanto, essa gama de fungos sugere tanto a necessidade de um tratamento das matrizes no campo experimental, conforme indicado por Oliveira et al.(2000) e Gratapaglia e Machado (1998), quanto um tratamento com fungicidas para descontaminação superficial. Os resultados com fragmentos de tecidos corroboram essa hipótese, pois demonstraram que nas três cultivares, independente da idade do tecido, as contaminações eram oriundas somente do tecido externo (Figura 1).
A B C D E F G H I J K L Figura 01 - Placas contendo fragmentos de tecido interno e externo de estacas jovens e adultas de segmentos nodais de três cultivares de manga (Mangifera indica L.). A- Alfa/jovem/interno; B- Alfa/jovem/externo; C- Alfa/adulto/interno; D- Alfa/adulto/externo; E- Roxa/jovem/interno; F- Roxa/jovem/externo; G- Roxa/adulto/interno; H- Roxa/adulto/externo; I - Tommy/jovem/interno; J- Tommy/jovem/externo; K- Tommy/adulto/interno; L- Tommy/adulto/externo. Avaliação do efeito de fungicidas nas matrizes do campo experimental Com o objetivo de diminuir a quantidade de inóculo nas matrizes experimentais foi avaliado o efeito da aplicação dos seguintes fungicidas: 20 g.l -1 Tebuconazole (Folicur 200 CE ); 20 g.l -1 de Mancozeb (Manzate 800 ); 20 g.l -1 de Procimidona (Sialex 500 ) nas estacas da cultivar Tommy Atkins de mangueira. Embora o fungicida Mancozeb (Manzate ) tenha apresentado os menores índices de contaminação, para todos os dias avaliados, não houve diferença significativa entre os tratamentos (Figura 2). No entanto, Grattapaglia e Machado (1998) consideram primordial o tratamento das matrizes doadoras de explantes com fungicidas. Assim sendo, até aprimorarmos os estudos utilizaremos Mancozeb nas matrizes do campo experimental.
% de explantes contaminados 80 60 40 20 0 7 10 12 14 17 19 21 Dias após inoculação Tebuconazole Mancozeb Procimidona Figura 02. Porcentagem contaminação de explantes após tratamento das matrizes com fungicidas. Avaliações do efeito de fungicidas na descontaminação superficial dos explantes Com o intuito de identificar um substituto para o Benomyl foram comparados o efeito seguintes fungicidas na descontaminação superficial: 500mg.L -1 Benomyl (Benlate), 500mg.L -1 Clorotalonil + Tiofanato-metílico (Cerconil) e 500mg.L -1 Carbendazin (Derosal). Embora os fungicidas sejam do mesmo grupo químico (benzimidazol) e possuam o mesmo modo de ação (sistêmico), o princípio ativo Carbendazin apresentou o melhor resultado (Figura 3), e diferença significativa a 6,5%, sendo incorporado ao protocolo de desinfestação superficial. 90,00 80,00 a 70,00 % contaminação 60,00 50,00 40,00 30,00 ab b 20,00 10,00 0,00 Clorotalonil + Tiofanatometílico Benomyl Carbendazim Figura 03 Porcentagem de contaminação de explantes após descontaminação superficial com fungicidas. As médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan.
Avaliações do efeito de fungicidas acrescidos em meio de cultura A inclusão de Tebuconazole no meio de cultura apresentou maior eficiência no controle da contaminação quando comparado aos demais tratamentos (Figura 4). Segundo Kososki e colaboradores (2001) tebuconazole nas doses, 0,1 ppm e 1 ppm, inibem tanto o crescimento micelial quanto a germinação in vitro, de conídios de isolados de Colletotrichum gloeosporioides do morangueiro (Kososki et al., 2001). Todos os fungicidas, com exceção do Mancozeb são sistêmicos, embora possuam princípio ativo diferente. Com estes resultados estamos sugerindo a inclusão de 2 g.l -1 Tebuconazole em meio de cultura para controlar a contaminação fúngica em explantes de mangueira. No entanto, são necessário realizar estudos para verificar os efeitos do fungicida no desenvolvimento dos explantes. 50 % de explantes contaminados 40 30 20 10 Tebuconazole Tebuconazole Mancozeb Procimidona Benzimidazol Controle Controle Carbedazim a e c d b 0 3 5 7 10 12 14 17 19 21 24 Dias após inoculação Figura 04. Porcentagem de explantes contaminados em meio de cultura contendo fungicida. As médias seguidas das mesmas letras não diferem estatisticamente pelo teste de Duncan, a 1% de probabilidade Conclusões 1. O tratamento das matrizes com Mancozeb é eficiente para diminuir a contaminação fúngica, mas é preciso novos estudos para averiguar a necessidade de outros tratamentos; 2. O Carbedazim pode ser utilizado como substituto ao Benomyl nos protocolos de descontaminação superficial dos explantes; 3. A adição de 2 g.l -1 Tebuconazole no meio de cultura é eficiente no controle do crescimento de fungos. Referências Bibliográficas
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