FOLICULOGÊNESE EM BOVINOS

JOSÉ BURATINI JUNIOR 55 FOLICULOGÊNESE EM BOVINOS José Buratini Junior 1 INTRODUÇÃO A maioria dos oócitos presentes no ovário ao nascimento não atinge a ovulação (Yang et. al., 1998). Portanto, técnicas de reprodução assistida como a superovulação/te e MIV/FIV têm sido desenvolvidas e aperfeiçoadas a fim de maximizar o potencial reprodutivo de fêmeas superiores ou ameaçadas de extinção. Em bovinos, protocolos hormonais que controlam o desenvolvimento folicular e a função lútea permitem IA em momento pré-determinado e sincronização de receptoras para TE, potencializando a eficiência reprodutiva (Barros & Ereno, 2004; Bó et al, 2004). Contudo, avanços nas técnicas de reprodução assistida requerem melhor entendimento da fisiologia ovariana. Apesar da enorme quantidade de informações produzidas durante as duas últimas décadas, o entendimento completo dos mecanismos controladores do desenvolvimento folicular ainda não foi atingido. A regulação do desenvolvimento folicular é complexa e envolve fatores endócrinos, parácrinos e autócrinos, que são orquestrados de maneira estágio-específica a fim de controlar vários processos incluindo proliferação e diferenciação de células foliculares, esteroidogênese, angiogênese/vascularização, remodelagem da membrana basal e matriz extracelular e atresia/apoptose (Webb et al., 2003; Silva & Price et al., 2000; Acosta & Miyamoto, 2004; Rodgers et al., 2003; Fortune et al., 2004). O objetivo desta revisão é sumarizar os principais mecanismos reguladores do desenvolvimento folicular pré-antral e antral. DESENVOLVIMENTO FOLICULAR PRÉ-ANTRAL O papel das gonadotrofinas no controle do desenvolvimento folicular pré-antral é controverso. Receptores de FSH (FSHR) podem ser detectados em folículos primários bovinos (Wandji et al., 1992) e estimulação do desenvolvimento folicular pré-antral pode ser alcançado pela adição de FSH ao meio de cultura. Entretanto, considera-se que o FSH desempenha um papel permissivo ao invés de regulador neste estágio de desenvolvimento (Gutierrez et al., 2000; McNatty et al., 1999; Webb et al, 2003). Alternativamente, o início e a regulação do desenvolvimento folicular pré-antral são predominantemente conduzidos por fatores produzidos localmente (McNatty et al., 1999). O oócito tem um papel ativo na coordenação da proliferação e diferenciação das células da granulosa ao seu redor (Gilchrist et al., 2004). Comunicação intercelular é proporcionada por processos citoplasmáticos trans-zonais (TZP), que são extensões das células da granulosa que penetram através da zona pelúcida e atingem a membrana do oócito, onde junções do tipo gap permitem transporte bidirecional de íons, metabólitos, aminoácidos e pequenas moléculas reguladoras (Albertini et al., 2001). Interessantemente, este tipo de comunicação entre o oócito e células somáticas parece ser regulada durante o desenvolvimento, uma vez que as TZPs retraem quando o folículo atinge o estágio antral, o que se acredita ser, pelo menos em parte, um efeito da ação do FSH (Albertini et al., 2001). A comunicação entre o oócito e as células somáticas também ocorre por sinalização parácrina. Dentre vários fatores de crescimento produzidos pelo oócito ou células da granulosa, o fator de células tronco (SCF; também conhecido como kit-ligante) e 1 Departamento de Fisiologia, Instituto de Biociências, UNESP Botucatu. (buratini@ibb.unesp.br)

56 JOSÉ BURATINI JUNIOR membros da família dos fatores de crescimento transformantes- (TGF- ), particularmente o fator de crescimento diferencial-9 (GDF-9) e a proteína morfogenética óssea-15 (BMP-15, também conhecida como GDF-9B) têm concentrado maior atenção recentemente. Em ovelhas, o receptor do KL, conhecido como c-kit, está localizado em oócitos de folículos em crescimento, enquanto que o KL é produzido por células da granulosa de folículos primordiais e primários (McNatty et al., 1999). Em camundongos, a imunização contra o c-kit aboliu a transição de folículos primordiais a primários e uma mutação no gene c-kit comprometeu a ativação de folículos primordiais (Kissel et al., 2000; Yoshida et al., 1997), o que destaca o absoluto requerimento da interação c- kit/kl para o desenvolvimento folicular pré-antral. Interessantemente, o KL estimula a síntese de DNA em células da granulosa, o que se acredita ser mediado por mitógenos de origem oocitária, uma vez que as células da granulosa não expressam o receptor c- kit (Yoshida et al., 1997; Otsuka & Shimasaki, 2002). Assim, sob estímulo do KL, o oócito dispararia um sinal bastante precoce para promover a proliferação das células da granulosa. Além disso, o sistema c-kit/kl também pode estar envolvido na diferenciação de células do estroma em células da teca, já que o receptor c-kit é expresso por células da teca e a expressão do KL aumenta em células da granulosa no momento da formação da camada da teca (Parrot & Skinner, 2000). Na maioria das espécies, o GDF-9 e BMP-15 ovarianos são exclusivamente expressos pelo oócito (revisado por Juengel et al., 2004 e Shimasaki et al., 2003), embora ambos tenham sido detectados por PCR em células da granulosa de folículos antrais em cabras (Silva et al., 2005). A expressão do GDF-9 é detectável a partir do estágio primordial (em ruminantes; Bodensteiner et al., 1999) ou primário (em camundongos; McGrath et al., 1995) do desenvolvimento folicular e é essencial para o desenvolvimento de folículos secundários, uma vez que camundongos com deleção do gene mostraram-se inférteis e com desenvolvimento folicular interrompido no estágio primário (Dong et al., 1996). Além disso, o GDF-9 estimulou o crescimento folicular préantral de ratas in vivo, provavelmente pela potencialização da proliferação das células da granulosa (Vitt et al., 2000ab). Como o GDF-9, a BMP-15 também estimula a proliferação das células da granulosa e é crucial para o desenvolvimento folicular préantral, já que ovelhas imunizadas contra a BMP-15 tiveram os folículos bloqueados no estágio primário (Otsuka et al., 2000; Juengel et al., 2002). Mutações espontâneas em ovelhas têm contribuído para esclarecer o papel da BMP-15. Ovelhas Inverdale com um único gene BMP-15 inativo são férteis e mostram taxa ovulatória aumentada, enquanto que ovelhas homozigotas para a mutação inativadora são estéreis e apresentam desenvolvimento folicular bloqueado no estágio primário (Galloway et al., 2000). Foi sugerido que níveis reduzidos de BMP-15 em ovelhas heterozigotas potencializariam o desenvolvimento folicular devido a um aumento na sensibilidade ao FSH. De fato, demonstrou-se que a BMP-15 suprime a expressão de receptores para FSH (FSHR) e de genes responsivos ao FSH incluindo a StAR (proteína reguladora aguda da esteroidogênese), P450scc (P450 clivadora de cadeia lateral), 3 -HSD (3 hidroxi-esteróide desidrogenase), LHR e inibina (Otsuka et al. 2001; Shimasaki et al., 2003). Uma alça de feedback negativo pode existir entre a BMP-15 e o KL. A BPM-15 estimula a expressão do KL, que, por sua vez, inibe a expressão da BMP-15. Contudo, a interrupção da sinalização c-kit/kl num sistema de co-cultivo (células da granulosa com oócitos) suprimiu a proliferação das células da granulosa induzida pela BMP-15, sugerindo que a interação entre a BMP-15 e o KL é importante para o crescimento folicular (Otsuka & Shimasaki, 2002; Shimasaki et al., 2003). Distintamente, o GDF-9 inibiu a expressão do KL em células da granulosa de camundongos (Joyce et al., 2000). Embora os padrões temporais de secreção desses fatores de crescimento

JOSÉ BURATINI JUNIOR 57 sejam ainda desconhecidos, propôs-se a hipótese de que o desenvolvimento folicular inicial seria conduzido pela interação do KL com a BMP-15, enquanto que o GDF-9 seria secretado um pouco mais tarde por oócitos inteiramente crescidos para promover proliferação das células da granulosa e modular a função do KL (Shimasaki et al., 2003). O fator de crescimento semelhante à insulina (IGF) também parece contribuir para a regulação do crescimento folicular pré-antral por meio de mecanismos endócrinos. Apesar do IGF-I e II não estarem expressos em folículos pré-antrais, eles expressam receptores de IGF (tipo 1) e proteínas ligantes de (IGFBP-2 e 3), que se acredita regularem a biodisponibilidade de IGFs extra-ovarianos (Webb et al., 2003). Os efeitos dos IGFs sobre o desenvolvimento folicular pré-antral têm variado com o sistema de cultivo, mas estimulação foi obtida quando doses de insulina próximas às fisiológicas foram utilizadas (Gutierrez et al., 2000; Fortune et al., 2004). Além disso, a importância dos IGFs para os estágios iniciais do desenvolvimento folicular foi claramente demonstrada por experimentos em que o nocaute do gene resultou em comprometimento severo da foliculogênese pré-antral e antral inicial em camundongos (Elvin & Matzuk, 1998). Vários outros fatores de crescimento estão envolvidos na sinalização parácrina préantral incluindo ativina, folistatina, inibina, fator de crescimento (EGF) e FGFs (McNatty et al., 1999). O FGF-2 (FGF básico) é certamente o FGF investigado mais extensivamente com relação ao desenvolvimento folicular. No ovário bovino, o FGF-2 foi localizado nos oócitos de folículos primordiais e primários e em células da granulosa e da teca de folículos pré-antrais em crescimento e antrais (Van Wezel et al., 1995). Estudos de ligação revelaram que os receptores para FGF-2 estão principalmente localizados na camada de células da granulosa (Wandji et al., 1992). Demonstrou-se que o FGF-2 é capaz de estimular a ativação de folículos primordiais em culturas de fragmentos de ovários de ratas e de promover proliferação de células da granulosa (Nilsson et al., 2001; Gospodarowicz et al., 1989). DESENVOLVIMENTO FOLICULAR ANTRAL Diferentemente do estágio pré-antral, o desenvolvimento folicular antral é criticamente dependente do suporte das gonadotrofinas. Em várias espécies domésticas, os folículos antrais são recrutados e crescem simultaneamente em uma onda folicular sob o controle das gonadotrofinas (Fortune et al., 2001; Ginther et al., 2001). Em bovinos, os intervalos interovulatórios apresentam 2 ou 3 ondas foliculares, sendo que a ocorrência de 1 ou 4 ondas constitui casos raros (Sirois & Fortune, 1988; Figueiredo et al., 1997). Além da ação das gonadotrofinas, também se tornou evidente que fatores de crescimento produzidos localmente constituem moléculas estimuladoras e reguladoras chave para os folículos antrais, atuando por meio de mecanismos parácrinos e endócrinos (Fortune et al., 2004; Ginther et al., 2001; Web et al., 2003). Uma elevação nas concentrações plasmáticas de FSH estimula o recrutamento folicular e a emergência da onda folicular (Adams et al., 1992; Fortune, 1994). Em espécies monovulatórias como a bovina, um folículo é selecionado do grupo de recrutados e adquire capacidade ovulatória, enquanto os folículos subordinados entram em atresia. O folículo selecionado é conhecido como folículo dominante e desempenha um papel ativo na supressão do crescimento dos subordinados pela secreção de estradiol e inibina (Fortune, 1994; Ginther et al., 1996). Em bovinos, os folículos podem atingir o diâmetro de 8mm independentemente do suporte do LH, mas o crescimento além de 9mm requer LH endógeno ou FSH exógeno (Gong et al., 1996). Portanto, os folículos

58 JOSÉ BURATINI JUNIOR são considerados dependentes de FSH até a ocorrência da dominância, após o que eles se tornam dependentes de LH (reviewed by Fortune et al., 2001, Ginther et al., 2001). Os receptores de LH (LHR) das células da granulosa parecem estar relacionados à dominância folicular. A comparação dos padrões de expressão gênica observados por hibridização in situ em folículos antrais bovinos recrutados e selecionados indicou que a seleção está associada ao início da expressão do gene LHR em células da granulosa (Bao & Garverick, 1998). Isto é apoiado pelo aumento dos níveis de RNAm do LHR detectado por RT-PCR em células da granulosa de futuros folículos dominantes comparados com seus subordinados, que ocorre no momento ou imediatamente antes do desvio (Beg 2001). Contudo, isto contradiz o relato de níveis indetectáveis de LHR à hibridização in situ em células da granulosa durante a seleção folicular (Evans & Fortune, 1997) e de níveis constantes de ligação do hcg a células da granulosa durante o ciclo estral (Ireland & Roche, 1983). Há também certa controvérsia sobre quando o LHR aparece em células da granulosa. O RNAm do LHR foi detectado por RT-PCR em células da granulosa de folículos com diâmetro entre 7 e 8mm (Beg et al., 2001) e em células da granulosa de folículos <5mm (Robert et al., 2003), mas não foi detectado antes dos 9mm de diâmetro por hibridização in situ (Xu et al., 1995). Recentemente, em nosso laboratório a expressão do LHR foi detectada em células da granulosa de folículos antrais 8mm e de apenas um de seis folículos de 7mm analisados (Nogueira et al., 2005). Considerando-se que os folículos utilizados neste experimento foram predominantemente obtidos de fêmeas Nelore e que o desvio folicular ocorre aos 6mm de diâmetro nesta raça (Sartorelli et al., 2005), nós assumimos que a expressão do gene LHR nas células da granulosa foi detectada após a seleção do folículo dominante em nossos estudos. Há fortes evidências de que o sistema IGF desempenha um papel crítico na seleção do folículo dominante. Os IGFs são sinérgicos ao FSH na promoção de crescimento folicular e produção de estradiol (Fortune et al., 2004). Apesar da expressão gênica do IGF-I e -II ter sido localizada em células da granulosa e da teca, respectivamente, o IGF-II tem sido apontado como o principal IGF intraovariano, enquanto que o IGF-I atuaria de uma maneira endócrina (Armstrong et al., 2000; Yuan et al., 1998, Webb et al., 1999). O IGF-I e -II ativam os receptores de IGF tipo I e II, ambos presentes em células da granulosa e da teca (Spicer et al., 2004). Os níveis de IGF total não foram diferentes no fluido folicular de folículos dominantes em relação a folículos subordinados (de la Sota et al., 1996), mas os níveis de IGF-I livre foram maiores no fluido folicular do maior folículo comparado ao segundo maior da mesma onda, antes da observação de diferenças na concentração de estradiol ou diâmetro (Beg et al., 2002). Esta observação está de acordo com um papel regulador para as IGFBPs mediante modulação da biodisponibilidade de IGF. A IGFBP-2, -3, -4 e -5 estão presentes no fluido folicular bovino e a expressão gênica da IGFBP-2 e -4 foi localizada em células da granulosa e da teca, respectivamente (revisado por Fortune, et al. 2001 e Webb et al., 1999). Níveis reduzidos da IGFBP-4 foram encontrados em folículos dominantes bovinos comparados com os dois maiores folículos subordinados apenas 1,5 dias após a emergência da onda (Mihm et al. 2000). Há fortes evidências sugerindo que a redução dos níveis de IGFBP-4 no folículo selecionado é conseqüência de um aumento da degradação proteolítica das IGFBPs pela proteína plasmática associada à gestação (PAPP-A), recentemente detectada no folículo (Mazerbourg et al., 2001). De fato, a degradação não apenas da IGFBP-4, mas também da IGFBP-5, foi mais alta no maior folículo antes do momento esperado do desvio folicular (Fortune et al., 2004). Por outro lado, os níveis intra-foliculares de IGFBP-2 parecem diminuir com o desenvolvimento do folículo dominante, mas posteriormente em relação à IGFBP-4 e -5

JOSÉ BURATINI JUNIOR 59 (Fortune et al., 2004). Distintamente da IGFBP-4 e -5, as concentrações de IGFBP-2 parecem ser reguladas no nível transcricional pelo FSH, uma vez que o RNAm da IGFBP-2 não foi detectado em células da granulosa de folículos dominantes grandes e o FSH inibiu a expressão gênica da IGFBP-2 em células da granulosa bovinas cultivadas (Armstrong et al., 1998; Webb et al., 2003). Contudo a ovulação do folículo dominante selecionado requer condições endócrinas favoráveis. Se a regressão luteal ocorre ainda durante a fase de crescimento do folículo dominante, a queda dos níveis de progesterona permite o aumento da freqüência dos pulsos de LH, estimulado pelo aumento da produção de estradiol do folículo dominante. O aumento da pulsatilidade do LH culmina então no pico de LH necessário à ovulação e à maturação oocitária com retomada da meiose que havia sido interrompida no início do desenvolvimento folicular. Caso não ocorra luteólise enquanto o folículo dominante permanece viável, ele regride e deixa de inibir a secreção de FSH, possibilitando a emergência de uma nova onda folicular (Monniaux et al., 1997). REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ACOSTA TJ, MIYAMOTO A. Vascular control of ovarian function: ovulation, corpus luteum formation and regression. Anim. Reprod. Sci. v. 82-83, p. 127-140, 2004. ADAMS GP, MATTERI RL, KASTELIC JP, KO JCH, GINTHER OJ. Association between surges of follicle-stimulating hormone and the emergence of follicular waves in heifers. J. Reprod. Fertil. v. 94, p. 177-188, 1992. ALBERTINI DF, COMBELLES CMH, BENECCHI E, CARABATSOS MJ. Cellular basis for paracrine regulation of ovarian follicle development. Reproduction. v. 121, p. 647-653, 2001. ARMSTRONG DG, BAXTER G, GUTIERREZ CG, HOGG CO, GLAZYRIN AL, CAMPBELL BK, BRAMLEY TA, WEBB R. Insuline-like growth factor binding protein-2 and -4 messenger ribonucleic acid expression in bovine ovarian follicles: effect of gonadotropins and development status. Endocrinology. v. 139, p. 2146-2154, 1998. BAO B, GARVERICK HA. Expression of steroidogenic enzyme and gonadotropin receptor genes in bovine follicles during ovarian follicular waves: a review. J. Anim. Sci. v. 76, p. 1903-1921, 1998. BARROS CM, ERENO RL. Avanços em tratamentos hormonais para a inseminação artificial com tempo fixo (IATF) em bovinos de corte. Acta Scientiae Veterinariae. v. 32, p. 23-34, 2004. BEG MA, BERGFELT DR, KOT K, GUINTHER OJ. Follicle selection in cattle: dynamics of follicular fluid factors during development of follicle dominance. Biol. Reprod. v. 66, p. 120-126, 2002. BÓ GA, MORENO D, CUIATA L, BARUSELLI PS, REIS EL. Manipulação hormonal do ciclo estral em doadoras e receptoras de embrião bovino. Acta Scientiae Veterinariae. v. 32, p. 1-22, 2004. BODENSTEINER KJ, CLAY CM, MOELLER CL, SAWYER HR. Molecular cloning of de ovine growth/differentiation factor-9 gene and expression of growth differentiation factor-9 in ovine and bovine ovaries. Biol. Reprod. v. 60, p. 381-386, 1999. DE LA SOTA RL, SIMMEN FA, DIAZ T, THATCHER WW. Insulin-like growth factor system in bovine firstwave dominant and subordinate follicles. Biol. Reprod. v. 55, p. 803-812, 1996. DONG J, ALBERTINI DF, NISHIMORI K, KUMAR TR, LU N, MATZUK MM. Growth differentiation factor- 9 is required during early ovarian folliculogenesis. Nature. v. 383, p. 531-535, 1996. ELVIN JA, YAN C, MATZUK MM. Oocyte-expressed TGF-beta superfamily members in female fertility. Mol. Cell. Endocrinol. v. 25, p. 1-5, 2000. FIGUEIREDO RA, BARROS CM, PINHEIRO OL, SOLER, JMP. Ovarian follicular dynamics in Nelore breed (Bos indicus) cattle. Theriogenology, v. 47, p. 1489-505, 1997. FORTUNE JE. Ovarian follicular growth and development in mammals. Biol. Reprod. v. 50, p. 225-232, 1994.

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