Impacto da suplementação de progesterona de longa ação durante o diestro inicial em vacas Nelore submetidas a IATF

Guilherme Pugliesi é Médico veterinário formado pela Universidade Federal de Minas Gerais, com mestrado e doutorado em Zootecnica pela Universidade Federal de Viçosa e estágio em doutoramento na University of Wisconsin-Madison. Desde 2012 é Pós-doutorando do Departamento de Reprodução Animal da Universidade de São Paulo, campus de Pirassununga e atualmente é Professor Auxiliar no curso de Medicina Veterinária da Unicastelo, campus Descalvado. Atua principalmente na área de fisiologia e biotécnicas reprodutivas associadas aos processos de receptividade uterina e sinalização do concepto em fêmeas bovinas. Impacto da suplementação de progesterona de longa ação durante o diestro inicial em vacas Nelore submetidas a IATF Guilherme Pugliesi 1 ; Felipe Barbosa Santos 1 ; Everton Lopes 1 ; Ed Hoffmann Madureira 1 ; Ériklis Nogueira 2 ; José Ricardo G. Maio 3 ; Luciano A. Silva 4 ; Mario Binelli 1 1 Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Universidade de São Paulo, Pirassununga, SP; 2 Embrapa Pantanal, Corumbá, MS; 3 Ouro Fino Saúde Animal, Cravinhos, SP; 4 Laboratório de Teriogenologia OJ Ginther, Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos, Universidade de São Paulo. Autor para correspondência: Guilherme Pugliesi Telefone: (19) 3565-4220. Endereço: Av. Duque de Caxias Norte 225, Pirassununga, SP, Brasil. e-mail: gpugliesi@usp.br

1. Introdução A secreção de progesterona (P4) pelo corpo lúteo (CL) durante o início da gestação pode ser influenciada pelo tamanho do folículo ovulatório e possui um significante efeito na sobrevivência do embrião/concepto em bovinos (Garret et al., 1988; Mann et al., 2003; Carter et al., 2008). Neste contexto, CLs maiores secretam mais P4 e isto tem sido associado, em alguns estudos (Vasconcelos et a., 2001; Inskeep, 2004; Baruselli et al., 2010), mas não todos (Spell et al., 2001), com aumento na taxa de gestação. Baixas concentrações circulantes de P4 nos primeiros dias após a concepção (Dia 3 a 8; Dia 0 = ovulação) são associadas com embriões menores no Dia 16, e consequentemente, podem resultar em menor produção de interferon-tau para suprimir a secreção endometrial de prostaglandina F2α, a qual induz a luteólise e impede a manutenção da gestação (Mann & Lamming, 2001). Similarmente, um atraso no aumento da P4 após a ovulação tem sido associado com uma redução na taxa de gestação em novilhas (Diskin et al., 2006) e vacas (Starbuck et al., 1999; Stronge et al., 2005). Apesar dos indicativos do efeito benéfico do aumento das concentrações de P4 no desenvolvimento embrionário em bovinos, os resultados de fertilidade em estudos objetivando elevar-se a P4 são comumente conflitantes e inconclusivos, e podem refletir o momento do tratamento, onde apenas os animais com baixa P4 podem ser beneficiados pelo tratamento (Lonergan, 2011). Mann e Lamming (1999) realizaram uma meta-análise dos estudos nos quais se aumentou a P4 circulante durante o período inicial da gestação e examinaram o efeito do dia de início da suplementação sobre a taxa de gestação. Estes autores concluíram que a suplementação com P4 logo no início do diestro resulta em média 5% de aumento na taxa de gestação, porém, a suplementação após o Dia 6 (Dia 0 = ovulação) não possui efeito benéfico. Contrariamente, o aumento de P4 antes do Dia 2 pode comprometer o desenvolvimento do CL e reduzir a fertilidade (Cleeff et al., 1996). O consenso entre a maioria dos estudos é que o período crítico para a P4 promover um aumento na taxa de desenvolvimento embrionário é do Dia 3 ao 7. Neste contexto, a elevação da concentração de P4 nestes dias aumenta significativamente o tamanho do concepto nos dias 13 e 16 de gestação (Carter et al., 2008). As concentrações de P4 durante o diestro podem ser elevadas pela indução da ovulação de um folículo dominante da primeira onda folicular pós-ovulação, usando GnRH ou hcg, para formar um CL acessório, ou pela suplementação exógena de P4

(revisado em Binelli et al., 2008). A indução de CLs acessórios só é capaz de aumentar a secreção de P4 após o 6-8º dia pós-ovulação, e assim, este aumento pode ser muito tardio para favorecer a sobrevivência embrionária (Howard et al., 2006). Entretanto, a suplementação de P4 exógena, através da injeção de P4 ou a inserção de um dispositivo intravaginal de liberação de P4, resulta em imediato aumento da concentração circulante de P4. Alternativamente, tal aumento pode ser obtido pela suplementação com P4 com formulação de longa-ação (Pugliesi et al., 2014). Assim, ao invés do uso de implantes intravaginais ou do uso repetido de P4 injetável como reportado em estudos anteriores (Garrett et al., 1988; Carter et al., 2008), uma alternativa é utilizar P4 injetável de longa ação em uma única administração. Desta maneira, objetivou-se com este estudo avaliar o efeito da administração de uma formulação de P4 injetável de longa-ação após a IATF sobre a fertilidade de vacas de corte. 2. Material e Métodos Experimento 1 O experimento foi realizado em uma fazenda comercial na região de Puerto Suarez, Bolívia durante os meses de Dezembro de 2013 e Janeiro de 2014. Para sincronização da ovulação, vacas Nelore (n=783) entre 30 e 50 dias pós-parto e escore de condição corporal médio 3,7 (em escala de 1 a 5) receberam um dispositivo intravaginal de P4 (Sincrogest; Ouro Fino, Cravinhos, SP, Brasil) e uma injeção intramuscular de benzoato de estradiol (2 mg; Sincrodiol, Ouro Fino) no Dia 10 (Dia 0 = dia da IATF). No Dia 2, os dispositivos foram retirados e foram injetados por via intramuscular cipionato de estradiol (1 mg; ECP; Zoetis, São Paulo, SP), ecg (300 UI; Novormon; Zoetis) e cloprostenol sódico (0,530 mg; Sicrocio; Ouro Fino). No Dia 0 as vacas foram inseminadas em tempo fixo (IATF) e o diâmetro do folículo pré-ovulatório foi mensurado por ultrassonografia transretal. No Dia 4 pós-iatf a ocorrência de ovulações foi confirmada e a área do CL foi mensurada por ultrassonografia, e os animais foram divididos para receberem por via intramuscular 1 ml de solução placebo (Grupo Controle; n= 393) ou 150 mg (1mL) de P4 injetável de longa ação (Sincrogest injetável; Ouro Fino; Grupo P4-tratado; n=390). A dose e momento de aplicação foram baseados em estudo prévio (Pugliesi et al., 2014), no qual foi observado aumento nas concentrações plasmáticas de P4 por >72 horas sem comprometimento no desenvolvimento do CL após administrar 150 ou 300 mg da mesma formulação de P4 de longa ação no terceiro dia após a ovulação.

Experimento 2 O experimento foi realizado em uma fazenda comercial no município de Rochedo, MS, Brasil, durante os meses de Dezembro de 2013 a Maio de 2014. Para sincronização da ovulação, vacas Nelore (n=605) com 35 a 65 dias pós-parto e escore de condição corporal médio de 3,3 (em escala de 1 a 5) foram submetidas a duas avaliações ovarianas por ultrassonografia transretal em um intervalo de 10 dias. Apenas as vacas com ausência de CL nas duas avaliações (consideradas em anestro) foram utilizadas, sincronizadas e divididas nos grupos Controle (n=189) e P4-tratado (n= 187) conforme descrito no Experimento 1. Diagnóstico de gestação e análises estatísticas Em ambos experimentos o diagnóstico gestacional foi realizado entre os dias 35 e 60 pós-iatf através de ultrassonografia transretal. Utilizou-se um equipamento de ultrassom Duplex composto com modo-b e modo-doppler, e com um transdutor linear multifrequencial (MyLab30, Esaote, São Paulo, SP, Brasil). A taxa de gestação foi avaliada por regressão logística utilizando-se o PROC Glimmix do software SAS. No modelo estatístico, foram considerados os efeitos de condição corporal, peso, lote, touro, tamanho do folículo na IATF, tamanho do CL no D4, tratamento (Controle ou P4-tratado), e suas interações. As variáveis segundo o critério de Wald com P>0,20 foram eliminadas do modelo, permanecendo apenas a variáveis de tamanho de folículo e tratamento no modelo final. 3. Resultados Experimento 1 No Experimento 1, a taxa de gestação não diferiu (P>0.1) entre os Grupos Controle e P4-tratado, considerando-se todas as vacas ou apenas as vacas ovuladas (Fig. 1). O tamanho médio do folículo pré-ovulatório foi 12,6 ± 2,2 mm no D0 e a área do CL no D4 nas vacas ovuladas foi de 1,42 ± 0,46 cm 2. Quando avaliado a taxa de gestação de acordo com a categoria de tamanho de folículo no D0 e tamanho de CL no D4 (Tabela 1), foi detectado menor (P<0,05) taxa de gestação nas vacas com folículos <11 mm e com CLs <0.9 cm 2 em relação as demais categorias. A taxa de gestação também não diferiu (P>0,1) entre os grupos Controle e P4-tratado para nenhuma das categorias de tamanho de folículo, mas foi maior (P<0,05) nas vacas com CL pequeno (<0.9 cm 2 ) que foram tratadas com P4 do que nas vacas do grupo Controle.

70 60 50 53,2% (209/393) 56,2% (219/390) Experimento 1 65,6% 62,6% (219/334) (209/334) 40 30 Grupo Controle Grupo P4 20 10 0 Todas Ovuladas P>0,1 Fig. 1. Taxa de gestação (%) em vacas Nelore tratadas com 150 mg de progesterona de longa ação (grupo P4-tratado) ou placebo (grupo Controle) no Dia 4 após a IATF. Experimento 1. Tabela 1. Taxa de gestação em vacas Nelore em amamentação tratadas com 150 mg de progesterona de longa ação (grupo P4-tratado) ou placebo (grupo Controle) no Dia 4 após a IATF. Experimento 1 (Agropecuária JPS, Puerto Suarez/Bolívia) 1 Grupo Variável Controle P4-tratado Diâmetro do folículo Pequeno (<11mm) 41,9% (13/31) B 42,3% (11/26) B Médio (11 a 14mm) 63,9% (85/133) A 73,7% (98/133) A Grande (>14mm) 72% (49/68) A 69,6% (48/69) AB Área do CL Pequeno (<0,9cm 2 ) 40,4% (21/52) Bb 57,9% (22/38) a Médio (0,9 a 1,8 cm 2 ) 67,1% (100/149) A 68,8% (108/157) Grande (>1,8 cm 2 ) 66,1% (82/124) A 64% (87/136) 1 O diagnóstico de gestação foi realizado entre os Dias 35 e 65 pós-iatf. ab Letras diferentes na mesma linha indicam diferença estatística (P<0,05) entre os grupos pelo teste de regressão logística. AB Letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística (P<0,05) dentro do mesmo grupo pelo teste de regressão logística. Experimento 2 No Experimento 2, a taxa de gestação foi maior nas vacas do grupo P4-tratado em comparação ao grupo Controle, considerando-se todas as vacas (P=0,05) ou apenas as vacas ovuladas (P=0,08). O tamanho médio do folículo ovulatório foi 12,8 ± 2,3 mm no D0 e a área do CL no D4 foi de 1,77 ± 0,55 cm 2.

70 60 50 P=0,05 46% (86/187) 55,6% (105/189) Experimento 2 49,7% (86/173) P=0,08 59% (105/178) 40 30 20 Grupo Controle Grupo P4 10 0 Todas Ovuladas Fig. 2. Taxa de gestação (%) em vacas Nelore em anestro tratadas com 150 mg de progesterona de longa ação (grupo P4-tratado) ou placebo (grupo Controle) no Dia 4 após a IATF. Experimento 2. 4. Discussão A busca por alternativas que resultem em melhor fertilidade de fêmeas bovinas de corte submetidas a protocolos de IATF é uma constante para se otimizar e maximizar o uso dessa biotecnologia em programas reprodutivos na pecuária de corte. Neste contexto, a modulação do ambiente endócrino no início do diestro pode ser uma alternativa para se obter incrementos nas taxas de gestação após a IATF em vacas de corte em condições fisiológicas/endócrinas específicas. No presente estudo, a modificação das concentrações circulantes de P4 pela suplementação de P4 de longa ação no início do diestro se constituiu uma alternativa promissora pois aumentou a taxa de concepção em 20% nas vacas em anestro pós-parto. Apesar desse efeito positivo, a suplementação com 150 mg de P4 de longa ação não alterou a fertilidade no Experimento 1, aonde o status reprodutivo não foi considerado no início do protocolo de IATF. Entretanto, quando avaliado de acordo com a categoria de tamanho do folículo ovulatório e CL independentemente do tratamento com P4, as vacas com folículo e CL maiores apresentaram um incremento em torno de 60% na taxa de gestação em comparação com vacas com folículo pequeno (<11mm) e CL pequeno (<0,9cm 2 ). Adicionalmente, as vacas que apresentaram um CL pequeno foram beneficiadas pela suplementação com P4, resultando em maior taxa de gestação. Tal resultado indica um efeito positivo da P4 apenas naquelas fêmeas com menor funcionalidade do CL (secreção de P4). Neste contexto, o uso de implantes intravaginais de P4 entre os Dias 2 e 7 pós-estro aumentam em 10 15% a sobrevivência embrionária (Mann & Lamming, 1999; Stronge et al., 2005). Tal aumento foi atribuído

aos efeitos embriotróficos da P4, especialmente em vacas com baixas concentrações de P4 no momento da suplementação. Assim, supõe-se que ao menos parte dos efeitos positivos da P4 decorra da estimulação do endométrio levando a um padrão específico de expressão gênica endometrial, e à secreção de proteínas necessárias à formação do fluido luminal uterino (histotrofo). Neste sentido, estudos anteriores (Forde et al., 2009; Mesquita et al., 2014; Forde et al., 2014) reportam diferenças no padrão de expressão gênica e composição do fluído uterino em vacas com diferentes perfis progesterônicos na fase inicial do diestro, que poderiam estimular o desenvolvimento embrionário. A diferença de resposta ao tratamento com P4 de longa ação entre os experimentos pode ser em decorrência de diferenças observadas em relação ao status reprodutivo (proporção de vacas anestro), condição corporal, tamanho do folículo pré-ovulatório e tamanho do CL. Neste sentido, estudos anteriores (Beal et al., 1984; Sá Filho et al., 2009; Whittier et al., 2013) têm reportado menor fertilidade em vacas de corte em anestro e com menor condição corporal. Assim, modificações e alternativas que otimizem o ambiente endócrino, principalmente aquele relacionado aos níveis de P4 no início do diestro podem melhorar a receptividade materna ao embrião em vacas com baixa funcionalidade do CL ou em anestro. Neste sentido, a administração de P4 de longa ação no quarto dia após a IATF pode ser uma alternativa mais viável para se aumentar as concentrações circulantes de P4 em relação ao uso de implantes intravaginais ou auriculares, pois reduz o número de manipulação dos animais após a inseminação para apenas uma vez, e pode assim, se constituir numa medida mais aplicável a campo. Em conclusão, a administração de P4 de longa ação no quarto dia após a IATF aumenta a fertilidade em vacas de corte em anestro. Tal incremento pode resultar de uma melhoria no ambiente uterino menos favorável a sobrevivência embrionária em animais não-cíclicos após o parto. Assim, a suplementação com P4 no início do diestro pode atenuar a baixa fertilidade de vacas com CL pequeno e/ou em anestro. Agradecimentos: CNPq (481199/2012-8); FAPESP (2011/03226-4; 2012/04004-8); Ouro Fino Agronegócio; Geneplan Reprodução Bovina; Innovare; e Panorama S.A (Marcos, Grazieli e Sr. Valdo). 5. Referências

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