Pré projeto de pesquisa - Biológicas Tema 2: Leishmaniose Título: Conhecendo a Leishmaniose Justificativa O tema de pesquisa do PIBID na área Biológica é sobre a Leishmaniose. Para realizar um trabalho junto aos alunos da Escola Helen Keller, os alunos bolsistas do PIBID tem necessidade de aprimorar os conhecimentos científicos sobre o tema, uma vez que serão futuros professores, portanto a necessidade de obter domínio do conhecimento. Objetivos - Caracterizar, tipificar a Leishmaniose, abordando formas de transmissão, sintomas, tratamento e prevenção ; - Realizar um levantamento histórico sobre o surgimento e a proliferação da Leishmaniose; - Caracterizar o agente etiológico; - Conhecer os sintomas da Leishmaniose no cão e as formas diagnosticas da doença; - Conhecer os métodos de prevenção e diagnóstico da doença em Adamantina. Metodologia Pesquisa bibliográfica na rede mundial de computadores e no acervo bliográfico da FAI sobre Leishmaniose, entrevista e palestra proferida pelo Profº Wiverson Moura Silva do Departamento de Controle de Vetores, Adamantina SP, debates entre os membros do grupo, encontros com a professora supervisora e coordenadora, redação no final do trabalho ( anexo) e elaboração de artigo. ( anexo). Cronograma Janeiro/Fevereiro de 2013 Resumo Os objetivos desse trabalho foi ampliar os conhecimentos do grupo sobre o tema do Leishmaniose para posteriormente transmitir com segurança para os alunos do ensino médio da EE Helen Keller. Para esta finalidade realizamos pesquisas bibliográficas, entrevistas no Departamento de Controle de Vetores de Adamantina e participação em palestra promovida pela coordenadora do PIBID. Como resultado o grupo aprimorou seus conhecimentos, elaborando uma redação e um artigo sobre Leishmaniose.
Redação da pesquisa Conhecendo a Leishmaniose 1-Leishmaniose Fonte: Inseto Lutzomyia, vetor da leishmaniose (Foto: Genilton Vieira/IOC/Fiocruz) È uma doença transmitida por protozoários do gênero Leishmania. No Brasil existem atualmente seis espécies de protozoários responsáveis por causar doença humana. As variedades mais encontradas são a Leishmaniose Visceral (LV) e a Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA). Leishmaniose Visceral É conhecida como calazar, esplenomegalia tropical e febre dundun. É infecciosa, mas não contagiosa. Acomete vísceras, como o fígado e o baço, podendo ocasionar aumento de volume abdominal. Transmissão A LV é transmitida ao homem por meio da picada do inseto vetor (Lutzomyia longipalpis) conhecido popularmente como "mosquito-palha, birigui, asa branca, tatuquira e cangalhinha". Esses insetos têm hábitos noturnos e vespertinos, atacando o homem e os animais principalmente no início da noite e ao amanhecer. Sintomas Os sintomas mais freqüentes são febre e aumento do volume do fígado e do baço, emagrecimento, complicações cardíacas e circulatórias, desânimo, prostração, apatia e palidez. Pode haver tosse, diarréia, respiração acelerada, hemorragias e sinais de infecções associadas. Quando não tratada, a doença evolui podendo levar à morte até 90% dos doentes. Tratamento
O SUS oferece tratamento específico e gratuito para a doença. O tratamento é feito com uso de medicamentos específicos a base de antimônio, repouso e uma boa alimentação. A droga de primeira escolha para tratamento de casos de LV é o antimoniato de N-metil glucamina (Glucantime ). É importante reforçar que quanto antes o doente procurar orientação médica e tratamento, maior a possibilidade de recuperação e cura. Prevenção As medidas preventivas visam a redução do contato homem-vetor, podendo ser realizadas medidas de proteção individual, dirigidas ao vetor e à população canina, tais como: uso de mosquiteiros com malha fina, telagem de portas e janelas, uso de repelentes, manejo ambiental, através da limpeza de quintais, terrenos e praças, eliminação de fontes de umidade, não permanência de animais domésticos dentro de casa, eliminação e destino adequado de resíduos sólidos orgânicos, entre outras medidas de higiene e conservação ambiental que evitam a proliferação do inseto vetor. Leishmaniose Tegumentar Americana É uma doença infecciosa, não contagiosa, que provoca úlceras na pele e mucosas. É transmitida ao homem pela picada das fêmeas de flebotomíneos infectadas. Transmissão A transmissão ocorre pela picada de fêmeas de flebotomíneos infectadas. Sintomas As lesões podem ocorrer na pele e/ou mucosas. As lesões de pele podem ser única, múltiplas, disseminada ou difusa. Apresentam aspecto de úlceras, com bordas elevadas e fundo granuloso, geralmente indolor. As lesões mucosas são mais freqüentes no nariz, boca e garganta. Quando atingem o nariz podem ocorrer entupimentos, sangramentos, coriza e aparecimento de crostas e feridas. Na garganta, dor ao engolir, rouquidão e tosse. Tratamento O SUS oferece tratamento específico e gratuito para a doença. O tratamento é feito com uso de medicamentos específicos a base de antimônio, repouso e uma boa alimentação. A droga de primeira escolha para tratamento de casos de LTA é o antimoniato de N-metil glucamina (Glucantime ). Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), a dose do Glucantime deve ser calculada em mg/sb+5/kg/dia, Sb+5, significando antimônio pentavalente. Para as lesões cutâneas, o esquema de tratamento é de 15 mg/sb+5/kg/dia por um período de 20 dias e para cutânea difusa o tratamento é de 20 mg/sb+5/kg/dia por um período de 20 dias. Para as lesões mucosas, é recomendada a dose de 20 mg/sb+5/kg/dia por um período de 30 dias. Outras opções terapêuticas disponíveis nos serviços de saúde são: isotionato de pentamidina e anfotericina B.
Prevenção O Ministério da Saúde recomenda ações dirigidas à: População humana: medidas de proteção individual, tais como usar repelentes e evitar a exposição nos horários de atividades do vetor (crepúsculo e noite) em ambientes onde este habitualmente possa ser encontrado; Vetor: manejo ambiental, através da limpeza de quintais e terrenos, a fim de alterar as condições do meio, que propiciem o estabelecimento de criadouros para formas imaturas do vetor; Atividades de educação em saúde: devem ser inseridas em todos os serviços que desenvolvam as ações de vigilância e controle da LTA, requerendo o envolvimento efetivo das equipes multiprofissionais e multiinstitucionais com vistas ao trabalho articulado nas diferentes unidades de prestação de serviços. Fonte: Mnistério da Saúde 2- Histórico da Leishmaniose visceral canina do contexto global para o local (Adamantina SP) Introdução O primeiro registro do agente etiológico da Leishmaniose Visceral Canina foi realizada por Willian Leishman e Charles Donovan em meados de 1900 na Europa, quase simultaneamente em 1903 ocorreu o primeiro óbito descrito, em um soldado irlandês. A Leishmaniose Visceral Americana é uma doença infecciosa fatal que vem se expandido por vários países considerada emergente como uma das mais importantes zoonoses pela Organização Mundial de Saúde obtendo 500.000 casos anuais no mundo e cerca de 2.000/3.000 casos anualmente no Brasil. O primeiro caso na América do Sul foi registrado no Paraguai em 1913, um paciente que havia contraído a doença no estado do Mato Grosso, Brasil desde então vem se expandido pelas regiões urbanas atingindo grandes centros como Rio de Janeiro (RJ) Belo Horizonte (MG) e Araçatuba (SP). No estado de São Paulo vem se tornando um caso de epidemia de saúde publica cada vez mais preocupante, atingindo vários municípios do interior que estão na região de Araçatuba, inclusive Adamantina que apresenta casos de pessoas infectadas e registro de óbitos. No ano de 2005 a cidade de Adamantina aderiu o Projeto LVA juntamente com o governo do estado de São Paulo em combate disseminação da doença, onde provem da realização de diagnóstico em cães errantes visando o controle da Leishmaniose Visceral Canina. O Diagnóstico em cães errantes é de grande importância para a identificação dos reservatórios de transmissão da doença já que não existe tratamento que se obtêm a cura do animal.
A LVA é conhecida como Calazar. O termo pode ter surgido das palavras kala e azar. Kala significa morte e azar significa doença, ou seja, doença que leva a morte (MINISTÉRIO DA SAÚDE,2004). Causada por um protozoário chamado Leshmania donovani com grande índice nas regiões tropicais e subtropicais caracterizada por causar febre irregular de longa duração, hepatosplenomegalia, emagrecimento, pancitopenia, hipergamaglobulinemia e hipoalbumenemia, sendo uma zoonose canina, felina, de roedores e marsupiais, transmitida para o homem por meio de flebótomos. O tratamento é efetuado por antimoniais penta valentes, geralmente consegui haver um controle do protozoário no organismo, caso contrário o quadro evolui para óbito dentro de um a dois anos. (xerox)sendo mais frequente em pessoas do sexo masculino com 63,9% e em crianças com menos de 10 anos 48,9%. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009). 2.1 Histórico A primeira observação parasitaria foi realizada na Índia em 1882 por Cunningham e posteriormente em 1903 foi descrito seu agente etiológico por Willian Leishman e Charles Donovan que fizeram o primeiro registro da doença em seres humanos. Em 1908 Nicole Comte demostrou pela primeira vez o parasito em cães, vendo a assim a possibilidade de seres os reservatórios da doença e somente em 1913 constataram que a transmissão da doença é causada pela picada de flebotomíneos responsável vetor. Em 1934, Penna fez o primeiro relato no Brasil examinando 47.000 lâminas onde encontrou 41 lâminas com parasitos, seguindo os seus estudos Evandro Chagas descreveu o primeiro caso in vivo no Brasil no ano de 1936. (NEVES, 2000) 2.2 Importância A LVA é uma doença emergente que atinge zonas rurais e urbanas com 500.000 casos mundiais por ano onde os principais reservatórios são animais domésticos que devido ao apego dos donos são migrados para cidades vizinhas na tentativa de salva-los da eutanásia, a expansão das favelas quando não tratada, pode evoluir para óbito em mais de 90% dos casos. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009) A preocupação da OMS possibilidade de se contrair a Leishmaniose através das transfusões sanguíneas no Brasil por não ser incluído na triagem dos exames de doadores, a transmissão da doença com grande velocidade devido ao uso de drogas injetáveis por ser usada a mesma seringa. (NEVES, 2000). Sendo mais frequente em pessoas do sexo masculino com (63,9%) e em crianças com menos de 10 anos ( 48,9%). (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009)
2.3 Distribuições Geográficas A Leishmaniose visceral tem sido encontrada em regiões onde existem flebotomíneos em diversas espécies como na Ásia, África, Europa e América e grande frequência mas também incidente na Birmânia, Tailândia, Vietnã, Laos, Malásia, Indonésia, Índia, Paquistão, China, Arábia Saudita, Iraque, Irã, Turquia, Republica do Uzbequistão, Azerbaijão, Israel, Líbano, Argélia, Tunísia, Senegal, Nigéria, Sudão, Quênia, Uganda, Madagascar, Marrocos, Líbia, Somália, Etiópia, África Ocidental e Equatorial, Tchad, Gambia, Moçambique, Itália, Grécia, Espanha, Portugal, Iugoslávia, México, El Salvador, Guatemala, Venezuela, Colômbia, Guiana Holandesa, Peru, Paraguai, Bolívia, Argentina, Brasil que representa mais de 90% dos casos relato nas Américas, entre outros países com menor taxa de casos. ( ATLAS ) Entre 2003 e 2009 foram registrados 34.583 casos de seres humanos portadores de LV no Brasil, onde a região Nordeste representou 47,5% dos casos, Norte 19,2 %, Sudeste 17,4 %, Centro Oeste 7,4% e Sul 0,2%. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009). No estado de São Paulo registrado em zona urbana de 79 municípios, essa expansão vem ocorrendo lentamente, tendo inicialmente registro no município de Araçatuba, posteriormente nas regiões de Bauru, Marília, Presidente Prudente, seguindo a região de São João da Boa Vista e recentemente na região de São José do Rio Preto. (Superintendência de Controle de Endemias SUCEN, 2011).
Figura 1: Municípios com transmissão da leishmaniose visceral americana canina, segundo faixa de prevalência (%). Estado de São Paulo, 2007. Fonte: http://www.cve.saude.sp.gov.br/agencia/bepa48_lva.htm Acesso: 05/06/2011 Gráfico 1 : Número de municípios com transmissão da leishmaniose visceral humana, coeficiente de incidência (por 100 mil habitantes). Estado de São Paulo, de 1999 a 2006. Fonte: http://www.cve.saude.sp.gov.br/agencia/bepa48_lva.htm Acesso: 05/06/2011 2.4 Transmissão A transmissão no Brasil é pela picada do mosquito L. longipalpis ou L. cruzi, também conhecidos como mosquito palha ou birigui, que estão infectados pelo protozoário causador a Leishmania chagasi. O vetor infecta-se ao sugar o sangue de animais portadores e ingere macrófagos na forma amastigota que por divisões binárias transformam-se em promastigotas metacíclicas, sendo esta a sua forma infectante. (RQUHART, 1997).
Figura 2: Lutzomyia Fonte : http://www.antropozoonosi.it/vettori/flebotomi.htm Acesso: 15/10/2011 14:38 2.6 Reservatórios Segundo Neves, a Leishmaniose Visceral Canina primeiramente atingia somente áreas rurais tendo como reservatórios do parasito raposas e roedores, depois surge em grandes centros urbanos com grande disseminação tento como o principal reservatório o cão doméstico. 3- Características do agente etiológico A Leishmaniose Visceral Canina ou Americana no novo mundo é causada pela presença única do protozoário denominado como Leishmania chagasi embora seja reconhecida atualmente três espécies, tais como a Leishmania donovani e Leishmania infantum. (xerox).
3.1 Classificação Reino: Protista Sub-reino: Protozoa Filo: Sarcomastigophara Sub-Filo: Mastigophora Classe: Zoomastigophorea Ordem: Kinetoplastida Sub Ordem: Trypanosomatina Família: Trypanosomatidae Gênero: Leishmania 3.2 Gênero Leishmania São os protozoários unicelulares, heteróxenos, parasitas que são encontrados nas formas flageladas promastigota, no trato digestivo dos hospedeiros invertebrados que parecem estar limitados a insetos hematófagos, flebotomíneos e, amastigota, semiflagelo livre, parasito intracelular obrigatório do sistema fagocítico mononuclear dos hospedeiros vertebrados com uma extensa variedade de mamíferos, embora seja mais frequente em roedores e canídeos entre eles o homem, ocorrendo a transmissão devido a picada do inseto infectado. (NEVES, 2000) 3.3 Promastigotas Formas promastigotas são alongadas, com um flagelo livre e longo, emergindo do corpo do parasito na sua porção anterior, possui um núcleo arredondado situado na porção anterior do corpo, com um cinetoplasto em forma de bastão, essa forma tem uma grande variabilidade de tamanho podendo ser observadas de 10,0 a 40,0 x 1,2 a 3,0 µm de diâmetro, podendo ter um flagelo do tamanho ou com uma medida superior ao corpo. (NEVES, 2000)
Figura 2: Foto microscópica em lâmina da Leishmania sp em forma promastigota. Fonte: http://www.vet.uga.edu/vpp/archives/nsep/brazil2002/leishmania/port/leish03.htm Acesso: 23/10/2012 3.4 Promastigotas metacíclicas Os promastigotas metacíclicos possuem diâmetros menores que os promastigotas normais porem tende a ter um flagelo muito longo com cerca de duas vezes que o seu corpo com uma mobilidade intensa. (NEVES, 2000) 3.5 Amastigotas Formas amastigotas, quando fixadas e coradas aparecem em microscopia óptica como organismos avais ou esféricos. No citoplasma, corado em azul claro, são encontrados: núcleo grande e arredondado ocupando um terço do corpo do parasito e um cinetoplasto em forma de um pequeno bastonete, ambos corados em vermelho-purpura, além de apresentarem vacúolos que podem ou não ser observados. Não há flagelo livre, sendo raramente visível, em sua forma amastigota tente a medir aproximadamente 1,5 a 3,0 x 3,0 a 6,5 µm de diâmetro. (NEVES, 2000)
Figura 3: Foto microscópica em lâmina da Leishmania sp em forma amastigota. Fonte: http://enfermagem-sae.blogspot.com/2009/04/leishmaniose-visceral-ou-calazar.html Acesso:23/10/2012. 3.6 Paramastigotas Formas paramastigotas, são pequenas e arredondadas, flagelo curto com um núcleo na porção mediana e cinetoplasto paralelo ao núcleo, seu tamanho varia de 5,0 a 10,0 x 4,0 a 6,0 µm. (Neves, 2000) 3.7 Ciclo Evolutivo No organismo do hospedeiro definitivo, encontram-se os parasitos sob a forma amastigota, no interior das células do sistema fagocítico mononuclear. Aí ocorre divisão abundante, rompem as células. Os protozoários livres são, então, ingeridos junto com o sangue circulante pelos flebotomíneos quem em seu tubo digestivo os formas amastigotas transformam-se em formas moveis, flageladas, essas formas se multiplicam rapidamente e intensamente, bloqueando o pro ventrículo do tubo digestivo do flebótomos, esse bloqueio faz com que o sangue sugado do homem ou outro animal sadio regurgite e seja reinoculado em seu organismo, levando as formas promastigotas. No organismo de um vertebrado, essas formas se transformam novamente em amastigotas sendo novamente fagocitadas elas células do sistema fagocítico mononuclear transformando em seu novo hospedeiro. (CAMARGO, 2007)
4- Sintomatologia da Leishmaniose em cães De acordo com a sintomatologia apresentada, podem ser classificados como assintomáticas, oligossintomáticos e sintomáticos, sendo considerados assintomáticos os cães que não apresentam sinais clínicos sugestivos de LVC; Oligossintomáticos os cães com pequenos sintomas como perda de peso, pelo opaco e presença de adenopatia linfoide; sintomáticos os que apresentam todos ou alguns sinais mais comuns da doença (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2004) O animal sintomático pode apresentar edemas de patas, coriza, apatia, vômito, onicogriofose, insuficiência renal crônica, diarreias, uveíte granulomatosas, encefalites e mengites (LUZ, K.G) Figura 4 : Cão sintomático encontrado por denuncia no Jardim Brasil, Adamantina Foto: Gabriela Essi 20/06/2011 5- Métodos de prevenção e diagnóstico da LVA aplicados no Projeto de Prevenção do Controle de Vetores em Adamantina 5.1 Diagnóstico O diagnostico da LVC envolve métodos parasitológicos, sorológicos e moleculares e apesar de grande quantidade de testes diagnósticos disponíveis, continua representando um desafio,
pois não existe nenhum método com sensibilidade e especificidade máximas, capazes de oferecer um diagnostico preciso das diferentes formas de apresentação da doença ( IKEDA F.A. E FEITOSA, M.M., 2007). O Projeto apresenta os exames sorológicos de ELISA e RIFI para a conclusão de diagnósticos, utilizando o ELISA como uma técnica de triagem das amostras quando contatado negativo, é considera realmente negativo, porem quando positivo vem a ser realizado a RIFI como a conclusão da positividade do cão, porem podendo assim surgi laudos inconclusivos com positividade no primeiro exame e negativo no segundo (CVE, 2006). 5.2 Métodos sorológicos Os métodos sorológicos detectam anticorpos circulantes anti-leishmania. Dentre esses métodos podemos citar a imunofluroscência indireta (RIFI), ELISA (Enzyme Lenked Immunosorbent Assay), fixação de complemento, a aglutinação direta e os testes rápidos de aglutinação (IKEDA, F.A. E FEITOSA, M.M., 2007). Esses métodos apresentam alta sensibilidade e especificidade, porem, doenças como a erlichiose, a babesiose, a borreliose, a tripanossomíase, podem interferir no resultado da análise, e levar a um resultado falso-positivo nos cães. Também pode ocorrer um resultado falso-negativo em cães que não desenvolvem resposta imune humoral. Deve-se obter 1,0 ml de soro e mantê-lo refrigerado por no máximo 7 dias após a coleta Valores de referencia: Reagente ELISA valor acima da linha do corte recomendado pelo fabricante do kit RIFI resultado com título igual os superior a diluição 1:40.
Indeterminado resultados com valores limites que os testes não foram capazes de determinar como reagente ou não reagente. Recomenda-se um novo teste após 30 dias do ultimo exame. Pode corresponder ao inicio da soroconversão, reações cruzadas e/ou inespecífica, falência do sistema imune. Não reagente Resultado sem título de anticorpos. Segundo o Ministério da Saúde, o exame esta sujeito, embora raramente, a ocorrência de falso-negativo e falso-positivo. É recomenda se o acompanhamento médico veterinário dos sinais e sintomas clínicos e se houver divergência entra as duas técnicas sorológicas para os diagnósticos de LVC, deve-se considerar RIFI como confirmatório. 5.3 Métodos Moleculares Reação em cadeia e polimerase (PCR) é a reação de amplificação define a presença do DNA do cinetoplasto da Leishmania sp. Pode ser realizado através de aspirado de medula óssea e linfonodos, conservados em temperatura ambiente em 24 horas; 5 ml de sangue total com EDTA, conservados em temperatura ambiente e processados até no máximo 72 horas após a coleta; biopsia de lesões, em etanol com gelo seco em até 48 horas após a coleta. O material deve ser enviado em tudo o frasco estéril. Nenhuma medicação tópica deve ser utilizada para diagnostico e como controle pós-tratamento. Já que a cicatriz imunológica (sorologia positiva) permanece durante anos sem que o paciente apresente a doença. (INSTITUTO H. PARDINI, 2007). Valor de referencia: Amostra negativa para Leishmania sp O exame de PCR é o mais sensível e especifico dos exames para o diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina, pois é de grande dificuldade de adaptação a campo, disponibilidade de reagentes e de custo elevado, o que se passa a ser um exame de difícil realização pelo governo.
5.4 Microchip O governo do estado de São Paulo esta realizando um projeto em parceria com os municípios epidemiológicos, esse projeto visa colocar chip de identificação nos cães de toda cidade com o objetivo de identificar o cão, seu proprietário, resistência, registro do exame de sorologia RIFI e ELISA e a colocação da coleira deltametrina 4%. O microchip é implantado abaixo do couro do animal, possui um tamanho menor que 12mm x 2mm, sendo comparado com o tamanho de um grão de arroz. É um microcircuito eletrônico constituído de um código exclusivo e inalterável, encapsulado e biovidro cirúrgico ( FECESP, 2006). Figura 5: Foto de um microchip ao lado de um grão de arroz. Fonte: http://www.perfectdog.com.br/o_que_e_microchip.html Acesso: 13/11/2012 Seu tamanho pequeno permite que seja injetado no animal com uma seringa especial, sendo indolor, com a confirmação que o cão não possui chip o micro chip deve ser implantado com a autorização do dono e deve ser aplicado no dorso entres as escápulas; desinfetando a pele no local de implantação usando algodão satura de álcool, levantando a pele do animal, inserindo a agulha em um ângulo de 45 C com o êmbolo da seringa para cima, empurrando rapidamente até o final do êmbolo da seringa e retirando a agulha ao terminar. ( FECESP, 2006) Na cidade de Adamantina, foi realizado um inquérito semestral onde foram implantados 3848 microchips em cães todos registrados em boletins e arquivo eletrônico de donos e localização
dos animais havendo um numero baixo de recusa dos moradores onde era previsto ser implantado 4000 microchips, assim atingindo a meta, e sendo realizado o serviço de leitura de microchip permitindo que os cães encontrados nas ruas, sejam devolvidos para seus proprietários. 4.5 Coleira de deltametrina 4% As coleiras inseticidas exercem efeito repelente e letal sobre os flebótomos. Sua utilização em cães vem se demostrando bastante satisfatória e estudos publicados mostram que se colocada em pelo menos 80% da população canina, tem a capacidade de interromper a transmissão do agente. Apresenta liberação regular e continua por ficção, dissolução lenta e deltametrina na camada lipídica da pele do cão. A coleira é doada para o cão junto com a implantação do microchip e a autorização de ser efetuado o exame do projeto. Figura 7 : Coleira de Deltametrina original Fonte: http://www.scalibor.ch/scalibor/scalibor.asp acesso: 06/12/2012.
5- PARASITOLÓGICO REALIZADO PELO MUNICÍPIO O método de diagnostico realizado pelo biólogo, agente Wiverson Moura Silva da Secretaria Municipal de Saúde de Adamantina sendo a parte do projeto do governo o parasitológico juntamente com o teste rápido em campo, pela necessidade de laudos urgências em casos denuncias de animais suspeitos com laudos inconclusivos. 5.1 Teste rápido O produto, que permite a detecção rápida de anticorpos contra Leishmania sp é composto de uma membrana de nitrocelulose acoplada a uma bandeja destacável, uma ampola contendo tampão, uma lanceta, um tubo capilar plástico e álcool. Na membrana de nitrocelulose, são absorvidos o antígeno rk39, formando a linha-teste, e o anticorpo anti-igg humano, constituindo a linha-controle. A bandeja destacável possui dois orifícios: o primeiro contém conjugado; e o segundo é reservado para lavagem da fita-teste (IKEDA F.A. E FEITOSA, M.M., 2007). A realização do teste segue, estritamente, as instruções do fabricante. Cerca de 10µL de sangue, obtido pela lanceta na parte interior da orelha, é transferido para o primeiro poço da bandeja destacável homogeneizado com duas gotas de tampão por cinco minutas. Em seguida, a tira-teste foi colocada nesse poço verticalmente e o sangue diluído, absorvido pela membrana em fluxo ascendente. Após cinco minutos, tira-teste foi lavada, em seguida coloque cinco gotas de soluçãotampão, previamente no segundo poço. Figura : Colhimento da amostra, na parte interna da orelha.
Na bandeja descartável é colocado o numero do microchip do animal e a data de realização do teste, para a identificação. Figura : Bandeja descartável, sendo colocada uma gota de sangue na primeira cavidade para a realização do teste. Segundo as instruções do produto O teste é considerado positivo quando é possível visualizar as duas linhas, teste e controle; e negativo, quando somente a linha controle foi visualizada na membrana de nitrocelulose. Em ambos os casos, visualização da linha-controle, localizada logo acima da linha-teste, indicou que a execução do teste foi adequada. 5.2 Método de preparo do material A aspiração do material feita em Adamantina é a partir dos linfonodos das pernas posteriores do animal. Primeiramente é realizada a assepsia local, com álcool 70% e algodão, palpação do linfonodo, injeção da agulha em três ângulos 90 de pois 45º para direita e para esquerda, retirar a agulha, encher uma seringa de ar, recolocar a agulha e aspirar ao material em uma lâmina de vidro, realizando o esfregaço, espalhando o material com outra lamina de vidro.
5.3 Coloração das lâminas Os esfregaços são corados pelo panótico. Onde de acordo com as instruções do kit é colocado a lamina submersa em três soluções, primeiramente em solução alcoólica de ciclohexadieno à 0,1% por dez segundos, após na segunda solução de aquosa de Bromobenzenossulfônico à 0,1%; Estabilizante I à 3%; Conservante à 0,26% por dez segundos, depois por mais dez segundos na terceira solução alcoólica de Fenotiazinas à 0,1%; Estabilizante à 1,5%; Conservante à 0,26%, logo após se lava a lâmina com agua corrente. Figura : Foto do processo de coloração do esfregaço.
5.4 Conclusão para laudo Obtêm-se laudos positivos com facilidade, pois a leitura da lamina e identificação da forma amastigota na lamina observada, por no mínimo duas pessoas, porem o laudo negativo é de grande probabilidade de falsos negativos, pelo fato de observação adequada e material em lamina. CONCLUSÃO O método parasitológico realizado em Adamantina pela secretaria municipal de Saúde no departamento de controle de vetores em animas com laudos inconclusivos e em denuncias de animais sintomáticos apesar de ser um exame pouco sensível ele facilita e permite uma conclusão definitiva de positividade com necessidade de emergência. BIBLIOGRAFIA E REFERÊNCIAS Alves, W. A.; Bevilacqua, P. D.; Reflexões sobre a qualidade do diagnóstico da leishmaniose visceral canina em inquéritos epidemiológicos: o caso da epidemia de Belo horizonte, 1993-1997. Cad. Saúde Pública, Rio de Janeiro, 20(1):259-265, jan-fev, 2004. Disponível em: < http://www.scielo.br/pdf/csp/v20n1/43.pdf ATOPIA Leishmaniose 15 de agosto de 2010 Staff, imagem da leishmania sp disponivel em : <http://imunovet5.blogspot.com/2010/08/leishmaniose.html BIOMEDICINA Doenças Parasitárias, imagens de Leishmania sp disponível em: < http://www.parasitoliga.com.br/2010/11/protozooses.html CAMARGO, J.B,; TRONCARELLI, M.Z,; RIBEIRO, M.G.; LANGONI, H. Leishmaniose visceral canina: Aspectos de saúde publica e controle. Clinica Veterinária, Ano XII, n.71, p 86-96, 2007. Centro de Vigilância Epidemiológica (CVE) artigo Leishmaniose Visceral Americana; Manual de Vigilancia e Controle da LVA Estado de São Paulo; Disponivel em < http://www.cve.saude.sp.gov.br/htm/zoo/leishv_doctec.html Com Ciência - Vera Lucia Fonseca de Camargo- Neves Leishmaniose Visceral Americana: doença emergente no estado de São Paulo; Disponível em < http://www.comciencia.br/reportagens/2005/06/17.shtml FECESP, Federação de Cinofilia do estado de São Paulo Formulário de microchip. Disponivel em < http://www.adobe.com.br/products/acrobat/readstep2.html IKEDA, F.A.; FEITOSA, M.M. Metodos de diagnósticos da Leishmaniose Visceral Canina. Clinica Veterinaria, Ano XII, n.71, p.34-42,2007.
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