UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA. João Edson Ourique Balbé

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1 UNIVERSIDADE TUIUTI DO PARANÁ FACULDADE DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS E DA SAÚDE CURSO DE MEDICINA VETERINÁRIA João Edson Ourique Balbé TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO CURITIBA 2010

2 EXAME ANDROLÓGICO EM BOVINOS E PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS CURITIBA 2010

3 João Edson Ourique Balbé EXAME ANDROLÓGICO EM BOVINOS E PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS Relatório de Estágio Curricular Obrigatório apresentado ao curso de Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná, na área de reprodução de grandes animais sob orientação do professor Msc. Marcelo Arne Feckinghaus e como orientador profissional a professora Dra. Mara Iolanda Batistella Rubin. CURITIBA 2010

4 Reitor Prof. Luis Guilherme Rangel Santos Pró- Reitor Sr. Carlos Eduardo Rangel Santos Pró-Reitora Profª Carmen Luiza da Silva Pró-Reitor de Planejamento e Avaliação Sr. Afonso Celso Rangel dos Santos Pró-Reitoria de Pós Graduação, Pesquisa e Extensão Prof. Roberval Eloy Pereira Secretário Geral Sr. Bruno Carneiro da Cunha Diniz Diretor da Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde Prof. João Henrique Faryniuk Coordenadora do Curso de Medicina Veterinária Profª Ana Laura Angelli Metodologia Científica Prof. Jair Mendes Marques Coordenação de Estágio Obrigatório do Curso de Medicina Veterinária Profª Ana Laura Angeli CAMPUS PROF. SIDNEY LIMA SANTOS (BARIGÜI) Rua Sidney A Rangel dos Santos 238 Bairro: Santo Inácio CEP Curitiba Paraná Telefone: (41)

5 TERMO DE APROVAÇÃO João Edson Ourique Balbé EXAME ANDROLÓGICO EM BOVINOS E PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado e aprovado para obtenção do título de Médico Veterinário por uma banca examinadora do Curso de Medicina Veterinária da Universidade Tuiuti do Paraná. Curitiba, 03 de dezembro de Orientador: Professor Msc Marcelo Arne Feckinghaus Universidade Tuiuti do Paraná Professora Msc. Beatriz Calderi Vianna Universidade Tuiuti do Paraná Professora Msc. Elza Maria Galvão Ciffoni Universidade Tuiuti do Paraná

6 Agradecimentos Aos meus pais Cesar R. J. Balbé e Inaiara O. Balbé por sempre me mostrarem o caminho certo a seguir, nunca me deixando desistir e sempre incentivando a estudar. Aos meus tios Getulio Jacques Ourique Neto e família por me apoiarem, pelo incentivo e pelos conselhos durante esta etapa. À professora Dra Mara Rubin e a toda equipe do laboratório Embryolab com quem tive o prazer de trabalhar durante o período de estágio. À minha vó Eima da Cruz Ourique pelo carinho depositado, pelos conselhos e pela dedicação. À professora Elza Maria G. Ciffoni pelas orientações e monitoria durante a faculdade cursada e pelo companheirismo. Ao professor Marcelo Feckinghaus por orientação durante o estágio curricular.

7 A lição número um, Eu aprendi com meus pais: Quem não sabe pra onde vai, Não vai a lugar nenhum. (Jayme Caetano Braun) É um grande erro teorizar antes de ter os dados, as pessoas destorcem os fatos para que se moldem às suas teorias, ao invés das teorias se moldarem aos fatos! Sherlock Holmes o filme.

8 SUMÁRIO LISTA DE QUADROS...6 LISTA DE FIGURAS...7 RESUMO INTRODUÇÃO DESCRIÇÃO DO LOCAL ATIVIDADES REALIZADAS EXAME ANDROLÓGICO EM TOUROS REVISÃO DE LITERATURA ANATOMIA E FISIOLOGIA DO APARELHO REPRODUTOR AVALIAÇÃO DO TOURO Morfologia testicular COLETA SÊMEN EM BOVINOS EXAME DO SÊMEN Avaliação da Motilidade e Vigor Morfologia espermática Integridade de membrana plasmática Concentração espermática EXAME ANDROLOGICO EM BOVINOS RELATÓRIO PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS REVISÃO DE LITERATURA ASPIRAÇÃO DOS FOLÍCULOS SELEÇÃO DOS COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITOS MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS Meios de cultivo e suplementos para maturação in vitro de embriões de bovinos FECUNDAÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS Capacitação espermática Fusão dos Gametas Meio de Fecundação in vitro de embriões bovinos CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS RELATÓRIO ASPIRAÇÃO FOLICULAR SELEÇÃO DOS OÓCITOS BOVINOS LAVAGEM DOS COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITOS MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS FECUNDAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS Capacitação espermática CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS AVALIAÇÃO DA TAXA DE ECLOSÃO E DOS EMBRIÕES...79

9 8 CONCLUSÃO REFERÊNCIAS...83

10 6 LISTA DE QUADROS QUADRO 1: PARÂMETROS MÍNIMOS E MÁXIMOS DA AVALIAÇÃO ESPERMÁTICA...24 QUADRO 2: ROTEIRO DO EXAME ANDROLÓGICO EM BOVINOS...26 QUADRO 3: EFEITOS POSITIVOS DAS CÉLULAS DO CUMULUS SOBRE A FECUNDAÇÃO...41 QUADRO 4: CRITÉRIOS UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE OÓCITOS BOVINOS...42 QUADRO 5: CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DE COCs E OÓCITOS...43 QUADRO 6: ETAPAS QUE CARACTERIZAM A CAPACIDADE DO OÓCITO...50 QUADRO 7: FATORES QUE AFETAM A MATURAÇÃO IN VITRO DOS OÓCITOS E DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES...50

11 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Frente do laboratório EMBRYOLAB UFSM FIGURA 2: Ilustração da planta baixa do laboratório embryolab da UFSM; FIGURA 3: Ilustração do sistema reprodutor masculino bovino...17 FIGURA 4: Inter-relações no controle da função reprodutiva masculina...19 FIGURA 5: Touro submetido ao exame andrológico...28 FIGURA 6: Coleta sêmen com auxilio do eletro-ejaculador introduzido no reto do animal...30 FIGURA 7: Eletro-ejaculador utilizado para coleta do sêmen bovino...30 FIGURA 8: Sêmen bovino avaliado sob microscópio - avaliação da motilidade e vigor FIGURA 9: Microscópico e câmara de Neubauer para determinação da concentração espermática FIGURA 10: Esquema de produção in vitro de embriões bovinos...38 FIGURA 11 : A.) COCs selecionados para maturação in vitro. B.) COCs após o período de maturação com as células do cumulus expandidas...48 FIGURA 12: Rompimento da vesícula germinativa...49 FIGURA 13: Preparação do sêmen com gradiente de Percoll...57 FIGURA 14: Método do Swin-up para obtenção de espermatozóides para FIV.58 FIGURA 15: Fases da Fertilização...60 FIGURA 16: Fases do desenvolvimento embrionário bovino FIGURA 17: Banho dos ovários em álcool e solução fisiológica...66 FIGURA 18: Aspiração folicular aspiração dos folículos de tamanho entre 2-8 mm...67 FIGURA 19: Seleção, lavagem e procura dos oócitos sob lupa...68 FIGURA 20: Complexos cumulus-oócitos...68 FIGURA 21: Banho dos COCs em liquido folicular sob lupa...69 FIGURA 22: Oócitos selecionados no meio TCM-Hepes...70 FIGURA 23: Estufa de pressão, temperatura e umidade controlada...71 FIGURA 24: Oócitos maturados, com as células do cumulus expandidas...71 FIGURA 25: Oócitos maturados, com as células do cumulus expandidas...72 FIGURA 26: Placa Nunc com meio de maturação...72 FIGURA 27: Meio Talp-Sperm em banho-maria FIGURA 28: Avaliação da motilidade e vigor das palhetas de sêmen descongeladas...75 FIGURA 29: Retirada do sobrenadante do Swin-up...76 FIGURA 30: Centrifuga centrifugação da fração do sobrenadante do Swin-up76 FIGURA 31: Possíveis zigotos submetidos ao vortex FIGURA 32: Busca dos possíveis zigotos e banho em gotas no meio TCM-HEPES FIGURA 33: Avaliação dos zigotos pós desnudamento em D FIGURA 34: Avaliação dos zigotos pós desnudamento em D xi

12 RESUMO O presente trabalho de conclusão de curso aborda os assuntos de: exame andrológico em bovinos e produção in vitro de embriões bovinos, ambos os temas realizados durante o estágio curricular realizado no laboratório de embriologia EMBRYOLAB da Universidade Federal de Santa Maria. O estágio foi orientado academicamente pelo professor Msc. Marcelo Arne Feckinghaus e profissionalmente pela professora Dra. Mara Iolanda Batistella Rubin, iniciando no dia 18 de julho de 2010 e tendo fim no dia 29 de outubro de 2010 totalizando 472 horas. Durante o período de estágio foram desenvolvidas várias atividades relacionadas à reprodução de grandes animais entre elas destacam-se a produção in vitro de embriões bovinos (PIV), congelamento de sêmen bovino, analise de sêmen bovino e eqüino, exames andrológicos em touros, entre outras atividades. Palavras-chave: Andrológico, produção in vitro, embrião, PIV.

13 INTRODUÇÃO Com o objetivo de aumentar a eficiência da produção em sistemas de criação de bovinos, várias técnicas reprodutivas foram desenvolvidas ao longo dos últimos anos, entre elas destacam-se a inseminação artificial, sincronização de cio, transferência de embriões e produção in vitro de embriões. Tais técnicas possibilitaram um aumento e rapidez no melhoramento genético de rebanhos. A produção in vitro de embriões bovinos em programas comerciais é utilizada para melhorar geneticamente o rebanho em curto espaço de tempo e se constitui como fonte alternativa para programas de transferências de embriões. Essa biotecnologia tem-se desenvolvido amplamente nas ultimas décadas, porém sua eficiência é relativamente baixa, tendo necessidade de pesquisas na área para seu aperfeiçoamento. Em um sistema de criação de bovinos a reprodução do rebanho é um ponto crucial para obtenção de lucros para o criador. E neste segmento, a avaliação da fertilidade do macho. O exame andrológico torna-se um requisito necessário em centrais de colheita e processamento de sêmen bovino e em propriedades que utilizam o macho a monta natural. A avaliação baseia-se em dizer se o reprodutor esta apto, questionável ou inapto para a reprodução com base na avaliação do touro e em exames seminais.

14 O presente trabalho de conclusão de curso, com estágio curricular sendo realizado no laboratório EMBRYOLAB, aborda os temas de exames andrológicos em touros e produção in vitro de embriões bovinos.

15 2. DESCRIÇÃO DO LOCAL O estágio obrigatório em medicina veterinária foi realizado no período de 19 de julho a 29 de outubro de 2010, completando 472 horas, este sendo realizado no Embryolab Laboratório de Embriologia Animal (ver figura 1) fazendo parte do departamento de clinica de grandes animais do centro de ciências rurais da Universidade Federal de Santa Maria (UFSM). FIGURA 1: Frente do laboratório EMBRYOLAB UFSM 2010 A UFSM localizada na cidade de Santa Maria está na região centro-oeste do estado do Rio Grande do Sul a 329 km de Porto Alegre, possui um clima mesotérmico e úmido.

16 O laboratório é coordenado pelos Médicos Veterinários Drs. Carlos Antonio Mondino Silva e Mara Iolanda Batistella Rubin. O estágio curricular foi orientado pela professora Dra Mara Iolanda Batistella Rubin CRMV-RS: 2294 O Embryolab possui o complexo de sala de laboratório que é composto por quatro salas, sendo estas: a sala de produção in vitro de embriões (PIV), a sala de pesagem e preparação dos meios, a sala de aspiração e armazenamento de materiais e a sala de limpeza e esterilização do material, o laboratório é composto ainda por: sala individual de professores sala da professora titular (Dra. Mara Rubin), sala de estudos e reuniões, sala de limpeza de material de campo e pela sala de armazenamento de material de campo e outros matérias (Ver figura 2). No laboratório propriamente dito, a sala principal é onde ocorrem os procedimentos, tais como: a aspiração folicular dos ovários, o congelamento e análise de sêmen, a análise de material coletado a campo, é também nessa sala ficam armazenados os botijões de nitrogênio e alguns materiais utilizados dentro do laboratório. Na sala de pesagem é efetuado o preparo de soluções e meios de cultivo para a PIV, no congelamento de embriões, no congelamento de sêmen, corantes para lâminas, entre outras soluções. Na sala da PIV ocorre: a busca e seleção dos complexos cumulus-oócitos, seleção e avaliação dos embriões, e onde fica a estufa de cultivo de embriões, enfim, é a sala de manipulação dos oócitos e dos embriões.

17 FIGURA 2: Ilustração da planta baixa do laboratório embryolab da UFSM; 2010 Na sala de limpeza como o próprio nome já diz, é onde se efetua a limpeza e esterilização do material do laboratório. Nela também se efetuam os processos de

18 destilação e deionização da água bem como a purificação da água, tornando-a ultrapura. Nesta sala encontram-se as estufas e autoclaves. O laboratório ainda conta com uma mangueira de contenção de bovinos, composta por 18 bretes, e neste espaço realizam-se as aulas práticas ministradas, cursos e manejo dos animais. No Embryolab desenvolvem-se pesquisas e atividades na área de reprodução de grandes animais, principalmente trabalhando nas espécies bovinas e equinas, além de desenvolver cursos na área. As atividades desenvolvidas no laboratório vão desde a produção in vitro de embriões bovinos e eqüinos, transferência de embriões, exames ginecológicos, seleção de doadoras e receptoras bovinas, coleta, análise e congelamento de sêmen bovino e eqüino. O laboratório ainda desenvolve o Equidil, um diluente para sêmen equino, e o TSZ - teste de sulfato de zinco, que analisa a imunidade passiva transferida ao potro. Ambos os testes são desenvolvidos comercialmente.

19 3. ATIVIDADES REALIZADAS No estágio curricular obrigatório efetuado no Embryolab, sob orientação da Professora Dra. Mara Iolanda Batistella Rubin, foram realizadas atividades referentes à área de reprodução de grandes animais, principalmente bovinos. As atividades foram: Preparo dos meios utilizados na produção in vitro de embriões bovinos; Produção in vitro de embriões bovinos; Exame andrológico em bovinos; Coleta e análise de sêmen bovino; Congelamento de sêmen bovino; Coleta e análise de sêmen eqüino; Exames ginecológicos em vacas: o Exames de palpação retal em vacas; o Exames de vaginoscopia em vacas; o Exames de ultra-sonografia em vacas. Protocolos de Inseminação Artificial em tempo fixo em vacas de corte; Visita e assistência técnica em propriedades leiteiras; Lavagem Uterina em bovinos; Avaliação de lâminas de biopsia uterina de éguas e vacas;

20 Acompanhamento das aulas teóricas e práticas de Ginecologia Veterinária; Acompanhamento de vulvoplastia equina; O presente trabalho de conclusão de curso aborda os temas de exame andrológico em bovinos e produção in vitro de embriões bovinos.

21 4. EXAME ANDROLÓGICO EM TOUROS REVISÃO DE LITERATURA 4.1 ANATOMIA E FISIOLOGIA DO APARELHO REPRODUTOR Os principais órgãos do sistema reprodutor masculino em bovinos são os testículos, epidídimos, ductos deferentes, glândulas vesiculares, próstata, glândulas bulbouretrais e pênis, ver figura 3 (NOAKES, 1991). FIGURA 3: Ilustração do sistema reprodutor masculino bovino FONTE: Noakes (1991).

22 Segundo Ball & Peters (2004), as duas funções dos testículos são: a secreção de testosterona e outros hormônios esteróides e a produção de espermatozóides, sendo que essas funções são controladas principalmente por hormônios da glândula pituitária anterior. As glândulas acessórias: a próstata, as glândulas vesiculares e as glândulas bulbouretrais emitem secreções para dentro da uretra; essas secreções misturam-se no momento da ejaculação com os espermatozóides e com as secreções ampolares dos dutos deferentes (HAFEZ & HAFEZ, 2004). O pênis, órgão copulador, é formado pelos corpos cavernosos pares, uretra com seu corpo cavernoso ímpar, pela ponta do pênis e pelas raízes da verga, sendo no bovino fibroelástico (REICHENBACH et al., 2008). Nos ruminantes, a verga apresenta duas flexões, em S, chamadas de S peniano ou flexura sigmóide (MIES FILHO, 1977). O escroto, os músculos cremasteres, o sistema vascular das artérias e veias testiculares tem como função a proteção e a regulação da temperatura dos testículos (MARQUES FILHO, 2006) A formação dos espermatozóides é um processo conhecido como espermatogênese e ocorre de maneira contínua, no testículo, durante a vida sexual dos animais. A espermatogênese tem duração de 61 dias e depende de fatores ambientais (luminosidade, temperatura e estresse), nutricionais e genéticos (MARQUES FILHO, 2006). Os gonócitos (primeiras células germinativas a habitarem os túbulos seminíferos) multiplicam-se diferenciando-se em espermatogônias. Estas se dividem e na última geração, formam as espermatogônias B que sofrendo meiose, formam os

23 espermatócitos primários e as espermátides arredondadas que se diferenciam em espermatozóides (AGUIAR et al., 2006). A espermatogênese depende do suporte funcional das células de Sertoli, dos níveis adequados de esteróides, gonadotrofinas e de fatores de crescimento (AGUIAR et al., 2006). Na figura abaixo que representa a função reprodutiva no macho mostra que o hormônio liberador de gonadotrofina (GnRH) estimula a liberação do FSH e do LH. O FSH age nos túbulos seminíferos dos testículos nas células de Sertoli estimulando a espermatogênese. As células de Sertoli produzem a inibina, que tem o efeito de feedback negativo na secreção de FSH. Já o LH estimula a liberação de testosterona pelas células de Leydig (PTASZYNSKA & MOLINA, 2007). FIGURA 4: Inter-relações no controle da função reprodutiva masculina FONTE: Ptaszynska & Molina (2007)

24 4.2 AVALIAÇÃO DO TOURO Umas das principais características consideradas na avaliação é a fertilidade do touro, tanto em sistemas de produção de carne quanto de leite. No exame andrológico completo detecta-se alterações no sistema reprodutivo, lesões nos órgãos, distúrbios na libido e na habilidade da cópula, tornando o touro infértil (BARBOSA et al., 2005). Sendo imprescindível para avaliação do potencial reprodutivo, o exame andrológico de touros jovens e adultos, utilizados em monta natural ou como doadores de sêmen para comercialização, fundamenta-se na avaliação da saúde geral, saúde do sistema reprodutor e conclusão do aproveitamento do touro na reprodução (REICHENBACH et al., 2008). No exame andrológico deve-se incluir o exame físico geral, onde se observa as condições que possam interferir com a habilidade de monta tais como defeitos de aprumos, condição corporal, incidência de doenças, problemas respiratórios e de dentição; o exame do trato reprodutivo, onde devem ser constatadas anormalidades dos órgãos genitais internos e externos (VALLE et al., 1998). O comportamento do touro em serviço e a avaliação da libido efetuada no exame andrológico devem ser observados em ambiente natural, com pelo menos duas vacas no estro, o padrão de acasalamento, libido bem como a inspeção do pênis ereto (NOAKES, 1991).

25 4.2.1 Morfologia testicular A morfologia testicular tem sido adotada como critério na avaliação da capacidade reprodutiva dos touros sendo que touros saudáveis, com perímetro escrotal grande geralmente apresentam maior fertilidade (REICHENBACH et al., 2008). A circunferência escrotal (CE) permite estimar o potencial reprodutivo do touro por estar associada ao desenvolvimento do testículo, a produção diária de espermatozóide e a idade à puberdade (NEVES, 2007). A avaliação da consistência, forma, simetria, mobilidade dentro do escroto, posição, temperatura, sensibilidade e tamanho também devem ser realizados rotineiramente nos exames andrológicos (BARBOSA et al., 2005). A CE geralmente obtida ao desmame do touro, ao ano 365 dias de idade e sobreano 450 a 550 dias de idade é uma medida biométrica de fácil obtenção que apresenta a herdabilidade de média a alta, a media da CE varia conforme o padrão racial dos touros (NEVES, 2007). 4.3 COLETA SÊMEN EM BOVINOS Vários métodos existem e podem ser usados para a coleta de sêmen dos bovinos. O mais utilizado é o emprego da vagina artificial que se baseia na utilização de um instrumento prático que tende a imitar o aparato genital feminino e que permite uma rápida coleta do ejaculado e este livre de contaminantes (RODRÍGUES et al., 2003). Aplicam-se ainda os métodos de estímulo por eletroejaculação e pela massagem por via retal das glândulas vesiculares e das ampolas dos condutos deferentes para a coleta do ejaculado nos bovinos (REICHENBACH et al., 2008).

26 Sendo geralmente utilizado em centrais de coleta e processamento de sêmen o método de induzir o touro a ejacular em vagina artificial a qual é constituída para simular a sensação da vagina de uma vaca. A quantidade e qualidade do sêmen obtido varia conforme a provação (tempo sem cobertura) do touro antes da coleta (BALL & PETERS, 2004). O eletro-ejaculador faz a indução da ejaculação por meio de estímulos elétricos ao nível da quarta vértebra lombar, o aparelho consiste por um gerador elétrico, de intensidade entre 0 e 1.000mA, acoplado a dois pólos terminais, disposto em fitas longitudinais ou anéis sobre um eletrodo bipolar (REICHENBACH et al., 2008). Reichenbach et al. (2008), indicam como método alternativo a massagem das glândulas vesiculares e ampolas dos ductos deferentes por palpação retal sendo que o método geralmente é empregado a campo com reprodutores não condicionados a vagina artificial e na indisponibilidade de um eletroejaculador. 4.4 EXAME DO SÊMEN Em centrais de colheita e processamento de sêmen bovino os métodos mais utilizados consistem basicamente na análise subjetiva da motilidade, concentração, morfologia e integridade de membranas plasmáticas e acrossomal (MAZIERO et al., 2009) Avaliação da Motilidade e Vigor A avaliação da motilidade espermática corresponde à proporção do número total de espermatozóides móveis em uma amostra de sêmen, sendo que a primeira

27 avaliação deve ser feita imediatamente após a obtenção do ejaculado (REICHENBACH et al., 2008). De forma subjetiva e sob microscopia óptica convencional, a motilidade é estimada pela avaliação visual das células espermáticas e associada à ausência de movimento com quadros de infertilidade (MAZIERO et al., 2009). Sendo uma técnica subjetiva, a avaliação da motilidade e vigor ao microscópio depende da capacitação do avaliador, sendo que a baixa repetibilidade dos resultados entre diferentes avaliadores leva a interpretações equivocadas. Para se realizar a avaliação da motilidade é utilizado geralmente um microscópio com contraste de fase, platina aquecida a 37ºC e a amostra é examinada em 200x de aumento, entre lâmina e lamínula. Conforme o quadro abaixo citado por Severo (2009) que mostra os parâmetros da avaliação espermática tem se uma base dos valores mínimos e máximos (SEVERO, 2009).

28 QUADRO 1: PARÂMETROS MÍNIMOS E MÁXIMOS DA AVALIAÇÃO ESPERMÁTICA 1 Motilidade espermática progressiva mínimo (%) 30 2 Vigor de motilidade mínimo (1-5) 3 3 Espermatozóides com motilidade progressiva mínimo (x10 6 /dose) 10 4 Motilidade após teste de termo-resistência mínimo (%) 15 5 Defeitos Maiores totais máximo 20 6 Defeitos totais maiores e menores Maximo (%) Morfologia espermática O estudo anatômico da célula espermática, a morfologia espermática (SEVERO, 2009), permite a eliminação de touros com baixo potencial de fertilidade, evitando a entrada desses animais nos programas de reprodução, pois os defeitos específicos na morfologia estrutural das células espermáticas correlacionam-se com a sub e infertilidade masculina (MAZIERO et al., 2009) Classificados conforme a estrutura espermática envolvida (acrossomo, cabeça, peça intermediária e cauda), os defeitos são interpretados em defeitos maiores associados com subfertilidade ou esterilidade e os defeitos menores não estando estes relacionados a processos patológicos dos testículos (REICHENBACH et al., 2008).

29 4.4.3 Integridade de membrana plasmática A integridade da membrana plasmática está relacionada aos processos de fertilização, tais como a capacitação espermática, ligação à zona pelúcida, reação acrossomal e fusão dos gametas (MAZIERO et al., 2009). Para avaliação da integridade da membrana plasmática, vários testes são disponibilizados tais como: colorações supra-vitais incluindo Tripan-Blue-Giensa e Eosina-Nigrosina; testes hiposmóticos; sondas fluorescentes (MAZIERO et al., 2009) Concentração espermática Sendo considerada como a quantidade de espermatozóides presentes em um dado volume do ejaculado, varia muito conforme o método de colheita de sêmen. Pode variar também conforme a freqüência da colheita, raça, época do ano e estado nutricional, sendo normalmente nos bovinos a concentração variando entre 0,2 a 2,2 milhões/mm 3. A concentração é determinada diluindo-se o sêmen em formol salino tamponado ou citrato de sódio formalizado, e em seguida introduz-se na câmara de Neubauer para se efetuar a contagem dos espermatozóides (REICHENBACH et al., 2008). Reichenbach et al. (2008) cita os passos do roteiro a ser seguido no exame andrológico conforme o quadro 2 abaixo.

30 QUADRO 2: ROTEIRO DO EXAME ANDROLÓGICO EM BOVINOS Etapas Objetivos gerais e procedimentos 1 Identificação Obtenção de informações referentes à propriedade e ao reprodutor 2 Exame clínico e Avaliação do rebanho: estado sanitário, manejo, nutrição, anamnese desempenho reprodutivo e índices de fertilidade obtidos; Avaliação da história pregressa do reprodutor com enfoque à fertilidade. Exame clínico geral Análise do desenvolvimento corporal, do temperamento, do estado nutricional e das características sexuais secundárias. Exame clínico especial Exame dos sistemas circulatório, respiratório, disgestório, musculoesquelético. Exame clínico do aparelho genital masculino 3 Exame do comportamento e da capacidade reprodutiva Inspeção e palpação dos órgãos genitais externos: escroto, testículos, epidídimos, cordões espermáticos, linfonodos testiculares, prepúcio, pênis, palpação retal e ultra-sonografia dos órgãos genitais internos Avaliação da capacidade coeundi (exame funcional): análise da libido, da capacidade de monta e de ereção Avaliação da capacidade generandi (espermograma) Exame macroscópico: características físicas e químicas do sêmen; Exame microscópico: análise do tipo e da freqüência de alterações morfológicas do espermatozóide; Exame microbiológico do sêmen.

31 4 Registro e avaliação Elaboração do Certificado de Exame Andrológico

32 5. EXAME ANDROLOGICO EM BOVINOS RELATÓRIO Ao longo do estagio curricular foram desenvolvidos exames andrológicos em bovinos, para fins de seleção de touros e avaliação de sêmen para utilização na produção in vitro e para congelamento, e analise de palhetas de sêmen congelado vindo de centrais para laudo técnico. O exame andrológico se inicia com a anamnese ou história clinica do animal e posterior identificação do touro, da propriedade que se encontra e do proprietário seguindo então a avaliação externa do animal, sua integridade física, sua idade, sua aptidão (para produção de leite ou para produção de carne), sua conformação e seu desenvolvimento corporal (ver figura 5). FIGURA 5: Touro submetido ao exame andrológico

33 Com o animal preso em um brete de contenção procedia-se o exame clinico geral, através da inspeção rápida dos sistemas, principalmente digestivo, locomotor, respiratório e circulatório. O exame do sistema genital, principalmente do escroto, testículos, epidídimos, prepúcio e pênis é feito através da inspeção e palpação, verificando a presença ou ausência do órgão, dimensão, consistência, simetria e mobilidade dos órgãos, avaliando-se a sua compatibilidade com o desenvolvimento corporal e idade, e verificação da existência de lesões ou outros tipos de anomalias. O escroto é avaliado com o animal em estação e por palpação, verificando-se mobilidade, sensibilidade, temperatura e presença de lesões. O testículo ainda é avaliado em sua forma, simetria, consistência, posição e mobilidade. O prepúcio também é um órgão examinado e considera-se a situação da pele e tecido subcutâneo, volume, temperatura e existência de lesões. O pênis avaliado, retraído e exposto (após excitação sexual), em seu tamanho, mobilidade e presença de anomalias. No exame andrológico também era avaliado a índole e comportamento sexual do touro. Utilizando-se vacas em cio, é verificada a manifestação dos sinais de interesse e excitação do touro. A coleta do sêmen para avaliação, feita principalmente através do uso de vagina artificial e vaca em cio como manequim para monta, porém, quando não se conseguia efetuar a coleta por este método, utilizava-se o eletro-ejaculador (ver figura 6 e 7).

34 FIGURA 6: Coleta sêmen com auxilio do eletro-ejaculador introduzido no reto do animal FIGURA 7: Eletro-ejaculador utilizado para coleta do sêmen bovino

35 No uso da vagina artificial, prende-se a vaca em cio, para servir de manequim na monta do touro, e apresenta-se o touro. Quando este monta na vaca, desvia-se o pênis para a vagina artificial e procede-se a coleta do ejaculado. Com auxilio do eletro-ejaculador o touro é preso no brete e introduz-se o eletrodo bipolar no reto do animal; coleta-se o sêmen em um copo coletor (ver figura 6 e 7). O eletro-ejaculador utilizado era automático, passando as correntes elétricas em modo automático ou manual, dependendo do operador. No modo automático, o eletroejaculador passa as correntes automaticamente e estimula à ejaculação, no modo manual, o operador aplica correntes elétricas rápidas de aproximadamente 200 ma por 2 a 3 segundos, aumentando a intensidade e o tempo de intervalo progressivamente. Logo após a coleta o sêmen era submetido à avaliação sendo que no exame imediato avaliava-se o volume, aspecto e cor do sêmen. Sob microscópio era avaliado a motilidade, o vigor e o movimento de massa dos espermatozóides sendo avaliado de forma subjetiva. A motilidade é expressa em porcentagem (%) de 0 a 100% - e o vigor é expresso de zero a cinco, de acordo com a velocidade do movimento progressivo (Ver figura 8).

36 FIGURA 8: Sêmen bovino avaliado sob microscópio - avaliação da motilidade e vigor. O sêmen diluído em formol salino e sob câmara de Neubauer sendo determinada à concentração espermática (ver figura 9). Para a determinação da concentração, utiliza-se a fórmula recomendada pelo manual de exames andrológicos do Colégio Brasileiro de Reprodução Animal: A = Número de espermatozóides contados; B = Fator de diluição (Ex. 1:200 = 200; 1:100 = 100); N = Número de quadrados grandes contados, superfície contada; 1/10 = altura da câmara.

37 Logo em seguida confeccionava-se um esfregaço em lâmina para coloração e avaliação morfológica dos espermatozóides. Na avaliação morfológica são verificados os espermatozóides e classificados os seus defeitos conforme a estrutura afetada (acrossomo, cabeça, peça intermediaria e cauda). O esfregaço em lâmina é corado seguindo o método de eosina-nigrosina e analisado sob imersão em aumento de a 2.000x em microscopia de campo claro. No laboratório são contadas aproximadamente 200 células por lâmina preparada e feita à porcentagem dos defeitos encontrados. Ainda é realizada a avaliação de partida de sêmen congelado, este vindo de central de inseminação, para elaboração de laudo técnico veterinário, este sêmen era submetido à avaliação, pós descongelamento, de motilidade, vigor e movimento em massa, a concentração era determinada e o prosseguia-se também o exame morfológico sobre lamina corada, na mesma maneira como citado anteriormente. O sêmen era submetido a teste de termo-resistência lento e teste de termo-resistência estressado. O teste de termo-resistência consistia em deixar a amostra por cinco horas em banho-maria a 38ºC e avaliar o vigor e a motilidade (ver figura 9). O teste de termo-resistência estressado consiste em deixar a amostra em banho-maria a 38ºC por cinco horas e depois transferir para geladeira a 5ºC e avaliar no outro dia, após 24 horas.

38 FIGURA 9: Microscópico e câmara de Neubauer para determinação da concentração espermática.

39 6. PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS REVISÃO DE LITERATURA Sendo uma ferramenta de significativa importância na exploração zootécnica na pecuária brasileira, a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos vem sendo utilizada para acelerar a produção de animais geneticamente superiores, constituindo uma fonte alternativa de embriões em programas de transferência de embriões (TE) (ALVES et al., 2001). Empregada primeiramente como instrumento de pesquisa fundamental, para estudar fenômenos fisiológicos relacionados aos gametas masculinos e femininos, o que permitiu uma melhor elucidação dos fenômenos de crescimento, maturação e fecundação de oócitos, da capacitação espermática, bem como do desenvolvimento embrionário precoce e de seus mecanismos de regulação (GONÇALVES et al, 2008). A PIV vem sendo utilizada em programas comerciais e apresenta resultados razoáveis, tendo grande variação em relação à taxa de clivagem e produção de mórulas e blastocistos (COELHO et al., 2000). A técnica de produção in vitro além de baixa eficiência, apresenta embriões de qualidade inferior quando comparados aos embriões produzidos in vivo (GONÇALVES et al., 2008). A taxa de blastocistos, prenhez e criopreservação obtidas a partir de oócitos maturados e fecundados in vitro são inferiores às obtidas em produção in vivo, provavelmente pela incompleta maturação citoplasmática do oócito, que reflete na

40 capacidade de desenvolvimento embrionário subseqüente (GONÇALVES et al., 2008). Palma (2008) afirma que a PIV apresenta vantagens sobre a inseminação artificial (IA) e a superovulação, do ponto do vista que na PIV, esta não depende de limites fisiológicos para responder a tratamentos como ocorre na superovulação, isto é, a PIV é uma técnica que permite produzir embriões cujas doadoras não respondem a tratamentos superovulatórios. As limitações desta biotecnologia estão relacionadas com as inter-relações potenciais do embrião com ambiente e meio durante o cultivo, sendo relacionado à composição do meio e o suplemento protéico (PALMA, 2008). Os diferentes protocolos utilizados tornam a técnica muito variável, tanto na pesquisa como em programas comerciais. Ocorre também a variação individual dos animais, condições de manejo nos quais estes estão submetidos e ao sistema de cultivo utilizado para a produção dos embriões como citado anteriormente (SILVA, 2006). Para o aumento da eficiência da técnica de produção in vitro, Gonçalves et al. (2008) sugerem o aperfeiçoamento e a simplificação das condições de cultivo durante as varias etapas do processo, principalmente no que se refere à maturação citoplasmática e molecular de oócitos obtida in vitro. Oócitos bovinos podem ser obtidos in vitro por meio de punção folicular ou de dissecação folicular de ovários provenientes de abatedouro ou in vivo por meio de laparotomia ou de laparoscopia via flanco e ainda por laparoscopia ou por ultrasonografia via vaginal (GONÇALVES et al., 2008). Com a incorporação da punção folicular em fêmeas vivas (ovum pick-up, OPU) tornou a ser uma vantagem na PIV e

41 estabeleceu um ponto de partida exitoso nos programas de produção de embriões (PALMA, 2008). As etapas que compreendem a produção in vitro de embriões bovinos são a maturação dos oócitos, a capacitação dos espermatozóides, a fecundação dos oócitos e o cultivo dos zigotos até o estádio de mórula ou blastocisto. Sendo de execução razoavelmente fácil, vários fatores podem interferir no processo e afetar os índices de sucesso da PIV (BERNARDI, 2005). Depois de recuperados os oócitos, três passos biológicos que ocorrem in vivo são realizados em laboratório para a produção de embriões: maturação in vitro (MIV) dos oócitos, fertilização in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) (BUENO & BELTRAN, 2008). Esses três principais eventos compreendem uma série de processos fisiológicos, muitos dos quais são desconhecidos, sendo que cada um pode ser o êxito ou o fracasso do processo seguinte (MUCCI et. al, 2006). O cultivo in vitro de embriões bovinos termina com a transferência para as receptoras, com os embriões nos estágio de mórulas ou blastocisto ou a criopreservação da estrutura (VARAGO et al., 2008). Embora a PIV tenha se desenvolvido ao longo das últimas décadas, sua eficiência é relativamente baixa, apenas 30-40% dos oócitos bovinos maturados, fecundados e cultivados conseguem se desenvolver até o estádio de blastocisto e dentre estes, somente 30% chegam a termo após a transferência para receptoras (GOTTARDI & MINGOTI, 2009). Palma (2008) esquematiza a produção in vitro de embriões bovinos conforme a ilustração abaixo.

42 FIGURA 10: Esquema de produção in vitro de embriões bovinos FONTE: Palma (2008) 6.1 ASPIRAÇÃO DOS FOLÍCULOS In vivo a principal técnica de aspiração folicular é pelo método transvaginal guiado por ultra-sonografia (OPU), técnica esta que permitiu a disseminação das biotecnologias e maior rapidez nos programas de melhoramento genético de rebanho bovinos (PONTES, 2009). A possibilidade de produzir descendentes geneticamente superiores em curto espaço de tempo e a precisão na seleção evidenciam a eficácia do

43 uso da OPU e da PIV. Essas biotecnologias progrediram deste o melhoramento genético do rebanho em curto prazo, bem como para o tratamento de infertilidade de doadoras impossibilitadas de produzir embrião (WAGTENDONK-DE LEEUW, 2006). In vitro, a forma mais utilizada e relativamente simples, é a aspiração de folículos de ovários provenientes de abatedouros com emprego de sistema dotado de bomba a vácuo, ou diretamente com seringas (PALMA, 2008). Em ovários provenientes de abatedouros Gonçalves et al. (2008) sugerem o uso de solução salina a 0,9% de NaCl, ou solução salina fosfatada tamponada (PBS) aquecida a 35ºC para o transporte. Palma (2008) propõe que os COCs aspirados com o liquido folicular devem ser coletados em tubos estéreis de 10 ml e postos para decantar por aproximadamente 10 minutos, com exceção de aspiração feita com auxílio de seringas. A pressão utilizada no sistema de aspiração com bomba a vácuo pode variar conforme o tamanho das mangueiras utilizadas, mas que geralmente ficam em torno de 90 a 150 mm Hg ou ml por minuto. Sendo que com a seringa a punção deve ser de 5 a 10 ml. Gordon (2003) relata da vantagem da aspiração folicular em quesito de velocidade de operação, o que se torna importante em unidades ou laboratórios de produção comercial de embriões, porém é importante levar em consideração a qualidade, há pouco mérito na velocidade das operações quando resulta em COCs de qualidade baixa. Na produção in vitro de embriões bovinos, os oócitos aspirados do interior dos folículos são de diâmetro de 2 a 8 mm, fase em que estão antes da divergência

44 folicular (GONÇALVES et al. 2008). O oócito no interior do folículo se encontra em repouso na prófase da primeira divisão meiótica, ou seja, em vesícula germinal (RAUBER et al.2003). Esses oócitos segundo Antoniolli (2005) mantém-se estagnados dentro do folículo devido a fatores inibitórios do mesmo ainda desconhecidos. Depois que são removidos do interior do folículo, estes oócitos meioticamente competentes reiniciam espontaneamente o processo de meiose, sendo que uma parte desse não adquire a plena competência citoplasmática (BARRETTO, 2007). Os oócitos menores de 2 mm não são competentes para reiniciar a meiose e os maiores de 8 mm geralmente se encontram em processo de atresia ou maturação. Em ambos os casos a viabilidade é comprometida (GONÇALVES et al. 2008). Os oócitos puncionados de folículos menores que 1 mm de diâmetro podem reiniciar a meiose quando cultivados in vitro, porém somente oócitos obtidos de folículos maiores que 2mm são capazes de atingir o estádio de metáfase II (BARRETTO, 2007). Sirard et al. (2006) afirma que a capacidade de sustentar a primeira semana de desenvolvimento embrionário é claramente influenciado pelo status folicular a partir do qual o oócito é obtido. 6.2 SELEÇÃO DOS COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITOS Os complexos cumulus-oócitos (COCs) aspirados para a produção in vitro variam em sua aparência (aspecto do citoplasma e das células do cumulus) e em sua morfologia (PALMA, 2008). Os oócitos aspirados na PIV são obtidos de folículos de diferentes etapas do desenvolvimento e em fases distintas do ciclo estral, portanto,

45 expostos a diferentes concentrações de estradiol, progesterona, LH e FSH, fatores estes que podem vim a afetar a competência oocitária para o desenvolvimento embrionário in vitro (CASTILHOS et al., 2007). Os COCs classificados de grau I ou II, de boa qualidade, são aqueles que estão rodeados por células do cumulus compacta de cor uniformemente marrom escuro. Essa células são importantes uma vez que regulam a maturação citoplasmática do oócito nas ultimas etapas do desenvolvimento in vitro. Outro fator de significativa importância é que estas células do cumulus melhoram a fecundação na maioria das espécies mamíferas, com exceção da espécie humana (PALMA, 2008). Para a seleção dos COCs são avaliados os parâmetros morfológicos, tais como: a morfologia do ooplasma e do cumulus, o tamanho do folículo e ovócito, e o grau de atresia folicular. Os COCs com massa de cumulus compacta, com numerosas camadas de células e com um ovócito de ooplasma homogêneo apresentam maior capacidade de desenvolvimento (CALADO et. al. 2005). QUADRO 3: EFEITOS POSITIVOS DAS CÉLULAS DO CUMULUS SOBRE A FECUNDAÇÃO Aumenta o número de espermatozóides fecundantes ao redor do ovócito, através de atividade quimiotática; Estabelece um microambiente que facilita a capacitação espermática e penetração, através da secreção de fatores e modelação da tensão de oxigênio e ph; Protege o oócito mudanças desfavoráveis, como o endurecimento prematuro da zona pelúcida que produzira uma menor penetração espermática; FONTE: Palma (2008)

46 Na prática Palma (2008) recomenda a seleção de COCs que possuem um cumulus denso, com 3 a 6 camadas de células que cobrem toda a superfície do oócito e que o citoplasma seja de cor marrom ou cinza escuro e uniforme. QUADRO 4: CRITÉRIOS UTILIZADOS NA AVALIAÇÃO DA QUALIDADE DE OÓCITOS BOVINOS Categoria COC 1 Cumulus compacto com várias camadas de células; ooplasma homogêneo; COC transparente em sua totalidade. 2 Cumulus compacto com várias camadas de células; ooplasma homogêneo, mas com aparência mais escura na periferia do oócito; COC transparente ou ligeiramente mais escuro. 3 Cumulus compacto com poucas camadas; ooplasma irregular e escuro; COC mais escuro que 1 e 2. 4 Cumulus expandido; células do cumulus espalhadas e escuras; ooplasma irregular e escuro; COC irregular e escuro. FONTE: Gordon (2003)

47 QUADRO 5: CRITÉRIOS DE SELEÇÃO DE COCs E OÓCITOS De Loos y col. (1989 y 1991) Cumulus e oócito Classificação Critérios 1 Cumulus com camadas múltiplas; Cumulus Compacto; COC de cor clara e transparente; Citoplasma Homogêneo; 2 Cumulus com 1 ou mais pontos escuros e menos transparente; Citoplasma com granulação mais grossa e mais escura na periferia que em 1; 3 Cumulus menos compacto, mas escuro que 1 e 2; Com Manchas escuras; 4 Cumulus expandido; Según Hawk y Wall (1994) Cumulus y ovócito Bom Cumulus com múltiplas camadas, compacto e translúcido Citoplasma com granulação fina, densa e uniforme. Regular Cumulus ligeiramente expandido, com menor número de camadas que podem cobrir a zona pelúcida, granulosa e granulações ligeiramente mais grossas; Cumulus parcialmente expandido e disperso; Rede de união nas células do cumulus; Ruim Ovócitos pequenos ou grandes, ovócitos desnudos; Cumulus escuro (marrom escuro); Citoplasma de cor muito claro ou escuro; Citoplasma regular com áreas claras ou escuras. FONTE: Palma (2008)

48 Gonçalves et al (2008) apresentam a classificação com escala de 1 a 4, considerando as características do cumulus (cobertura do oócito) e do citoplasma do oócito (ooplasma). Qualidade 1 cumulus compacto presente, com mais de três camadas de células. Ooplasma com granulações finas e homogêneas, preenchendo o interior da zona pelúcida e de coloração marrom. Qualidade 2 cumulus compacto parcialmente presente em volta do oócito ou rodeando-o por completo, com menos de 3 camadas celulares. Ooplasma com granulações distribuídas de modo heterogêneo, podendo estar mais concentradas no centro e mais claras na periferia, ou condensadas em um só local aparentando uma mancha escura. O ooplasma preenche o espaço do interior da zona pelúcida. Qualidade 3 Cumulus presente, mas expandido. Ooplasma contraído, degenerado, vacuolado, ou fragmentado, com espaço entre a membrana celular e a zona pelúcida, preenchendo irregularmente o espaço perivitelino. Qualidade 4 oócito desnudo sem células do cumulus. O diâmetro dos ovócitos esta relacionado a sua capacidade para retornar a meiose. Os oócitos menores que 110 µm ainda que ativos, possuem um valor reduzido na capacidade de retornar a meiose. Os oócitos de pequeno tamanho e com zona pelúcida de pouca espessura tendem a uma maturação meiótica anormal, tendo problemas na maturação, fertilização e clivagem. (GORDON, 2003).

49 6.3 MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS No folículo pré-ovulatório de uma vaca cíclica, o oócito in vivo inicia a maturação com a presença da onda do hormônio luteinizante (LH), para atingir o estagio desde prófase I a metáfase II em aproximadamente 20-24h (Palma, 2008). Os oócitos meioticamente competentes mantidos em estádio de vesícula germinativa (VG) no ambiente folicular é mantido ate que ocorra o pico de LH o qual estimula a maturação oócitaria (BARRETTO, 2007). In vitro o início da meiose ocorre espontaneamente no momento em que o oócito é separado do folículo não ovulatório (2-8 mm) e alcança a metáfase II em horas de cultivo (PALMA, 2008). Varago et. al. (2008) afirmam que o fator que inibe a maturação oócitaria esta presente no folículo, pois este desaparece com a remoção do oócito do ambiente folicular e inicia seu desenvolvimento. Palma (2008) divide a maturação dos oócitos em 3 níveis: Maturação meiótica. Maturação citoplasmática. Maturação molecular. A maturação envolve transformações nucleares, citoplasmáticas e moleculares, todas ligadas a uma série de mudanças estruturais e bioquímicas isto faz com que o gameta feminino se torne apto a ser fecundado e a completar seu desenvolvimento embrionário (GONÇALVES et al., 2008). A maturação engloba os eventos que permitem o oócito expressar seu máximo potencial de desenvolvimento após a fecundação (BARRETTO, 2007).

50 As alterações oocitárias de maturação são nucleares e citoplasmáticas, entre as nucleares incluem-se: quebra da vesícula germinativa (GVBD), desaparecimento do nucléolo, condensação da cromatina, extrusão do primeiro corpúsculo polar e formação do segundo fuso meiótico. As alterações citoplasmáticas são: redistribuição das organelas intracelulares (mitocôndrias migram para posição perinuclear e grânulos corticais depositam-se abaixo da membrana vitelina) e maturação dos mecanismos de liberação de cálcio (Ca² + ) (BARRETTO, 2007). Na retomada da meiose, o oócito avança para metáfase, anáfase I (AI) e telófase I (TI), momento que ocorre a extrusão do primeiro corpúsculo polar. Então o desenvolvimento cessa em metáfase II (MII), a conclusão da meiose ocorre então com a penetração do espermatozóide, ou seja, com a fecundação ocorre a ativação oócitaria que é acompanhada pela extrusão do segundo corpúsculo polar para o espaço perivitelinico (VARAGO et. al, 2008). Para a conclusão da primeira divisão meiótica in vitro de oócitos bovinos o tempo varia de horas, sendo o primeiro evento, o rompimento da vesícula germinativa, ocorre entre 7 e 12 horas após o inicio do cultivo, enquanto a metáfase I (MI) ocorre entre 12 e 15 horas. A anáfase I e a telófase I ocorrem entre 15 e 18 horas e a metáfase II (MII) a partir de 18 horas, sendo que mais de 95% dos oócitos apresentam bloqueio em MII entre 22 a 24 horas de cultivo (BERTAGNOLLI et al. 2004). Avaliando ao microscópio, o primeiro sinal da retomada da meiose é a dissolução da membrana nuclear, extrusão do primeiro corpúsculo polar e a formação do segundo fuso meiótico posteriormente de ocorrer o amadurecimento do oócito e

51 expansão das células do cumulus (GORDON, 2003). A expansão das células do cumulus na superfície do oócito indica e coincide com a retomada da meiose (BARRETTO, 2007). As células ao redor do oócito, chamadas de células da granulosa, que formam o complexo cumulus-oócito (GONÇALVES et al., 2008), são importantes para assegurar ao oócito sua completa maturação, sob as condições de cultivo em laboratório, sendo avaliadas as características morfológicas para o processo seguinte (GORDON, 2003). Durante a maturação as células do cumulus desenvolvem importantes funções no crescimento, divisão meiótica e na maturação citoplasmática do oócito. Essas células do cumulus exceto as do mural tornam-se suspensas em uma matriz de muco durante a maturação, permanecendo separadas em conseqüência do acumulo desse muco o qual é rico em acido hialurônico, esse acido sintetizado pelas células do próprio cumulus induzem sua expansão ou mucificação durante a maturação (GONÇALVES et al, 2008).

52 FIGURA 11 : A.) COCs selecionados para maturação in vitro. B.) COCs após o período de maturação com as células do cumulus expandidas FONTE: Gordon (2003)

53 A primeira modificação do núcleo visível ao microscópio é a condensação da cromatina e a dissolução da membrana nuclear, processo conhecido como ruptura da vesícula germinativa. A ultima manifestação da maturação nuclear coincide com o final da meiose e presença de 2 corpúsculos polares (PALMA, 2008). FIGURA 12: Rompimento da vesícula germinativa FONTE: Gordon (2003)

54 QUADRO 6: ETAPAS QUE CARACTERIZAM A CAPACIDADE DO OÓCITO Alcançar a meiose; Dividir-se depois da fecundação; Desenvolvimento a blastocisto; Induzir a prenhes; Desenvolvimento fetal até nascimento. FONTE: Palma (2008). QUADRO 7: FATORES QUE AFETAM A MATURAÇÃO IN VITRO DOS OÓCITOS E DESENVOLVIMENTO DE EMBRIÕES Origem dos oócitos se estes provem de folículos grandes ou pequenos, estado cíclico da fêmea, estado nutricional, etc. nutricional; Saúde e integridade do folículo: atresia, dominância, estado sexual e Comunicação entre o oócito e as células do cumulus; Estimulação do folicular; Condições de cultivo in vitro. FONTE: Palma (2008). Depois de maturados, os oócitos permanecem em metáfase II até a fecundação ou a ativação partenogenética, provavelmente por ação de fatores citostáticos (CSF) (BETAGNOLLI et al. 2004). Após a conclusão da maturação nuclear e citoplasmática o oócito esta competente para ser fecundado e para o desenvolvimento embrionário. Uma inadequada maturação, tanto nuclear como citoplasmática, inviabiliza a

55 fecundação e aumenta a ocorrência de polispermia, de partenogênese e de bloqueio de desenvolvimento embrionário (VARAGO et. al, 2008) Meios de cultivo e suplementos para maturação in vitro de embriões de bovinos A habilidade do oócito para se tornar um embrião e eventualmente um bezerro, é adquirida durante sua diferenciação progressiva na foliculogênese, processo que culmina em um estado de competência de desenvolvimento, conhecido também por capacitação do oócito (GORDON, 2003). O meio de cultivo tradicional e mais utilizado na maturação dos oócitos bovino é o Tissue Culture Medium 199 (TCM-199), composto por sais Earle s com HEPES e bicarbonato, como estabilizadores de ph, suplementado com piruvato, lactato, vitaminas, aminoácidos, purinas, proteínas (albumina bovina ou soro de vaca em estro) (PALMA, 2008). Com o uso do soro como componente e este por conter varias substancias ativas (hormônios, aminoácidos, proteínas, fatores de crescimento, etc.), torna-se difícil saber a medida da resposta do oócito frente à presença ou ausência de substâncias não identificadas em tais suplementos (GORDON, 2003). A desvantagem do uso de soro de vaca no estro (SVE) vem do fato da indefinição de seus componentes, pois, além de conter estrógenos, o soro pode conter outras substâncias estimuladoras e/ou inibidoras da maturação oócitaria, além disso, o uso do SVE impossibilita o conhecimento exato da concentração hormonal utilizada e os resultados podem ser influenciados pela partida do soro (COELHO et al., 2002).

56 O TCM é usado por muitos dos principais laboratórios como meio de maturação in vitro para oócitos bovinos, sendo modificado de acordo com cada um, geralmente adicionado de piruvato, lactato, aminoácidos, bicarbonato de sódio, vitaminas entre outras substancias. A suplementação com o hormônio folículo estimulante (FSH) e o hormônio luteinizante (LH) são essenciais, enquanto a suplementação de estrógenos nos meios MIV é opcional e varia conforme o laboratório (VARAGO et.al, 2008). Os hormônios LH e FSH promovem uma melhor expansão nas células do cumulus oophorus, sendo que o FSH estimula a produção de substâncias sinalizadoras pelas células somáticas, que induzem a retomada da meiose e, portanto, facilitam a fertilização (GOTTARDI & MINGOTI, 2009). As fontes protéicas de origem animal mais utilizadas nos meios de maturação são o soro fetal bovino (SFB) e a albumina sérica bovino (BSA), porem, esses suplementos possuem componentes como fatores de crescimento, aminoácidos e proteínas, as quais variam significativamente (VARAGO et al, 2008). O Soro, um componente de origem biológica, utilizado em inúmeros protocolos da PIV, fornece nutrientes e fatores ainda pouco conhecidos, e há sempre o risco da introdução de agentes patogênicos nas etapas do processo que o utilizam (MOZZAQUATRO, 2004). Pontes (2009) vincula o SFB a alterações no metabolismo embrionário, como o rompimento da estrutura mitocondrial, desenvolvimento de grandes vesículas de lipídios, alterações da estrutura embrionária, modificações na expressão gênica e formação prematura de blastocele. Apesar do avanço tecnológico nos métodos de coleta e principalmente processamento do soro, não se tem a completa eliminação de contaminantes exógenos,

57 e certas viroses podem permanecer, sendo que a inativação pelo calor ou radiação gama não são inteiramente eficazes na eliminação da contaminação vírica (FIGUEIRÓ et al., 2004). O uso de soro de égua em estro, utilização de soro heterólogo, na PIV de embriões bovinos é citado como uma alternativa para evitar a transmissão de doenças espécie-específica (FIGUEIRÓ et al., 2000). Nos meios de cultura varias proteínas são adicionadas e desempenham papel importante, tais como: redução da embriotoxicidade do suplemento ou de produtos do metabolismo embrionário, fonte básica de necessidades nutritivas do embrião, fonte de fator de crescimento, promoção do desenvolvimento direta ou indiretamente do embrião através da proliferação das células do cumulus (ECKERT & NIEMANN, 1995). Coelho et al. (2002) afirmam que a adição de estradiol no meio de maturação melhora tanto a maturação nuclear como promove a síntese do fator de crescimento do pronúcleo masculino em oócitos imaturos submetidos à maturação e fecundação. Muitos estudos vêm sendo desenvolvido ao longo dos anos na busca de um protocolo definido para identificação da composição exata dos meios com objetivo de evitar variabilidade nos resultados. Porém, tais protocolos não viabilizam a obtenção de taxas embrionárias superiores aos protocolos que utilizam fontes de proteínas animais (MOZZAQUATRO, 2004).

58 6.4 FECUNDAÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS Palma (2008) descreve a fecundação in vitro (FIV) como sendo o procedimento do qual os oócitos maduros são cultivados junto com os espermatozóides e fecundados. Sendo um processo complexo, resultando na união do espermatozóide e do oócito, sinaliza o início da transição de oócito para embrião é também um processo no qual o óvulo é ativado e pode ser considerado um evento obrigatório para o início do desenvolvimento após a fecundação (GORDON, 2003). Para o sucesso da FIV esta requer a preparação adequada de ambos os gametas, assim como meios de cultivo e condições favoráveis para que ocorra a fertilização (GORDON, 2003) Capacitação espermática A capacidade fecundante dos touros pode ser definida como o sucesso do espermatozóide em fecundar o oócito, resultando na formação do zigoto, seguindo um desenvolvimento embrionário e fetal até o nascimento (WATANABE & OLIVEIRA FILHO, 2000). Os espermatozóides de mamíferos após serem ejaculados não possuem habilidade para fecundação, mesmo estando móveis e com morfologia aparente normal. A capacidade de adquirir a competência para fecundar é denominada capacitação espermática. In vivo, a capacidade fecundante é completada quando o espermatozóide atinge o trato genital da fêmea (BALL & PETERS, 2004). Sendo uma célula altamente especializada, o espermatozóide precisa se tornar capaz para fertilizar

59 o oócito, para isso precisa sofrer uma serie de alterações bioquímicas atingindo um estado denominado capacitação (PONTES, 2009). Ball & Peters (2004), dizem que a capacitação espermática envolve mudanças e alterações enzimáticas e estruturais, principalmente na parte anterior do acrossoma e da membrana da cabeça do espermatozóide, tais alterações são: 1. Aumento na permeabilidade do cálcio; 2. Alterações da estrutura da membrana; 3. Ativação da enzima adenil-ciclase; 4. Conversão de proteínas. Na FIV, os espermatozóides precisam estar capacitados, isto requer uma seleção e recuperação de espermatozóides móveis, com formas normais, livres de contaminantes do plasma seminal (COELHO et al, 2000). Para a fecundação in vitro de oócitos bovinos, grande parte dos laboratórios utilizam sêmen congelado, porém após o descongelamento é necessário selecionar os espermatozóides vivos e aptos a fecundar (VARAGO et.al, 2008). Camargo et al. (2002) afirmam que há grande variabilidade entre touros durante a fecundação in vitro. Coelho et al. (2000) indicam vários métodos utilizados para a separação e eliminação do plasma seminal e diluente da fração móvel do sêmen diluído e descongelado, tais como: swin-up, separação por gradiente descontinuo de BSA, filtração em coluna de sefadex/filtro de troca iônica, separação por gradiente descontínuo de Percoll e lavagem mediante centrifugação.

60 Os dois métodos mais comumente utilizados para preparação de espermatozóides para a FIV, em bovinos, são o gradiente de Percoll e o Swim-up (migração ascendente) (RHEINGANTZ et al., 2002). Gordon (2004) refere-se que umas das etapas da FIV é a seleção de espermatozóides, uma prática comum nos laboratório é selecionar o esperma descongelado com base no método de separação de Percoll. O método de separação de Percoll refere-se a uma suspensão coloidal de partículas de sílicas revestidas com polivinil pirrolidona (PVP). Gordon (2003) atribui duas vantagens ao metodo de separação de Percoll, são elas: os espermatozóides móveis foram efetivamente isolados e foram rapidamente removidos do plasma seminal, células somaticas, células mortas e espermatozóides morfologicamente anormais. A separação por Percoll consiste na deposição dos espermatozóides em duas ou mais camadas de soluções de Percoll em diferentes concentrações, sendo submetido a centrifugação, a qual permite o fracionamento de subpopulações de espermatozóides separando-os do diluidor e de outras celulas (RHEINGANTZ et al. 2002). Em seu trabalho, Coelho et al. (2000) descrevem a técnica utilizada separação de Percoll usando soluções de gradiente a 55% e a 90% de Percoll a 100%. No fundo de um tubo cônico contendo previamente a solução de Percoll a 55%, adicionou-se a solução de Percoll a 90% e, sobre as duas soluções, a amostra de sêmen depositada delicadamente. O conjunto foi centrifugado a 200G durante 25 minutos, efetuaram-se duas lavagens com meio TALP-SPERM sem cálcio nem glicose, suplementado com cafeína e adicionado de sulfato de gentamicina para retirada do Percoll, o sedimento

61 foi ressuspenso em meio TALP-SPERM contendo heparina e posteriormente incubado. FIGURA 13: Preparação do sêmen com gradiente de Percoll Fonte: Gonçalves et al., 2008 O método do Swim-up é baseado na tendência que os espermatozóides mais móveis apresentam, de migrarem para cima após incubação em um meio apropriado, geralmente o Tyrode com albumina, lactato e piruvato (TALP). Após o período de incubação, os espermatozóides capacitados são retirados da fração superior do meio e durante a migração ascendente desses espermatozóides. Ocorre também a remoção dos fatores de decapacitação, diluentes e crioprotetores (RHEINGANTZ et al., 2002). O meio TALP modificado é uma preparação contendo Tyrode, bicarbonato e albumina bovina, ainda pode possuir lactato de sódio, fontes de energia, piruvato de sódio (GORDON, 2003).

62 FIGURA 14: Método do Swin-up para obtenção de espermatozóides para FIV FONTE: Gordon, 2003 A metodologia de separação por gradiente de Percoll resulta em recuperação de espermatozóides móveis seis vezes maior que o do Swim-up, porém os espermatozóides submetidos ao Swim-up penetram um maior número de oócitos, aumentando as taxas de fecundação e clivagem, quando a mesma concentração de espermatozóides é utilizada (PARRISH et al., 1995). A concentração espermática e o tempo de incubação de oócitos são fatores de elevada importância no sistema de fecundação in vitro. A concentração espermática afeta a taxa de fecundação e clivagem em bovinos, tanto o excesso de espermatozóides durante a fecundação como aumento do tempo de incubação entre os gametas podem provocar aumento da incidência de polispermia (CAMARGO et al., 2002). Em geral a concentração usada para a FIV é de 2 x 10 6 espermatozóides por ml, calculado de acordo com a motilidade e concentração da fração viva de espermatozóides obtida (BUENO & BELTRAN, 2008).

63 6.4.2 Fusão dos Gametas In vivo a fecundação - união entre espermatozóide e oócito ocorre na ampola e essa fecundação requer 3 eventos críticos, sendo eles: 1) migração espermática entre as células do cumulus oophorus; 2) união espermática e migração através da zona pelúcida e 3) fusão das membranas plasmáticas do espermatozóide e do oócito (HAFEZ & HAFEZ, 2004). Quando o espermatozóide atravessa a zona pelúcida e se une as microvilosidades da membrana plasmática do oócito, fase esta que se denomina fusão dos gametas, a parte posterior da cabeça espermática se incorpora ao oócito por meio de fusão das membranas, enquanto a parte anterior esta envolvido pela membrana do oócito como se fosse uma fagocitose (PALMA, 2008). A fecundação é completada (ver figura 15) com a fusão dos prónucleos haplóides masculino e feminino, processo conhecido como singamia (BALL & PETERS, 2004).

64 FIGURA 15: Fases da Fertilização. Fonte: Hafez & Hafez (2004) Meio de Fecundação in vitro de embriões bovinos O meio de cultivo tem um importante papel na fecundação de embriões bovinos in vitro (BHUIYAN et al., 2007). Este meio de cultivo deve permitir o metabolismo do oócito e das células do cumulus e manter a função espermática eficiente (GONÇALVES et al., 2008).

65 Muitos fatores no meio de cultivo contribuem para a interação bem sucedida do oócito e espermatozóide para a fertilização in vitro. O meio TALP modificado sob óleo mineral é amplamente utilizado como meio de fertilização por diversos laboratórios (GORDON, 2003). A adição de penicilamina, hipotaurina e epinefrina ao meio de fertilização (TALP-FERT) é para aumentar a porcentagem de capacitação do acrossoma do espermatozóide. Sabe-se que a hipotaurina combinada com adrenalina ou epinefrina, aumenta a motilidade e a taxa de penetração do espermatozóide no oócito, outro fator é que a hipotaurina mais adrenalina são capazes de limitar a formação de superóxido que pode inibir a peroxidação lipídica na célula espermática (GORDON, 2003). In vivo a fecundação ocorre no istmo e há presença de fluidos orgânicos, os quais são viscosos e compostos por glicoproteinas que contribuem para subida do espermatozóide e sua fusão com o oócito. In vitro, a viscosidade do meio é diferente das secreções tubáricas. Na verdade o SFB e a BSA são componentes comum dos meios de fecundação, fornecendo fonte de proteínas e aumentando a viscosidade, mas não atinge os níveis presumíveis do liquido tubárico, onde medições precisas ainda não estão disponíveis (COY et al., 2009).

66 6.5 CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS O oócito aspirado do folículo é competente segundo Sirard et al. (2006), quando: 1. Possui habilidade para retomar a meiose; 2. Possui capacidade de clivar após a fecundação; 3. Possui capacidade de desenvolver até o estádio de blastocisto; 4. Possui capacidade de induzir uma gravidez e levá-la a termo; 5. Possui capacidade de desenvolver geneticamente a expressão de boa saúde. Após a fertilização, o óvulo começa a mitose, processo conhecido como clivagem. Essa divisão continua até um grupo de células sólido ser formado, conhecida por mórula, por volta de 5 6 dias. Do sexto dia após fertilização a mórula começa a formar o blastocisto este constituído por uma única camada de células esféricas o trofoblasto (BALL & PETERS, 2004). O cultivo in vitro corresponde ao período de desenvolvimento do oócito fertilizado até o estádio de blastocisto, durante tal período ocorre ativação do genoma embrionário, processo de divisão celular, compactação dos blastômeros no estádio de mórula e inicio da diferenciação embrionária com a formação da blastocele (BUENO & BELTRAN, 2008). A primeira semana de desenvolvimento embrionário representa um momento perigoso, neste intervalo ocorre o implante na parede uterina e estabelecimento da prenhes. Este intervalo é conhecido como fase de pré-implantação ou desenvolvimento

67 de pré-fixação, este período culmina com a formação do blastocisto (WATSON & BARCROFT, 2001). FIGURA 16: Fases do desenvolvimento embrionário bovino. FONTE: Gordon (2003). O período de pré-implantação se caracteriza por clivagens sucessivas do zigoto e estádio embrionários iniciais, ativação da transcrição embrionária e eventos morfogenéticos de compactação e cavitação, que culminam com a formação do blastocisto (LIMA & SOUZA, 2009).

68 Lima & Souza (2009) afirmam que o zigoto, estádio embrionário inicial, difere do blastocisto, estádio embrionário final, em termos de morfologia e características fisiológicas e bioquímicas. As principais alterações morfológicas que ocorrem no embrião inicialmente são: A compactação dos blastômeros (mórula compacta); O desenvolvimento da blastocele (blastocisto inicial). A compactação dos blastômeros se caracteriza por um aumento do contato celular entre blastômeros, o qual permanece até o total desaparecimento dos limites celulares individuais por meio de junções de adesão. O estádio de blastocisto é caracterizado pela diferenciação de células do trofectoderma, que se localizam mais externamente e circundam a blastocele, e pela formação da massa celular interna (WATSON & BARCROFT, 2001).

69 7. PRODUÇÃO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS RELATÓRIO A produção in vitro de embriões bovinos (PIV) desenvolvida no laboratório EMBRYOLAB, ao longo do estágio curricular para fins de pesquisas e estudos, se inicia com a coleta dos ovários no frigorífico Silva, localizado na Rodovia Br 392, 100 km 8, Urlandia, na cidade de Santa Maria a aproximadamente 20 km do laboratório. Os ovários provenientes do frigorífico são transportados em uma garrafa térmica com solução fisiológia de NaCl (Cloreto de Sódio) a 9% acrescida de penicilina G-potássica e a uma temperatura de aproximadamente 35º-37ºC. Desde o horário da coleta a chegada ao laboratório, o tempo varia em torno de 1 a 2 horas. Ao chegar no laboratório, os ovários são submetidos a uma lavagem com álcool 70% e posterior enxágüe em solução fisiológica, ambos aquecidos previamente a uma temperatura de aproximadamente 35 ºC (ver figura 17). Logo após esse processo, os ovários são colocados no banho-maria em solução fisiológica a aproximadamente 35º-37ºC, e então é realizada a punção folicular.

70 FIGURA 17: Banho dos ovários em álcool e solução fisiológica 7.1 ASPIRAÇÃO FOLICULAR A aspiração dos folículos é realizada com auxílio de uma bomba a vácuo conectadas a mangueira e tubo coletor, sendo a punção realizada com agulha tamanho 25mm x 8mm (21G). A pressão utilizada na bomba a vácuo é em torno de 20 ml por minuto (ver figura 18). Os folículos puncionados no laboratório são do tamanho de 2 8mm de diâmetro, sendo os mais aspirados e recomendados os de 2 6 mm.

71 Após a punção dos complexos cumulus-oócitos (COCs) e liquido folicular em tubos estéreis, estes são postos a sedimentar por 10 minutos a uma temperatura de 37ºC. FIGURA 18: Aspiração folicular aspiração dos folículos de tamanho entre 2-8 mm 7.2 SELEÇÃO DOS OÓCITOS BOVINOS Após a sedimentação das estruturas celulares nos tubos é realizada a procura e seleção dos oócitos sob lupa estereomicroscópica. Com auxilio de pipeta de Pasteur, o sedimentado dos tubos é posto em placas de Petri e então feita a seleção. Os oócitos selecionados segundo a avaliação de De Loos (1989 citado por PALMA, 2008) são os de grau I e II e raramente os de grau III. A avaliação dos complexos cumulus-oócitos é subjetiva, selecionando os COCs de melhor aparência, aqueles que possuam de 3-5 camadas de células do

72 cumulus, estas sendo compactas e sem vacúolos. Os oócitos devem ter o ooplasma homogêneo e sem manchas enegrecidas (ver figura 20). FIGURA 19: Seleção, lavagem e procura dos oócitos sob lupa FIGURA 20: Complexos cumulus-oócitos

73 7.3 LAVAGEM DOS COMPLEXOS CUMULUS-OÓCITOS O restante do líquido folicular é centrifugado para ser usado na lavagem dos COCs. As estruturas são lavadas em placas de Petri pequenas (ver figura 19 e 21) ou em gotas, quando o banho for em gotas utiliza-se de 4 a 6 gotas. Posteriormente as estruturas são submetidas e lavadas com HEPES, para retirar o liquido folicular, este sendo lavado em mais gotas, dependendo do operador, sendo usados geralmente 5 a 8 gotas de HEPES por grupo de COCs. FIGURA 21: Banho dos COCs em liquido folicular sob lupa

74 FIGURA 22: Oócitos selecionados no meio TCM-Hepes 7.4 MATURAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS Após serem lavados em meio TCM-Hepes os COCs são transferidos para o meio de maturação TCM-199 postos em placas Nunc de 4 poços (ver figura 26) e então conduzidos a estufa de pressão, temperatura e umidade controlada (39 C, com 5% de CO 2 em ar com umidade saturada,) por horas aproximadamente (ver figura 23). Para a maturação foi utilizado de COCs por poço da placa Nunc em meio TCM-199 adicionado de piruvato de sódio, rfsh, LH e soro fetal bovino.

75 FIGURA 23: Estufa de pressão, temperatura e umidade controlada FIGURA 24: Oócitos maturados, com as células do cumulus expandidas

76 FIGURA 25: Oócitos maturados, com as células do cumulus expandidas FIGURA 26: Placa Nunc com meio de maturação

77 7.5 FECUNDAÇÃO IN VITRO DE OÓCITOS BOVINOS Concluída a maturação dos oócitos (ver figura 24 e 25), estes são avaliados para constatar a maturação e não degeneração e/ou morte celular ou contaminação do meio e então são transferidos para Placas Nunc com solução de TALP-FERT, acrescido de Bovine Serum Albumin (BSA albumina de soro bovino), de piruvato de sódio, penicillaminea, hypotaurine, epinefrine (PHE) e de heparina. O meio é préestabilizado na estufa de cultivo de uma a duas horas antes. Para a fecundação in vitro (FIV) é utilizado sêmen de bovino congelado, em palhetas de 0,25ml, este sendo descongelado por 30 segundos em banho-maria a 38ºC. Após a adição do sêmen nos poços com os oócitos, estes vão para a estufa de cultivo e permanecem em torno de horas Capacitação espermática A capacitação espermática no laboratório é feita pelo método de Swim-up. O método desenvolvido consiste em depositar 1 ml de meio TALP-FERT em um tubo cônico, fazendo vários tubos, aproximadamente 5 por palheta, deixar estabilizar em banho-maria a 38ºC por 1 hora, deposita-se o sêmen no tubo com TALP-FERT estabilizado (ver figura 27). O sêmen proveniente de palhetas congeladas é descongelado a 38ºC por 30 segundos, avaliado a motilidade e vigor e então submetido ao método (ver figura 28). Após depositar o sêmen no meio aguardar 1 hora para que ocorra a migração ascendente. Ao final do processo retira-se o sobrenadante de cada tubo tendo o

78 cuidado de não mexer o tubo e misturar o sobrenadante com o precipitado e não aspirar a camada inferior (ver figura 29). O sobrenadante dos tubos são postos para centrifugar por 10 minutos a 1200 rpm (ver figura 30), é retirado o pellet que se forma após a centrifugação, homogeneizado e determinada a concentração espermática. Para determinar a concentração espermática utiliza-se 5µL o qual é diluído em 95 µl de água tendo uma diluição de 1:20 e efetuada a contagem na câmara de Neubauer. A câmara de Neubauer é montada, adiciona-se o sêmen diluído nos dois lados da câmara, e aguarda-se cinco minutos com a câmara em repouso na horizontal, para que as células fiquem depositadas no fundo da mesma. Sob microscópio de campo claro e objetivas de 10x e 40x, realiza-se a contagem de cinco quadrados grandes de cada lado da câmara e divide-se por 2. Para o calculo da FIV divide-se 400 µl (volume/poço) pelo numero de espermatozóides contados nos dois lados da câmara. A dose inseminante utilizada nas rotinas é de 1 a 2 x 10 6 de espermatozóides por ml.

79 FIGURA 27: Meio Talp-Sperm em banho-maria. FIGURA 28: Avaliação da motilidade e vigor das palhetas de sêmen descongeladas

80 FIGURA 29: Retirada do sobrenadante do Swin-up FIGURA 30: Centrifuga centrifugação da fração do sobrenadante do Swin-up

81 7.6 CULTIVO IN VITRO DE EMBRIÕES BOVINOS Após a incubação dos oócitos/espermatozóides os possíveis zigotos são desnudados, isto é, retirada as células do cumulus. Para isso é utilizado o método de VORTEX que consiste em depositar meio TCM-HEPES em tubos cônicos e transferir os possíveis zigotos para o mesmo, e então submetidos a agitação mecânica por 1,5 minutos com 20% de intensidade (ver figura 31). O conteúdo do tubo é vertido em placa de Petri estéril, o tubo é lavado duas vezes com meio TCM-HEPES depositando o conteúdo na mesma placa e então é realizada a busca dos prováveis zigotos, estes são postos em uma gota do meio TCM- HEPES e espera-se cinco minutos para que ocorra a sedimentação das células da granulosa. Após estas etapas os zigotos são submetidos a banhos de TCM-Hepes, então são transferidos para placas Nunc com meio SOFaa (Sintetic Oviduct Fluid), este já estabilizado na estufa (ver figura 32). Para o cultivo de possíveis zigotos, após a fecundação e o desnudamento, é utilizado o meio SOFaa, este geralmente feito um dia antes - quando se prepara o meio de fertilização - adicionado de Soro fetal bovino (SFB), aminoácidos essenciais e aminoácidos não essenciais, sendo distribuído em aproximadamente 20 zigotos por poço da placa Nunc, sob óleo mineral e levado a estufa de cultivo celular.

82 FIGURA 31: Possíveis zigotos submetidos ao vortex. FIGURA 32: Busca dos possíveis zigotos e banho em gotas no meio TCM-HEPES.

83 7.7 AVALIAÇÃO DA TAXA DE ECLOSÃO E DOS EMBRIÕES As avaliações ocorrem no dia 2 após a fertilização (D2) no dia 7 (D7) e no dia 9 (D9), considerando o dia da fertilização como dia zero (D0) Em D2 avalia-se a taxa de clivagem dos embriões. Em D7 avalia-se Blastocistos inicias (Bi), Blastocistos expandidos (Bx), Blastocistos em eclosão (Bh) e Blastocistos eclodidos (Be). Em D9 avalia-se Bx, Bh e Be. A avaliação leva em consideração o grau de desenvolvimento embrionário e variações no desenvolvimento e aspecto morfológico das estruturas. Avaliando-se o aspecto morfológico os principais parâmetros de qualidade, sendo classificados de 1 a 5 sendo 1 excelente e 5 degenerado - são: Formato; Simetria; Coloração; Extrusão celular; Integridade da zona pelúcida.

84 FIGURA 33: Avaliação dos zigotos pós desnudamento em D2 FIGURA 34: Avaliação dos zigotos pós desnudamento em D2