ESTUDO DE VIABILIDADE DE UM PROCESSO DE BIORREMEDIAÇÃO EM SOLO CONTAMINADO COM HIDROCARBONETO POLICÍCLICO AROMÁTICO (HPA) BENZO(A)PIRENO

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1 0 DAFNE QUINTAS WASZAK ESTUDO DE VIABILIDADE DE UM PROCESSO DE BIORREMEDIAÇÃO EM SOLO CONTAMINADO COM HIDROCARBONETO POLICÍCLICO AROMÁTICO (HPA) BENZO(A)PIRENO CANOAS, 2010

2 1 DAFNE QUINTAS WASZAK ESTUDO DE VIABILIDADE DE UM PROCESSO DE BIORREMEDIAÇÃO EM SOLO CONTAMINADO COM HIDROCARBONETO POLICÍCLICO AROMÁTICO (HPA) BENZO(A)PIRENO Trabalho de conclusão apresentado ao Curso de Química do Centro Universitário La salle Unilasalle como exigência parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química. Orientação: Prof. Dr. Delmar Bizani Co-Orientação: Profª Dra. Ana Cristina Borba da Cunha CANOAS, 2010

3 2 DAFNE QUINTAS WASZAK ESTUDO DE VIABILIDADE DE UM PROCESSO DE BIORREMEDIAÇÃO EM SOLO CONTAMINADO COM HIDROCARBONETO POLICÍCLICO AROMÁTICO (HPA) BENZO(A)PIRENO Trabalho de conclusão aprovado como requisito parcial para a obtenção do grau de Bacharel em Química do Centro Universitário La salle - Unilasalle. Aprovado pelos avaliadores em 9 de Dezembro de Prof. Dr. Delmar Bizani Unilasalle. Profª Dra. Ana Cristina Borba da Cunha Unilasalle.

4 3 Aos meus pais, Robson e Mônica, eternos e incansáveis incentivadores, pelo que sou e realizo, simplesmente.

5 4 AGRADECIMENTOS Agradeço primeiramente a Deus pela minha vida, por estar sempre ao meu lado me iluminando. Ao meu pai Robson, sem ele com certeza eu não chegaria aqui. Pai, obrigada pelo paitrocínio, pelo apoio, por todas as caronas de volta para a casa depois das aulas, inverno, verão, sempre esteve presente nesta jornada! Te amo demais. Agradeço à minha mãe Mônica, pela minha educação, pelo incentivo para o estudo, pelo carinho, dedicação, puxões de orelha, paciência, e principalmente pelo amor de mãe sempre presente. Te amo demais, obrigada! Agradeço aos meus familiares que me ajudaram nesta jornada, principalmente minhas avós, Marise e Elza, sempre presentes em minha vida, grandes incentivadoras. Vó Marise, obrigada por tudo que tens feito por mim neste momento decisivo, a Sra. Também faz parte dessa conquista. Agradeço ao meu namorado Márcio por todo o carinho, atenção, paciência e incentivo, por estar sempre ao meu lado. Agradeço aos meus amigos que estiveram comigo nesta fase, ouviram minhas angústias, meus medos, e sempre estiveram ao meu lado dando muita força. Agradeço aos meus colegas de faculdade que se tornaram amigos também, hoje fazem parte desta jornada, obrigada pelo apoio, pela ajuda no estudo, pela parceria sempre. Meus agradecimentos especiais por este trabalho são para as pessoas que foram fundamentais. Agradeceria em inúmeras linhas por todo o tempo dedicado a minha pessoa. Obrigada de coração por tudo! São eles: Meu orientador Prof. Delmar, por todo o conhecimento passado de microbiologia desde o estágio até a conclusão deste trabalho. Agradeço por toda a dedicação na minha metodologia, pelo apoio e incentivo. À co-orientadora Profª. Ana, presente desde o início da minha vida acadêmica. Agradeço imensamente pela dedicação ao meu trabalho, pela sugestão do tema, constante motivadora. Ao Matheus, parceria de pesquisa, colega de curso, uma pessoinha maravilhosa que me ajudou muito, esteve presente em todas as etapas no laboratório. Obrigada por tudo querido!

6 5 Agradeço também ao Jéferson, aluno do mestrado, que esteve presente durante toda a metodologia. Obrigada pela ajuda! À Priscila, por todo o material concedido, pela disponibilidade no início da pesquisa, você foi o ponto de partida. Obrigada Pri! À Jéssica, técnica do laboratório de química, por todas as dicas, ajuda em qualquer dúvida. Obrigada! Aos professores, pela minha formação e por todo o conhecimento transferido. Agradeço a todos que colaboraram de forma direta ou indireta para que este trabalho pudesse ser concluído. Obrigada a todos pela atenção e paciência, e pelo tempo a mim dedicado.

7 6 Determinação, coragem e auto confiança são fatores decisivos para o sucesso. Se estamos possuídos por uma inabalável determinação conseguiremos superálos. Independentemente das circunstâncias, devemos ser sempre humildes, recatados e despidos de orgulho. (Dalai Lama)

8 7 RESUMO Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são compostos mutagênicos e carcinogênicos aos humanos e aos animais que são introduzidos no ambiente em grandes quantidades devido às atividades relacionadas à extração, ao transporte, ao refino, à transformação e à utilização do petróleo e de seus derivados. Apesar disso, a grande maioria dos microorganismos do solo não possui a capacidade de degradá-los, o que resulta na sua acumulação no ambiente e na conseqüente contaminação dos ecossistemas. Uma estratégia para eliminação dos HPAs do solo é através da biorremediação, na qual os microorganismos que apresentam a capacidade de metabolizar estes compostos irão transformá-los em substâncias inertes, CO 2 e água. O presente trabalho apresenta uma proposta para biorremediação de um solo inerte contaminado com o benzo(a)pireno, o qual apresenta um elevado grau de toxicidade. Após a contaminação, o solo foi submetido a análises físicas e químicas para caracterização e determinação do ponto de partida, foram realizadas análises microbiológicas para monitoramento do crescimento microbiano, no qual o benzo(a)pireno foi monitorado quantitativamente. Palavras-chave: Biorremediação. HPAs. Benzo(a)pireno.

9 8 ABSTRACT Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) are mutagenic and carcinogenic and compounds to the humans and animals released through the environment buy anthropogenic activities related to the extraction, transport, refine, transformation and use of the petroleum and its derivatives. Most of the soils microorganisms do not possess the capacity to degrade them, which results in its accumulation in the atmosphere and contamination of the ecosystems. A strategy for PAHs elimination from the soil is through the bioremediation, where microorganisms having capacity to metabolize these compounds will transform them in inert substances, CO 2 and water. This paper presents a proposal bioremediation of soil inert contaminated with benzo(a)pyrene, wich has a high degree of toxicity. After contamination, the soil was subjected to physical and chemical characterization and of determining the starting point, were analyzed for microbiological monitoring of microbial growth, in which benzo(a)pyrene was monitored quantitatively. Keywords: Biodegradation. PAH's. Benzo (a) pyrene.

10 9 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (HPAs) Fontes de emissão de HPAs Propriedades físico-químicas Toxicidade Rota dos HPAs no meio ambiente Benzo(a)pireno Legislações NBR Environmental Protection Agecy (EPA) BIODEGRADAÇÃO Fatores físico-químicos que influenciam o processo de biodegradação Receptores de elétrons Nutrientes Água ph Temperatura Solo Biodegradação de HPAs BIORREMEDIAÇÃO Fatores ambientais que influenciam a biorremediação dos HPAs no solo.28 5 MICROBIOLOGIA Microbiologia do solo Crescimento Microbiano Microrganismos degradadores de HPAs Bactérias do solo Bacillus spp Pseudonomas spp Serratia marcescens Fungos do solo Candida albicans...41

11 Metabolismo microbiano na presença de HPAs CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROSCOPIA DE MASSAS Cromatografia gasosa Análise Quantitativa Calibração com padrões Método do padrão interno Espectroscopia de massas MATERIAIS E MÉTODOS Preparação e contaminação do solo Medição e redução do ph Planejamento fatorial Preparação dos meios de cultura e inoculação dos microrganismos Incubação dos microrganismos Preparação dos frascos Preparação das amostras Incubação Incubação das amostras Contagem dos microrganismos Quantificação Benzo(a)pireno RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO...71 REFERÊNCIAS...72 ANEXO A Resultado quantificação inicial...75 ANEXO B Cromatograma da quantificação inicial...76 ANEXO C Resultado quantificação final consórcio ANEXO D Cromatograma da quantificação final consórcio

12 11 1 INTRODUÇÃO Para que o homem possa continuar a desenvolver-se de uma forma que não venha a prejudicar o meio ambiente e a si próprio, é preciso que o atual modelo de desenvolvimento seja revisto. Este atual desenvolvimento terá que ser modificado para um tipo de modelo que proporcione um futuro melhor, que é o desenvolvimento sustentável. Neste tipo de desenvolvimento, o homem irá interagir com a natureza de forma harmoniosa, sem deixar de lado o seu desenvolvimento, ou seja, ele continuará produzindo, progredindo, mas sem danificar seu meio ambiente. (SILVA; MELO; SOUZA, 2005). A poluição se tornou inaceitável para a sociedade, aumentando a preocupação com os seus efeitos sobre o meio ambiente. Preocupações com a qualidade do ar e das águas são antigas, mas as preocupações com solos contaminados só se tornaram evidente no final da década de 70. Infelizmente é impossível reverter todos os danos causados ao ambiente utilizando técnicas de remediação. As estratégias modernas de gerenciamento têm dado ênfase à minimização de resíduos, reciclagem e remediação em preferência à disposição dos resíduos no meio ambiente. (MESQUITA, 2004). Atualmente, com o grande crescimento do número de postos de combustíveis no Brasil a partir da década de 70, verificou-se também uma elevada preocupação com essa problemática ambiental e, em especial, com o grande potencial de risco de contaminação das águas subterrâneas decorrentes de derramamentos de combustíveis. Os HPAs têm recebido mais atenção desde que foram encontrados no solo pela primeira vez por Blümer, em 1961, devido ao elevado impacto no meio ambiente e do seu potencial carcinogênico. A concentração de benzo(a)pireno (BAP) no solo tem aumentado consideravelmente devido à ampliação de seu uso industrial no último século, como o aumento do trânsito nos grandes centros urbanos e aos freqüentes vazamentos de diesel provenientes de postos de combustíveis. (D AGOSTINO; FLUES, 2005). Uma estratégia para a eliminação dos solos contaminados com HPAs, é através da biorremediação, que é a utilização de processo ou atividade biológica para transformar os contaminantes em substâncias inertes. Esta biotecnologia vem sendo utilizada há vários anos em outros países e, certos casos apresentam menor

13 12 custo e maior eficiência na remoção dos contaminantes do que as técnicas físicas e químicas (como incineração e lavagem do solo), sendo atualmente utilizada em escala comercial no tratamento de diversos resíduos e na remediação de áreas contaminadas. (JAQUES et al., 2007). O uso da técnica de biorremediação já está regulamentada, conforme a resolução 314 do CONAMA, que visa disciplinar o registro de produtos com a finalidade de biorremediar solos contaminados por vazamentos de petróleo e seus derivados. Esta resolução estabelece que os remediadores devem ser registrados no IBAMA, para que possam ser produzidos, importados, comercializados e utilizados ficando dispensados de registro aqueles que se destinam a pesquisa e experimento necessitando da aprovação do órgão.(conselho NACIONAL DO MEIO AMBIENTE, 2010). Desde o início do século XX são conhecidas espécies de bactérias e fungos capazes de utilizar hidrocarbonetos como fonte de carbono aerobicamente. Somente no fim da década de 80 foram identificados organismos que realizam este processo em condições anaeróbias. (WIDDEL; RABUS, 2001). A capacidade metabólica que certos organismos possuem de transformar ou mineralizar contaminantes em formas menos tóxicas, as quais passam a ser integradas aos ciclos bioquímicos, é chamada de biodegradação. (MIRANDA, 2008). Esse trabalho tem como objetivo avaliar de forma exploratória o potencial da utilização dos microrganismos Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, Serratia marcenscens e Candida albicans na degradação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs - benzo(a)pireno) em solo contaminado. O benzo(a)pireno foi selecionado por estar listado como contaminante classe I na NBR 10004, por possuir mais de 3 anéis benzênicos, possuir pressão de vapor baixa 0,00002 Pa (HPAs com mais de 4 anéis não permanecem muito tempo no ar como molécula gasosa, devido sua baixa pressão de vapor condensam e tornam-se absorvidos nas superfícies e partículas de fuligens e cinzas) apresentar uma meia vida longa no sedimento (aproximadamente 6 anos), possuir log Kow 6,04 (log Kow entre 5,8 e 8,0 indica a maior probabilidade do contaminante ser encontrado em sedimento) (NBR 10004/2004) e por haver padrão e metodologia disponível.

14 13 2 HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS AROMÁTICOS (HPAs) Hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) são compostos orgânicos semi voláteis formados em processos de combustão a alta temperatura. O processo de queima incompleta de materiais orgânicos, que contém cadeias carbônicas em sua estrutura, é a principal fonte de emissão de HPAs. A queima de combustível fóssil em processos industriais, motores de automóveis, sistemas de aquecimento domésticos (com carvão mineral ou gás butano), incineração de resíduos domésticos e industriais, fumaça de cigarros, refinarias de petróleo, emissões de foto copiadoras. Ainda várias fontes naturais, incluindo a queima de biomassa em florestas e erupções vulcânicas são consideradas emissoras de HPAs. (FERRAZ, 2005). Os HPAs constituem uma família de compostos caracterizada por possuírem dois ou mais anéis aromáticos condensados. Estas substâncias, bem como seus derivados nitrados e oxigenados, têm ampla distribuição e são encontrados como constituintes de misturas complexas em todos os compartimentos ambientais como o ar, água e sedimento, em diferentes níveis de concentração (FERRAZ, 2005). As estruturas dos 16 HPAs identificados pela Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos da América (EPA) como os principais carcinogênicos e/ou mutagênicos são mostrados na Figura 1.

15 Figura 1: Estrutura molecular dos 16 HPAs mais importantes segundo Agência de Proteção Ambiental dos Estados Unidos (EPA). Fonte: Ferraz,

16 Fontes de emissão de HPAs Encontra-se na literatura resultados coincidentes de fontes de emissão de determinados HPAs. Criseno, por exemplo, foi considerado como traçador de emissões de incineradores e da queima de combustível fóssil, tais como: óleo industrial ardente e exaustão veicular. Pequenas concentrações de criseno no ar foram observadas em 25 estações quentes (média de 18 ng.m -3 ). Maiores concentrações de criseno foram propostas relativamente as mais baixas temperaturas atmosféricas durante as estações de inverno (média de 75 ng.m -3 ). Tal fenômeno foi atribuído, ao aumento de consumo de combustíveis fósseis e à pequena freqüência de chuva (FERRAZ, 2005). Em geral, com a exceção à espécie instável benzo(a)pireno, os HPAs mais estáveis como pireno, fluoranteno, benzo(k)fluoranteno, benzo(g,h,i)perileno e indeno (1,2,3-cd)pireno foram considerados na literatura como traçadores de atividades de tráfego veicular. Destes, fluoreno, antraceno, fenantreno e pireno foram considerados como traçadores de fontes de motores a diesel, já os compostos fluoranteno, benzo(g,h,i)perileno e indeno(1,2,3-cd)pireno foram considerados como traçadores de emissões de motores à gasolina. (FERRAZ, 2005) 2.2 Propriedades físico-químicas A massa molar, a solubilidade em água, a constante de Henry e a pressão de vapor, dos 16 principais HPAs são substâncias pouco solúveis em água e, em geral, sua solubilidade diminui com o aumento do número de anéis aromáticos da molécula (aumento da afinidade lipofílica). De mesmo modo, a volatilidade dos compostos diminui com o aumento da massa molar e, conseqüentemente, HPAs de massas molares mais baixas são mais voláteis e apresentam maiores pressões de vapor que os mais pesados. O mesmo é observado com os valores da constante de Henry que diminui com o aumento da massa molar. Destes compostos estima-se que benzo(a)antraceno, criseno, benzo(b)fluoranteno, benzo(a)pireno, indeno(1,2,3,-

17 16 cd)pireno, dibenzo(a,h)antraceno e benzo(g,h,i)perileno, sejam os mais tóxicos para saúde humana. (FERRAZ, 2005) 2.3Toxicidade Pesquisas da Agência Internacional de Estudo do Câncer (IARC) classificam alguns HPAs como carcinogênicos e/ou mutagênicos e/ou genotóxicos (PUC-RJ, 2005). Compostos carcinogênicos são aqueles capazes de induzir um carcinoma, tumor maligno com tendência a produzir metástase. Evidências sobre a carcinogenicidade dos HPAs são indicadas principalmente por estudos de exposição ocupacional a misturas de HPAs resultantes de processos como a produção de coque, refinamento do petróleo, entre outros. (PUC-RJ, 2005) Já compostos mutagênicos são capazes de induzir ou aumentar a frequência de mutação no cromossomo de um organismo e compostos genotóxicos são aqueles com capacidade de induzir alterações no material genético de organismos a eles expostos (PUC-RJ, 2005). Uma substância genotóxica é tóxica para o DNA. Ela pode se unir diretamente a ele ou atuar indiretamente afetando as enzimas ligadas a sua replicação, levando a mutações que podem levar ao aparecimento de um câncer. No entanto, vale ressaltar que substâncias genotóxicas não são necessariamente cancerígenas (PUC-RJ, 2005). Estudos in vitro mostram que o benzo[a]pireno induz danos em células procarióticas, eucarióticas de mamíferos produzindo efeitos genotóxicos variados, incluindo mutações genéticas em células somáticas, formação de adutos de DNA, síntese de DNA não programada, entre outros Toxicidade dos HPAs. É importante ressaltar que muitos desses compostos, ao serem metabolizados, podem dar origem a compostos mais tóxicos do que o original (PUC-RJ, 2005). Nos Estados Unidos, a Agência de Proteção Ambiental americana (USEPA) prioriza o monitoramento de 16 HPAs baseado em suas características tóxicas, mutagênicas e carcinogênicas: naftaleno, antraceno, pireno, criseno, fenantreno, benzo(a)pireno, dibenzo[a,h]antraceno, benzo[a]antraceno, benzo[g,h,i]perileno,

18 17 acenafteno, acenaftileno, fluoreno, fluoranteno, benzo[k]fluoranteno, benzo[b]fluoranteno, indeno[1,2,3-cd]pireno (PUC-RJ, 2005). A exposição humana (e de outros animais) aos HPAs ocorre por diferentes vias. As mais importantes são a inalação de ar poluído e a ingestão de alimentos ou água contaminada (PUC-RJ, 2005). 2.4 Rota dos HPAs no meio ambiente A rota principal de transporte dos HPAs é feita através da atmosfera. Resultados de monitoramento ambiental mostraram que concentrações de HPAs são da ordem de poucos nanogramas por metro cúbico de ar. Os veículos motorizados todos que possuem motor de combustão interna - também contribuem para o aumento da poluição atmosférica com HPAs através da exaustão de gases, partículas de pneu e óleo lubrificante. Durante o processo de combustão, os veículos que utilizam o óleo diesel são a maior fonte de HPAs de baixo peso molecular para a atmosfera, enquanto os veículos movidos a gasolina são fonte de HPAs de alto peso molecular (MESQUITA, 2004). Os HPAs são caracterizados pela baixa solubilidade em água e alto coeficiente de partição octanol-água. Devido a essa hidrofobicidade natural, os HPAs se acumulam nas partículas finas e na matéria orgânica do sedimento marinho, tornando-o assim, um reservatório de HPAs. Esse acúmulo nos sedimentos marinhos pode ser proveniente de várias fontes, incluindo deposição atmosférica, produção off-shore, transporte de petróleo e lançamento de esgoto (MESQUITA, 2004). A concentração de HPAs no sedimento marinho varia de algumas ng/kg até g/kg, dependendo da proximidade de áreas industriais, correntes marítimas e águas servidas. A concentração de HPAs em solos contaminados de áreas industriais varia em função da atividade, do tipo de solo, constituintes do solo e grau de saturação do local (MESQUITA, 2004). A concentração de HPAs no solo de países industrializados revelou um aumento desde meados de 1800, com um pico entre 1950 e Um estudo feito por Jones em amostras de solo da Inglaterra mostrou um aumento de concentração

19 18 de HPAs próximo aos centros urbanos. Mas a combustão antropogênica de combustíveis fósseis e o longo alcance do transporte atmosférico contribuíram para a dispersão de HPAs no ambiente. Observa-se que quando HPAs alquil substituídos predominam nos sedimentos, eles são provenientes de derivados de petróleo, mas quando predominam HPAs sem grupos substituintes, a origem é de processo de combustão (MESQUITA, 2004). Além do ar, sedimento marinho e solo, os HPAs podem se acumular em organismos marinhos. A entrada de HPAs em organismos marinhos está ligada à biodisponibilidade (ex.: partição entre sedimento, água e alimento), e à fisiologia do organismo, sendo influenciada pelo tamanho do organismo, taxa de ingestão, taxa de crescimento, permeabilidade da membrana, taxa de ventilação, tempo de residência no intestino e regulação osmótica. Os HPAs podem ser eliminados dos organismos por difusão passiva ou por excreção de substâncias polares, produzidos em algum processo metabólico envolvendo HPAs (MESQUITA, 2004). A presença de HPAs em plantas pode expor indiretamente o homem através da cadeia alimentar. Deposições atmosféricas de HPAs sobre plantas, em alguns casos, podem ser assimiladas pelo homem. Se o HPA penetrar na célula, ele pode se transformar em β-o-glicosídeo e β-o-glucoronídeo conjugados; contudo, o destino dessas moléculas e seus derivados nas folhas ainda não foram elucidados. Vários fatores podem influenciar o acúmulo de HPAs nas plantas: propriedade física do HPA, espécie e estrutura da planta e condições ambientais concentração atmosférica de HPAs e temperatura (MESQUITA, 2004). 2.5 Benzo(a)pireno Composto pouco volátil. Quando presente no solo apresenta baixa mobilidade, na água, é pouco solúvel e adsorve aos sólidos suspensos e ao sedimento. Segundo a U.S. Environmental Protection Agency (U.S. EPA), a exposição ao benzo(a)pireno em períodos curtos pode produzir a deterioração dos glóbulos vermelhos no sangue, levando à anemia. A exposição prolongada causa um efeito potencial no desenvolvimento de cânceres.(wild,1992).

20 19 Poucos microorganismos foram identificados como degradadores deste composto, o tempo de meia vida para a mineralização por meio de biodegradação varia entre 200 e 300 semanas (HSDB, 2003). Dentre os HPA s, o benzo(a)pireno, é o composto mais carcingênico e resistente à foto-oxidação. (MIRANDA, 2008). Em alguns estudos de toxicidade em ratos, mostrou-se embriotóxico, teratogênico e causou diminuição na fertilidade(cheminfo, 2007). A figura 2 apresenta a estrutura do benzo(a)pireno. Figura 2 : Estrutura química do benzo(a)pireno Fonte: AGENCIA ESPAÑOLA DE SEGURIDADE ALIMENTARIA Y NUTRICIÓN, Legislações Os HPAs são poluentes orgânicos de grande importância ambiental e interesse toxicológico, pois muitos apresentam propriedades pré-carcinogênicas e ou mutagênicas para homens e animais. (WHO, 1998). Em resíduos sólidos a presença dos HPAs é de interesse, uma vez que pode ocorrer contaminação humana direta (manuseio, tratamento ou disposição) ou indireta (destino inadequado, contaminando o solo, lençóis freáticos, corpos d água superficiais, biota e ar (WHO, 1998) NBR A NBR trata da classificação dos resíduos sólidos, tendo como objetivo classificar os resíduos sólidos quanto aos seus riscos potenciais ao meio ambiente e à saúde pública. São previstas três categorias nesta norma: a) Classe I resíduos perigosos;

21 20 b) Classe II resíduos não inertes; c) Classe III resíduos inertes. Esta classificação é fundamental para o gerenciamento adequado dos resíduos Environmental Protection Agecy (EPA) A EPA estabeleceu uma lista de 16 HPAs considerados prioritários para o monitoramento ambiental, em função de sua carcinogenicidade e ocorrência. A tabela 1 apresenta a classificação toxicológica dada pela EPA, ABNT e IARC para alguns HPA s. Tabela 1: Classificação toxicológica de alguns HPA s HPAs IARC EPA ABNT Fluoreno 3 P NM Antraceno 3 P NM Metilfenantrenos+Metilantracenos 3 P NM Pireno 3 P NM Fluoranteno 3 P CP Benzo(a)antraceno 2A P CP Criseno 3 P CP Benzo(b)fluoranteno 2B P CP Benzo(k)fluoranteno 2B P NM Benzo(e)pireno 3 P NM Benzo(a)pireno 2A P CP Indeno(1,2,3-c,d)pireno 2B P CP Dibenzo(a,h)antraceno 2A P CP Benzo(g,h,i)perileno 3 P NM Coroneno 3 P NM IARC: International Agency for Research on Câncer; EPA: Environmental Protection Agency; ABNT: Associação Brasileira de Normas Técnicas (NBR 10004) Fonte: Caderno de saúde pública, 2003.

22 21 3 BIODEGRADAÇÃO Os fenômenos biológicos abrangem duas atividades fundamentais interdependentes, que são a síntese dos compostos orgânicos e a biodegradação destes compostos. A biodegradação é a decomposição de um material em componentes mais simples por organismos vivos, em que este processo biológico envolve dois fatores essenciais, que é a nutrição e a respiração (SILVA; MELO; SOUZA, 2005). Os microrganismos fazem uso da matéria orgânica constituída de um resíduo, seja ele sólido ou líquido, servindo-se de uma boa parte desta para a sua autoconstrução e reprodução. O restante é oxidado por meio da respiração, aproveitando sua energia e compensando ao meio, elementos na forma de subprodutos do seu metabolismo. Desta maneira, carbono, nitrogênio e fósforo, etc, que faziam parte das moléculas orgânicas dos resíduos, são devolvidas ao meio (ar, água, solo) na forma de compostos mais simples, como gás carbônico, fosfatos, nitratos, etc (SILVA; MELO; SOUZA, 2005). Um grande volume de biomassa pode ser processado por meio de vastos processos produtivos e objetivando uma grande diversidade na produção final de produtos, como: alimentos, bio-energia, bio-plásticos, papel, celulose e outros produtos químicos (SILVA; MELO; SOUZA, 2005). 3.1 Fatores físico-químicos que influenciam o processo de biodegradação Mesmo que o microrganismo possua habilidade para degradar o contaminante existem muitas razões para que esse composto seja degradado lentamente ou não. Entre as razões citam-se: receptor de elétrons, nutrientes, água, ph, temperatura e tipo de solo, os quais serão discutidos nos itens abaixo (MESQUITA, 2004).

23 Receptores de elétrons Na maioria dos casos, a biodegradação do contaminante depende de atividade aeróbia dos microrganismos, embora existam alguns processos que utilizem a biorremediação anaeróbia. Muitas vezes, os contaminantes podem servir como doadores ou receptores de elétrons nas reações bioquímicas redox, podendo ser parcialmente transformados ou mineralizados (MESQUITA, 2004). Devido a maior quantidade de energia produzida durante o processo de respiração aeróbia, o oxigênio é o receptor de elétrons final, quando presente. Quando o oxigênio livre se torna limitante, os microrganismos passam a usar o oxigênio proveniente do nitrato (NO 3 ) e depois continuam a usar outras formas de oxigênio que estejam presentes na região (SO4-2 ). As formas oxidadas de ferro e manganês (Fe +3 e Mn +4 ) também podem ser utilizadas como receptores de elétrons. As formas reduzidas de manganês e ferro (Mn +2 e Fe +2 ) são capazes de capturar o oxigênio, tornando possível o desenvolvimento de microrganismos anaeróbios estritos, como os sulfato-redutores e os metanogênicos (MESQUITA, 2004). Na matriz do solo, o oxigênio está presente nos vazios dos poros. O solo pode vir a ficar deficiente de oxigênio, ou anóxico, devido às dificuldades de difusão do O2, quando os poros são preenchidos por água. Em geral, é necessário um mínimo de 10% de ar na matriz do solo, para manter a atividade aeróbia. O aumento do nível de oxigênio no solo pode ser obtido, evitando a saturação com água. Para garantir a quantidade de oxigênio necessário para manter o crescimento aeróbio, podem ser usadas técnicas de injeção de ar ou peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ). O uso de peróxido é limitado, porque em concentrações acima de 100 ppm ele se torna tóxico aos microrganismos. Outro problema é que o peróxido tende a se decompor rapidamente na presença de alguns componentes do solo (MESQUITA, 2004): H 2 O 2 O 2 + H 2 O Condições anaeróbias podem ser usadas para degradar compostos clorados tóxicos aos microrganismos aeróbios - embora a taxa de degradação seja muito baixa. Após a etapa anaeróbia, pode ser implementado o tratamento aeróbio para completar a degradação do composto parcial ou totalmente clorado, assim como outros contaminantes presentes (MESQUITA, 2004).

24 Nutrientes Os nutrientes necessários, em ordem decrescente, para o crescimento celular são: nitrogênio, fósforo, potássio, enxofre, magnésio, cálcio, manganês, ferro, zinco, cobre e elementos traço. Se os nutrientes não estão disponíveis em quantidade suficiente, a atividade microbiana ficará limitada (MESQUITA, 2005). O nitrogênio pode estar presente no solo sob as formas inorgânicas e orgânicas. A forma inorgânica do nitrogênio no solo inclui amônia, nitrato, nitrito e óxido nitroso. As formas orgânicas ocorrem como aminoácidos ou proteínas. Em geral, a forma preferida pelos microrganismos é a amônia. Quando outras formas de nitrogênio estão presentes, elas são convertidas em amônia, para depois serem assimiladas. O fósforo é freqüentemente limitado devido a sua baixa solubilidade. Em solos orgânicos, o fósforo é encontrado no húmus, enquanto a fração inorgânica ocorre em várias combinações com ferro, alumínio, cálcio e flúor. Os compostos inorgânicos são normalmente pouco solúveis em água. Os fosfatos reagem com as argilas formando complexos insolúveis de complexos argilo-fosfatados. As formas mais comuns de fosfato no solo são (H2PO4)- e (HPO4) 2. Em solos ácidos, o fosfato precipita na forma de fosfato de alumínio e ferro, enquanto em solos neutros ou alcalinos ele é precipitado na forma de fosfato de cálcio. De maneira geral, o fosfato é solúvel em solos cujo ph vai de 5,5 a 7,0 (MESQUITA, 2005) Água A água funciona como veículo de transporte no qual matéria orgânica e nutrientes atravessam a parede celular dos microrganismos e leva os sub produtos do metabolismo para fora da célula. O excesso de água pode ser limitante por inibir a passagem de oxigênio pelo solo, a não ser que se esteja querendo trabalhar em condições anaeróbias. A água está presente no solo sob três formas: livre, capilar e higroscópica. A água livre é aquela que pode se mover livremente através do solo. Ela pode deslocar o oxigênio da matriz do solo, desenvolvendo condições anóxicas. Em sítios contaminados, o movimento dessa água é o principal responsável pelo

25 24 transporte de materiais para camadas inferiores de solo, podendo até chegar ao aquífero. A água capilar é aquela presente nos poros da matriz do solo quando o solo não está saturado. Essa água é a que está disponível para os microrganismos. A água higroscópica representa a água que está interagindo com a superfície da matriz do solo. Essa água é extremamente difícil de ser removida do solo e geralmente não está biologicamente disponível (MESQUITA, 2004) ph A solubilidade dos nutrientes e a atividade microbiana estão diretamente ligadas ao ph do solo. A biodegradação de um contaminante por bactérias heterotróficas é tipicamente acelerada no ph neutro ou próximo dele. Podemos encontrar valores de ph do solo que vão desde 2.5 (áreas de mineração) a 11 (desertos alcalinos). Os valores de ph do solo, em geral, são ácidos, assim em muitos projetos de biorremediação, existe a necessidade de neutralizar a acidez do solo de modo a elevar o ph próximo à neutralidade. A técnica mais usada para elevar o ph do solo é a adição de cal. A quantidade da cal necessária não é determinada somente pelo ph do solo. É preciso levar em consideração outros fatores como: textura, quantidade de matéria orgânica e capacidade de troca catiônica. Os dois fatores mais influenciam na diversidade microbiana, em geral, são o ph e a capacidade de tamponamento do solo (MESQUITA, 2004) Temperatura A atividade microbiana está diretamente relacionada com a temperatura. As taxas de reações metabólicas aumentam com aumento de temperatura, sendo que a faixa ótima se situa entre 20 e 30ºC. A temperatura também está relacionada com a diminuição do contaminante pelo processo de evaporação. A solubilidade dos contaminantes aumenta com o aumento de temperatura, e a solubilidade do oxigênio diminui com o aumento de temperatura (MESQUITA, 2004).

26 Solo A textura do solo afeta a permeabilidade, a umidade, e a densidade. A textura do solo deve ser levada em consideração. Para garantir que a adição de oxigênio, a distribuição de nutrientes e que a umidade sejam mantidas de maneira efetiva. Por exemplo, solos argilosos são difíceis de aerar e resultam numa baixa concentração de oxigênio, dificultando a distribuição e homogeneização dos nutrientes. Esse tipo de solo também é capaz de reter água por longos períodos de tempo após a precipitação. Durante um longo período de chuvas a umidade do solo ficará maior que a necessária ao tratamento. Por outro lado, durante o período de seca a umidade ficará abaixo da faixa ótima para o crescimento microbiano. Em geral, a biodegradação de contaminantes no solo é otimizada quando a umidade do solo está entre 50 e 75% da capacidade de campo. É importante enfatizar que os níveis de umidade devem estar relacionados à capacidade de campo e não ao percentual de água no solo. Se esse fato não for observado, estarão sendo utilizados níveis excessivos de água no solo, reduzindo assim, o nível de oxigênio disponível (MESQUITA, 2004). 3.2 Biodegradação de HPAs Desde a década de 1970, pesquisadores vêm demonstrando que bactérias, fungos e algas possuem atividades catabólicas que podem ser utilizadas na remediação de áreas contaminadas por HPAs (MESQUITA, 2004). Atualmente, a biorremediação tem demonstrado ser efetiva na mitigação de solos contaminados com HPAs de baixo peso molecular. Embora a falta de atividade microbiológica para HPAs de alto peso molecular seja atribuída a fatores específicos de campo, como biodisponibilidade do contaminante, nutriente, potencial redox, etc., o fator limitante pode ser a falta de microrganismos capazes de degradar os compostos com mais de quatro anéis aromáticos. Embora exista uma grande diversidade de organismos capazes de degradar HPAs de baixo peso molecular,

27 26 como naftaleno, acenafteno e fenantreno, apenas poucos gêneros são capazes de degradar HPAs de alto peso molecular como o b[a]pireno (MESQUITA, 2004). Acredita-se que as bactérias oxidem preferencialmente hidrocarbonetos aromáticos que vão do benzeno ao benzo[a]pireno. No processo oxidativo são gerados cis-dihidrodióis pelo processo de incorporação de átomos de oxigênio ao anel aromático tendo as dioxigenases como catalisador. Os cis-dihidrodióis são rearomatizados pela ação da enzima cis-diidrodiol desidrogenase. Em seguida, o cis-diidrodiol é oxidado a catecol, que é substrato para outras dioxigenases que levam à quebra do anel aromático. O caminho oxidativo orto envolve a quebra entre os átomos de carbono dos dois grupos hidroxílicos, formando o ácido cis,cismucônico. No caminho oxidativo meta quebra a ligação entre o carbono hidroxilado e o carbono adjacente, formando o 2-hidroximucônico semialdeído (MESQUITA, 2004). O produto final desse processo de degradação resulta na produção de succinato, CoA (Coenzima A), ácidos pirúvico e acético, e aldeídos, todos eles utilizados por microrganismos na síntese de constituintes celulares e energia (Ciclo do Ácido Tricarboxílico). Os subprodutos dessas reações são CO 2 e água. Uma vez que o primeiro anel aromático hidroxilado do HPA é degradado (ácido pirúvico e CO 2 ), o segundo anel é enzimaticamente processado da mesma maneira. Contudo, muitas moléculas de alto peso molecular (benzo[a]pireno) são degradadas com dificuldade, devido a baixa solubilidade, grande energia de ressonância e toxicidade (MESQUITA, 2004).

28 27 4 BIORREMEDIAÇÃO A técnica de biorremediação consiste no emprego de microrganismos, com ajuda de fatores ambientais, visando a degradação de compostos tóxicos em produtos neutros que não irão agredir o meio ambiente (MESQUITA, 2004). Esta técnica vem sendo usada há vários séculos em processos de compostagem de resíduos orgânicos, para produzir condicionadores de solo ou adubo. Desde a década de 1940 esse processo, como técnica de degradação de contaminantes orgânicos, vem sendo usado na industria de petróleo para tratar resíduos do processo de refino (MESQUITA, 2004). O processo de biorremediação pode ser executado ex situ (i.e. land-farming, bio-pilha, bio-reatores) ou in situ. No processo ex situ o material removido (solos escavados, efluentes, sólidos) é tratado em sistema aberto ou fechado, utilizando microrganismos na degradação do contaminante. Uma das alternativas é a disposição do solo contaminado em células ou em áreas abertas para a dispersão de nutrientes e microrganismos, além da aeração do sistema. Os principais gastos com o sistema são: escavação e remoção do material contaminado, área para disposição do solo contaminado, análises químicas periódicas para avaliação do método, eficiência do método de oxigenação do sistema (MESQUITA, 2004). O processo in situ tem como objetivo criar um ambiente favorável ao crescimento e desenvolvimento de microrganismos capazes de degradar o contaminante no local. O processo envolve projeto e instalação de sistemas de suprimento de nutrientes, microrganismos (no caso da bioaumentação) e oxigênio (para estimular processos aeróbios) ou nitrogênio (para processos anaeróbios) em subsuperfície (MESQUITA, 2004). A água doce e do mar, solo e efluentes domésticos possuem grande quantidade e diversidade de comunidades microbianas que demonstram capacidade de degradar moléculas xenobióticas. Embora a capacidade de degradação de um organismo ou consórcio seja necessária, a sua mera existência não é o suficiente. Além disso, as condições devem auxiliar a degradação de modo a aumentar a eficiência do processo (MESQUITA, 2004). Quando o tempo e as condições são favoráveis, mesmo que originalmente não exista nenhuma via metabólica, é possível degradar um composto orgânico sintético

29 28 ou xenobiótico. Por outro lado, células bacterianas tendem a limitar a quantidade de códigos genéticos às necessidades presentes, mas a capacidade genética de certas bactérias é ampla e essa característica confere uma vantagem seletiva quando ocorrem mudanças nas condições ambientais, ou por conferir melhor velocidade de crescimento pela bactéria portadora, ou por transferir esse código genético as outras bactérias - através de plasmídeos (MESQUITA, 2004). Existem, no mínimo, quatro vias diferentes que resultam em uma bactéria capaz de degradar certo composto ou grupo de compostos em um determinado sítio (MESQUITA, 2004): a) A microbiota natural ser exposta à molécula xenobiótica por tempo suficiente de forma a expressar mudanças nos genes capazes de codificarem enzimas para degradação de um composto. Esse tipo de evolução ocorre a todo o momento, mas é relativamente lenta. Como conseqüência, a comunidade microbiana passa a ter as vias degradativas, mas a degradação pode ser insuficiente devido ao número reduzido de células ou à baixa atividade; b) A microbiota natural que está adaptada às condições locais, é exposta a moléculas xenobióticas. Com o tempo as bactérias trocam genes com capacidade degradativa com outras células bacterianas próximas. Assim, a transferência genética pode ser feita por conjugação, transdução ou transformação. Do ponto de vista da biorremediação, esse tipo de evolução é relativamente lento, mas pode ser melhorado; c) Como o item 2, a microbiota natural pode ser equipada com a capacidade degradativa. Uma vez que o contaminante é conhecido, o grupo de genes pode ser introduzido. Se não houver nenhum gene natural, ele pode ser construído. As cepas de laboratório podem ser usadas como doadoras, tanto para transferir a capacidade para as cepas isoladas do sítio contaminado, ou por introdução de doadores no local e deixar a transferência ocorrer; d) Uma bactéria capaz de degradar o contaminante é isolada do sítio contaminado. Contudo, a cepa precisa ser capaz de competir com a microbiota natural do sítio a ser remediado. 4.1 Fatores ambientais que influenciam a biorremediação dos HPAs no solo

30 29 A biorremediação também pode ser limitada se as condições do solo não forem favoráveis à sobrevivência e à atividade dos microrganismos degradadores. A umidade do solo é considerada o fator ambiental mais crítico na biodegradação, pois uma alta atividade microbiana somente ocorrerá se houver adequada disponibilidade de aguá aos microrganismos. Além disso, o teor de água no solo tem relação inversa com a disponibilidade de oxigênio e, consequentemente, com a atividade dos microrganismos aeróbios, que são os principais responsáveis pela degradação dos HPAs (JACQUES et al, 2007). A temperatura afeta a atividade metabólica, o consumo de substrato pelos microrganismos e, por conseqüência, a biodegradação dos HPAs. Apesar de a biodegradação ocorrer numa ampla faixa de temperatura, as maiores taxas ocorrem entre 25ºC e 35ºC, sendo que, em temperaturas acima ou abaixo destas, há prejuízos para este processo. O ph do solo afeta diretamente a atividade dos microrganismos através dos efeitos dos íons H + na permeabilidade celular e na atividade enzimática, assim como, indiretamente, pela influência na disponibilidade de macro e micronutrientes e na solubilidade do alumínio e demais metais pesados, que podem ser tóxicos aos microrganismos(jacques et al., 2007).. Em ambientes naturais, o nutriente que normalmente limita o crescimento microbiano é o C, sendo que os nutrientes inorgânicos estão presentes em quantidades que normalmente excedem as demandas das comunidades microbianas. No entanto, a presença de elevadas concentrações de HPAs no solo com potencial para serem utilizadas como substrato para o crescimento dos microrganismos pode fazer com que outros nutrientes, que não o C, tornem-se limitantes. A relação de C:N:P: de 100:10:1 no solo a ser biorremediado tem sido normalmente recomendada. Entretanto, as pesquisas que avaliaram os efeitos da adição de N e P ao solo demonstraram resultados muito conflitantes, o que provavelmente se deve às especificidades de cada ambiente, no que se refere a teores de nutrientes no solo, tipo de contaminante e população microbiana envolvida (JACQUES et al., 2007). Outros nutrientes que poderiam influenciar a degradação dos HPAs no solo são o ferro e o enxofre, porque desempenham funções celulares que estão intimamente relacionadas ao metabolismo dos HPAs, como a participação na estrutura das enzimas que realizam a degradação destes compostos nas células microbianas.

31 30 Após revisão sobre os efeitos destes fatores ambientais na biodegradação dos HPAs, pode-se constar que a grande maioria dos pesquisadores recomenda que a adição de nutrientes deve ser realizada somente após a criteriosa avaliação, de forma a evitarem-se adições desnecessárias, que resultam em aumentos dos custos e em prejuízos ao processo de biorremediação. (JACQUES et al., 2007). Em vista da baixa solubilidade em água e da forte tendência de sorção dos HPAs à fase sólida do solo, a degradação desses compostos pode ser limitada devido a sua baixa biodisponibilidade aos microrganismos degradadores. O termo sorção é definido como o processo em que compostos químicos tornam-se associados à fase sólida. No solo, este processo ocorre porque os HPAs são apolares e sua permanência na fase líquida demanda que as moléculas de água rompam as pontes de H que estão estabelecidas com outras moléculas de água. Como esta reorganização tem um custo energético muito elevado, o composto apolar é forçado a deslocar-se na direção dos locais de maior hidrofobicidade, representados no solo pela matéria orgânica (MO) e pela superfície dos minerais (JACQUES et al., 2007).. A MO é a principal matriz hidrofóbica do solo, porque é constituída principalmente de átomos de C e de H, fazendo com que as pontes de H estejam limitadas a determinados locais de uma estrutura. Além disso, por se encontrarem em um meio hidrofílico, que é o solo, as moléculas de MO tendem a expor suas superfícies com carga para o exterior e formar espaços hidrofílicos em seu interior, nos quais os compostos apolares podem penetrar. O conteúdo de MO é a característica do solo que mais influencia a sorção dos HPAs, sendo que vários autores demonstraram relações lineares positivas entre o conteúdo de C orgânico do solo e a capacidade de sorção dos HPAs (JACQUES et al., 2007).. Em vista de que a composição da fase sólida do solo determina a sua capacidade de sorção de HPAs, é de se esperar que solos com diferentes conteúdos de MO e composições mineralógicas apresentem biodisponibilidade desses compostos aos microrganismos degradadores do solo (JACQUES et al., 2007).

32 31 5 MICROBIOLOGIA Durante as últimas décadas, os microrganismos têm surgido como parte do eixo principal das ciências biológicas. Entre as razões para isto, está o conceito de umidade em bioquímica, que significa que muitos dos processos bioquímicos que ocorrem em microrganismos são essencialmente os mesmos em todas as formas de vida, inclusive o homem, e a descoberta de que toda informação genética de todos os organismos, dos microrganismos a seres humanos, é codificada pelo DNA. Em virtude da relativa simplicidade em realizar experimentos com microrganismos, associada à rápida velocidade de crescimento e de sua variedade de atividades bioquímicas, os microrganismos tornam-se o modelo experimental de estudo. (RELCZAR JR; CHAN; KRIEG, 1997). Toda a matéria, organismos vivos contêm átomos e moléculas como suas unidades estruturais básicas. A forma como estes átomos e moléculas interagem determina as qualidades fundamentais dos compostos, tais como solubilidade e acidez. Tais aspectos da química também são de grande importância para os microrganismos, que dependem de nutrientes solúveis e são afetados por seus ambientes. As substâncias químicas importantes nos organismos vivos são baseadas em elementos contendo nucléicos. Os processos bioquímicos dependem de substâncias especiais denominadas enzimas, que podem aumentar significativamente a velocidade na qual uma reação específica ocorre. (RELCZAR JR; CHAN; KRIEG, 1997). Por meio do equilíbrio entre produção e utilização de milhares de substâncias químicas, cada microrganismo pode regular e mesmo contribuir para seu ambiente. (RELCZAR JR; CHAN; KRIEG, 1997). 5.1 Microbiologia do solo Bilhões de organismos, tanto microscópicos como grandes insetos e minhocas, formam uma comunidade viva e vibrante no solo.um solo típico tem milhões de bactérias em cada grama. A população é maior nos poucos centímetros do topo do

33 32 solo e declina rapidamente com a profundidade. Os organismos mais numerosos no solo são as bactérias. Embora os actinomicetos sejam bactérias, eles são estudados separadamente. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005) Populações de bactérias do solo são geralmente estimadas utilizando-se contagem em placas em meio nutriente e os números atuais são provavelmente subestimados por este método. Nenhum único meio nutriente ou condição de crescimento pode encontrar todos os nutrientes e outras exigências necessárias para todos os microrganismos do solo. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005) Podemos pensar em solo como um fogo biológico. Uma folha que cai de uma árvore é consumida por este fogo assim como sua matéria orgânica é metabolizada pelos micróbios do solo. Elementos da folha entram nos ciclos biogeoquímicos do carbono, nitrogênio e enxofre. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005) Considerando a evolução histórica do conceito de solo, mais adequado e mais abrangente, na atualidade pode ser: Solo: corpo natural da superfície terrestre, constituído de materiais minerais e orgânicos resultantes das interações dos fatores de formação (clima, organismos vivos, material de origem e relevo) através do tempo, contendo matéria viva e em parte modificada pela ação humana, capaz de sustentar plantas, de reter água, de armazenar e transformar resíduos e suportar edificações. (MATOS, 2006) O solo é formado por três fases: líquida (constituída de água, de minerais e de compostos orgânicos nela dissolvidos), formando a solução do solo, gasosa (os mesmos gases da atmosfera, porém, com diferentes proporções) e sólida. Esta última é composta de partículas minerais de várias formas, tamanhos e características químicas, raízes de plantas, populações de organismos macro e microscópicos vivos e com metabolismo ativo ou dormente, e matéria orgânica em vários estádios de decomposição. A característica estrutural dominante é formada por complexos de argila e matéria orgânica estabilizados em partículas de diferentes tamanhos (areia, silte e argila), formas e arranjos. De modo geral, a fase sólida representa em torno de 45% do volume total, o espaço poroso (fase líquida e gasosa) 50% e a matéria orgânica 5% (incluindo os organismos vivos). A proporção entre as três fases, porém, varia em função do tipo de solo e das condições ambientais. (MATOS, 2006).

34 33 O solo apresenta características e propriedades morfológicas, físicas e químicas e atividade biológica que são importantes para o seu estudo e compreensão. (MATOS, 2006). A fase aquosa (líquida) que ocupa o espaço poroso do solo constitui a solução do solo. É a parte de um sistema dinâmico e aberto, cuja composição é resultante de inúmeras reações que ocorrem com as outras fases que o constituem. A composição da solução do solo varia muito com o material de origem do solo, com o ph, com as condições de oxi-redução, com o teor de matéria orgânica, com a adição de produtos químicos (fertilizantes, inseticidas, fungicidas, herbicidas) e com seu manejo. Os elementos na solução do solo são influenciados por transformações bióticas e abióticas específicas que regulam os processos de adição e perda, assim como a biociclagem dos mesmos passando por diferentes formas no solo e absorção pela vegetação e microbiota. (MATOS, 2006). Na fração argila muitos fenômenos ocorrem, entre eles o da troca iônica. Existem duas cargas na natureza: positiva e negativa. A maioria dos solos na crosta terrestre apresenta maior número de cargas negativas do que o número de cargas positivas são solos eletronegativos. Essas cargas, que estão na superfície dos minerais de argila e da matéria orgânica são capazes de adsorver íons com cargas opostas (cátions): Ca 2+, Mg 2+, K +, H + e etc. Estes cátions adsorvidos podem ser substituídos, isto é, trocados uns pelos outros, fenômeno denominado de troca de cátions, enquanto que, ao conjunto das cargas negativas dá-se o nome de capacidade de troca catiônica - CTC ou T. (MATOS, 2006). O estudo da química do solo fornece informações que permitem caracterizar os processos químicos que nele ocorrem e são importantes para a agricultura e para o ambiente. (MATOS, 2006). A matéria orgânica, juntamente com os componentes inorgânicos da fase sólida, exerce um papel fundamental na química do solo. Ela é gerada a partir da decomposição de resíduos de plantas e animais, sendo formada por diversos compostos de carbono em vários graus de alteração e interação com as outras fases do solo (mineral, gasosa e solução). Apesar de compor menos de 5% na maioria dos solos, apresenta uma alta capacidade de interagir com outros componentes, alterando assim as propriedades químicas, físicas e biológicas do solo, as quais afetam o crescimento e desenvolvimento das plantas. É um componente bastante

35 34 sensível às condições ambientais e as mudanças nas práticas de manejo agrícola, por isso esta deve ser levada em consideração na avaliação do potencial produtivo do solo e na escolha das práticas de manejo a serem empregadas. (MATOS, 2006). 5.2 Crescimento Microbiano Quando falamos em crescimento microbiano nos referimos ao número e não ao tamanho das células. Os microrganismos em crescimento estão aumentando seu número e se acumulando em colônias que contêm milhares de células ou populações que agrupam milhares de células. (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005) Populações microbianas, durante um período de tempo muito curto, podem-se tornar muito grandes. Por meio de entendimento das condições necessárias para o crescimento microbiano podemos determinar como controlar o crescimento dos microrganismos patogênicos ou daqueles que contaminam e degradam os alimentos. Os fatores necessários para o crescimento microbiano podem ser divididos em duas categorias principais: físicos e químicos. 5.3 Microrganismos degradadores de HPAs Para que um microrganismo utilize estes compostos como fonte de C e energia para seu crescimento, é necessário que possua as várias enzimas que transformam as complexas moléculas dos HPAs em intermediários comuns das suas rotas catabólicas. Várias vias metabólicas de degradação dos HPAs já foram identificadas em diferentes microorganismos, porém as mais estudadas são as do metabolismo aeróbico realizado pelas bactérias, pelos fungos lignolíticos e pelos fungos nãolignilíticos. No metabolismo bacteriano, a oxigenação inicial dos HPAs é realizada por uma enzima intracelular dioxigenase, que tem função de reconhecer o HPA e adicionar dois átomos de oxigênio, quebrando a estabilidade devido à ressonância

36 35 do anel aromático. Após sucessivas oxidações, o último anel aromático é transformado em um dos intermediários centrais da via de degradação dos HPAs, que pode ser catecol, o protocatecol ou o gentisato. Até aqui atuaram as enzimas denominadas de periféricas, que têm a função de reconhecer as moléculas dos HPAs e convertê-las nestes intermediários centrais. A partir de então, atuam as denominadas enzimas de fissão, que converterão os intermediários centrais em compostos que possam ser utilizados nas vias comuns de geração de carbono e energia de bactéria. As enzimas de fissão podem ser divididas em dois grupos, conforme o local da clivagem no intermediário central: as enzimas de fissão podem ser divididas em dois grupos, conforme o local da clivagem no intermediário central: as enzimas intradiol abrem o anel aromático por via orto, originando o cis-mucanato, que, por passos sucessivos, será convertido em succinato e acetil-coenzima; e as enzimas extradiol fazem a abertura do anel aromático por via meta, originando o semialdeído 2-hidroximucônico, que, por passos sucessivos, será transformado em ácido pirúvico e acetaldeído (JACQUES et al., 2007). Devido ao grande número de enzimas envolvidas na degradação destes compostos, a maioria dos microrganismos do solo não possui a capacidade de degradar os HPAs, justificando a necessidade de se isolar e selecionar microrganismos degradadores, visando a sua utilização na biorremediação de solos contaminados. Desde a década de 1950, vêm sendo isoladas bactérias degradadoras destes compostos, pertencentes principalmente aos gêneros Pseudonomas, Aeromonas, Beijerinckia, Flavobacterium, Nocardia, Corynebacterium, Sphingomonas, Mycobacterium, Stenotrophomonas, Paracoccus, Burkholderia, Microbacterium, Gordonia, dentre outros. No entanto, nos últimos anos, tem sido dada atenção à obtenção de consórcios microbianos, que, comparativamente às culturas puras, têm-se mostrado mais efetivos na degradação destes compostos. Estes consórcios apresentam maior capacidade de utilização de um grande número de HPAs como fonte de C e, principalmente, podem mineralizar completamente estes compostos, devido à complementaridade metabólica entre os membros do consórcio, em que os HPAs seriam transformados em CO 2 e água através da ação de mais de um microrganismo. Estudando um consórcio bacteriano degradador de óleo diesel no solo, verificaram que, dos sete membros deste consórcio, quatro não utilizavam diretamente o óleo como fonte de carbono e energia; no entanto, a presença destes aumentava a produção de CO 2 pelo

37 36 consumo de intermediários produzidos pelos demais membros (RICHARD ; VOGUEL, 1999 ). 5.4 Bactérias do solo As bactérias são organismos procariontes, de tamanhos que variam entre 0,2 a 2,0 µm de diâmetro e 2 a 8 µm de comprimento. As formas mais comuns de procariotos são cocos, espirilos e bacillus que podem apresentar alterações em função das condições ambientais. As bactérias podem ser gram-positivas quando apresentam na sua parede celular peptideoglicano, polissacarídeos e ácido teióico.(santos, 2006) Nas bactérias gram-negativas há uma membrana externa permeável a moléculas de polissacarídeo e lipopolissacarídeo. O peptideoglicano é bastante poroso e circundado por lipoproteínas e pela membrama plasmática. A dispersão do material genético pelo citoplasma, cromossomos circulares e reprodução geralmente por fissão binária são características genéticas que os diferenciam dos eucariotos. As bactérias mostram uma grande capacidade e diversidade no que se refere à colonização de ambientes adversos. (SANTOS, 2006). O número de bactérias normalmente é maior que os fungos e actinomicetos do solo, representando entre 25 e 30% de biomassa microbiana. A população destes grupos é maior na superfície do solo declinando com a profundidade. Os microrganismos que vivem nos horizontes superfíciais do solo são os mais envolvidos na formação do solo, no ciclo biogeoquímico dos nutrientes e na regulação do fluxo da água. Assim, a microbiota dos horizontes superficiais é responsável pelo funcionamento ecológico do solo, possuindo um importante papel nas atividades de decomposição e transformação de nutrientes. (SANTOS, 2006). Processos de redução de metais como cromo, cobre, urânio e ferro com a presença de bactérias do solo são possíveis. A redução de Fe (III) e Mn (IV) é possível porque estes organismos usam esses metais em seus processos metabólicos como aceptores finais de elétrons. (SANTOS, 2006). Bactérias termofílicas Sulfolobus acidocaldarius (Darland) exibem habilidade em reduzir o Fe (III) em estudos de cultura pura. Resultados positivos também foram

38 37 encontrados em gêneros Termoanaerobacter, Anaerobranca e Sulfobacillus. Estudos com Ni mostram que a concentração do metal extraído aumentou de 2,2 mg kg-1 para 2,6 mg kg-1 quando o solo foi incubado com Microbacterium arabinagalactanolyticum.( SANTOS, 2006). A produção de sideróforos é bastante estimulada na presença de metais pesados, alterando a biodisponibilidade dos metais para o solo e para plantas. Trabalhos com Azotobacter vinelandii Lipman em presença de Zn (II) e Pseudomonas aeruginosa mostraram aumento na produção de sideróforos. (SANTOS, 2006) Bacillus spp Bactérias do gênero Bacillus subtilis são gram-positivas e podem ser aeróbias, facultativas ou anaeróbias. São resistentes ao calor e a outros agentes destrutivos. Podem oxidar uma ampla faixa de compostos orgânicos e em alguns casos são fermentativas. A maioria delas tem exigências nutricionais simples, requerendo no máximo alguns aminoácidos ou vitaminas B como fatores de crescimento. Formam endósporos característica que as coloca entre os esporulados e apresentam a habilidade de produzir antibiótico. A formação de endósporos aumenta a resistência aos fatores adversos. Dessa forma, podem ser armazenados, como inoculantes, por um período mais longo, e possuem maior tempo de permanência no solo, além da facilidade de aplicação. (FREITAS; PIZZINATTO, 1997). A seguir a figura 3 apresenta os bacillus spp.

39 38 Figura 3: Bacillus spp Fonte: Lancaster city council, Pseudonomas spp O gênero Pseudomonas são bactérias gram-negativas e produzem um pigmento verde-amarelado fluorescente em meio B, observado sob luz com comprimento de onda próximo do ultravioleta. Esses organismos podem ser encontrados na água e no solo. As espécies mais importantes desse grupo são Pseudomonas fluorescens e Pseudomonas putida, geralmente estudadas com o objetivo de avaliar a promoção de crescimento em plantas, e P. aeruginosa, considerada patogênica a animais. (KING et al, 2003). A diversidade metabólica de bactérias do grupo fluorescente do gênero Pseudomonas dá a essas bactérias uma grande habilidade para adaptação a vários ambientes, tais como solo e rizosfera. (KING et al., 2003). A figura 4 apresenta a morfologia típica do gênero Pseudonomas.

40 39 Figura 4: Pseudonomas spp Fonte: Bioweb, Serratia marcescens Serratia é um gênero de bactéria gram-negativa, anaeróbia facultativa. É um bacilo da família Enterobacteriaceae cuja espécie mais comum é a S. marcescens, que normalmente causa infecção nosocomial. Porém, existem relatos de cepas de S. plymuthica, S. liquefaciens, S. rubidaea e S. Odorifera e que causaram doenças. Membros deste gênero produzem pigmento vermelho característico e podem ser distinguidos de outros gêneros pertencentes á família das Enterobacteriaceae pela produção de três enzimas: DNase, lipase e gelatinase.(aní, 2007). Em hospitais, espécies do gênero Serratia tendem a colonizar o trato respiratorio e urinário ao invés do gastrointestinal, em adultos. Infecções por Serratia são responsáveis por aproximadamente 2% das infecções nosocomiais no trato respiratório baixo, trato urinário, sangue, feridas cirúrgicas, pele e mucosas em pacientes adultos. (ANÍ, 2007). A figura 5 a seguir apresenta a morfologia do gênero Serratia.

41 40 Figura 5: Serratia marcescens Fonte: Comons, Fungos do solo Os fungos podem ser classificados na Divisão Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basiomycota e Deuteromycota. Os gêneros Mucor, Rhizopus, Aspergillus, Trichoderma, Penicillium, Fusarium,Pythium, Verticillium e Alternaria são fungos tidos considerados os mais comuns encontrados no solo. (SANTOS, 2006). Os eucariontes apresentam características distintas como a organização do seu material genético dentro do núcleo, presença de organelas citoplasmáticas e divisão do corpo por mitos. Ao contrário dos procariotos, estes não apresentam a capacidade de usar compostos inorgânicos e de fixar nitrogênio atmosférico. Mesmo não sendo um grupo predominante no solo, os fungos representam entre 70 e 80% da biomassa microbiana do solo e sua ocorrência está condicionada a fatores como ph, umidade e quantidade de matéria orgânica. (SANTOS, 2006). Os fungos apresentam grande capacidade de adaptação à presença de metais pesados no solo. Este mecanismo pode ser explicado por mutações genéticas e adaptações fisiológicas dos fungos em contato com o metal pois a capacidade de um organismo sobreviver em condições adversas depende da rapidez de suas respostas fisiológicas as condições ambientais. (SANTOS, 2006). A capacidade de biossorção dos fungos se aplica aos metais pesados. Testes

42 41 contando o número de unidades formadoras de colônias (UFC) mostraram um aumento de 21% na dose de 200 mg Cu L -1 quando comparado ao tratamento controle. Resultados encontrados pelo mesmo autor relatam um crescimento de 24% dosfungos em solos poluídos com Zn quando comparados com o tratamento controle onde o crescimento mostrado foi de 4,5%. (SANTOS, 2006) Os fungos podem ser sensíveis a compostos radioativos e defensivos agrícolas. Fusarium oxysporum apresenta alterações na presença de herbicidas da classe das triazinas, mostrando diferenças na pigmentação e na velocidade de crescimento quando colocado na presença de diferentes concentrações de herbicidas. (SANTOS, 2006). Os processos de agregação do solo, decomposição de resíduos orgânicos, mineralização de nutrientes, controle de pragas, doenças e estabelecimento de relações simbióticas são realizados com a participação efetiva dos fungos. Participam também de processos de degradação de pesticidas e podem servir como compartimentalizadores de metais pesados do solo, diminuindo a sua toxidez para ambiente. (SANTOS, 2006) Candida albicans Candida albicans é uma espécie de fungo diplóide que causa, oportunamente, alguns tipos de infecção oral e vaginal nos seres humanos. As infecções causadas por fungos emergiram como uma das principais causas de morte em pacientes com algum tipo de imunodeficiência (como é o que caso dos portadores da AIDS e das pessoas que estão passando por algum tipo de quimioterapia). Além disso, esse fungo pode ser perigoso para pacientes cuja saúde já esteja enfraquecida, como por exemplo os pacientes de uma unidade de tratamento intensivo. Devido a estes fatores, a Candida albicans tem despertado grande interesse das pesquisas na área de saúde e da medicina. (KUNAMOTO et al, 2005) A Candida albicans está entre os muitos organismos que vivem na boca e no sistema digestivo humano. Sob circunstâncias normais, a Candida albicans pode ser encontrada em 80% da população humana sem que isso implique em quaisquer

43 42 efeitos prejudiciais a sua saúde, embora o excesso resulte em candidiase. (KUNAMOTO et al., 2005) A virulência e patogenicidade da Candida albicans estão ligadas a diversos factores, sendo a formação de hifas, a estrutura da sua superfície celular (que, durante o contacto com células do hospedeiro, se adapta, sendo determinante para uma eficaz adesão e penetração), alterações fenotipicas (transição espontânea entre a forma típica de levedura, branca e circular, e uma forma opaca, em forma de pequenos bastões) e produção de enzimas extracelulares hidroliticas os mais estudados ao longo dos últimos anos. (KUNAMOTO et al, 2005) A patogenicidade da Candida albicans não pode ser atribuída a apenas um factor isolado; é da produção concomitante dos diversos factores que este organismo se transforma numa célula adaptada à invasão dos tecidos de um hospedeiro imunodeprimido. Como forma de resistência, tem capacidade de se multiplicar unicelularmente por gemulação. Na presença de compostos que induzem à sua patogenicidade, e.g. soro de mamíferos, a Candida albicans expressa os seus factores de virulência, tal como a formação de hifas; estas capacitam a célula para exercer força mecânica, ajudando na sua penetração nas superfícies epiteliais, e uma vez na corrente sanguínea, têm uma acção danosa sobre o endotélio, o que permite que a Candida albicans invada os tecidos profundos do organismo (em casos mais graves, a invasão dos tecidos hepático e pancreático). (KUNAMOTO et al., 2005) Em determinadas condições a Candida albicans desenvolve-se como uma pseudo-hifa, que se caracteriza por uma célula alongada que se propaga por uma gemulação unipolar, apresentando um aspecto de um cordão de contas. (KUNAMOTO et al, 2005). A figura 6 a seguir apresenta a morfologia do gênero Candida.

44 43 Figura 6: Candida albicans Fonte: Curiosidades de microbiologia, Metabolismo microbiano na presença de HPAs Várias vias metabólicas de degradação dos HAPs já foram identificadas em diferentes microrganismos, porém as mais estudadas são do metabolismo aeróbico realizado pelas bactérias, pelos fungos lignolíticos e pelos fungos não-lignilíticos. No metabolismo bacteriano dos HAPs, a oxigenação inicial é realizada por uma enzima intracelular dioxigenase que tem a função de reconhecer o HAP e adicionar dois átomos de oxigênio, quebrando a estabilidade devido a ressonância do anel aromático. Esta importante enzima do ciclo biogeoquímico do carbono no planeta é constituída de três componentes, uma oxigenase terminal, uma ferredoxina e uma ferredoxina redutase dependente de NADPH, que, conjuntamente, formam uma cadeia curta de transporte de elétrons. Um cis-diidrodiol é o produto da dioxigenase, que por ação de uma desidrogenase será transformado em um composto diidroxilado. Subseqüentes oxidações permitem a aber tura de um anel aromático e a formação de ácido pirúvico, que será utilizado para a produção de carbono e energia pela célula. A molécula com o anel fechado será transformada em um dos intermediários centrais da via de degradação dos HAPs, que pode ser o catecol, o protocatecol ou o gentisato.(jaques et al., 2005).

45 44 Até aqui atuaram as enzimas denominadas de periféricas, que tem a função de reconhecer as moléculas dos HAPs e convertê-las nestes intermediários centrais. A partir de então, atuam as denominadas enzimas de fissão, que converterão os intermediários centrais em compostos que possam ser utilizados nas vias comuns de geração de carbono e energia da bactéria. As enzimas de fissão podem ser divididas em dois grupos, conforme o local da clivagem no intermediário central: as enzimas intradiol abrem o anel aromático por via orto, originando o cis-muconato, que por passos sucessivos será convertido em succinato e acetil-coenzima; e as enzimas extradiol fazem a abertura do anel aromático por via meta, originando o semialdeído 2-hidroximucônico que por passos sucessivos será transformado em ácido pirúvico e acetaldeído.(jaques et al., 2005). A possibilidade de utilização integral dessas vias bioquímicas permite a algumas bactérias crescerem utilizando os HAPs como única fonte de carbono e energia para o seu crescimento, resultando na degradação destes compostos e na sua eliminação do ambiente. isolaram três bactérias do gênero pseudomonas que degradaram em média 51% do antraceno presente no meio de cultura mineral. A utilização de HAPs marcados com 14C permitiu a comprovação da capacidade das bactérias em utilizar integralmente estas vias bioquímicas, conduzindo a mineralização destes compostos obtiveram mineralizações próximas a 100% quando o fenantreno foi utilizado como única fonte de carbono e energia por uma bactéria do gênero Sphingobium..(JAQUES et al., 2005). Os fungos também podem metabolizar os HAPs. As principais vias descritas na literatura são duas: a primeira está relacionada aos fungos não-lignolíticos e a segunda aos fungos lignolíticos. Para exemplificá-las utilizar-se-á as vias de degradação do fenantreno. O metabolismo dos HAPs do Cunninghamella elegans é bastante estudado entre os fungos não lignolíticos. Assim como em seres humanos, o citocromo P450 realiza a monoxigenação inicial do fenantreno em óxidos arenos (epóxidos), que, através das enzimas epóxido hidrolases, são transformados em trans-diidrodióis, ou um dos anéis pode ser rearranjado nãoenzimaticamente a fenol e ser conjugado, originando compostos como oglicosídeos e o-glicoronídeos. Os trans-diidrodióis são transformados por desidratação em fenantróis, que podem então ser convertidos em 9-fenantrilbeta-D-glicopiranosídeo, que se acredita ser um dos produtos finais da via de degradação dos fungos não-lignolíticos..(jaques et al., 2005).

46 45 Em vista da baixa solubilidade em água e forte tendência de sorção as partículas minerais e orgânicas, a degradação dos HAPs pode ser limitada devido a baixa biodisponibilidade destes compostos, uma vez que bactérias e fungos somente absorvem nutrientes que estejam em solução. Os microrganismos têm buscado superar esta limitação utilizando-se de mecanismos como a produção de biossurfactantes. Os surfactantes são compostos químicos que apresentam uma porção hidrofílica e uma porção hidrofóbica, fazendo com que se posicionem preferencialmente nas interfaces entre fases fluidas com diferentes graus de polaridade (como nas interfaces óleo/água ou ar/água). Uma das propriedades destas moléculas é a redução da energia interfacial (tensão interfacial) e da tensão superficial devido a formação de uma camada molecular ordenada na interface. Além disso, promovem a formação de microemulsões, onde os HAPs são incorporados no centro hidrofóbico das micelas e, desta forma, podem penetrar numa solução aquosa..(jaques et al., 2005). Os surfactantes utilizados na biorremediação podem ser produzidos industrialmente, a partir de derivados do petróleo, ou serem sintetizados biologicamente por microrganismos. A utilização de surfactantes biológicos (biossurfactantes) apresenta vantagens em relação aos industriais, como a menor toxicidade aos microrganismos degradadores, menor recalcitrância no ambiente, maior diversidade de estruturas químicas, atuação em uma gama maior de condições, dentre outros fatores..(jaques et al., 2005). Os biossurfactantes são sintetizados nas células microbianas e liberados para o meio; sua porção hidrofílica pode ser constituída de aminoácidos, peptídeos e sacarídeos e a porção hidrofóbica é normalmente formada por ácidos graxos saturados ou insaturados.adicionaram um biossurfactante ramnolipídeo produzido por Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 ao meio de cultura mineral e verificaram que a solubilidade do fenantreno aumentou de 0,7 mg L-1 para 35 mg L-1, o que resultou em um aumento significativo da biodegradação deste HPA obtiveram aumentos da biodegradação do tetradecano, pristano e hexadecano no solo, com a adição de um biossurfactante produzido por uma bactéria do gênero Pseudomonas. Observou reduções de 90, 85 e 74% nas concentrações de antraceno, fenantreno e pireno, respectivamente, após a adição ao solo de um biossurfactante. Estes relatos são exemplos das potencialidades da utilização de biossurfactantes visando

47 46 aumentar a biodisponibilidade e, conseqüentemente, a degradação dos HAPs no ambiente..(jaques et al., 2005).

48 47 6 CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA A ESPECTROSCOPIA DE MASSAS Cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (GCMS) é a combinação de duas técnicas poderosas: a cromatografia gasosa para maior eficiência na separação dos componentes em amostras complexas, e a espectrometria de massas para identificação destes componentes bem como para identificação de componentes desconhecidos.(niessen, 2001). 6.1 Cromatografia gasosa A cromatografia gasosa ou líquido/gasosa foi introduzida em 1952 por James e Martin. Sua operação básica é a volatilização e a transferência dos analitos para uma coluna cromatográfica, através de uma interface aquecida chamada de injetor. A coluna cromatográfica também é aquecida de forma controlada podendo criar rampas com temperaturas desejadas, e para movimentar a amostra dentro da coluna usa-se um gás inerte, como hélio ou nitrogênio, que é chamado de gás de arraste, o qual faz o papel da fase móvel. A aplicação desta técnica é ampla, contudo sua principal limitação deve-se ao fato de que os analitos devem ser voláteis e estáveis nas condições de análise (SOUZA, 2008). A identificação dos compostos utilizando apenas o sistema de cromatografia pelo seu tempo de eluição através da coluna era bastante difícil. A identificação muitas vezes tinha que ser feita posteriormente, através da coleta do analito, geralmente feita borbulhando o efluente da coluna em solvente ou então em condensadores apropriados (chamados de cold trap), para só então realizar a identificação por infravermelho ou por espectrometria de massas. Contudo não demorou muito para que as técnicas de cromatografia gasosa e de espectrometria de massas fossem acopladas, dando origem ao GC-MS. Um dos primeiros relatos (senão o primeiro) sobre esta interface entre o GC e o MS é de Gohlke (1959). Hoje em dia a técnica GC-MS é muito difundida, sendo que várias configurações podem ser encontradas. Uma das mais comuns é o GC-MS utilizando ionização eletrônica com detector do tipo ion trap (SOUZA, 2008).

49 Análise Quantitativa A CG quantitativa está baseada na comparação da altura ou da área de um pico analítico com aquele de um ou mais padrões. Se as condições são controladas adequadamente, ambos os parâmetros variam linearmente com a concentração. Portanto, considerando esse fato, a área é um parâmetro analítico mais satisfatório que a altura do pico. Contudo, as alturas de pico são medidas de forma mais fácil e, para os picos estreitos, mais exata. A maioria dos instrumentos cromatográficos modernos é equipada com computadores que fornecem medidas de áreas relativas. (HARRIS, 2005) Calibração com padrões O método mais direto de análise cromatográfica gasosa quantitativa envolve a preparação de uma série de soluções padrão cuja composição se aproxima daquela da amostra (método do padrão externo). Os cromatogramas para os padrões são obtidos e as alturas dos picos ou suas áreas são empregadas em um gráfico em função da concentração para se obter uma curva analítica. Um gráfico dos dados deve fornecer uma linha reta passando pela origem; as análises quantitativas são baseadas nesse gráfico. A calibração deve ser realizada sempre antes das determinações para maior exatidão (NIESSEN, 2001). Através da curva de calibração obtem-se uma regressão linear (y= a.x + b), onde teremos: Concentração do analito = (área do analito/área PI) x conc. PI + b Onde: PI: padrão interno b: é o valor onde a reta corta o eixo y

50 Método do padrão interno A maior precisão em CG quantitativa é obtida empregando-se padrões internos porque as incertezas introduzidas pela injeção da amostra, vazão e variações nas condições da coluna são minimizadas. Nesse procedimento, uma quantidade cuidadosamente medida de um padrão interno é introduzida em cada padrão de calibração e na amostra e a razão entre área do pico do analito (ou sua altura de pico) e a área do pico do padrão interno (ou sua altura) é utilizada como parâmetro analítico. Para que esse método seja bem-sucedido, é necessário que o pico do padrão interno seja bem separado dos picos dos outros componentes da amostra. Contudo, deve aparecer próximo ao pico do analito. Naturalmente, o padrão interno deve estar ausente na amostra a ser analisada. Empregando-se um padrão interno adequado, precisões relativas de 0,5% a 1% têm sido relatadas (NIESSEN, 2001). 6.3 Espectroscopia de massas Espectrometria de massas pode ser entendida como uma técnica analítica que permite a identificação da composição química de um determinado composto isolado, ou de diferentes compostos em misturas complexas, através da determinação de suas massas moleculares na forma iônica, (ou seja, com carga elétrica líquida, positiva ou negativa), baseada na sua movimentação através de um campo elétrico ou magnético. Esta movimentação é determinada pela razão entre a massa de um determinado composto (analito) e sua carga liquida, designada por m/z (mass to charge ratio). Assim, conhecendo o valor de m/z de uma molécula é possível inferir sua composição química elementar, e com isso determinar sua estrutura. A espectrometria de massas pode ser utilizada em análises quantitativas, mas é em análises qualitativas que ela tem se destacado, como na identificação de compostos em misturas e, principalmente, na caracterização estrutural de compostos desconhecidos, que pode ser alcançado através da formação de íonsmolécula e de seus respectivos íons-fragmentos (SOUZA, 2008).

51 50 Poderíamos considerar então que a espectrometria massas fornece informações precisas sobre a massa dos compostos analisados. Contudo devemos tomar muito cuidado com este tipo de conclusão! Na realidade um espectrômetro de massas fornece a massa obtida apenas de íons, entretanto nem todas as moléculas contêm grupos químicos naturalmente carregados. Tomemos como exemplo a glucose (Glc), uma molécula neutra, ou seja, sem carga líquida, que apresenta uma massa molecular nominal de 180 Da. Os procedimentos de ionização para uma molécula neutra como a Glc, envolvem a incorporação de adutores iônicos, sendo o mais comum o cátion Na+. Neste processo, o adutor interage ou mesmo participa de ligações coordenadas com o analito fornecendo a ele sua própria carga. Como conseqüência deste processo de ionização a massa iônica da glucose passa de 180 Da para 203 Da, ou em termos mais apropriados, seu íon pseudo-molecular tem m/z 203 [M+Na]+, no qual z sendo igual a 1 (um) é possível pela subtração do adutor conhecer a massa do composto original: m/z (Na+) = 180 Da. É desta forma que moléculas neutras podem ser analisadas por espectrometria de massas. Em outros processos de ionização dependendo das características químicas das moléculas a serem analisadas, pode se obter íons protonados, comuns em moléculas contendo grupamentos R-NH2, ou então íons desprotonados, como no caso de moléculas que apresentam grupamentos ácidos em suas estruturas. Nestes dois casos os íons são chamados de íons quasi-moleculares (SOUZA, 2008). A espectrometria de massas também é utilizada na determinação de razões isotópicas. Tomemos como exemplo a análise de uma amostra de NaCl. Em solução os íons Na+ e Cl- estarão dissociados, e quando analisados em modo de detecção de íons positivos, será obtido apenas um íon de m/z 23 referente ao Na+ (SOUZA,2008). Entretanto, quando analisamos esta mesma solução em modo de detecção de íons negativos veremos o aparecimento de dois íons, um de m/z 35 sendo este o íon base (aquele aparece representando 100%) e outro de m/z 37, que deverá representar cerca de 1/3 do íon base. Estes resultados devem-se à relação isotópica apresentada pelos íons analisados. Átomos de sódio são mono-isotópicos, com uma massa de 22,98977 m.u. (nominal de 23 m.u.). Já os íons cloreto apresentam dois isótopos, um com massa de 34, m.u. (nominal de 35 m.u., com abundância natural de cerca de 75%) e outro com massa de cerca de 36, m.u. (nominal de 37 m.u., com abundância natural de cerca de 25%) (SOUZA, 2008).

52 51 Moléculas orgânicas são formadas essencialmente por átomos de carbono e hidrogênio, e ambos contêm dois isótopos principais, no caso do carbono temos o isótopo leve 12C (~99%) e o pesado 13C (~1%), e para o hidrogênio temos o isótopo leve 1H (>99,9%) e o isótopo pesado 2H (<0,1%). Apesar de aparecerem em baixas concentrações naturais, moléculas contendo pelo menos 1 isótopo pesado podem representar grande parte das moléculas naturais. Moléculas contendo diferentes isótopos são designadas como isotopólogos (SOUZA, 2008).

53 52 7 MATERIAIS E MÉTODOS Os seguintes materiais foram utilizados na pesquisa: a) Solo As amostras de solos estudados no presente trabalho foram provenientes do Laboratório de Solo do Departamento de Análises de Solo da Faculdade de Agronomia da UFRGS, o mesmo é classificado como solo inerte, ou seja, sem presença de outros tipos de contaminantes. b) Vidrarias e equipamentos: Elermeyers de 500 ml para a incubação dos solos, eppendorf de 1 ml, micropipetadores automáticos (0,01-10 ml), placas de Petry, phmetro digital Multitec PG 1800, cápsulas de porcelana, estufa De léo, dessecador, bico de bunsen, autoclave Bio Eng A30, alça de platina, contador de colônias mecânico Phoenix CP 602, tubo plástico com tampa, balão de fundo redondo de 50 ml, funil, papel de filtro, ultra-som, rotaevaporador, mixer, vial 2 ml, cap, cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas autosampler Perkin Elmer e peneira de 2 mm. c) Reagentes: Foram utilizados água deionizada e destilada, bactérias Bacillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia marcescens, fungo Candida albicans, PCA (Plate Count Agar), benzo(a)pireno (padrão interno) da Dr Ehrenstorfer, cartucho de sílica, pentano grau HPLC, diclorometano grau HPLC da Tédia e ciplohexano grau HPLC da Tédia para preparo dos padrões. d) Análises: As análises de ph foram realizadas do laboratório de química da UNILASALLE, a incubação e contagem dos microrganismos foram realizadas no laboratório de microbiologia da UNILASALLE, a contaminação de benzo(a)pireno foi realizada no Laboratório de Análises Regulatórias do RPC Américas da Souza Cruz AS, juntamente com a preparação do solo para a incubação e as análises de benzo(a)pireno foram realizadas no laboratório particular ALAC.

54 Preparação e contaminação do solo A preparação do solo é muito importante para uma melhor eficiência na análise de cromatografia gasosa acoplada com massas. Nesta etapa inicial, todo o solo a ser utilizado em todas as análises foi peneirado com uma peneira de 2mm. A figura 7 apresenta o peneiramento do solo. Figura 7: Peneiramento do solo Fonte: Autoria própria, A contaminação do solo foi realizado com o contaminante Benzo(a)pireno (padrão interno). Colocou-se a quantidade total de solo em um recipiente plástico de 2L, pesou-se o padrão benzo(a)pireno e foi adicionado a uma concentração de 647µg/Kg, mexeu-se bem até total homogeneização, deixou-se repousar por 10 dias. 7.2 Medição e redução do ph A determinação do ph do solo é muito importante, pois o ph influencia no crescimento e metabolismo dos microrganismos. Foram adicionado 30 ml de água deionizada e destilada a um béquer contendo 30 g de solo, deixando-se repousar por 10 min. Agitou-se novamente e a

55 54 amostra ficou em repouso por 20 min. A figura 8 apresenta a amostra para leitura de ph. Figura 8: Preparo da amostra para medição do ph Fonte: Autoria própria, Após realizou-se a leitura do ph na solução sobrenadante. O ph normal do solo fica em torno de 6,5 à 7,5, porém alguns microorganismos apresentam um melhor comportamento com ph reduzido, entre 5,0 a 5,5. Foi realizado a redução do ph do solo. Colocou-se toda a quantidade do solo em um recipiente plástico de 2l. Pesou-se 100gr de nitrato de alumínio e adicionouse 100mL de água deionizada, homogeneizou-se a solução e foi adicionado no solo. Deixou-se repousar por 7 dias e foi repetido a medição do ph, o resultado apresentado foi de 5,25. A figura 9 apresenta o recipiente onde o solo ficou em repouso. Figura 9: Solo em repouso para a redução do ph Fonte: Autoria própria, 2010.

56 Planejamento fatorial Utilizamos a técnica de planejamento fatorial, que permite a combinação de todas as variáveis em todos os níveis, obtendo-se assim uma análise completa das variáveis. O planejamento fatorial é a melhor maneira de prever interação entre fatores. Foi realizado um planejamento fatorial do tipo 2k, isto é, dois níveis, com duas variáveis, gerando um 22, que é muito útil em investigações preliminares, quando queremos saber se determinados fatores têm ou não influência sobre a resposta e não estamos preocupados ainda em descrever muito rigorosamente essa possível influência. É um planejamento muito simples de executar, que depois podem ser ampliados para formar um planejamento mais sofisticado. No planejamento de qualquer experimento, a primeira coisa que devemos fazer é decidir quais são os fatores e as respostas de interesse. Os fatores, em geral, são as variáveis que o experimentador tem condições de controlar. Podem ser qualitativos, como o tipo de microrganismo, ou quantitativos, como a temperatura. (NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2007). As variáveis e níveis utilizados foram os seguintes: a) Temperatura de incubação: (32ºC e 37ºC); b) Colônias de microrganismos: (Consórcio 1: Pseudonomas e Bacillus, Consórcio 2: Serratia e Candida). Para fazer um planejamento fatorial completo, devemos realizar experimentos com todas as possíveis combinações dos níveis dos fatores: a) Consórcio 1 em temperatura de 32ºC; b) Consórcio 1 em temperatura de 37ºC; c) Consórcio 2 em temperatura de 32ºC; d) Consórcio 2 em temperatura de 37ºC. A lista dessas combinações, que é chamada de matriz de planejamento (NETO; SCARMINIO; BRUNS, 2007).

57 Preparação dos meios de cultura e inoculação dos microrganismos Os meios de cultura destinam-se ao cultivo artificial de microrganismos. Estes meios fornecem os princípios nutritivos indispensáveis ao seu crescimento. (NEDER, et al, 2000). Pesou-se 2,8g de caldo de BHI, adicionou-se 75mL de água deionizada em erlemeyer de 125mL. Tampou-se com papel de alumínio juntamente com papel pardo, com camada dupla. Colocou-se na autoclave à 120ºC. A figura 10 apresenta os meios de cultura. Figura 10: Meios de cultura Fonte: Autoria própria, A inoculação consiste em semear os microrganismo em meios de cultura adequados a suas exigencias bioquimicas e nutricionais, onde estarão submetidas à condições ideais de temperatura e oxigenação, obtendo assim reprodução dos mesmos. (NEDER et al., 2000). Colocou-se um fração de cada uma das colônias, Bacillus, Pseudonomas, Serratia e Candida, nos erlenmeyers contendo a solução preparada de meios de cultura, fechou-se com camada dupla de papel alumínio e papel pardo, logo após foi levado para a estufa à 32ºC, ficando em incubação por 3 dias. As figuras 11 e 12 apresentam o processo de inoculação.

58 57 Figura 11: Inoculação dos microrganismos Fonte: Autoria própria, Figura 12: Microrganismos inoculados Fonte: Autoria própria, Incubação dos microrganismos A seguir estão descritas as etapas que envolveram a incubação dos microrganismos Preparação dos frascos

59 58 Vinte e quatro erlenmeyers de 500mL foram lavados com água, sabão e água deionizada, para que não ocorresse nenhuma interferência com o meio externo. Após a lavagem, os frascos foram para aquecimento sob uma temperatura de 105ºC por um intervalo de 4 horas. Transcorrido o período de aquecimento na estufa, os frascos foram retirados e colocados num local e um ambiente adequado, para evitar contaminação com microrganismos presentes no ar Preparação das amostras Amostras de aproximadamente 60 g de solo contendo como contaminantes Benzo(a)pireno foram acrescentadas nos frascos. A quantidade de massa em cada frasco está indicada na tabela 2 a seguir. Tabela 2: Relação de frascos com massa de solo Frasco Massa solo 1 59,97g 2 59,98g 3 60,08g 4 59,97g 5 59,97g 6 59,95g 7 60,06g 8 59,97g 9 59,95g 10 60,15g 11 60,43g 12 60,40g 13 60,38g 14 59,97g 15 60,24g 16 60,67g 17 60,06g

60 ,13g 19 60,46g 20 59,90g 21 60,53g 22 60,06g 23 60,33g 24 60,45g Fonte: Autoria própria, A figura 13 a seguir ilustra o solo sendo pesado e colocado no frasco. Figura 13: Preparação das amostras Fonte: Autoria própria, Incubação Três espécies de bactérias foram usadas: Bacillus, Pseudonomas e Serratia, uma espécie de fundo: Candida. Foram divididas em dois consórcios: consórcio 1 e consórcio 2. Utilizamos as iniciais de cada microrganismo para identificação, segue abaixo: Bacillus B Pseudonomas P

61 60 Serratia S Cândida C. Os consórcios foram divididos da seguinte maneira: Consórcio 1: B&P Consórcio 2: S&C Os frascos foram divididos conforme a tabela 3 a seguir: Tabela 3: Relação de frascos com espécies de microrganismos Frasco Consórcio 1 Consórcio 1 2 Consórcio 1 3 Consórcio 1 4 Consórcio 1 5 Consórcio 1 6 Consórcio 1 7 Consórcio 2 8 Consórcio 2 9 Consórcio 2 10 Consórcio 2 11 Consórcio 2 12 Consórcio 2 13 Consórcio 1 14 Consórcio 1 15 Consórcio 1 16 Consórcio 1 17 Consórcio 1 18 Consórcio 1 19 Consórcio 2 20 Consórcio 2 21 Consórcio 2 22 Consórcio 2 23 Consórcio 2 24 Consórcio 2 Fonte: Autoria própria, 2010.

62 61 Foi acrescentado com uma pipeta automática 300 µl de cada consórcio nos respectivos frascos e estes foram fechados com camada dupla de papel alumínio e pardo, para não haver interação do meio externo com o interno, o que poderia interferir no resultado final do procedimento, logo após este procedimento os frascos foram levados para as estufas Incubação das amostras As amostras foram incubadas em duas temperaturas, com a finalidade de observar o comportamento bacteriano dos diferentes consórcios. A tabela 4 a seguir apresenta a relação dos consórcios, condição e frasco Tabela 4: Consórcios com relação à temperatura Frasco Consórcio Temperatura 1 Consórcio 1 37ºC 2 Consórcio 1 37ºC 3 Consórcio 1 37ºC 4 Consórcio 1 37ºC 5 Consórcio 1 37ºC 6 Consórcio 1 37ºC 7 Consórcio 2 37ºC 8 Consórcio 2 37ºC 9 Consórcio 2 37ºC 10 Consórcio 2 37ºC 11 Consórcio 2 37ºC 12 Consórcio 2 37ºC 13 Consórcio 1 32ºC 14 Consórcio 1 32ºC 15 Consórcio 1 32ºC 16 Consórcio 1 32ºC 17 Consórcio 1 32ºC

63 62 18 Consórcio 1 32ºC 19 Consórcio 2 32ºC 20 Consórcio 2 32ºC 21 Consórcio 2 32ºC 22 Consórcio 2 32ºC 23 Consórcio 2 32ºC 24 Consórcio 2 32ºC Fonte: Autoria própria, A figura 14 a seguir ilustra o monitoramento das amostras. Figura 14: Monitoramento das amostras Fonte: Autoria própria, Contagem dos microrganismos As contagens dos microrganismos foram realizadas no laboratório da microbiologia da UNILASALLE. Este procedimento foi realizado em placas pelo método das diluições. Este método consiste em colocar um inoculo de uma cultura com quantidade desconhecida de células em uma placa com meio de cultura. Contando as colônias que cresceram após a incubação das placas, teremos o número de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs/mL) da cultura que estamos ensaiando. Porém, como, em geral, pretendemos contar as células de culturas de crescimento denso,

64 63 torna-se necessário fazer diluições do inoculo, a fim de que apareça nas placas um número final de colônias entre trinta e trezentas, o que facilitará a contagem e fornecerá uma aproximação mais exata da população microbiana. (NEDER et al, 2000). Foram realizadas quatro contagem, em cada etapa realizada, foi feito o mesmo procedimento. Foi pesado aproximadamente 0,1g de solo em eppendorf de cada consórcio exposto as duas temperaturas, a divisão foi realizada da seguinte forma conforme tabela 5 a seguir: Tabela 5: Método contagem de colônias Consórcio Temp Consórcio 1 32ºC 1ª diluição 2ª diluição 3ª diluição 37ºC 1ª diluição 2ª diluição 3ª diluição Consórcio 2 32ºC 1ª diluição 2ª diluição 3ª diluição Fonte: Autoria própria, ºC 1ª diluição 2ª diluição 3ª diluição Após a etapa da pesagem do solo, iniciou-se a diluição de cada uma destas alíquotas, adicionou-se 100 µl na original. Procedeu-se diluição seriada até A figura 15 mostra a seqüência de diluição.

65 64 Figura 15: Diluição da amostra para contagem dos microrganismos Fonte: Autoria própria, Em cada diluição, levou-se cada alíquota para o misturador, para melhor solubilização. A figura 16 apresenta a homogeneização da amostra. Figura 16: Homogeneização das amostras Fonte: Autoria própria, Após este processo, a solução das alíquotas foram transferidas para uma placa de Petry com PCA (Plate Count Agar), para contagem das colônias. Foi utilizada uma alça de vidro, tipo Drigalsky, flambada para espalhar a solução na placa. A figura 17 apresenta o procedimento de transferência da amostra para a placa de Petry.

66 65 Figura 17: Distribuição da amostra na placa de Petry Fonte: Autoria própria, A distribuição das placas, ficou conforme a tabela a seguir. Tabela 6: Distribuição nas placas de Petry Consórcio Temp. 32ºC Placas Consórcio 1 37ºC Consórcio 2 32ºC 37ºC Fonte: Autoria própria, As placas foram incubadas em estufa à 37ºC por 48 h em aerobiose, a seguir s foram contadas as colônias, utilizando-se do equipamento Contador de Colônias Mecânico CP602, apresentado na figura 18.

67 66 Figura 18: Contador de Colônias Mecânico CP602 Fonte: Autoria própria, A contagem foi feita apenas nas colônias que possibilitaram a sua visualização macroscópica e que possuíam a caracterização bem definidas, conforme a figura 19. A B Figura 19: Consórcio 1- Colônia A: Bacillus; Colônia B: Pseudomonas Fonte: Autoria própria, A cada contagem dos microorganismos foi realizado o descarte dos frascos, devido à contaminação exposta com o procedimento. A tabela a seguir mostra a ordem do descarte. Tabela 7: Descarte dos frascos após procedimento

68 67 Contagem Frascos descartados 1ª 1, 7, 13 e 19 2ª 2, 8, 14 e 20 3ª 3, 9, 15 e 21 4ª 4, 10, 16 e 22 Fonte: Autoria própria, Quantificação Benzo(a)pireno A quantificação do benzo(a)pireno no solo foi realizado no laboratório particular ALAC, o método utilizado foi o EPA 8270-d.

69 68 8 RESULTADOS E DISCUSSÃO Realizou-se a leitura do ph do solo que foi realizado a incubação, o resultado foi de 5,25. Segundo Jaques, 2005, o ph atua diretamente na atividade dos microrganismos através dos efeitos dos íons H+ na permeabilidade celular e na atividade enzimática, assim como indiretamente, pela influência na disponibilidade de macro e micronutrientes, e na solubilidade dos metais pesados, que podem ser tóxicos aos microrganismos. A quantificação inicial do solo foi realizada após a contaminação de b(a)p, o resultado obtido foi de 647 µg/kg. Realizou-se quatro contagens de crescimento dos microrganismos em cada 15 dias. O resultado das contagens encontra-se nas tabelas a seguir. Tabela 8: Resultados da primeira contagem Consórcio Temperatura 32ºC Temperatura 37ºC Consórcio 1 2,2 X 10 8 UFC/g 1,9 x 10 8 UFC/g Consórcio 2 2,0 X 10 8 UFC/g 1,51 X 10 8 UFC/g Fonte: Autoria própria, Tabela 9: Resultados da segunda contagem Consórcio Temperatura 32ºC Temperatura 37ºC Consórcio 1 3,8 X 10 8 UFC/g 9,51 x 10 8 UFC/g Consórcio 2 2,3 X 10 8 UFC/g 1,1 X 10 9 UFC/g Fonte: Autoria própria, Tabela 10: Resultados da terceira contagem Consórcio Temperatura 32ºC Temperatura 37ºC Consórcio 1 4,1 X 10 7 UFC/g 3,2 x 10 7 UFC/g Consórcio 2 3,1 X 10 6 UFC/g 1,3 X 10 7 UFC/g Fonte: Autoria própria, 2010.

70 69 Tabela 11: Resultados da quarta contagem Consórcio Temperatura 32ºC Temperatura 37ºC Consórcio 1 1,2 X 10 5 UFC/g 2,2 x 10 6 UFC/g Consórcio 2 3,3 X 10 4 UFC/g 4,7 X 10 5 UFC/g Fonte: Autoria própria, Através destes resultados, é possível plotar uma curva de crescimento microrganismos. A figura 20 apresenta a curva de crescimento em escala logarítmica dos consórcios ao longo do experimento. 1,20E+09 1,00E+09 UFC por grama 8,00E+08 6,00E+08 4,00E+08 2,00E+08 0,00E Consórcio 1 temperatura 32ºC Consórcio 2 temperatura 32ºC Consórcio 1 temperatura 37ºC Consórcio 2 temperatura 37ºC tempo (quinzena) Figura 20: Crescimento dos consórcios ao longo do experimento Fonte: Autoria própria, O consórcio 2 à 37ºC foi o que demonstrou maior desenvolvimento microbiano juntamente com o consórcio 1 nas mesmas condições. Foi observado que em temperaturas mais elevadas favoreceu expressivamente o crescimento. Altas temperaturas ajudam na atividade biológica, o consumo de substrato pelo microrganismo e, por conseqüência, a biodegradação dos HPAs (JAQUES et al., 2005). O consórcio 1 e 2 à 32ºC não obtiveram a mesma eficiência, mostrou um crescimento razoável.

71 70 Embora o decréscimo após a terceira quinzena, foi possível observar alguns resultados. Os microrganismos poderiam não se desenvolver, ou até mesmo morrer nas primeiras quinzenas. No presente experimento os microrganismos consorciados utilizaram o contaminante benzo(a)pireno como forma de carbono, convertendo como energia. As condições ambientais expostas, de alguma forma contribuíram para tal resultado. O resultado da quantificação final do solo foi realizada em apenas uma variável. Foi escolhido o consórcio 1 à 37ºC, onde os resultados microbianos apresentaram melhor desenvolvimento. O resultado final obtido foi de 86,3 µg/kg. Com o resultado obtido, foi possível mostrar um processo viável para a redução do contaminante no solo, os microrganismos Pseudonomas e Bacillus utilizaram de alguma forma o B(a)p como fonte de carbono inorgânico, o que justificaria a redução de em 86,66%. Para obtenção de resultados satisfatórios, foi estudado limitações bióticas e abióticas que podem influenciar a biorremediação em solos contaminados com HPAs. Foi fundamental a importância do conhecimento dos princípios e das aplicações desta técnica, de acordo com as condições específicas do contaminante. Além disso, volume de solo tratado, tempo de remediação, dependência de condições ambientais, aceitação pública e impacto ambiental devem ser levados em consideração para que este processo se torne economicamente viável e eficiente. Entretanto, com somente uma variável, não é possível ter a confirmação da biorremediação. Possíveis erros como transporte do solo contaminado, extração, injeção, cálculos através da área dos picos, são fatores para que o resultado não se torne confiável. Portanto sugere-se para próximos trabalhos a realização da quantificação final em todas as análises em duplicata ou triplicata, para se ter a confiabilidade no resultado.

72 71 9 CONCLUSÃO A utilização de microrganismos degradadores é uma alternativa que já vem sendo utilizada em outros países e tem grandes chances de se desenvolver no Brasil. As pesquisas nacionais e internacionais já possibilitaram o isolamento e a identificação destes microrganismos, assim como o conhecimento das vias bioquímicas, que confirmam a capacidade de transformação dos HPAs. (JAQUES et al., 2005). Este trabalho comprovou um processo viável para uma possível biorremediação com as bactérias como: Pseudonomas aeruginosa e Bacillus subtilis. O bom crescimento do consórcio 1 à 37ºC, demonstrou uma redução de 86,66% do contaminante B(a)p, o que significou que estes microrganismos provavelmente utilizaram o contaminante como forma de carbono convertido em energia, transformando-o em substâncias menos tóxicas. Fatores ambientais como disponibilidade de água e oxigênio, temperatura e ph e disponibilidade de nutrientes inorgânicos influenciaram na sobrevivência e a atividade dos microrganismos degradadores. Altas temperaturas ajudam na atividade biológica, o consumo de substrato pelo microrganismo e, por conseqüência, a biodegradação dos HPAs (JAQUES et al., 2005). O crescimento microbiano foi comprovado melhor eficiência à temperatura mais alta, 37ºC. Tanto no consórcio 1, quanto no consórcio 2, foi demonstrado que a taxa de crescimento teve uma variação expressiva comparada a temperatura de 32ºC. Para próximos trabalhos sugere-se fazer a quantificação final em todas as amostras. Neste trabalho escolheu-se apenas um consórcio e uma temperatura, o que demonstrou melhores resultados. Sendo assim, não foi comprovado a biorremediação.

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76 ANEXO A Resultado quantificação inicial 75

77 ANEXO B Cromatograma da quantificação inicial 76

78 ANEXO C Resultado quantificação final consórcio 1 77