DIAGNÓSTICO DE RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM BOVINOS

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1 UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DIAGNÓSTICO DE RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM BOVINOS JOSÉ HENRIQUE DAS NEVES Botucatu SP 2014

2 ii UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA JÚLIO DE MESQUITA FILHO FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA DIAGNÓSTICO DE RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM BOVINOS JOSÉ HENRIQUE DAS NEVES Dissertação de mestrado apresentada junto ao Programa de Pós-Graduação em Medicina Veterinária para obtenção do título de Mestre. Orientador: Prof. Dr. Alessandro Francisco Talamini do Amarante.

3 iii Nome do Autor: José Henrique das Neves Título: DIAGNÓSTICO DE RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA EM BOVINOS COMISSÃO EXAMINADORA Prof. Dr. Alessandro Francisco Talamini do Amarante Presidente e Orientador Departamento de Parasitologia IBB UNESP - Botucatu Prof. Dra. Cyntia Ludovico Martins Membro Departamento de Produção Animal FMVZ UNESP Botucatu Prof. Dr. Helder Louvandini Membro Centro de Energia Nuclear na Agricultura USP Piracicaba Data da Defesa: 21 de fevereiro de 2014.

4 iv Dedicatória Primeiramente a Deus, por abençoar-me nesta trajetória na vida acadêmica. À minha mãe, Maria José Figueiredo (Zezé), sempre me incentivando a lutar em busca dos meus objetivos. Ao meu pai José Osório Munhoz das Neves, que me ensinou o valor do trabalho. Aos demais familiares que contribuíram cada um à sua maneira, em minha formação. Aos amigos da República Ública, pela amizade e momentos inesquecíveis.

5 v Agradecimentos À minha família e amigos, que jamais me abandonaram nesta caminhada. A todos os produtores rurais que disponibilizaram seu rebanho para esta pesquisa. À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia de Botucatu UNESP pelo apoio e a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela bolsa concedida. Aos membros da banca examinadora da qualificação, Alexandre Secorun Borges e Roberto Calderon Gonçalves, da banca de defesa, Cyntia Ludovico Martins e Helder Louvandini por disponibilizarem seu tempo para correção e avaliação desta dissertação. Ao professor Alessandro Francisco Talamini do Amarante pela paciência na orientação, e pela oportunidade de aprender, aperfeiçoar e acrescentar conhecimentos na área de parasitologia, dando-me oportunidade de ingressar na pós-graduação sob sua orientação, mesmo não tendo cursado a graduação nesta instituição. A todos os amigos do Laboratório de Helmintologia Veterinária que me ajudaram nas colheitas de dados desta pesquisa, pois sem eles seria impossível a realização deste experimento, Michelle Cardoso, César Bassetto, Maurício Wilmsen, Maria Regina Silva, Marina Frontana e Lucca Baptistella de Napoli. Agradeço aos amigos particulares que me ajudaram às vezes mesmo sem terem conhecimento sobre esta área, se prontificaram imediatamente em me apoiar, Luna Scarpari, Luara Canal, Maria Érika Picharillo, Ramiro Oliveira, Augusto Schulz, Talles Carvalho, Ana Lopes e outros que não me recordo devido às inúmeras colheitas. Aos amigos: Karoline Alves Rodrigues que sempre era o plano B, pois quando eu estava sem ninguém para auxiliar-me, ela era capaz de cancelar seus compromissos para me ajudar e por último, mas não menos importante, ao amigo Nadino Carvalho que sempre suportou minhas loucuras, principalmente no auge das colheitas de dados, onde muitas vezes era necessário acordar as 04:00 h e trabalhar nos fins de semana e feriados, para darmos conta do cronograma, sempre apoiando e sendo parceiro em tudo.

6 vi LISTA DE TABELAS TABELA 1: Exportação brasileira de produtos bovinos no ano de TABELA 2: Prevalência e intensidade média da infecção por nematódeos parasitas de bovinos, determinadas por necropsia, em estados brasileiros TABELA 3: Prevalência e intensidade média da infecção por cestódeos e trematódeos parasitas de bovinos, determinadas por necropsia, em estados brasileiros TABELA 4: Drogas anti-helmínticas atualmente disponíveis no Brasil para o controle de nematódeos de ruminantes TABELA 5: Introdução de drogas anti-helmínticas para ruminantes e relatos de resistência anti-helmíntica as drogas TABELA 6: Casos de resistência anti-helmíntica em bovinos no Brasil TABELA 7: Eficiência de diferentes soluções de flutuação e densidades, para o diagnóstico de ovos, oocistos e larvas de 1º estágio de parasitas de bovinos, búfalos, ovinos e caprinos, utilizando a técnica Flotac

7 vii LISTA DE FIGURAS FIGURA 1: Bezerros jovens parasitados e utilizados neste experimento FIGURA 2: Ovos de parasita da Ordem Strongylida (A), Trichuris spp. (B) e, Moniezia benedeni (D). Oocistos de Eimeria spp. (E) e amostra de fezes de animal com infecção mista por nematódeo, Moniezia e Eimeria spp. (C) FIGURA 3: Relatos de resistência anti-helmíntica em bovinos no mundo FIGURA 4: Coleta de fezes (A), administração de anti-helmíntico (B) e bovinos jovens utilizados na pesquisa (C) FIGURA 5: Câmaras de McMaster (A) e Câmaras de Flotac (B)

8 viii SUMÁRIO Página 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA BOVINOCULTURA NO BRASIL DIAGNÓSTICO DAS HELMINTOSES POR MEIO DA CONTAGEM DE OVOS POR GRAMA DE FEZES (OPG) PREJUÍZOS NA PRODUÇÃO DE BOVINOS ESPÉCIES DE NEMATÓDEOS PARASITAS DE BOVINOS MEDIDAS ALTERNATIVAS OU COMPLEMENTARES DE CONTROLE DE HELMINTOS DROGAS ANTI-HELMÍNTICAS IVERMECTINA MOXIDECTINA ALBENDAZOL LEVAMISOL RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA MÉTODOS DE DIAGNÓSTICO DE RESISTÊNCIA ANTI-HELMÍNTICA MÉTODOS IN VITRO TESTE DE ECLOSÃO DOS OVOS TESTE DE DESENVOLVIMENTO LARVAL TESTE DE BASE MOLECULAR (PCR) MÉTODOS IN-VIVO MÉTODOS IN-VIVO COM NECROPSIA MÉTODOS IN VIVO COM EXAME DE FEZES TÉCNICAS DE CONTAGEM DE OPG PARA DIAGNÓSTICO ANTI-HELMÍNTICO CONTAGEM DE OPG EM CÂMARA DE MCMASTER CONTAGEM DE OPG EM CÂMARA FLOTAC FÓRMULAS MATEMÁTICAS PARA O CÁLCULO DO FECRT TRABALHO CIENTÍFICO BIBLIOGRAFIA... 63

9 ix NEVES, J.H. Diagnóstico de Resistência Anti-helmíntica em Bovinos. Botucatu, p. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Resumo A resistência anti-helmíntica em bovinos se tornou um problema global, e no Brasil tem sido relatada em alguns estados. Devido à necessidade de métodos mais precisos de diagnóstico da resistência anti-helmíntico, o objetivo deste trabalho foi avaliar duas técnicas (McMaster e Flotac) e duas fórmulas matemáticas (FECRT1 - de acordo com a média de OPG e FECRT2 - de acordo com o número total de ovos contados) para calcular o teste de redução de ovos nas fezes (FECRT). O anti-helmíntico testados foram ivermectina (0,2 mg/kg), moxidectina (0,2 mg/kg), sulfóxido de albendazol (2,5 mg/kg) e fosfato de levamisol (4,7 mg/kg), administrada na dose recomendada pelo fabricante. Dez propriedades foram avaliadas, quatro visitas em cada, pré-tratamento (D - 2), processamento (D 0), 10 dias pós-tratamento (D10) e 28 dias póstratamento (D28). Em todas as propriedades foi observada resistência a um ou mais agentes anti-helmínticos testados, independentemente da técnica ou da fórmula matemática avaliada. Os gêneros/espécies encontradas com resistência a um ou mais anti-helmínticos foram Haemonchus placei, Cooperia spp., Trichostrongylus spp. e Oesophagostomum radiatum. Em conclusão, a resistência anti-helmíntica está presente em todos os rebanhos avaliados. A técnica Flotac e a fórmula matemática FECR2 foram mais precisas do que a técnica de McMaster e fórmula FECR1. Há necessidade de maior conscientização dos produtores sobre o uso de anti-helmínticos. Portanto, em estudos futuros de resistência anti-helmíntica em bovinos, recomenda-se a utilização do método de diagnóstico com uma maior precisão, como é o método Flotac. Na interpretação dos resultados, nosso estudo indica que o cálculo pela fórmula FECR2, o que elimina o uso de um grupo de controle, deve ser recomendada. Palavras-chave: eficácia, resistência, bovino.

10 x NEVES, J.H. Diagnosis of Anthelmintic Resistance in Cattle. Botucatu, p. Dissertação (Mestrado) Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho. Abstract The anthelmintic resistance in cattle has become a global problem, and in Brazil it has been reported in some states. Due to the need for more accurate methods of diagnosis of anthelmintic resistance the purpose this work was to evaluate two techniques (McMaster and Flotac) and two mathematical formulas (FECRT1 - according to the average EPG and FECRT2 - according to the total number of eggs counted) to calculate the faecal egg count reduction test (FECRT) in the diagnosis of anthelmintic resistance in cattle. The anthelmintic tested were ivermectin (0.2 mg/kg), moxidectin (0.2 mg/kg), albendazole sulfoxide (2.5 mg/kg) and levamisole phosphate (4.7 mg/kg), administered at the dose recommended by the manufacturer. Ten farms were assessed, four visits in each pre-treatment (D -2), processing (D 0), 10 days post-treatment (D 10) and 28 days post-treatment (D 28). In all of the properties was observed resistance to one or more anthelmintics tested, regardless of the technique (McMaster or Flotac) or FECRT the mathematical formula (1 and 2). The genera/species found with resistance to one or more anthelmintics were Haemonchus placei, Cooperia spp., Trichostrongylus spp. and Oesophagostomum radiatum. In conclusion, the anthelmintic resistance is present in all herds evaluated. The Flotac technical and mathematical formula FECR2 were more accurate than the McMaster technique and formula FECR1. Need is greater awareness of the producers on the use of anthelmintics. Therefore, in future studies on anthelmintic resistance in cattle, use of the method of diagnosis with higher accuracy, it is recommended, as is the case FLOTAC method. In interpreting the results, our study indicates that the calculation by formula FECR2 %, which eliminates the use of a control group, should be recommended. Key words: efficacy, resistance, cattle.

11 11 1 INTRODUÇÃO A bovinocultura no Brasil está passando por um processo de aumento da produtividade, com decréscimo de 3,4 % na área destinada à pastagem e acréscimo de 50 % na taxa de ocupação (animal/hectare) entre 1990 e 2011 (ANUALPEC, 2012). O país permanece com o 2º maior rebanho comercial do mundo e o 2º maior produtor de carne bovina. Porém, devido o aumento dos custos de produção, tem sido necessária maior profissionalização dos proprietários e profissionais envolvidos na produção agropecuária (ANUALPEC, 2013). Dentre os fatores que afetam a produção de ruminantes, o parasitismo por helmintos é um dos principais, sendo que o principal método de controle destes parasitas é a utilização de anti-helmínticos (GRAEF et al., 2013). Porém, devido ao aparecimento da resistência anti-helmíntica, a importância do monitoramento da eficácia dos produtos disponíveis no mercado e os gêneros/espécies de parasitas envolvidos, têm sido objeto de estudo em vários locais do mundo como na Argélia (BENTOUNSI et al., 2012), Argentina (FAZZIO et al., 2012), Escócia (BARTLEY et al., 2012), Estados Unidos (YAZWINSKI et al., 2013) e Nova Zelândia (LEATHWICK e MILLER, 2013). No Brasil foram relatados casos de resistência anti-helmíntica em endoparasitos de bovinos nos estados de Minas Gerais (RANGEL et al., 2005), São Paulo (SOUTELLO et al., 2007), Rio de Janeiro (CARDOSO et al., 2008), Santa Catarina (SOUZA et al., 2008), Rio Grande do Sul (CEZAR et al., 2010) e Mato Grosso do Sul (BORGES et al., 2013), sendo que no Estado de São Paulo foi descrito pela primeira vez no mundo resistência de Oesophagostomum radiatum à moxidectina (CONDI et al., 2009). Além das perdas causadas pelo parasitismo, à utilização de produtos ineficazes como a ivermectina (BORGES et al., 2013; CEZAR et al., 2010; SOUTELLO et al., 2007), gera resíduos contaminantes que interferem no meio ambiente (LUMARET et al., 2012). Segundo Coles et al. (2006), existe grande necessidade de melhoria dos métodos de detecção de resistência anti-helmíntica, em particular para a detecção de resistência às lactonas macrocíclicas, em bovinos. Portanto, o estudo sobre os fatores ligados ao diagnóstico de resistência anti-helmíntica é de fundamental importância para a produção de bovinos no Brasil.

12 Revisão de Literatura Bovinocultura no Brasil A bovinocultura é um dos principais destaques do agronegócio brasileiro no cenário mundial. Sendo que o rebanho nacional aumentou de 118,1 milhões/animais em 1980, para 211,3 milhões/animais em 2012 (SIDRA, 2014), o que coloca o Brasil junto aos líderes mundiais do setor. Além de abastecer o mercado interno, os produtos e subprodutos oriundos de bovinos geram mais de 8 bilhões de dólares em exportações anualmente (TABELA 1). TABELA 1: Exportação brasileira de produtos bovinos no ano de Pecuária de Corte Pecuária de Leite Produtos Bilhões de Dólares (US$) Carne Bovina Industrializada 0,636 Carne Bovina "in natura" 4,495 Miudezas Bovinas (Frescas/resfriadas) 0,015 Línguas de Bovinos (Congeladas) 0,034 Fígados de Bovinos (Congelados) 0,001 Rabos de Bovinos (Congelados) 0,004 Outras Miudezas de Bovinos (Comestíveis congelados) 0,224 Tripas de Bovinos (Congeladas) 0,306 Bovinos vivos 0,594 Couro Bovino 2,055 Sebo de Bovinos 0,004 Produtos Leite e Creme de Leite (não concentrado) 0,018 Leite em pó/creme de Leite (concentrado) 0,055 Iogurte e Creme de Leite (Fermentado) 0,003 Soro de Leite e Produtos Concentrados 0,001 Manteiga e Derivados 0,002 Queijos e Requeijão 0,092 Total 8,541 Elaborado pelo autor de acordo com dados disponíveis em ANUALPEC, Vários fatores contribuem para estes resultados e para a contínua expansão da atividade no Brasil como: o clima tropical e equatorial úmido onde está localizada a maior parte do rebanho brasileiro, a grande extensão territorial, a capacidade de expansão em unidade animal/hectare devido à

13 13 baixa lotação atual, a disponibilidade de subprodutos para alimentação e o baixo custo de produção. No entanto, para atender a demanda do mercado, atualmente os produtores brasileiros têm de se adequar aos anseios do consumidor moderno. O consumidor brasileiro está cada vez mais interessado em conhecer a maneira pela qual o alimento foi produzido, desde a sua origem até a sua mesa, exigindo do seu governo responsabilidade para atestar a qualidade, a segurança e a sua proteção (BRASIL, 2009). Os resíduos de insumos utilizados na produção de bovinos causam vários prejuízos à pecuária, por exemplo, embargos comerciais pelos mercados que adquirem a carne bovina, como os estados Unidos e a União Europeia, além da exposição nociva do consumidor brasileiro a resíduos contaminantes tais como as drogas antimicrobianas e antiparasitárias (MAPA, 1999). Resíduos de antibióticos no leite causam inibição de culturas lácteas sensíveis utilizadas na fabricação de queijos, iogurtes e outros produtos fermentados, dificultando a obtenção destes produtos ou alterando sua qualidade (BRITO e LANGE, 2008). Dentre os parasiticidas, a ivermectina é o principal responsável pela contaminação ambiental e impacto sobre a fauna existente no solo (LUMARET et al., 2012). É sabido que os parasitas causam diversos prejuízos aos bovinos, e a utilização racional de fármacos é uma necessidade atual. Para isso, o conhecimento sobre as espécies de parasitas, em especial os nematódeos que acometem os bovinos, é fundamental para elaboração de estratégias sustentáveis de controle, sem a utilização e/ou com a diminuição do uso de anti-helmínticos Diagnóstico das Helmintoses por meio da Contagem de Ovos por Grama de Fezes (OPG) Estudos demonstraram que existe correlação mediana de 0,32 a 0,47 (BRICARELLO et al., 2007; GIRÃO et al., 1985) entre a carga parasitária de bovinos e as contagens de ovos de nematódeos por grama de fezes (OPG), utilizando a técnica de McMaster. No entanto, Condi et al. (2009) encontraram alta correlação de 0,65. Porém, não foram encontrados estudos avaliando a

14 14 correlação entre a carga parasitária e uma técnica de OPG com maior acurácia, por exemplo, Flotac. O monitoramento do grau de infecção dos animais por meio das contagens de OPG, em conjunto com a coprocultura, permite avaliar o momento ideal para everminação dos animais. Os valores de OPG tendem a diminuir nos bovinos à medida que se tornam adultos. Os bovinos adquirem imunidade eficiente ao redor dos meses de idade (BIANCHIN et al., 1995; BORGES et al., 2013). Portanto, é recomendável como estratégia de controle de helmintos, o tratamento de bovinos em crescimento (Figura 1), com faixa etária inferior a meses, com o objetivo de diminuir o número de ovos excretados nas fezes, diminuindo a contaminação ambiental e consequentemente o nível de reinfecção. Com isso, pode-se reduzir o número de casos clínicos de verminose e, principalmente evitar perdas econômicas decorrentes da verminose. FIGURA 1: Bezerros jovens parasitados e utilizados neste experimento Prejuízos na Produção de Bovinos O crescimento de bezerros pode ser prejudicado pelo parasitismo gastrintestinal subclínico mesmo antes do desmame. Este fato foi observado em Mato Grosso do Sul, por (CATTO et al., 2005), onde bovinos jovens tratados antes da desmama, aos 3-5 meses de idade, ganharam de 4 a 7 kg a mais do que os não tratados. No mesmo estado, (BIANCHIN et al., 1995) observaram que bezerros da raça Nelore, tratados estrategicamente com anti-

15 15 helmínticos, nos meses de maio, julho e setembro, com faixa etária do desmame aos meses de idade, ganharam em média 41 kg a mais do que os não tratados. Soutello et al. (2002) observaram ganho em peso de 54 kg a mais, para bovinos machos do desmame (8-9 meses de idade) até os 24 meses de idade, após tratamento estratégico (3x/ano) com moxidectina, em comparação aos animais não tratados. Borges et al. (2013) avaliaram garrotes de 15 meses de idade da raça Nelore, criados extensivamente, com pastejo em Brachiaria spp., em uma propriedade com diagnóstico prévio de resistência à ivermectina. Após a administração de um fármaco com eficácia de 81%, observou-se ganho médio diário (GMD) de 106 gramas/dia a mais que o grupo não tratado, durante um período de 112 dias. A maioria dos bovinos são parasitados por várias espécies de helmintos ao mesmo tempo (BRESCIANI et al., 2001; SANTOS et al., 2010), o que dificulta a mensuração das perdas causadas pelo envolvimento de cada espécie e/ou gênero de parasita. Porém, vários outros fatores podem influenciar na mensuração dessas perdas como, disponibilidade e qualidade da forragem, categoria animal, suplementação mineral, suplementação protéica, sexo e raça Espécies de Nematódeos Parasitas de Bovinos Alguns gêneros de parasitas de bovinos são identificados pela visualização dos ovos e oocistos encontrados nas fezes dos bovinos (FIGURA 2). No entanto, a maioria dos gêneros/espécies é identificada a partir de larvas de terceiro estágio, produzidas em coproculturas. A prevalência e a intensidade média dos helmintos que parasitam bovinos estão descritos na TABELA 2, sendo que os gêneros mais prevalentes encontrados em todos os estudos foram Haemonchus spp., Cooperia spp. e Oesophagostomum sp. As espécies de nematódeos gastrintestinais mais importantes em bovinos criados no Brasil são: Haemonchus placei, Haemonchus similis, Ostertagia ostertagi e Trichostrongylus axei; todos parasitas do abomaso. No intestino delgado, destacam-se Cooperia pectinata,

16 16 Cooperia punctata, Strongyloides papillosus e Nematodirus spp. No intestino grosso são comuns às espécies de Oesophagostomum radiatum e Trichuris discolor. Dentre os trematódeos que acometem os bovinos, em estudos epidemiológicos não foi relatada a presença de Fasciola hepatica (TABELA 3). Porém, esporadicamente são descritos surtos (ADRIEN et al., 2013) e achados em linhas de abate de frigoríficos, pelo Serviço de Inspeção Federal (SIF), como no estado de Goiás, onde dos 4,53% dos 949 animais inspecionados estavam parasitados (ARAÚJO et al., 2007). FIGURA 2: Ovos de parasita da Ordem Strongylida (A), Trichuris spp. (B) e, Moniezia benedeni (D). Oocistos de Eimeria spp. (E) e amostra de fezes de animal com infecção mista por nematódeo, Moniezia e Eimeria spp. (C). Apesar de estudos epidemiológicos serem fundamentais para a elaboração das estratégias de controle dos helmintos, hoje em dia são cada vez mais raras estas pesquisas básicas. Durante esta revisão, foram encontrados 11 trabalhos realizados entre 1971 e 2002, e apenas um realizado nos últimos 12 anos (Erro! Fonte de referência não encontrada.).

17 17 TABELA 2: Prevalência e intensidade média da infecção por nematódeos parasitas de bovinos, determinadas por necropsia, em estados brasileiros. Ano 1971 (1) 1981 (2) 1983 (3) 1985 (4) 1985 (5) 1985 (6) 1989 (7) 2001 (8) 2001 (9) 2001 (10) 2002 (11) 2010 (12) MS e MT MS SP Estado BA n=48 PI n=25 SP n=74 SP n=6 SP n=48 SP n=55 SP n=42 RJ n=98 MG n=76 n=65 n=45 n=40 OE Espécie P% (IM) P% (IM) P% (IM) P% (IM) P% (IM) AB ID Haemonchus contortus 23,9 69,7 (90) 72,9 (493) 90,0 (1341) 100 (116) Agriostomum wryburgi ,7 (3) - 2,7 (8) P% (IM) 12,5 (8) P% (IM) P% (IM) P% (IM) P% (IM) P% (IM) P% (IM) 83,3 (151) - 94,5 (2675) Haemonchus placei ,3 97,6 99, (215) (2010) (1039) (3895) Haemonchus similis 76,1 87,0 81,3 94,0 43,2 75,0 83,3 33,3 50,9 21,4 29,0 - (1527) (483) (430) (116) (179) (1210) (675) (185) (175) (160) Ostertagia lyrata ,8 (3,50) - 2,6 (1) Ostertagia ostertagi ,1 (12) - 2,6 (3) Ostertagia trifurcata ,3 (0,3) Trichostrongylus axei - 42,0 88,0 24,3 12,5 66,7 69,1 26,2 69,7 8,3 (82) - * (395) (2172) (66) (205) (353) (110) (466) (239) 10,0 (10) Bunostomum 52,1 60,0 10,0 23,0 26,5 (4) 36,0 (5) 9,5 (34) 2,5 (10) 16,7 (40) - 16,7 (54) phlebotomum (32) (32) (0,5) 2,6 (0,3) Capillaria bovis , ,6 (1) 11,9 (46) - 9,2 (1) Cooperia curticei ,0 (260) Cooperia pectinata 17,6 49,7 74,0 44,6 35,0 83,3 69,1 19,1 34,2 8,3 (15) 2,1 (5) - (506) (2581) (1040) (143) (8521) (497) (1043 (1010) Cooperia punctata 82,4 88,6 95,8 98, , , , (3989) (3905) (6655) (3649) (477) (11109) (1120) (3160) (8733) (5595) Cooperia punctata/spatulata (9361) -

18 18 Cooperia spatulata Strongyloides 25,0 4,0 - - papillosus (63) (360) ,4 (10) * 1,3 (0,1) Trichostrongylus 28,0 10,0 6,1-8,3 (15) - colubriformis (315) (360) ,4 (20) - 10,5 (11) Trichostrongylus 22,3 - longyspicularis (38) ,6 (0,5) Oesophagostomum 83,0 79,2 94,0 86,5 17,5 41,7 98,2 73,8 89,0 94,7 26,1 83,3 (56) radiatum (175) (75) (315) (160) (121) (60) (348) (295) (103) (471) IG Trichuris discolor 7,6 35,6 21,6 56,4 64,3-30,0 (4) - 50,0 (17) - 38,1 (67) (39) (34) (47) (15) 47,4 (32) Trichuris spp ,9 (66) CP Setaria cervi , PM Dictyocaulus viviparus ,3 13,5 12,0 (24) (382) ,1 16,7 (22) * - OE = Órgão de eleição, AB = Abomaso, ID = Intestino Delgado, IG = Intestino Grosso, CP = Cavidade Peritonial, PM = Pulmão; n = número de animais; P = prevalência; IM = intensidade média da infecção; * = infecções esporádicas não mensuradas; MS = Mato Grosso do Sul, MT = Mato Grosso, SP = São Paulo, PI = Piauí, MG = Minas Gerais, BA = Bahia, RJ = Rio de Janeiro; 1 (GRISI e NUERNBERG, 1971), 2 (CATTO e UENO, 1981), 3 (SANTANA et al., 1983), 4 (GIRÃO et al., 1985), 5 (OLIVEIRA e MATSUMOTO, 1985), 6 (RODRIGUES et al., 1985), 7 (ZOCOLLER et al., 1983), 8 (BRESCIANI et al., 2001), 9 (LANDIM et al., 2001), 10 (BORGES et al., 2001), 11 (PIMENTEL NETO e FONSECA, 2002) e 12 (SANTOS et al., 2010). 29,1 (50) 14,3 (770) - 32,9 (138)

19 A necessidade de novas pesquisas de epidemiologia é factível, principalmente nos estados de Mato Grosso, Minas Gerais, Goiás, Mato Grosso do Sul e Pará, onde estão localizados os maiores rebanhos do país e juntos são responsáveis por 54,36% do rebanho nacional (SIDRA, 2014). No entanto, para a realização destas é necessário o treinamento de técnicos para a correta identificação das espécies. Amarante (2011) aborda esta questão com muita propriedade e faz a seguinte menção: A identificação precisa das diferentes espécies, bem como o conhecimento sobre a epidemiologia das gastroenterites parasitárias, são fundamentais para a elaboração de estratégias sustentáveis de profilaxia das parasitoses. Na TABELA 2 é possível visualizar que em alguns estudos em que foi diagnosticada a espécie Haemonchus contortus em bovinos, podem se tratar na verdade de Haemonchus placei, conforme observado por Amarante (2011). TABELA 3: Prevalência e intensidade média da infecção por cestódeos e trematódeos parasitas de bovinos, determinadas por necropsia, em estados brasileiros. Ano 1985 (1) 1985 (2) 1985 (3) 1989 (4) 2001 (5) 2002 (6) Estado PI n=25 SP n=74 SP n=40 SP n=6 SP n=42 RJ n=98 OE Espécie P% (IM) P% (IM) P% (IM) P% (IM) P% (IM) P% (IM) ID Moniezia benedeni - - 2,5 (1) 16,7 (1) 4,8 (1) * PC Eurytrema coelomaticum - 14,9 (146) - - 4,8 (45) - RM Paramphistomum spp. 8, OE = Órgão de eleição, ID = Intestino Delgado, PC = Pâncreas, RM = Rúmen; n = número de animais; P = prevalência; IM = intensidade média da infecção; * = infecções esporádicas não mensuradas; SP = São Paulo, PI = Piauí, RJ = Rio de Janeiro; 1 (GIRÃO et al., 1985), 2 (OLIVEIRA e MATSUMOTO, 1985), 3 (RODRIGUES et al., 1985), 4 (ZOCOLLER et al., 1983), 5 (BORGES et al., 2001), 6 (PIMENTEL NETO e FONSECA, 2002) Medidas Alternativas ou Complementares de Controle de Helmintos O controle adequado dos helmintos pode ser alcançado por meio de algumas medidas, por exemplo, pastejo simultâneo entre ovinos e bovinos, onde devido à especificidade parasitária, os bovinos são capazes de eliminar as infecções por helmintos que não são específicos a espécie (AMARANTE et

20 al., 1997). Essa interação entre espécies animais proporcionou efeito benéfico significativo no controle da verminose ovina, após a utilização de pastejo rotacionado e alternado de ovinos e bovinos adultos (FERNANDES et al., 2004). Recentemente, Brito et al. (2013) ao avaliarem bovinos pastejando isoladamente, ovinos pastejando isoladamente, bovinos e ovinos pastejando simultaneamente, e bovinos pastejando previamente aos ovinos, observaram que para os ovinos, os sistemas consorciados apresentaram redução na infecção endoparasitária, sendo o pastejo simultâneo com ovinos melhor que o pastejo prévio de bovinos e alternado com ovinos. No entanto, para os bovinos, nenhuma diferença entre os sistemas de pastejo foi verificada, porém o pastejo simultâneo (ovinos e bovinos) pode ser uma ferramenta para reduzir a necessidade de tratamentos anti helmínticos em ovinos. Além de que os bovinos são menos seletivos que os ovinos e ingerem partes grosseiras da pastagem, como talos, proporcionando melhor rebrota do capim e consequentemente maior relação folha: colmo. Outras medidas de controle também são descritas na literatura, como: seleção de reprodutores bovinos resistentes aos nematódeos gastrintestinais, devido à herdabilidade da característica (h = 0,3) (GASBARRE et al., 2001). Bricarello et al. (2007) observaram coeficiente de correlação (r = 0,64) entre a carga parasitária de Cooperia spp. e Haemonchus spp., em bovinos da raça Nelore, indicação de que a seleção para a resistência a uma das espécies, consequentemente, melhora a resistência à outra. Utilizando vacina, Bassetto et al. (2011) obtiveram redução na contagem de OPG de 99% para Haemonchus contortus e 97% para Haemonchus placei, após a imunização com vacina contendo glicoproteínas de membrana do intestino de H. contortus, em bezerros da raça holandesa, infectados experimentalmente. Tratamentos fitoterápicos e homeopáticos também são descritos na literatura. No entanto, em uma pesquisa recente, Catto et al. (2013) verificaram em dois ciclos experimentais subsequentes de 318 e 313 dias de duração, que não houve diferença significativa (P>0,05), entre o tratamento com dois produtos homeopáticos, um fitoterápico e um grupo controle, nas contagens de OPG, moscas dos chifres, carrapatos e no ganho em peso. No mesmo

21 experimento, o grupo tratado alopaticamente com moxidectina, obteve menor média da contagem de OPG (P<0,05), menor média nas contagens de carrapato (P<0,05), e ganharam de 22 a 30 kg de peso vivo a mais (P<0,05) que o grupo não tratado ou tratado com medicamentos alternativos. Portanto emprego de drogas anti-helmínticas convencionais ainda se mostra como a medida mais eficiente para o controle de helmintos Drogas Anti-helmínticas Segundo o Sindicato Nacional da Indústria de Produtos para Saúde Animal (SIDAN), o faturamento total do setor no Brasil no ano de 2012 foi de R$ 3,7 bilhões, sendo que os antiparasitários representaram 25% deste faturamento e dentre as espécies animais, os ruminantes representam a classe mais expressiva com 54,2% do mercado (SIDAN, 2013). Atualmente, as drogas anti-helmínticas para ruminantes comercializadas no Brasil de acordo com o princípio ativo são: 10 para bovinos, 9 para ovinos e 5 para caprinos, conforme TABELA 4. Em três estudos em rebanhos leiteiros no Brasil (CHARLES e FURLONG, 1996; DELGADO et al., 2009; PEREIRA, 2011), foram observados que os anti-helmínticos mais utilizados por pecuaristas brasileiros são os pertencentes à classe das lactonas macrocíclicas (ivermectina, doramectina, abamectina e moxidectina), seguido dos imidazotiazóis (levamisol) e benzimidazóis (albendazol). Foram relatados casos de resistência antihelmíntica a todos estes produtos, no entanto, a maioria dos casos de resistência é descrito para o grupo químico das lactonas macrocíclicas, em especial a ivermectina. Para o anti-helmíntico ser eficaz, alguns fatores são importantes como: a concentração de droga no local onde o parasita se encontra no organismo do hospedeiro e o tempo de exposição do parasita a droga (LANUSSE et al., 1997). A administração de um mesmo fármaco pode apresentar diferentes persistências de concentrações plasmáticas, de acordo com a espécie animal, por exemplo, o metabólito sulfóxido de albendazol (fração detectável do albendazol no plasma) foi observado por até 54, 42 e 36 horas em ovinos, caprinos e bovinos, respectivamente (DELATOUR et al., 1991).

22 TABELA 4: Drogas anti-helmínticas atualmente disponíveis no Brasil para o controle de nematódeos de ruminantes. Grupo Químico Princípio Ativo Albendazol Ex: Nomes Comerciais Albendathor, Valbazen Espécie Animal Bovinos, Ovinos e Caprinos Benzimidazóis Bovinos, Ovinos e Oxfendazol Oxfaden Caprinos Imidazotiazóis Levamisole Ripercol Bovinos e Ovinos Organofosforados Triclorfone Neguvon Bovinos, Ovinos e, Triveron Caprinos Salicilanidas Aminoacetonitrílicos (aminoacenitrile derivatives, AAD) Lactonas Macrocíclicas Closantel Diantel, Galgosantel Bovinos, Ovinos e Caprinos Monepantel Zolvix Ovinos Ivermectina Altec, Ivomec, Ivermectin, Bovinos, Ovinos e Caprinos Abamectina Duotin, Abactin Bovinos Doramectina Dectomax, Doramec Bovinos e Ovinos Eprinomectina Eprinex Bovinos Moxidectina Cydectin, Onix Bovinos e Ovinos Elaborado pelo autore com base em informações disponíveis sobre os produtos com licenças vigentes pelo Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento (MAPA). Lifschitz et al. (2000) observaram a presença de ivermectina por 38, 48, 48 e 38 dias após tratamento (0,2 mg/kg por via subcutânea), na mucosa abomasal, mucosa intestinal, pele e nos parasitas, respectivamente, comprovando a longa persistência deste fármaco nos tecidos alvo, em bovinos. No mesmo experimento foi observada alta correlação (r = 0,88) entre os perfis de concentração da droga no plasma e aqueles alcançados no tecido da mucosa gastrintestinal, pulmão e pele. Sendo assim, a mensuração da ivermectina através da concentração plasmática é um bom parâmetro para avaliar a disposição da droga nos tecidos Ivermectina A ivermectina é um endectocida, ou seja, possui ação nos endoparasitas e ectoparasitas, sendo estes os nematódeos gastrointestinais e pulmonares,

23 insetos e ácaros. No Brasil, ela está disponível para bovinos, na formulação injetável, nas concentrações de 0,2 mg/kg (ex: Baymec, Bayer), 0,45 mg/kg (ex: Solution 3,5 % LA, MSD Saúde Animal), 0,63 mg/kg (ex: Ivomec Gold, Merial), 0,8 mg/kg (ex: Master LP, Ouro Fino) e tópica na concentração de 0,5 mg/kg (ex: Ivomec Pour-On, Merial; Baymec Pour-on, Bayer). Após a administração da ivermectina, por via subcutânea, a droga é absorvida no espaço subcutâneo, chega à circulação sistêmica, e é distribuída nos tecidos e locais onde se encontram os parasitas-alvo. O mecanismo de ação da ivermectina envolve tanto a potencialização do ácido gama-amino butírico (GABA), um neurotransmissor inibitório das respostas motoras dos parasitos, como a interação com os canais de glutamato-cloro independentes de GABA, aumentando a permeabilidade da membrana das células nervosas dos parasitos aos íons de cloro. Assim, a ivermectina causa bloqueio neuromuscular, resultando em paralisia flácida e morte do parasito (MCKELLAR e BENCHAOUI, 1996). A ivermectina é quase exclusivamente (98%) excretada nas fezes, independentemente das espécies e via de administração, com menos de 2% da dose excretada na urina (CHIU et al., 1990; MCKELLAR e BENCHAOUI, 1996). Os resíduos de ivermectina presente nas fezes de bovinos causam impacto na fauna não-alvo, interferindo na harmonia do ecossistema (LUMARET et al., 2012). Besouros coprófagos enterram cerca de 70% das fezes dos bovinos em até 10 dias após a exposição das fezes frescas (MIRANDA et al., 2000). Período esse que abrange as elevadas concentrações residuais de ivermectina nas fezes (ALVINERIE et al., 1998; CHIU et al., 1990; LANUSSE et al., 1997). A fauna coprófaga é essencial para a degradação do bolo fecal. No entanto, em um estudo a campo, foi observada a falha na degradação das fezes de bovinos, devido à ausência de insetos, após o tratamento com ivermectina de liberação lenta (PRICHARD et al., 2012; WALL e STRONG, 1987). Iglesias et al. (2006) observaram uma redução de 33% na contagem total de artrópodes presentes no bolo fecal, após a administração de ivermectina (0,2 mg/kg) em bovinos. No mesmo experimento, as menores

24 concentrações de ivermectina encontradas em amostras de fezes do grupo tratado aos 60 dias pós-tratamento, foram superiores as concentrações indicadas por Strong e James (1993), passíveis de causar efeitos sub-letais nos organismos não-alvo. Suarez (2002) observou redução na quantidade total de artrópodes, ácaros e dípteros, dos três aos 29 dias pós-tratamento com ivermectina e doramectina (ambas 0,2 mg/kg). Devido inúmeros relatos da ineficácia da ivermectina e dos efeitos danosos ao meio ambiente, sua utilização para ruminantes hoje em dia é motivo de ser questionada Moxidectina A moxidectina é um endectocida, pertencente à classe das lactonas macrocíclicas. Suas moléculas são grandes, com peso molecular de 600 kd, e diferem das avermectinas em sua estrutura química (LANUSSE et al., 2009). Ela possui atividade semelhante à ivermectina, sobre os mesmos parasitas de bovinos e no Brasil, está disponível em formulação injetável nas concentrações de 0,2 mg/kg (ex: Exceller, Vallée; Cydectin, Zoetis) e 1 mg/kg (ex: Onix, Zoetis). A ivermectina e a moxidectina têm diferentes cinéticas no plasma e nos tecidos, que afetam a duração da atividade (LANUSSE et al., 1997). A via de excreção é a mesma da ivermectina. No entanto, a ivermectina tem atividade durante 14 a 28 dias, enquanto moxidectina possui maior período de atividade (14 a 42 dias), quando administradas em dose única, com uma formulação de ação não prolongada (PRICHARD et al., 2012). Porém, ivermectina e a moxidectina foram detectadas no plasma de bovinos, 80 dias após aplicação de 0,2 mg/kg de ambos os fármaco (LANUSSE et al., 1997). As lactonas macrocíclicas (ivermectina e moxidectina) apresentam atividade sobre helmintos, devido o GABA ser o seu principal neurotransmissor. No entanto, elas não apresentam atividade sobre cestódeos e trematódeos (SPINOSA et al., 2006), parasitas que não possuem receptores GABA.

25 Albendazol O albendazol é um fármaco endoparasiticida, e possui atividade sobre nematódeos gastrintestinais e pulmonares, cestódeos e trematódeos. Uma particularidade deste fármaco é que ele também possui atividade ovicida. No Brasil esta droga está disponível para bovinos em forma injetável, de sulfóxido de albendazol na concentração de 2,5 mg/kg (ex: Albendathor, Tortuga) e em formulação oral 5 mg/kg (ex: Albendazole, Matsuda). A biotransformação dos benzimidazóis ocorre primeiramente no fígado, onde o composto original é biotransformado por processos de oxidação (sulfoxidação) e hidroxilação em metabólitos ativos (sulfóxido) e inativos (sulfonas) que são eliminados basicamente pela urina (SPINOSA et al., 2006). Seu mecanismo de ação envolve dois modos: 1) Despolimerização da tubulina onde os microtúbulos, estruturas que compõem o citoesqueleto das células, modificam-se por processos de polimeralização das subunidades da proteína tubulina. A ligação dos benzimidazóis a tubulina do parasita resulta na sua despolimeralização, alterando os microtúbulos, interrompendo processos vitais para a função celular, como a divisão mitótica, transporte de nutrientes e alteram a forma da célula (SPINOSA et al., 2006); 2) Inibição da enzima fumarato-redutase nas reações mitocondriais - os benzimidazóis interferem no metabolismo energético do parasita, por inibirem a absorção ou o metabolismo da glicose, resultando no esgotamento das reservas energéticas, causando a morte do nematódeo por inanição (SPINOSA et al., 2006). A persistência do albendazol é relativamente curta, quando comparada as lactonas macrocíclicas. Cristofol et al. (2001) observaram a presença de sulfóxido de albendazol, em fluido abomasal, fluido intestinal e mucosa intestinal, até 32 horas após a administração de sulfóxido de albendazol 7,5 mg/kg em bovinos, por via intra-venosa (IV). No entanto, este fármaco não foi detectado no tecido dos parasitas 20 horas pós-tratamento. O principal mecanismo de resistência aos benzimidazóis envolve mudanças na estrutura primária de β- tubulinas, os blocos de construção de microtúbulos. Especificamente, as mutações pontuais no gene de β - tubulina isotipo 1, conduzindo a substituições de aminoácidos nos códons 167, 198 e 200 da proteína, têm sido associados com resistência em nematódeos. Estes polimorfismos de nucleotídeo único oferecem um meio de detectar a presença

26 de resistência dentro de populações de helmintos (SAMSON- HIMMELSTJERNA et al., 2007) Levamisol O levamisol pertence à classe dos imidazotiazóis, tem um amplo espectro de ação nematodicida, incluindo nematódeos gastrintestinais e pulmonares, e não apresentam atividade cestodicida e trematodicida. No Brasil este fármaco está disponível em formulação oral de cloridrato de levamisol na concentração de 5 mg/kg (ex: Ripercol L Solução, Zoetis), e injetável na concentração de 4,5 mg/kg (ex: Levamisol Injetável Matsuda, Matsuda). Segundo (Lanusse et al., 2009), os sais de fostato e cloridrato permitem formular o levamisole como uma solução estéril de administração subcutânea, intramuscular, oral ou intra-ruminal. Os imidazotiazóis são agonistas colinérgicos e penetram no parasito pela cutícula (SPINOSA et al., 2006). Sendo que o levamisol imita a acetilcolina e atua como um agonista dos receptores nicotínicos pós-sinápticos de acetilcolina, localizados na musculatura do nematódeo, e devido o levamisol não ser quebrado rapidamente (como a acetilcolina), ele induz a uma paralisia espástica, que permite a expulsão do parasita do hospedeiro (MARTIN et al., 2005). A resistência dos parasitas ao levamisol pode estar associada à seletividade deste fármaco a um determinado receptor colinérgico, sendo que Martin et al. (2005) observaram redução dos receptores colinérgicos do tipo-l, associados com a resistência ao levamisol Resistência Anti-helmíntica Após a introdução das drogas anti-helmínticas no mercado mundial em 1940, a utilização destes produtos para controle de parasitas de ruminantes, foi aumentando gradativamente e simultaneamente ao surgimento de novas drogas. No entanto, com o surgimento das drogas endectocidas entre 1980 e 1990, estes produtos passaram a ser utilizados em larga escala. Na TABELA 5 é possível observar o ano de introdução do anti-helmíntico no mercado, e o primeiro relato de resistência à respectiva droga, sendo que

27 existem relatos de resistência anti-helmíntica a todas as classes de medicamentos disponíveis no mundo. TABELA 5: Introdução de drogas anti-helmínticas para ruminantes e relatos de resistência anti-helmíntica as drogas. Compostos Heterocíclicos Nome Genérico da Droga Introduzido no Mercado Relato de Resistência Referência Fenotiazina Leland et al., 1957 Piperazina Drudge et al., 1988 Benzimidazóis Tiabendazol Drudge et al., 1964 Cambendazol Berger, 1975 Oxibendazol Drudge et al., 1985 Mebendazol Berger, 1975 Albendazol Cawthorne e Whitehead 1983 Febendazol Boersema e Lewingvan der Wiel 1982 Oxfendazol Le Jambre et al., 1981 Triclabendazol Mitchell et al., 1998 Imidazotiazóis e Tetrahydopirimidinas Levamisol Sangster et al., 1979 Pirantel Chapman et al., 1996 Oxantel Morantel Sangster et al., 1979 Lactonas Fim dos anos Abamectina Macrocíclicas Wooster et al., 2001 Ivermectina Wyk e Malan, 1988 Moxidectina Leathwick, 1995 Doramectina Borgsteede et al., 2007 Eprinomectina Loveridge et al., 2003 Classe Antihelmíntica Aminoacetonitrílicos (AAD) Spiroindole Monepantel Scott et al., 2013 Derquantel + Abamectina Adaptado de Graef et al. (2013) Kaminsky et al., 2011 O uso de anti-helmínticos simultaneamente em todas as categorias de bovinos, juntamente com o uso excessivo e sem critérios técnicos (DELGADO et al., 2009), provavelmente foi o fator principal do surgimento da resistência, sendo hoje difundida no mundo todo, conforme FIGURA 3.

28 FIGURA 3: Relatos de resistência anti-helmíntica em bovinos no mundo. No Brasil, os primeiros relatos de resistência anti-helmíntica em ruminantes ocorreram no Rio Grande do Sul. Em ovinos foi registrada a presença de H. contortus resistente ao Tiabendazol (SANTOS e GONÇALVES, 1967) e em bovinos Haemonchus spp. resistente ao oxfendazole e ao albendazole (PINHEIRO e ECHEVARRIA, 1990). Posteriormente, vários gêneros de nematódeos resistentes foram descritos em bovinos no Brasil (Tabela 6). A moxidectina foi à última droga lançada no mercado brasileiro (década de 90) para o controle de nematódeos de bovinos. Além de novas drogas não serem lançadas frequentemente, a última, como é o caso do monepantel para ovinos, são de alto valor, aumento os custos de produção. Portanto o uso consciente destes produtos atuais é imprescindível para a mantença dos que ainda possuem eficácia. Durante esta revisão sobre fármacos disponíveis no Brasil, para o closantel não foi encontrado relato de resistência anti-helmíntica em bovinos. Provavelmente a utilização desse produto é restrita devido ao fato de estar disponível apenas para uso oral, o que limita a sua aplicação em bovinos, pois, segundo Pereira (2011), 78,9% dos proprietários preferem a utilização de formulações injetáveis. Outra questão a ser observada, é que geralmente o nematódeo mais prevalente em rebanhos brasileiros é Cooperia spp., e dentre

29 os parasitas de ruminantes da superfamília Trichostrongyloidea, este fármaco é descrito com atividade apenas sobre Haemonchus spp. (SPINOSA et al., 2006). Por outro lado, em ovinos, já foram descritos casos de resistência anti- helmíntica de Haemonchus spp. ao closantel (ALMEIDA et al., 2010; ECHEVARRIA et al., 1996; RAMOS et al., 2002). TABELA 6: Casos de resistência anti-helmíntica em bovinos no Brasil. Classe Antihelmíntica Abamectina LA Dosagem Nematódeos espécies/genero Autor 0,2 mg/kg Haem., Coop., Tric. Cezar et al., 2010 Doramectina 0,2 mg/kg Haem., Coop., Oeso., Tric. Rangel et al., 2005; Cardoso et al., 2008; Cezar et al., 2010; Borges et al., 2013 Doramectina 0,7 mg/kg Haem., Coop., Oeso., Tric. Borges et al., 2013 Fosfato de Soutello et al., 2007; 4,7 a 5 mg/kg Haem., Coop., Tric., Oste. Levamisol Souza et al., 2008 Rangel et al., 2005; Soutello et al., 2007; Ivermectina 0,2 mg/kg Cezar et al., 2010; Lopes et al., 2009 Haem., Coop., Tric., Oste. Souza et al., 2008; Trichuris Cardoso et al., 2008; Ivermectina 0,8 mg/kg Haem., Coop. Cezar et al., 2010 Ivermectina 1,9 mg/kg Haem., Coop., Tric. Cezar et al., 2010 Cezar et al., 2010; Haem., Coop., Oeso., Tric., Ivermectina 0,6 a 0,63 mg/kg Borges et al., 2013; Oste., Trichuris Lopes et al., 2009 Ivermectina + Abamectina Ivermectina LA Moxidectin Sulfóxido de Albendazol 0,45 + 0,25 mg/kg Haem., Coop. 0,2 mg/kg Haem., Coop., Tric. 0,2 mg/kg Haem., Coop., Oeso., Tric.; Trichuris 2,5 a 3,75 mg/kg Haem., Coop. Cezar et al., 2010; Borges et al., 2013 Rangel et al., 2005; Cezar et al., 2010 Condi et al., 2009; Souza et al., 2010 Soutello et al., 2007; Souza et al., 2008; Cezar et al., 2010 Triclorfon 48,5 mg/kg Tric., Oeso. Lopes et al., 2009 Haem. (Haemonchus spp.), Coop. (Cooperia spp), Tric. (Trichostrongylus spp.), Oeso. (Oesophagostomum spp.), Oste. (Ostertagia spp.) Métodos de Diagnóstico de Resistência Anti-helmíntica Vários métodos para a detecção da resistência anti-helmíntica são descritos na literatura, sendo que os mais utilizados são os recomendados pela

30 Associação Mundial para o Avanço na Parasitologia Veterinária (WAAVP) (COLES et al., 2006, 1992). Os métodos podem ser in vitro e in vivo Métodos in vitro Teste de eclosão dos ovos Este teste é descrito para a detecção de resistência aos benzimidazóis. Consiste na incubação dos ovos em conjunto com diferentes concentrações de benzimidazol, e após o tempo determinado realiza-se a contagem dos ovos e larvas em cada poço da placa. O tiabendazol é usado devido à sua relativamente elevada solubilidade em água. A sensibilidade do tiabendazol diminui com a idade dos ovos, portanto há duas formas para sua utilização, com ovos frescos (coletados em no máximo 3 horas antes do teste), ou com ovos armazenados de forma anaeróbia. O teste detalhado é descrito por Coles et al. (2006) Teste de desenvolvimento larval Consistem na comparação do número larvas infectantes sobreviventes na presença ou não, de anti-helmíntico. Este teste é diferente em vários aspectos do teste de eclosão de ovos, por exemplo, a idade de ovos utilizados não é importante, e ao final do teste são comparadas as espécies/gêneros das larvas infectantes sobreviventes ao anti-helmíntico, em relação às espécies/gêneros encontradas nos poços do grupo controle. O teste atualmente só é confiável para os benzimidazóis e para o levamisol. No entanto, o teste não foi adequadamente avaliado para uso com nematódeos de bovinos, sendo mais utilizado para ovinos e equinos (COLES et al., 2006) Teste de base molecular (PCR) A técnica da PCR permite que um fragmento específico da molécula de DNA (parasitas adultos, ovos e/ou larvas infectantes) seja amplificado milhares de vezes, a fim de detectar e analisar a sequência alvo do estudo (genes relacionados à resistência), em comparação com primers específicos para resistência. Segundo Coles et al. (2006) este teste é indicado somente para o diagnóstico de resistência aos benzimidazóis, devido os mecanismos

31 moleculares de resistência para levamisol e/ou pirantel e lactonas macrocíclicas, ainda serem insuficientemente compreendidos Métodos in-vivo Métodos in-vivo com necropsia Teste de eficácia controlada Consiste na necropsia e quantificação da carga parasitária de helmintos (UENO e GONÇALVES, 1998). Não há dúvida de que o teste controlado é o mais preciso dos métodos de detecção de resistência. (TAYLOR et al., 2002) abordaram as dificuldades metodológicas relacionadas ao assunto e faz a seguinte menção à necropsia de animais: o teste controlado é o mais confiável para avaliar a eficácia antihelmíntica, mas também é o mais caro por ser extremamente laborioso e por requer o sacrifício dos animais. Por essa razão é pouco usado Métodos in vivo com exame de fezes Teste de redução da contagem de ovos nas fezes (FECRT) - consiste na comparação da contagem de OPG do grupo tratado em relação ao grupo não tratado, e/ou na comparação da redução de OPG do grupo após tratamento, em relação ao mesmo grupo antes do tratamento; Segundo Coles et al. (2006) para realização do FECRT em bovinos, são necessários no mínimo 15 animais (por grupo), realiza-se uma coleta prévia onde são selecionados os animais com contagem individual 150 OPG, distribuem-se os lotes a partir dos valores de OPG e realiza-se a administração dos anti-helmínticos a serem avaliados. A segunda coleta é realizada de acordo com a base anti-helmíntica utilizada, sendo de 3 a 7 dias póstratamento para Levamisol, 8 a 10 dias para os benzimidazóis e para as lactonas macrocíclicas que possuem maior persistência no organismo, 28 dias pós-tratamento. O FECRT é o principal método para a detecção da resistência antihelmíntica, e pode ser utilizado para detectar a presença de nematódeos gastrintestinais com resistência a todos os grupos de anti-helmínticos (COLES et al., 2006). Porém, existe grande necessidade de melhoria dos métodos de detecção de resistência anti-helmíntica.

32 Vários fatores dificultam o diagnóstico da resistência em bovinos. Em primeiro lugar, recomenda-se que os grupos de animais a serem tratados com os diferentes produtos, sejam constituídos por pelo menos 15 animais, com contagens mínimas de 150 OPG (COLES et al., 2006, 1992). Frequentemente, a maioria dos animais do rebanho, mesmo jovens, apresenta baixa contagem de OPG. Além disso, a maioria das propriedades não tem número de animais suficientes para o teste simultâneo de várias drogas (FIGURA 4). Por exemplo, 75 animais com contagem superior a 150 OPG seriam necessários para se testar quatro anti-helmínticos, mantendo-se um grupo, não tratado, como controle. Portanto, faz-se necessário o desenvolvimento de novas abordagens para o diagnóstico da resistência anti-helmíntica, buscando a melhoria dos métodos já existentes e/ou introdução de novos métodos a fim de melhorar a detecção da resistência, minimizando a quantidade de animais envolvidos e consequentemente diminuindo os custos FIGURA 4: Coleta de fezes (A), administração de anti-helmíntico (B) e bovinos jovens utilizados na pesquisa (C).

33 Técnicas de Contagem de OPG para Diagnóstico Anti-helmíntico Contagem de OPG em Câmara de McMaster Esta é a técnica mais utilizada pela comunidade científica, para a contagem de OPG. Esta técnica foi descrita inicialmente por Gordon e Whitlock (1939), e é comumente empregada para a contagem de OPG de ovos de nematódeos gastrintestinais de ruminantes. Esta técnica é realizada da seguinte forma: Pesar de 4 gramas de fezes bovinas coletadas diretamente do reto; Colocar as fezes em um recipiente (ex: copo plástico, becker), acrescentando-se 56 ml de solução hipersaturada (com gravidade de 1,120 a 1,200 gramas/ml) de NaCl ou sacarose; Triturar as fezes com auxílio de bastão de vidro; Filtrar em gaze, com o auxílio de peneira, para outro recipiente; Homogeneizar o filtrado, e com auxílio de pipeta, retirar uma pequena quantidade da amostra e preencher os dois lados da câmara; Aguardar 1 a 2 minutos, para realizar a contagem nos dois lados da câmara em objetiva com aumento de 10x do microscópio; O resultado do OPG se dá pelo resultado do total de ovos encontrados nos dois lados da câmara, multiplicado por 50 (ex: 5 ovos encontrados x 50, é igual a 250 OPG); Vários trabalhos demonstram que existe correlação significativa entre o OPG e número total de helmintos adultos (BRICARELLO et al., 2007; GIRÃO et al., 1985) fato este que torna esta técnica tão difundida nos testes de resistência anti-helmíntica, além da praticidade, rapidez, baixo custo e não necessitar de equipamentos auxiliares (ex: centrífuga). No entanto, a técnica para a contagem de OPG em câmara de McMaster, apresenta limitações, especialmente em bovinos, que com frequência apresentam contagens reduzidas de ovos nas fezes, o que dificulta a interpretação dos resultados Contagem de OPG em Câmara Flotac Pesquisadores italianos (CRINGOLI et al., 2010) desenvolveram uma nova câmara denominada Flotac (FIGURA 5), para o diagnóstico de nematódeos, cestódeos, trematódeos e protozoários em diferentes espécies

34 animais como: bovinos, búfalos, ovinos, caprinos, gatos, cães, equinos e humanos FIGURA 5: Câmaras de McMaster (A) e Câmaras de Flotac (B). Nesta técnica foram avaliadas diferentes soluções de flutuação (sacarose, cloreto de sódio (saturada), sulfato de zinco, nitrato de sódio, sacarose + iodo mercurato de potássio, sulfato de magnésio, iodo mercurato de potássio e sulfato de zinco + iodo mercurato de potássio) em diferentes densidades (1,20, 1,25, 1,28, 1,35, 1,44 e 1,45 gramas/ml), e foram determinadas as soluções e densidades específicas para cada espécie/gênero de parasita avaliado (CRINGOLI et al., 2010). A eficiência de diferentes soluções e densidades para o diagnóstico de parasitas em fezes frescas de bovinos, búfalos, ovinos e caprinos são descritas na TABELA 7: As amostras fecais de herbívoros (bovinos, búfalos, equinos, ovinos e caprinos) podem ser coletadas e armazenadas da mesma forma, sendo coletadas diretamente do reto, em sacos plásticos individuais, armazenadas a 4 ºC e processadas dentro de 24 a 48 horas (CRINGOLI et al., 2010). A técnica Flotac para o diagnóstico de parasitas de herbívoros é realizada da seguinte forma: Pesagem de 10 gramas de fezes; Coloca-se as fezes em recipiente (copo plástico/becker) e acrescenta-se 90 ml de água; Homogeneizar a amostra; Transferir para outro recipiente, filtrando-a com auxílio de peneira; Homogeneizar, pipetar e transferir 11 ml do filtrado para um tubo; Centrifugar a r.p.m. por 3 minutos;

35 Descartar o sobrenadante; Adicionar a solução de flutuação no tubo até o nível de 11 ml e homogeneizar com pipeta; bolhas de ar; Preencher os dois lados da câmara, com cautela para evitar Centrifugar a r.p.m. por 5 minutos; Abrir parcialmente a câmara (este passo requer treinamento do técnico, portanto ver no artigo original); Realizar a contagem dos dois lados da câmara; A quantidade de ovos encontrada será expressa em OPG, sem a necessidade de fator multiplicação (ex: 182 ovos encontrados = 182 OPG); A técnica em câmara Flotac, quando comparada com os métodos Cornell-Wisconsin e em câmara de McMaster, forneceu resultados mais confiáveis para o teste de redução na contagem de ovos por grama de fezes, e menor viés principalmente em rebanhos com baixo (1-49 OPG) nível de excreção de ovos de helmintos (LEVECKE et al., 2012). TABELA 7: Eficiência de diferentes soluções de flutuação e densidades, para o diagnóstico de ovos, oocistos e larvas de 1º estágio de parasitas de bovinos, búfalos, ovinos e caprinos, utilizando a técnica Flotac. Parasita Forma Parasitária Solução de Flutuação (SF) e Densidade (D) SF1 SF2 SF3 SF4 SF5 SF6 SF7 SF8 SF9 D D D D D D D D 1,20 1,20 1,20 1,20 1,25 1,28 1,35 1,44 Eimeria spp. Oocistos Estrongilídeos Gastrintestinais Ovos Moniezia spp. Ovos Fasciola hepatica Ovos (Cascas) Calicophoron daubneyi Ovos (Cascas) Dicrocoelium dendriticum Ovos Vermes pulmonares Larva 1º estágio SF1 (solução de sacarose), SF2 (solução de cloreto de sódio saturada), SF3 (sulfato de zinco), SF4 (nitrato de sódio), SF5 (sacarose + iodo mercurato de potássio), SF6 (sulfato de magnésio), SF7 (sulfato de zinco), SF8 (iodo D 1,45

36 mercurato de potássio) e SF9 (sulfato de zinco + iodo mercurato de potássio); +++ (maior eficiência), ++ (eficiente), + (baixa eficiência), - (não sugerido) Fórmulas Matemáticas para o Cálculo do FECRT Várias fórmulas matemáticas (FM) são descritas na literatura para o cálculo do FECRT, sendo que há uma divergência entre estudos. George et al. (2011) avaliaram diferentes fórmulas para o teste FECRT descritas por vários autores sendo: FM 1 - (DASH et al., 1988): FECRT (%) = 100 x [1 - (T2/T1) (C2/C1)]; FM 2 - (COLES et al., 1992): FECRT (%) = 100 x [1-(T2/C2)]; FM 3 - (KOCHAPAKDEE et al., 1995): FECRT (%) = 100 x [1 - (T2/T1)]; FM 4 - (MCKENNA, 2006): FECRT (%) = 100 x [1 - (T2/C1)]; onde T1 e T2 = média aritmética do OPG do grupo tratado no pré e póstratamento, e C1 e C2 = média aritmética do OPG de um grupo não tratado (Controle) no pré e pós-tratamento, respectivamente e os resultados obtidos do cálculo das FECRT (%) por estes quatro métodos diferentes, revelaram estimativas muito próximas (GEORGE et al., 2011). No entanto, a utilização FM 3 seria mais relevante para estimar a redução na contagem de ovos, devido não precisar do grupo de controle. Em concordância, Calvete e Uriarte (2013), também recomendam o FM 3, que possui maior acurácia para quantificar a redução na contagem de ovos nas fezes, em comparação a fórmula FM 2. McKenna (2006) também avaliou estas quatro fórmulas e observou que a FM 3 demonstra maior sensibilidade em relação a FM 1 e FM 2, porém especificidade idêntica às demais fórmulas. Sendo que, segundo o autor, as definições de sensibilidade e especificidade são as seguintes: Sensibilidade é a porcentagem de casos de resistência anti-helmíntica corretamente diagnosticados como resistentes pelo FECRT; Especificidade é a porcentagem de casos não resistentes corretamente diagnosticados como suscetíveis pelo FECRT; A sensibilidade e especificidade do FECRT são estimadas por comparações com testes de abate controlado: a resistência anti-helmíntica é considerada presente quando a eliminação de parasitas é inferior a 95% da carga parasitária total após o tratamento anti-helmíntico (MCKENNA, 2006).

37 É consensual entre estes autores que o FM 3, que compara os mesmos animais antes e após o tratamento anti-helmíntico, é a fórmula matemática mais indicada para o FECRT. No entanto, para um anti-helmíntico ser eficaz ele deve promover redução superior a 95% na contagem de ovos por grama de fezes, com limite inferior do intervalo inferior de confiança a 95%, maior ou igual a 90%, limite este que às vezes é incorretamente determinado nos métodos atuais. Dobson et al. (2012) propõem uma nova metodologia, sendo a substituição da média da contagem de OPG, pela contagem total de ovos encontrados (FECRT (%) = 100 x [1 - (soma da contagem total de ovos do T2/soma da contagem total de ovos do T1)]. Deste modo, a amplitude entre o limite superior e inferior do intervalo de confiança a 95% é diminuída, aumentando a precisão do intervalo de confiança. Devido os fatores apresentados nesta revisão, o objetivo desta pesquisa foi comparar duas técnicas e duas fórmulas matemáticas, a fim determinar qual é a melhor abordagem metodológica para o correto diagnóstico de resistência anti-helmíntica em bovinos.

38 Trabalho Científico Nas páginas a seguir encontra-se o manuscrito a ser encaminhado à revista Veterinary Research, no formato Original research papers (Regular Papers). Após a defesa o artigo será corrigido e encaminhado à revista. Resumo das normas da revista: 1º Os manuscritos devem ser escritos em Inglês; 2º Ter as linhas numeradas, com margens amplas e espaçamento duplo por toda parte; 3º Manuscrito deve ser organizado na seguinte ordem: título, nome dos autores, endereço postal completo de filiações, telefone, , endereço, resumo, palavras-chave, introdução, material e métodos, resultados, discussão, conclusão, agradecimentos, referências, tabelas, figuras; 4º Títulos e subtítulos não devem ser executados dentro do texto, devem ser digitados em uma linha separada, sem recuo, em letras minúsculas; 5º Usar unidades do Sistema Internacional.

39 Diagnosis of anthelmintic resistance in cattle José Henrique das Neves a *, Nadino Carvalho a, Alessandro F. T. Amarante a a UNESP Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Departamento de Parasitologia, IBB, CEP , Botucatu, SP, Brazil. *Corresponding author: nevesjh@fmvz.unesp.br Abstract The anthelmintic resistance in cattle has become a global problem, and in Brazil it has been reported in some states. Due to the need for more accurate methods of diagnosis of anthelmintic resistance the purpose this work was to evaluate two techniques (McMaster and Flotac) and two mathematical formulas (FECRT1 - according to the average EPG and FECRT2 - according to the total number of eggs shown) to calculate the reduction of eggs in stool test (FECRT) in the diagnosis of anthelmintic resistance in cattle. The anthelmintic tested were ivermectin (0.2 mg/kg), moxidectin (0.2 mg/kg), albendazole sulfoxide (2.5 mg/kg) and levamisole phosphate (4.7 mg/kg), administered at the dose recommended by the manufacturer. Ten farms were assessed, four visits in each pre -treatment (D-2), processing (D0), 10 days after treatment (D10) and 28 days post-treatment (D28). In all of the properties was observed resistance to one or more anthelmintics tested, regardless of the technique (McMaster or Flotac) or FECRT the mathematical formula (1 and 2). The genera/species found with resistance to one or more anthelmintics were Haemonchus placei, Cooperia spp., Trichostrongylus spp. and Oesophagostomum radiatum. In conclusion, the anthelmintic resistance is present in all herds evaluated. The Flotac technical and mathematical formula FECR2 were more accurate than the McMaster technique and formula FECR1.

40 Need is greater awareness of the producers on the use of anthelmintics. Therefore, in future studies on anthelmintic resistance in cattle, use of the method of diagnosis with higher accuracy, it is recommended, as is the case Flotac method. In interpreting the results, our study indicates that the calculation by formula FECR2 %, which eliminates the use of a control group, should be recommended Introduction Parasitism by gastrointestinal nematodes (GIN) is a cause of significant losses in cattle industry, due to productivity decrease and high costs with drugs used in the prophylaxis of infections. Although the infection by GIN may cause death, the main loss is due to a reduction in body weight gain of young animals. Steers with GIN infections showed a decrease of more than 11 kg in body weight gain when evaluated during 112 days (Borges et al., 2013). Administration of anthelmintic drugs is the most used method for the prophylaxis of helminth infections, however, it has been applied indiscriminately. In the state of Minas Gerais, it has been shown that in the 69.1% of the 1289 properties analyzed, the farmers did not have any knowledge about the control of helminth infections of cattle (Delgado et al., 2009). Most owners treated animals of all categories with anthelmintic without any technical criteria, and the main drugs used were those belonging to the avermectin class (Delgado et al., 2009). As a result of indiscriminate use, anthelmintic resistance has become a global problem in cattle industry, with numerous reports on different countries, such as Algeria (Bentounsi et al., 2012), Argentina (Fazzio et al., 2012), UK (Bartley et al., 2012), USA (Yazwinski et al., 2013) and New Zealand (Leathwick and Miller, 2013). In Brazil there are reports of resistance, especially involving Haemonchus spp. and Cooperia spp. in

41 the states of Minas Gerais (Lopes et al., 2009; Rangel et al., 2005), São Paulo (Borges et al., 2008; Condi et al., 2009; Soutello et al., 2007), Santa Catarina (Souza et al., 2008), Rio Grande do Sul (Cezar et al., 2010) and Mato Grosso do Sul (Borges et al., 2013). The primary method used for the diagnosis of anthelmintic resistance is the faecal egg count reduction test ( FECRT ), which can be used to detect the presence of GIN resistant to all groups of anthelmintics (Coles et al., 2006). However, there is a great need for improved methods of detecting anthelmintic resistance. Several factors complicate the diagnosis of resistance in cattle. Firstly, it is recommended that each group of animals should have at least 15 animals, with a minimum of 150 eggs per gram of faeces (EPG) (Coles et al., 1992). Often, most of the animals in a herd, even young, have low faecal egg counts (FEC). Furthermore, most of the properties do not have a sufficient number of animals allow testing several drugs simultaneously. For example, 75 animals with more than 150 EPG would be needed to test four anthelmintics, considering also an untreated control group. An innovation was introduced by Dobson et al. (2012) in a formulae which uses the total number of eggs counted rather than eggs per gram of faeces to determine the efficacy. This approach focuses attention on how many eggs are observed, rather than the number of animals in each group or the egg detection level. They suggest that rather attempting to estimate the mean, the effort would be better directed to counting a large number of eggs pre-treatment from high shedding animals (e.g. the four animals in the group with the highest counts) and then counting the same animals with the same degree of sensitivity post-treatment, thus avoiding the low or zero egg producing animals. These animals contribute greatly to the variance but provide little useful information to the estimate of efficacy. The required paradigm shift is to ignore the animal as the experimental unit, regarding the egg as the unit of interest (Dobson et al., 2012).

42 Therefore, it is necessary to develop new approaches for the diagnosis of anthelmintic resistance. In this study, we investigated the occurrence of anthelmintic resistance to levamisole, albendazole, ivermectin and moxidectin in cattle from ten properties using two techniques for counting eggs in faeces, McMaster (Ueno and Gonçalves, 1998) and Flotac (Cringoli et al., 2010), and also two mathematical formulas used to calculate the efficacy of the anthelmintic treatments Materials and methods This work was developed in accordance with the ethical principles of animal experimentation and was approved by the local ethics committee on animal use (protocol 44/2012/CEUA-FMVZ) Description of Cattle Herds and Management Ten cattle farms located in São Paulo State, Brazil (Fig. 1) were evaluated from May 2012 to June The presence of balance for weighing animals was prerequisite for the test to be carried out on the property in order to enable the accurate administration of the anthelmintic doses. The total area of the properties ranged from 121 to 1815 hectares and the number of cattle in each ranged from 210 to 800 heads; the age, sex and breed of animals in each farm are presented in Table 1. The bovines did not receive any anthelmintic treatment within eight weeks prior to the experiment Experimental description. The bovines were allocated into experimental groups based on their previous stratification according to their FEC obtained by the Flotac method, perfomed in individual faecal samples two days before treatment. The animals were classified into

43 FEC classes of five animals each. Randomly, one bovine of each class was allocated to the following groups: Group 1 - treated with injectable ivermectin (0.2 mg/kg of body weight (BW), Ivomec, Merial, Brazil); Group 2 - treated with injectable moxidectin (0.2 mg/kg BW, Cydectin, Fort Dodge, Brazil); Group 3 - treated with injectable albendazole sulphoxide (2.5 mg/kg; Albendathor, Tortuga, Brazil); Group 4 - treated with injectable levamisole phosphate (4.7 mg/kg BW, Ripercol, Fort Dodge, Brazil); and Group 5 - control (not treated). Animals were treated with each anthelmintic according to the manufacturer's instructions and the number of animals in each group ranged from 8 to 11, depending on the number of young animals available in each farm (Table 1) Faecal examination Faecal samples from each animal were collected two days before the treatment (D-2) and again 10 and 28 days post treatment. Samples were individually processed using the modified McMaster technique with a sensitivity of 50 eggs/g (Ueno and Gonçalves, 1998) and the Flotac Dual technique with a sensitivity of 2 eggs/g (Cringoli et al., 2010). On the same collection days, composite faecal cultures were prepared for each group to obtain and differentiate third stage larvae into parasitic genus (Amarante, 2011; Ueno and Gonçalves, 1998; Wyk and Mayhew, 2013). In the case of Haemonchus larvae, the distance between the tip of the larval tail and the end of the sheath tail were measured. Those larvae with mean (±standard error) measures 99.2±0.70 µm were identified as Haemonchus placei, while those with average (standard error) of 57.3±0.80 µm were identified as Haemonchus similis (Amarante, 2011). 660

44 Statistical analysis The faecal egg count reduction (FECR) estimation methods were calculated according to the following formulae: FECR-1=100 (1 (T2/C2)), where T2 and C2 are the post-treatment arithmetic means of the individual epg counts for the treated and control groups, respectively (Coles et al., 1992). FECR-2=100 (1 (T2/T1)), where T1 and T2 represented the total pre- and post-treatment faecal nematode egg counts of a treated group. The lower 95% confidence limits (LCL) was estimated from the cumulative inverse beta distribution by: 95%LCL = 100 (1 (BETAINV(0.975, x + 1, n x + 1))), while the 95% upper-cl (UCL) was estimated by: 95%UCL = 100 (1((BETAINV(0.025, x + 1, n x + 1))) according to descriptions by Dobson et al. (2012). In both cases, there resistance was considered present when FECR was lower than 95% and the lower confidence interval limit (95%) was lower than 90%. When only one of those parameters was identified, there was just suspect resistance (Coles et al., 1992) Results 3.1. History of use and criteria for choice of anthelmintics In all farms, the administration of anthelmintics was the only approach used to control GIN infections. The frequency of anthelmintic treatments ranged from 2 to 12/year, and all farms used mostly macrocyclic lactones, especially ivermectin (Table 1), due to its action also against ectoparasites. Albendazole and levamisole and were also used, respectively in one and five farms. In only one property (Farm 1), the animals were weighed before administration of anthelmintic. In the other farms the dose was

45 calculated based on visual estimation of the body weight. Most owners drenched the cattle in combination with the vaccine against foot-and-mouth disease, following the official national calendar of prophylaxis of this disease. One farm reported that the administration was performed when the animals had clinical signs of parasitism (Farm 5). In 6 farms, treatments were administered in all animals of the herd, in two, only animals up to 18 months old were treated Comparison of parasitological techniques and formulas used to calculate the efficacy In the data analysis, due to the higher values of variance, the efficacy calculated with data obtained with the McMaster method always presented confidence intervals with higher width than those obtained with the FLOTAC method. Therefore, using data from McMaster, there were suspected resistance in some cases, even with high efficacy (FECR > 95%), due to the lower limit of the confidence interval being less than 90%. For example, in farms 5 and 7 levamisole showed high efficacy based on the values obtained with the FLOTAC method 10 days after treatment (Table 2). On the other hand, suspected presence of resistant nematodes was recorded in those properties based on results by the McMaster method, i.e., a false diagnosis of suspect anthelmintic resistance. The two formulas employed to calculate the efficacy presented coinciding results. One of the few exceptions occurred in the property 9, 28 days after treatment with moxidectin. With the use of EPG values obtained with FLOTAC method, it is observed that the efficacy was relatively low, 75.6 % (CI = 91, 36) with the FECR1 formula, which uses data from the untreated control group for the calculation of efficacy. With the use of FECR2 formula, the drug would be considered effective with

46 % reduction (CI = 96, 94). This discrepancy in results was due to the sharp reduction in the EPG values that occurred in animals of the control group in that property (Table 3). Since the formula FECR1 uses the values of the control group to calculate the efficacy, there was bias in the result obtained with this formula. As regards the definition of the day post treatment for collecting samples, the results indicate no need for collection on two dates. In evaluation of albendazole, levamisole and ivermectin, results obtained 10 days post treatment are satisfactory. On the other hand, in the case of moxidectin, it is preferable the late sampling, in the case 28 days post treatment Nematodes with resistance Due to greater accuracy and precision, results obtained through FLOTAC method and the FECR2 formula were considered for determining the presence of anthelmintic resistance in the farms. Excepting farm 1 for albendazole and farm 6 for levamisole, these anthelmintics showed high efficacy against GIN (Tables 4 and 2). After treatment with albendazole, Cooperia larvae were predominant corresponding to 100% of the larvae in 13 of the 15 fecal cultures that yield third stage larvae (Table 4). Relatively high percentages of Trichostrongylus spp. (in farms 3 and 7) and Haemonchus placei (in farms 2 and 9) were found after treatment with levamisole, although Cooperia spp. have also prevailed in cultures (Table 2). In general, ivermectin proved totally ineffective (Table 5). The low efficacy of ivermectin was observed in all the properties already at the early sampling at 10 days after treatment. Besides Cooperia spp., most of the farms presented relatively high percentage of Haemonchus placei with resistance. The results also indicated the

47 presence of Oesophagostomum radiatum (Farms 2, 4, 6 and 10) and Trichostrongylus spp. (Farm 3) with resistance. Moxidectin showed efficacy superior to 95% only in Farm 9, 28 days after treatment (Table 6). The percentage of nematodes in fecal cultures were similar to those reported after treatment with ivermectin, calling attention farm 3 that showed 82% and 72% Trichostrongylus spp. 10 and 28 days after treatment with moxidectin, respectively (Table 6) Discussion In the present study it was possible to evaluate different approaches to detect anthelmintic resistance in cattle showing different degrees of infection by GIN: (1) two techniques to perform faecal egg counting, McMASTER with a sensitivity of 50 EPG and FLOTAC with a sensitivity of 2 EPG; (2) two formulas employed to determine the anthelmintic efficacy; and (3) two different periods for sampling, 10 and 28 post anthelmintic treatment. Our results indicated that the most reliable results were obtained using the FLOTAC technique associated with the FECRT2 formulae that compares pre and post treatment FEC in the same group. In agreement with our results, (Levecke et al., 2012) reported that FLOTAC provided the most precise FECRT results (inversely correlated with width of the 95% CI of the FECRT), while CORNELL-WISCONSIN and McMASTER gave similar imprecise results. However, according to those authors the true drug efficacy is likely to be underestimated when FEC are low and drugs are more efficacious, this regardless of the analytic sensitivity of the FEC method. The McMASTER has been the most used method in surveys of anthelmintic resistance due to its simplicity, however lacks sensitivity. Before the anthelmintic treatment, eggs were detected in all samples by the FLOTAC method, but some of them

48 did not present eggs by the McMASTER method. Therefore, the FLOTAC method allowed the use of animals with light infections, that otherwise would be discarded. This is of pivotal importance in studies with cattle that usually shed small number of eggs per gram of faeces. The number of animals per group is another limiting factor for the realization of FECRT in cattle herds. (Coles et al., 2006, 1992) recommended at least 15 cattle per group with FEC 150 EPG. This requirement would make impractical to perform the FECRT in most of the cattle farms. In the present study, for example, due to the difficulty of obtaining farms with a large number of cattle, we used groups with 8-11 animals. In addition, it was possible to carry out the trial in farms where animals were presenting low mean FEC, such as Farms 1 and 10. Regarding the formula used to determine the efficacy, overall the results obtained by the formula FECRT2 (Dobson et al., 2012) proved more reliable than the FECRT1, decreasing the width of the confidence interval and, therefore, avoiding false diagnosis of anthelmintic resistance. The approach with FECR2 formulae presents the additional advantage of not requiring a control group, so fewer animals to the test and, therefore smaller number of samples to be processed in the laboratory. In other studies, there was also indication that methods based on group averages calculated from individual FECs (individual-based FECRT method) performed without a control group (FECRT2=100 (1 [T2/T1])) are the most appropriate to quantify the anthelmintic resistance (Cabaret and Berrag, 2004; Calvete and Uriarte, 2013; George et al., 2011) in comparison with methods that uses data from non treated control group to determine the efficacy (Coles et al., 1992). Our results demonstrate that the late collection of faeces (28 days post treatment) is useful only if moxidectin is being subject to evaluation, otherwise, a single collection around 10 days post treatment is enough to determine the efficacy of anthelmintics,

49 including ivermectin. This time is important due to the short pre-patent period of some nematodes like Cooperia punctata that reach patency days post infection (Wood et al., 1995). The presence of this genus in fecal culture by day 28 days post treatment, associated with high FEC, can occur due to reinfection after elimination of anthelmintic by the host organism, especially in the case of levamisole and albendazole that present a short period of activity after administration, which differs from the avermectins that may have activity for days and from moxidectin that has the longest period of activity, from 14 to 42 days, depending on the target species (Prichard et al., 2012). In two farms (1 and 4) moxidectin would be considered with high efficacy taking into consideration only the sampling at 10 days post treatment. However, the efficacy proved to be lower when the samples were taken 28 days post treatment. Apparently, MOX decreased the number of eggs in female Cooperia spp. worms that survived the treatment (Condi et al., 2009; Graef et al., 2013), which is not the case of IVM (Graef et al., 2013). Therefore, our results showed that the FECRT is not a reliable assay to detect MOX resistance when samples were collected 10 days after treatment, while it was possible to detect resistance 28 days later, when worms possibly recover the normal fecundity. Cezar et al. (2010) also found that moxidectin provided a reduction of 95% and 100% in FEC at 7 and 14 days after treatment, respectively. However, this effect was not confirmed in the sample taken 21 days after treatment. Only 3 of the 10 farms had used moxidectin previously, but 9 of them had resistance to this drug, possibly as a result of lateral resistance due to selection pressure caused by the constant use of ivermectin. Although ivermectin and moxidectin belong to the same family of macrocyclic lactones, they have similar but not identical, spectral ranges of activity. Some important differences between moxidectin and avermectins in interaction with various invertebrate ligand-gated ion channels are known and could be

50 the basis of different efficacy and safety profiles. Profound differences between moxidectin and the avermectins are seen in interactions with ABC transporters in mammals and nematodes (Prichard et al., 2012). The highest degree of resistance to moxidectin occurred on farm 10, precisely the farm that had been using this anthelmintic in a formulation with high concentration (moxidectin 10%, 1.0 mg/kg, Onyx, Zoetis). In this case, the high selection pressure resulted in Cooperia spp. and Oesophagostomum radiatum populations with a high degree of resistance. Such moxidectin resistance had been reported previously in cattle raised in Brazil (Condi et al., 2009; Rangel et al., 2005; Soutello et al., 2007). In general, our results confirmed the lack of efficacy of ivermectin against GIN in accordance with other studies carried out in Brazil (Borges et al., 2013; Soutello et al., 2007; Souza et al., 2008). The main parasites found with resistance to ivermectin were Haemonchus placei and Cooperia spp., in agreement with Rangel et al. (2005) and (Borges et al., 2008). The resistance of Trichostrongylus spp. to macrocyclic lactones has been described to a lesser extent (Cezar et al., 2010), corroborating the results of this work. Suspected resistance of Haemonchus similis to moxidectin in one farm and to levamisole in three farms was also found. There is no report of H. similis with anthelmintic resistance. Therefore controlled efficacy trial for this confirmation is required. The severity of the anthelmintic resistance involving ivermectin is certainly a reflection of the lack of criteria and excessive use of anthelmintics, especially avermectins (Delgado et al., 2009). The low efficacy of avermectins is an important cause of economical loss, due to expenses on ineffective products, management costs and reduced productivity. This finding reinforces the importance of the routinely use of methods to evaluate anthelmintic efficacy in cattle. However, it is not an easy task

51 convincing farmers about the need to invest in such tests, because GIN infections in cattle are usually subclinical and losses are not perceived by the farmers (Cezar et al., 2010). In conclusion, anthelmintic resistance to macrocyclic lactones are present in all herds evaluated, and the awareness of farmers about the rational use of anthelmintics is pivotal for the maintenance of the efficacy of other products, such as levamisole and albendazole, which still demonstrated high efficacy in most of the farms evaluated. In surveys about anthelmintic resistance in cattle, the use of diagnostic method with higher accuracy is recommended, as is the case FLOTAC method, which allows the use of a smaller number of animals, being an alternative for small producers. In interpreting the results, our study indicates that the calculation of efficacy by FECR2 formulae (Dobson et al., 2012), which eliminates the use of a control group, should be recommended Acknowledgements The authors would like to thank the technical assistance of César C. Bassetto, Maurício O. Wilmsen, Maria R.L. Silva, and Michelle C. Santos. José Henrique das Neves and Nadino Carvalho received financial support from CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior) and A.F.T. Amarante from CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico). Reference Amarante, A.F.T., Why is it important to correctly identify Haemonchus species? Rev. Bras. Parasitol. Veterinária 20, Bartley, D.J., McArthur, C.L., Devin, L.M., Sutra, J.F., Morrison, A.A., Lespine, A., Matthews, J.B., Characterisation of macrocyclic lactone resistance in two field-derived isolates of Cooperia oncophora. Vet. Parasitol. 190,

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