Boletim de Pesquisa 126 e Desenvolvimento ISSN Julho, CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO focalizando a bananeira

Transcrição

1 Boletim de Pesquisa 126 e Desenvolvimento ISSN Julho, 2006 CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO focalizando a bananeira

2 ISSN Julho, 2006 Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento 126 CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO focalizando a bananeira Kazumitsu Matsumoto BRASÍLIA - DF 2006

3 Exemplares desta edição podem ser adquiridos na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia Serviço de Atendimento ao Cidadão Parque Estação Biológica, Av. W/5 Norte (Final) Brasília, DF CEP Caixa Postal PABX: (61) Fax: (61) e.mail:sac@cenargen.embrapa.br Comitê de Publicações Presidente: Sergio Mauro Folle Secretário-Executivo: Maria da Graça Simões Pires Negrão Membros: Arthur da Silva Mariante Maria Alice Bianchi Maria de Fátima Batista Maurício Machain Franco Regina Maria Dechechi Carneiro Sueli Correa Marques de Mello Vera Tavares de Campos Carneiro Supervisor editorial: Maria da Graça S. P. Negrão Normalização Bibliográfica: Maria Iara Pereira Machado Editoração eletrônica: Maria da Graça S. P. Negrão 1ª edição 1ª impressão (2006): M 434 Matsumoto, Kazumitsu. Cultura de células em suspensão focalizando a bananeira. / Kazumitsu Matsumoto. Brasília, DF : Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, p. - (Boletim de Pesquisa e Desenvolvimento / Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, ISSN ; 126). 1. Musa. 2. Banana cultura de células. 3. Calo. 4. Micropropagação. 5. Melhoramento. 6. Conservação. 7. Protoplasto I. Título. II. Série CDD 21

4 SUMÁRIO RESUMO...5 ABSTRACT Introdução Estabelecimento de Cultura Asséptica e Indução de calos Estabelecimento de Células em Suspensão, Multiplicação e Regeneração de Plantas Aclimatação e Sementes Sintéticas Melhoramento de plantas Métodos auxiliados por cultura de embriões e ápices caulinares Métodos auxiliados por cultura de células e protoplastos Prospectos Protocolos Protocolo básico para cultura de células e regeneração de plântulas Protocolo para obtenção e cultura de protoplastos [Matsumoto & Oka...18 REFERÊNCIAS

5 CULTURA DE CÉLULAS EM SUSPENSÃO focalizando a bananeira Kazumitsu Matsumoto 1 RESUMO Cultura de células em suspensão consiste em técnicas de indução, propagação e manutenção de células em uma forma de suspensão em meio líquido de cultura. É uma ferramenta muito útil para micropropagação, melhoramento genético e conservação de recursos genéticos de plantas. Tem sido intensivamente estudada em bananeira porque maiorias das suas variedades cultivadas não produzem sementes e tem grande importância não só cientificamente mas também economicamente. Neste artigo, foi revisada a cultura de células em suspensão de bananeira dividindo etapas de estabelecimento de cultura asséptica, indução de calos, estabelecimento de células em suspensão, multiplicação de células, regeneração de plantas e aclimatação. Foram também revisadas suas aplicações para melhoramento genético de plantas. Foram finalmente descritos protocolos laboratoriais das culturas de células e de protoplastos como uma etapa avançada. Palavras chaves: Musa, calo, micropropagação, melhoramento, conservação, protoplasto. 1 Embrapa- Recursos Genéticos e Biotecnologia, PqEB, Final, Av W5 Norte, , Brasília-DF, Brasil. kazumoto@cenargen.embrapa.br

6 CELL SUSPENSION CULTURE focusing to banana plant ABSTRACT Cell suspension culture consists in techniques of cell induction, propagation and maintenance in the form of suspension in liquid culture medium. It is a very useful tool for plant micropropagation, breeding and genetic resources conservation. It has been intensively studied in banana because most of the cultivated varieties do not produce seeds and has a great importance not only scientifically but also economically. In this article, the banana cell suspension culture was reviewed dividing stages of aseptic culture establishment, callus induction, cell suspension establishment, cell multiplication, plant regeneration and acclimatization. Their applications to plant breeding were also reviewed. Laboratory protocols of cell culture and protoplast culture as an advanced stage were finally described. Keywords: Musa, callus, micropropagation, breeding, conservation, protoplast. 6

7 1. Introdução Cultura de células em suspensão consiste em técnicas de indução, propagação e manutenção de células em uma forma de suspensão em meio líquido. Uma vez que uma célula vegetal tem totipotência (capacidade potencial para regenerar uma planta inteira), a cultura de células em suspensão é uma ferramenta muito útil para micropropagação, melhoramento genético e conservação de recursos genéticos. Visando estas aplicações, a técnica não se refere somente a cultura de células, mas também inclui o processo de regeneração de plantas. A cultura de células em suspensão para micropropagação foi estudada em muitas espécies devido a sua alta eficiência de propagação, adaptação fácil para automatização inclusive produção de sementes sintéticas, e consequentemente custo operacional reduzido (KITTO e JANICK, 1985; REDENBAUG et al., 1986). Em banana, já existem alguns artigos sobre regeneração de plantas de células em suspensão por embriogênese somática (NOVAK et al., 1989; DHED'A et al., 1991; KRIKORIAN e SCOTT, 1995; CÔTE et al., 1996). Variação somaclonal, que é o problema mais sério em micropropagação via embriogênese somática de células, é baixa em variedades de banana (SCHOOFS, 1997; CÔTE et al., 2000). A micropropagação através de cultura de células em suspensão é, então, uma das técnicas mais promissoras para obter grandes quantidades de mudas de qualidade com baixos custos de produção. 2. Estabelecimento de Cultura Asséptica e Indução de calos Suspensões celulares ou calos podem teoricamente ser estabelecidos a partir de qualquer parte de tecidos vegetais. Em muitas espécies dicotiledôneas (ex: fumo, café), calos ou células são estabelecidas de limbo foliar, mas isto raramente acontece em espécies monocotiledôneas (ex: arroz, milho). Nestas espécies, os calos ou as células são induzidos de tecidos que contem alto teor de células meristemáticas, tais como embriões, gemas axilares, ápices caulinares ou radiculares. Culturas de células em 7

8 suspensão de bananeira são principalmente estabelecidas de calos originados de: embriões zigóticos imaturos (CRONAUER-MITRA e KRIKORIAN, 1988; ESCALANT e TEISSON, 1989), brotos múltiplos ou gemas axilares (NOVAK et al., 1989; DHED'A et al., 1991), e gemas florais (ESCALANT et al., 1994; CÔTE et al., 1996; GRAPIN et al., 1996 e 1998). Porém, não são normalmente usados embriões zigóticos para explantes iniciais em propagação clonal, devido à possibilidade de ter segregação genética se não for homozigotos. Neste capítulo, culturas de células em suspensão dos dois últimos tipos de explantes são descritas. Quando brotos múltiplos ou gemas in vitro de bananeira forem usados como explantes iniciais, já que os explantes estão livres de microrganismos, nenhum processo de desinfestação é preciso e em qualquer laboratório onde há uma sala de ambiente controlado ou fitotron pode ter usado este tipo de explantes. Para induzir células ou calos, uma camada fina de tecido (1-2 mm de espessura) com cerca de 5 x 5 mm 2 é extraído de rizomas meristemáticos de brotos múltiplos ou gemas (NOVAK et al., 1989). Estes explantes finos do tecido meristemático são também chamados como scalps (DHED'A et al., 1991). Para obter scalps de alta qualidade, brotos ou gemas podem preliminarmente ser cultivados em um meio de cultura com alta concentração (100 µm) de 6-benzilaminopurina (BA) (SCHOOFS et al., 1998). Por outro lado, explantes de gemas florais só podem ser usados por quem mora perto de uma região produtora de banana. A vantagem de usar este tipo de explante é que não há necessidade de manutenção in vitro, é de desinfestação fácil e há possibilidade de fazer uma pré-avaliação de plantas, particularmente para qualidade de frutas antes da colheita. Inflorescência masculina (coração) é colecionada de planta em campo e feita desinfestação superficial com 70% de álcool. As flores masculinas imaturas de posições 1 a 15 (posição 0 era o ápice caulinar) estão isoladas debaixo de um microscópio estereoscôpico em uma câmara de fluxo laminar, e estão usadas como explantes (ESCALANT et al., 1994; CÔTE et al., 1996; GRAPIN et al., 1996). As gemas florais masculinas imaturas são também usadas, em conjunto sem separação pelas posições. Neste caso, tecidos (aproximadamente 3 x 3 x 3 mm3) com ápice caulinar e gemas florais masculinas adjacentes são 8

9 extraídos de uma inflorescência masculina e cortados longitudinalmente em duas partes para serem usados (MATSUMOTO et al., 2002a). Para indução de calos ou células embriogênicas em maioria dos trabalhos, usa-se o meio semi-sólido de cultura constituído de um inteiro ou metade de sais de MS, vitaminas de MS ou sua modificação, sacarose (20 30 g L -1 ) e auxinas, particularmente ácido 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D), em escuro ou em iluminação de baixa intensidade. O 2,4-D, ou outras auxinas semelhantes como picloram e dicamba, é geralmente usado a uma faixa de concentração de 5 a 30 µm (NOVAK et al., 1989; DHED'A et al., 1991; PANIS et al., 1993; CÔTE et al., 1996). Excepcionalmente, uma concentração muito alta (414 µm) é usada quando o meio é adicionado com carvão ativado (0.2%) para reduzir o problema de tecido oxidado (CONCEIÇÃO et al., 1998). São induzidos diferentes tipos de calos ou células. É importante selecionar calos ou células embriogênicas. Os calos embriogênicos são de coloração branca, globular e friável (Figura 1-A). Eles são induzidos diretamente dos explantes ou indiretamente de calos compactos amarelos inicialmente formados. Por meio de análise microscópica, deveriam ser observadas células globulares com citoplasma denso e vacúolos pequenos (SCHOOFS et al., 1998; GEORGET et al., 2000) (Figura 1-B). 3. Estabelecimento de Células em Suspensão, Multiplicação e Regeneração de Plantas Para estabelecimento e multiplicação de células em suspensão, os calos são transferidos em um frasco de Erlenmeyer com um meio líquido de cultura. Concentração de auxina no meio de cultura deveria geralmente ser reduzida a em redor de 5 µm com ou sem citocinina. As culturas são mantidas em um agitador horizontal às rpm (Figura 1-C). As células e microcalos produzidas são passadas por uma peneira para obter células homogêneas em suspensão (Figura 1-D). Embriogênese das células em suspensão seguida da regeneração de planta é observada quando as células são transferidas em um meio sem regulador de crescimento ou com baixa concentração de citocinina (DHED'A, et al., 1991; PANIS et al., 1993), 9

10 entretanto combinações de diferentes tipos de reguladores de crescimento, carboidratos, aminoácidos e suplementos orgânicos complexos podem aumentar a eficiência (CÔTE et al., 1996; GRAPIN et al., 1996). Embriogênese acontece em um meio líquido no agitador em redor de 70 rpm ou em um meio semi-sólido (Figura 1-E). A taxa de regeneração de plântulas depende de variedades cultivadas e processo de cultura. Em boas condições, de 1 ml de células embriogênicas sedimentadas podem ser obtidas a plântulas depois de 5 meses de regeneração e germinação (CÔTE et al., 1996; GRAPIN et al., 1996). 10

11 Figura 1. Cultura de célula em suspensão e regeneração de plantas. A: Calos embriogênicos de banana. B: Células embriogênicas que apresentam uma forma redonda com citoplasma denso. C: Cultura de células em frascos de Erlenmeyer. D: Células em suspensão estabelecidas. E: Embriões somáticos em germinação. F: Plântulas com raízes prontas para aclimatação. G: Plântulas em aclimatação em casade-vegetação. H: Transplantio das plântulas aclimatadas em campo. 11

12 4. Aclimatação e Sementes Sintéticas O processo de aclimatação pode ser mesmo de micropropagação convencional de ápices caulinares. Já foram relatados em outro lugar detalhes deste processo (DANIELLS e SMITH, 1991; VUYLSTEKE, 1998). Plântulas acima de 30 mm de altura são transferidas a sacos plásticos ou bandejas com substratos em casa-de-vegetação (Figura 1-F e G). Na primeira semana, estão sob luminosidade solar reduzida e alta umidade relativa do ar. Nas semanas seguidas, a luminosidade é aumentada e a umidade relativa do ar reduzida gradativamente. Objetivando-se facilitar ou dispensar este processo, foram estudadas sementes sintéticas. Semente sintética é um embrião somático ou ápice caulinar encapsulado em um material de revestimento a ser protegido de dano mecânico e/ou infecção microbiana, com a finalidade de uso como uma semente natural. Inicialmente, foram encapsulados ápices caulinares de banana em gotas de alginato de cálcio (GANAPATHI et al., 1992; MATSUMOTO et al., 1995). Porém, usando cultura de células em suspensão e embriões somáticos, a formação de semente sintética pode ser muito mais fácil que ápices caulinares (REDENBAUGH et al., 1986). Embora as sementes sintéticas de bananeira ainda não são usadas diretamente em campo e, para isto acontecer, deverão ter muitos estudos e melhorias, elas já podem ser usadas em processo de aclimatação, possibilitando sua automatização mais eficiente. 5. Melhoramento de plantas A técnica de cultura de células tem grande importância em micropropagação, mas isto será ainda maior em melhoramento genético de plantas. A seguir, é descrito um breve histórico de aplicação de cultura de tecidos e de células em métodos de melhoramento de bananeira. 5.1 Métodos auxiliados por cultura de embriões e ápices caulinares Melhoramento genético de plantas em Musa tem sido beneficiado de técnicas de micropropagação, particularmente de cultura de embrião, ou seja, 12

13 técnica de resgate de embrião. A técnica foi primeira relatada por Cox et al. (1960) e tem sido usada por quase todos os programas de melhoramento de Musa por fecundação cruzada no mundo (STOVER e SIMMONDS, 1987; SHEPHERD, 1987). Uma vez que sementes híbridas de banana dificilmente germinaram em condição natural, a cultura de embrião constitui a técnica principal para aquisição de plântulas. Variação Somaclonal pode aumentar variabilidade genética e pode ser usada para melhoramento de plantas de Musa. Com ou sem tratamentos mutagénicos em ápices caulinares ou brotos múltiplos, foram selecionadas mutantes com características agronômicas úteis, como precocidade de florescimento (NOVAK et al., 1990), tolerância à toxidez de alumínio (MATSUMOTO e YAMAGUCHI, 1990), tolerância à murcha de Fusarium (HWANG e KO, 1988; BHAGWAT e DUNCAN, 1998; MATSUMOTO et al., 1999), etc. 5.2 Métodos auxiliados por cultura de células e protoplastos Já foram relatados bons resultados de técnicas de transformação genética em células de banana (SAGI et al., 1995; MAY et al., 1995; BECKER et al., 2000; MATSUMOTO et al., 2002a; CHAKRABARTI, et al., 2003; KHANNA et al., 2004). Os sucessos na aplicação destas técnicas em bananeiras dependeram da eficiência em cultura de células, além do conhecimento de genes úteis em nível molecular. Marcadores moleculares que vêm sendo procurados (JARRET et al., 1994; KAEMMER et al., 1997; CRESTE et al., 2004; BUHARIWALLA et al., 2005) podem aumentar a aplicabilidade das técnicas, mas o desenvolvimento da técnica de cultura de células é de suma importância para que as diferentes variedades de bananeira possam ser beneficiadas pelas técnicas. Faltando o conhecimento de genes em nível molecular, hibridação somática por meio de fusão de protoplastos pode ser uma alternativa boa para melhoramento de bananeira (MATSUMOTO et al., 1992; MATSUMOTO et al., 2002b; ASSANI et al., 2005). Protoplasto é um estado transitório de uma célula desprovida da parede celular, comumente pela ação de enzimas pectocelulolíticas (Ver abaixo no Item 7.2 Protocolo.). Sem parede celular, os 13

14 protoplastos adiquirem capacidade de incorpolar materiais como DNA ou de fungir entre si. Quando a fusão ocorra entre protoplastos de variedades diferentes, híbridos somaticos são obtidos. A técnica de hibridação somática é útil quando uma variedade cultivada mostra esterilidade genital e difícil de ser cruzada com outra variedade como exemplo de bananeira, ou quando um caráter desejado não foi encontrado na mesma espécie e deve ser incorporado de outra espécie ou género. 6. Prospectos Micropropagação de banana já tem sido usada para multiplicação rápida de clones de elite, e para conservação e intercâmbio internacional de germoplasma de Musa. Porém, com a finalidade de uso mais amplo e intenso, os problemas de alto custo operacional e variação somaclonal indesejada deveriam ser superados. O custo operacional poderá ser reduzido pelo sistema de micropropagação via células embriogênicas em suspensão e pelo biorreactor com um sistema de imersão temporal. Técnicas de marcadores moleculares aplicadas para detecção de variantes somaclonais poderão facilitar o controle de qualidade das plantas micropropagadas. Um sistema de micropropagação de banana, em futuro, pode ser composto dos processos seguintes: (1) técnica simples de criopreservação de células embriogênicas ou brotos múltiplos para obter explantes iniciais; (2) multiplicação de células ou brotos e regeneração de plantas em um bioreactor de imersão temporal; (3) formação de semente sintética para facilitar aclimatização de plântulas micropropagadas; e (4) controle de qualidade com marcadores moleculares. É esperado que todos estes sistemas estejam disponíveis para nosso uso no futuro próximo. Hibridação sexual e somática pode ajudar identificar genes úteis. Mutações pontuais originadas de variação somaclonal ou de tratamento mutagênico são também muito importantes para a identificação de genes (DAMASCO et al., 1996; FERREIRA et al., 1998; TULMANN NETO et al., 1998). Por outro lado, plantas transgênicas com um gene de marcador, como resistência antibiótica, façam identificação de híbridos mais fáceis 14

15 (GERDEMANN-KNORCK et al., 1995; RAMULU et al., 1995; SAMOYLOV e SINK, 1996). Estas técnicas, então, poderiam interagir entre si e poderiam aplicar em melhoramento genético como ferramentas complementares. 7. Protocolos Os protocolos seguintes são usados em nosso laboratório. 7.1 Protocolo básico para cultura de células e regeneração de plântulas (MATSUMOTO e SILVA NETO, 2003; STROSSE et al., 2003) A- Estabelecimento de células em suspensão de uma inflorescência masculina. (1) uma coração (inflorescência masculina) de banana é coletada logo após a fixação de última fruta e desinfetada superficialmente. (2) É extraído um tecido de ápice caulinar com gemas florais masculinas em redor de 3 x 3 x 3 mm 3. (3) O tecido é longitudinalmente cortado em duas partes e inoculado sobre um meio de indução de calos (Tabela 1-A), tal modo de que a superfície cortada ter contato com o meio. (4) Depois de 2 a 3 meses de cultura, quando apareceram calos globulares, os calos são transferidos a um meio semi-sólido para multiplicação de células (Tabela 1-B). 15

16 Tabela 1. Meios para cultura de células em suspensão. Componente Meio de cultura A B C D E F Macronutrientes MS ½ MS ½ MS ½ MS ½ MS MS e Fe-EDTA Micronutrientes e vitaminas MS MS MS MS MS MS Ácido ascórbico - 10 mg L mg L mg L mg L -1 - Auxina 414 µm Picloran 5 µm 2,4-D µm AIA Citocinina 492 µm 2iP 1 µm Zeatina µm Zeatina 2 µm BA Carvão ativado 0.2% % L-prolina mm 10 mm 10 mm - Sacarose 30 g L g L g L g L g L g L -1 Phytagel 2 g L -1 2 g L -1 2 g L g L -1 Outros 300 µm componentes L- arginina e 15.3 mm MES ph MS: Murashige e Skoog, (5) Depois de 2 a 3 subculturas adicionais de um mês cada, serão obtidos calos friáveis globulares brancos (Figura 1-A). Eles são transferidos em um meio líquido (sem Phytagel) de multiplicação de células no agitador às rpm, em escuro (Figura 1-C). Obs: Para manter capacidade embriogênica de calos ou células, eles são cultivados em um meio de manutenção de células (Tabela 1-C) debaixo de baixa iluminação. (6) O meio líquido é semanalmente renovado. Os calos são passados ocasionalmente por uma peneira de 0.6-mm para selecionar somente microcalos e células. (7) Depois dos aproximadamente 3 5 meses, suspensão de células embriogênicas deveria ser obtida (Figura 1-D). O período varia, dependendo de variedades de banana. B- Regeneração de plantas. (8) O 0.5 ml SCV (volume de célula sedimentadas) de células embriogênicas é transferido em 20 ml de um meio de indução de embrião (Tabela 1-D) em um 250 ml de frasco de Erlenmeyer no agitador (50 60 rpm) em baixa intensidade de luz. (9) Depois de 2 semanas de cultura, as células são transferidas em um meio de maturação de embrião (Tabela 1-E). (10) Depois de mais um a dois meses, quando observados pro-embriões, eles são transferidos a um meio líquido ou semi-sólido de regeneração (Tabela 1-F) (Figura 1-E). (11) Depois de 2 a 4 meses, plântulas acima de 3 cm em altura são obtidas (Figura 1-F) e podem ser transferidas a uma casa-de-vegetação/telado para aclimatação (Figura 1-G). (12) Após um a dois meses da aclimatação, plântulas podem ser transplantadas em campo (Figura 1-H). 16

17 7.2 Protocolo para obtenção e cultura de protoplastos (MATSUMOTO e OKA, 1998) A- Preparo de soluções e meios de cultura (1)- preparar soluções estoques de enzimas e meios de cultura como Tabela 2. As soluções estoques de enzimas devem ser preparadas e conservadas como * a seguir. Tabela 2. Solução e meios para cultura de protoplastos. Componente Solução e meio de cultura para protoplastos MCP R10 estoque* Y23 estoque* PA3 PA5 Macronutrient ½ MS ½ MS es e Fe-EDTA Micronutriente MS MS s e vitaminas Ácido mg L mg L -1 ascórbico Auxina µm 2,4-D 5 µm 2,4-D D-Mannitol 0,6 M 0,6 M 0,6 M 0,55 M 0,275 M Sacarose g L g L -1 Gelificante Com ou sem 1,6 % de agarose VII CaCl 2 2H 2 O 0,1 mm 0,1 mm 0,1 mm - - PVP-40 0,5% 0,5% 0,5% MES 3,5 mm 3,5 mm 3,5 mm Púrpura de 8 mg L -1 8 mg L -1 8 mg L -1 Bromocresol ph 5,6 5,6 5,6 5,8 5,8 Enzimas 3,75% Cellulase onozuka R10 1% Pectolyase Y23 * Para estoque R10: (3.75%) Pesar 3,75 g de Cellulase onozuka R10. Dissolver em MCP. Completar a 100 ml por MCP. Centrifugar a 5000 rpm por 30 min. Filtrar por filtro de membrana de 0,22 µm de porosidade. Distribuir a 3 frascos de Erlenmeyer de 125 ml. Estocar no congelador. * Para estoque Y23: (1%) Pesar 0.5 g de Pectolyase Y23. Dissolver em MCP. Completar a 50 ml por MCP. Centrifugar a 5000 rpm por 30 min. Filtrar por filtro de membrane de 0,22 µm de porosidade. Distribuir a 3 frascos de Erlenmeyer de 50 ml. Estocar no congelador. 0,2 % de Phytagel ou Gelrite 17

18 (2)- preparar a solução de enzimas em uso misturando as soluções estoques de enzimas e a solução MCP na câmara de fluxo laminar, como abaixo. Solução Concentração Concentração Volume usado estoque do estoque final desejada R10 em MCP 3,75 % 1,5 % 8 ml Y23 em MCP 1 % 0,2 % 4 ml MCP 8 ml Volume total 20 ml B- Isolamento de protoplastos (3)- pegar por pipeta 1 ml de SCV (settled-cell-volume) das células e pôr na solução enzimática. (4)- deixar em escuro, 28 C, 50 rpm, durante uma noite (15 horas). C- Purificação (5)- passar solução com protoplastos pela tela de nylon (25 30 μm). Para facilitar passagem, podemos previamente passar por millaclose ou tela mais grossa. (6)- coletar a solução filtrada em tubos de centrífuga (de 30 ml). (7)- centrifugar por 900 rpm, 3 min. (8)- eliminar sobrenadante e acrescentar 20 ml da MCP e homogeneizar. (9)- centrifugar por 900 rpm, 3 min. (10)- repetir (8) e (9) mais 2 vezes. (11)- eliminar sobrenadante e acrescentar por 2 ml de PA3 (Tabela 2). (12)- contar número de protoplastos por hemacitómetro e ajustar concentração a 1 x 10 6 protoplastos/ml. C- Cultura protetora (13)- pegar 1 ml de SCV de células protetoras (própria células de banana ou outras em crescimento rápido) e suspender em 9 ml de PA3. (14)- acrescentar 10 ml da PA3 + 1,6 % agarose VII (temperatura baixa para solidificação) que previamente aquecido, dissolvido e mantido 35 a 40 C. (14)- esperar a solução torna-se um pouco viscoso. (15)- colocar 2 ml/placa sobre meio sólido de PA5 (Tebela 2) tal modo de que forma um circulo de 3 a 4 cm de diâmetro no centro de placa de Petri. (16)- colocar uma membrana Millipore ou Isopore de 25 mm de diâmetro e 5 μm de porocidade sobre as células. (17)- colocar 0,3 ml da solução de protoplastos preparada no ítem B-(11) sobre a membrana. (18)- cultivar em escuro, 28 C. (19)- após 2 semanas, transferir a membrana com protoplastos ao meio novo de PA5 com células protetoras. (20)- após um mês de cultivo, transferir no meio PA5 sem células protetoras. (21)- formando embriões somáticos de aproximadamente 1 mm, transferir ao meio para regeneração de plantas (MS + 2μM de BA + 2μM de AIA). 18

19 REFERÊNCIAS ASSANI, A.; CHABANA, D.; HAICOUR, R.; BAKRY, F.; WENZEL, G.; FOROUGHI-WEHR, B. Protoplast fusion in banana (Musa spp.): comparison of chemical (PEG: polyethylen glycol) and electrical procedure. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Dordrecht, Netherlands, v. 83, p , BECKER, D. K.; DUGDALE, B.; SMITH, M. K.; HARDING, R. M.; DALE, J. L. Genetic transformation of Cavendish banana (Musa spp. AAA group) cv Grand Nain via microprojectile bombardment. Plant Cell Reports, Berlin, v. 19, n. 3, p , BHAGWAT, B.; DUNCAN, E. J. Mutation breeding of banana cv. Highgate (Musa spp., AAA group) for tolerance to Fusarium oxysporum f.sp. cubense using chemical mutagens. Scientia Horticulturae, Amsterdam, v. 73, p , BUHARIWALLA, H. K.; JARRET, R. L.; JAYASHREE, B.; CROUCH, J. H.; ORTIZ, R. Isolation and characterization of microsatellite markers from Musa balbisiana. Molecular Ecology Notes, Oxford, v. 5, p , CHAKRABARTI, A.; GANAPATHI, T. R.; MUKHERJEE, P. K. MSI-99, a magainin analogue, imparts enhanced disease resistance in transgenic tobacco and banana. Planta, v. 216, p , CONCEIÇÃO, A. S.; MATSUMOTO, K.; BAKRY, F.; BERND-SOUZA, R. B. Plant regeneration from long-term callus culture of AAA-group dessert banana. Pesquisa Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 33, n. 8, p , CÔTE, F. X.; DOMERGUE, R.; MONMARSON, S.; SCHWENDIMAN, J.; TEISSON, C.; ESCALANT, J. V. Embryogenic cell suspensions from the male flower of Musa AAA cv. Grand nain. Physiol. Plant., v. 97, p , CÔTE, F. X.; FOLLIOT, M.; DOMERGUE, R.; DUBOIS, C. Field performance of embryogenic cell suspension-derived banana plants (Musa AAA, cv. Grande naine). Euphytica, Dordrecht, Netherlands, v. 112, p , COX, E. A.; STOTZKY, G.; GOODS, R. D. In vitro culture of Musa balbisiana Colla embryos. Nature, London, v. 185, n. 4710, p ,

20 CRESTE, S.; TULMANN NET, A.; VENCOVSKY, R.; SILVA, S. O.; FIGUEIRA, A. Genetic diversity of Musa diploid and triploid accesions from the Brazilian banana breeding program estimated by microsatellite markers. Genetic Resources and Crop Evolution, Dordrecht, Netherlands, v. 51, p , CRONAUER-MITRA, S. S.; KRIKORIAN, A. D. Plant regeneration via somatic embryogenesis in the seeded diploid banana Musa ornata Roxb. Plant Cell Reports, Berlin, v. 7, p , DAMASCO, O. P.; GODWIN, I. D.; SMITH, M. K.; ADKINS, S. W. Gibberellic acid detection of dwarf off-types in micropropagated Cavendish bananas. Australian Journal of Experimental Agriculture, Collingwood, v. 36, n. 2, p , DANIELLS, J.; SMITH, M. Post-flask management of tissue-cultured bananas. Canberra: ACIAR, p. (ACIAR Technical Reports, 18). DHED A, D.; DUMORTIER, F.; PANIS, B.; VUYLSTEKE, D.; DE LANGHE, E. Plant regeneration in cell suspension cultures of the cooking banana cv. Bluggoe (Musa spp. ABB group). Fruits, v. 46, n. 2, p , ESCALANT, J. V.; TEISSON, C. Somatic embryogenesis and plants from immature zygotic embryos of the species Musa acuminata and Musa balbisiana. Plant Cell Reports, Berlin, v. 7, p , ESCALANT, J. V.; TEISSON, C.; COTE, F. Amplified somatic embryogenesis from male flowers of triploid banana and plantain cultivars (Musa spp.). In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant, Wallingford, v. 30, p , FERREIRA, M. E.; CALDAS, L. S.; PEREIRA, E. A. Aplicações da cultura de tecidos no melhoramento genético de plantas. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L.S.; BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília: Embrapa-SPI, Embrapa-CNPH, p GANAPATHI, T. R.; SUPRASANNA, P.; BAPAT, V. A.; RAO, P. S. Propagation of banana through encapsulated shoot tips. Plant Cell Reports, Berlin, v. 11, p , GEORGET, F.; DOMERGUE, R.; FERRIÈRE, N.; CÔTE, F. X. Morphohistological study of the different constituents of a banana (Musa AAA, 20

21 cv. Grande naine) embryogenic cell suspension. Plant Cell Reports, Berlin, v. 19, n. 8, p , GERDEMANN-KNORCK, M.; NIELEN, S.; TZSCHEETZSCH, C.; IGLISCH, J.; SCHIEDER, O. Transfer of disease resistance within the genus Brassica through asymmetric somatic hybridization. Euphytica, Dordrecht, Netherlands, v. 85, p , GRAPIN, A.; ORTIZ, J. L.; DOMERGUE, R.; BABEAU, J.; MONMARSON, S.; ESCALANT, J. V.; TEISSON, C.; CÔTE, F. X. Establishment of embryogenic callus initiation and regeneration of embryogenic cell suspensions from female and male immature flowers of Musa. InfoMusa, Montipellier, France, v. 7, p , GRAPIN, A.; SCHWENDIMAN, J.; TEISSON, C. Somatic embryogenesis in plantain banana. In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant, Wallingford, v. 32, p , HWANG, S. C.; KO, W. H. In vitro somaclonal variation in banana and its application for screening for resistance to fusarial wilt. Taipei, Taiwan: Food & Fertilizer Technology Center, p. (Technical Bulletin, 107) JARRET, R. L.; BHAT, K. V.; CREGAN, P.; ORTIZ, R.; VUYLSTEKE, D. Isolation of microsatellite DNA markers in Musa. InfoMusa, Montipellier, France, v. 3, p. 3-4, KAEMMER, D.; FISCHER, D.; JARRET, R. L.; BAURENS, F. C.; GRAPIN, A.; DAMBIER, D.; NOYER, J. L.; LANAUD, C.; Kahl, G.; LAGODA, P. J. L. Molecular breeding in the genus Musa: a strong case for STMS marker technology. Euphytica, Dordrecht, Netherlands, v. 96, p , KHANNA, H.; BECKER, D.; KLEIDON, J.; DALE, J. Centrifugation assisted Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation (CAAT) of embryogenic cell suspensions of banana (Musa spp. Cavendish AAA and Lady finger AAB). Molecular Breeding, Dordrecht, The Netherlands, v. 14, p , KITTO, S. L.; JANICK, J. Production of synthetic seeds by encapsulating asexual embryos of carrot. Journal of the American Society for Horticultural Science, Alexandria, USA, v. 110, n. 2, p ,

22 KRIKORIAN, A. D.; SCOTT, M. E. Somatic embryogenesis in bananas and Plantains (Musa clones and species). In: BAJAJ, Y. P. S. (Ed.). Biotechnology in Agriculture and Forestry. Berlin Heidelberg: Springer- Verlag, p v Somatic Embryogenesis and Synthetic Seed II. MATSUMOTO, K.; BARBOSA, M. L.; SOUZA, L. A. C.; TEIXEIRA, J. B. In vitro selection for Fusarium wilt resistance in banana. II. Resistance to culture filtrate of race 1 Fusarium oxysporum f.sp. cubense. Fruits, v. 54, p , MATSUMOTO, K.; HIRAO, C.; TEIXEIRA, J. B. In vitro growth of encapsulated shoot tips in banana (Musa sp.). Acta Horticulturae, The Hague, Holanda, v. 370, p , MATSUMOTO, K.; KOBAYASHI, S.; BARBOSA, M. L.; TEIXEIRA, J. B. Isolamento e fusão dos protoplastos de banana. Revista Brasileira de Fruticultura, Cruz das Almas, v. 14, n. 1, p , MATSUMOTO, K.; MORAIS, L. S.; VIANNA, G. R.; ARAGÃO, F. J. L.; RECH, E. L. Genetic transformation of banana embryogenic cells through particle bombardment, using a herbicide resistance gene as selectable marker. Acta Horticulturae, The Hague, Holanda, v. 575, p , 2002a. MATSUMOTO, K.; OKA, S. Plant regeneration from protoplasts of a Brazilian dessert banana (Musa spp., AAB group). Acta Horticulturae, The Hague, Holanda, v. 490, p , MATSUMOTO, K.; SILVA NETO, S. P. Micropropagation of bananas. In: JAIN, S. M.; ISHII, K. (Eds.). Micropropagation of Woody Tree and Fruits. Dordrecht, The Netherlands: Kluwer Academic Publishers, p MATSUMOTO, K.; VILARINHOS, A. D.; OKA, S. Somatic hybridization by electrofusion of banana protoplasts. Euphytica, Dordrecht, Netherlands, v. 125, p , 2002b. MATSUMOTO, K.; YAMAGUCHI, Y. Selection of aluminium-tolerant variants from irradiated protocorm-like bodies in banana. Tropical Agriculture, v. 67, n. 3, p , MAY, G. D.; AFZA, R.; MASON, H. S.; WIECKO, A.; NOVAK, F. J.; ARNTZEN, C. J. Generation of transgenic banana (Musa acuminata) plants 22

23 via Agrobacterium-mediated transformation. Bio/Technology, v. 13, p , MURASHIGE, T.; SKOOG, F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., v. 15, p , NOVAK, F. J.; AFZA, R.; VAN DUREN, M.; OMAR, M. S. Mutation induction by gamma irradiation of in vitro cultured shoot-tips of banana and plantain (Musa cvs.). Tropical Agriculture, v. 67, n. 1, p , NOVAK, F. J.; AFZA, R.; VAN DUREN, M.; PEREA-DALLOS, M.; CONGER, B. V.; TANG XIAOLANG. Somatic embryogenesis and plant regeneration in suspension cultures of dessert (AA and AAA) and cooking (ABB) bananas (Musa spp.). Bio/Technology, v. 7, p , PANIS, B.; WAUWE, A. V.; SWENNEN, R. Plant regeneration through direct somatic embryogenesis from protoplasts of banana (Musa spp.). Plant Cell Reports, Berlin, v. 12, p , RAMULU, K. S.; DIJKHUIS, P.; RUTGERS, E.; BLAAS, J.; VERBEEK, W. H. J.; VERHOEVEN, H. A.; COLIJN-HOOYMANS, C. M. Microprotoplast fusion technique: a new tool for gene transfer between sexually-incongruent plant species. Euphytica, Dordrecht, Netherlands, v. 85, p , REDENBAUGH, K.; PAASCH, B. D.; NICHOL, J. W.; KOSSLER, M. E.; VISS, P. R.; WALKER, K. A. Somatic seeds: encapsulation of asexual plant embryos. Bio/Technology, v. 4, p , SAGI, L.; PANIS, B.; REMY, S.; SCHOOFS, H.; DE SMET, K.; SWENNEN, R.; CAMMUE, B. P. A. Genetic transformation of banana and plantain (Musa spp.) via particle bombardment. Bio/Technology, v. 13, p , SAMOYLOV, V. M.; SINK, K. C. The role of irradiation dose and DNA content of somatic hybrid calli in producing asymmetric plants between an interspecific tomato hybrid and eggplant. Theoretical and Applied Genetics, Berlin, v. 92, p , SCHOOFS, H. The origin of embryogenic cells in Musa p. Thesis (Ph.D.) - K. U. Leuven, Belgium. (Dissertationes de Agricultura, 330). 23

24 SCHOOFS, H.; PANIS, B.; SWENNEN, R. Competence of scalps for somatic embryogenesis in Musa. Acta Horticulturae, The Hague, Holanda, v. 490, p , SHEPHERD, K. Banana breeding past and present. Acta Horticulturae, The Hague, Holanda, v. 196, p , STOVER, R. H.; SIMMONDS, N. W. Bananas. 3. ed. England: Longman Scientific & Technical, p. (Tropical Agriculture Series) STROSSE, H.; DOMERGUE, R.; PANIS, B.; ESCALANT, J. V.; COTE, F. Banana and plantain embryogenic cell suspensions. In: VEZINA, A.; PICQ, C. (Eds.). International Network for the Improvement of Banana and Plantain. Montpellier, France: INIBAP, p. (INIBAP. Technical Guidelines, 8). TULMANN NETO, A.; MENDES, B. M. J.; ANDO, A. Progressos na indução e uso de mutações in vitro. In: TORRES, A. C.; CALDAS, L. S.; BUSO, J. A. (Eds.). Cultura de Tecidos e Transformação Genética de Plantas. Brasília: Embrapa-SPI, Embrapa-CNPH, p VUYLSTEKE, D. R. Shoot-tip culture for the propagation, conservation, and distribution of Musa germplasm. Ibadan, Nigeria: International Institute of Tropical Agriculture, p. 24