KELLEN REGINA BOLDRINI

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1 KELLEN REGINA BOLDRINI Acessos alopoliplóides, níveis ímpares de ploidia e assincronia na microsporogênese como evidências citológicas de número básico de cromossomos x = 6 em Brachiaria humidicola (Poaceae) Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (Área de concentração - Biologia Celular e Molecular) da Universidade Estadual de Maringá, para obtenção do grau de Doutor em Ciências Biológicas. Maringá - PR 2009

2 KELLEN REGINA BOLDRINI Acessos alopoliplóides, níveis ímpares de ploidia e assincronia na microsporogênese como evidências citológicas de número básico de cromossomos x = 6 em Brachiaria humidicola (Poaceae) Orientadora: Dra. Maria Suely Pagliarini Co-Orientadora: Dra. Cacilda Borges do Valle Maringá - PR 2009

3 Dados Internacionais de Catalogação-na-Publicação (CIP) (Biblioteca Central - UEM, Maringá PR., Brasil) B687a Boldrini, Kellen Regina Acessos alopoliplóides, níveis ímpares de ploidia e assincronia na microsporogênese como evidêncis citológicas de número básico de cromossomos x=6 em Brachiaria humidicola (Poaceae) / Kellen Regina Boldrini. -- Maringá : [s.n.], f. : il. Orientadora : Prof. Dr. Maria Suely Pagliarini. Co-orientadora : Prof. Dr. Cacilda Borges do Valle. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Celular e Molecular, Brachiaria (Brachiaria humidicola) - Meiose. 2. Brachiaria (Brachiaria humidicola) - Poliplóidia. 3. Brachiaria - Apomixia. I. Universidade Estadual de Maringá, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas, área de concentração Biologia Celular e Molecular. II. Título. CDD 21.ed

4 BIOGRAFIA Kellen Regina Boldrini, filha de Valdir Luiz Boldrini e Bernadete Rech Boldrini, nasceu em Pato Branco/PR em 18/04/1981. Possui graduação em Ciências Biológicas pela Universidade Estadual de Maringá (2004) e Mestrado em Ciências Biológicas Área de concentração em Biologia Celular, pela Universidade Estadual de Maringá (2006). Em abril de 2006, matriculou-se no curso de doutorado em Ciências Biológicas da Universidade Estadual de Maringá. Atualmente atua no grupo de pesquisa em Citogenética Vegetal da Universidade Estadual de Maringá.

5 Aos meus pais pelo exemplo de conduta de vida e pelo grande esforço na minha formação educacional. Dedico.

6 Que importa que ao chegar eu nem pareça um pássaro, que importa que ao chegar venha me rebentando, caindo aos pedaços, sem aprumo e sem beleza!... Fundamental é cumprir a missão e cumprí-la até o fim. Dom Hélder Câmara

7 AGRADECIMENTOS A Deus por tudo.

8 À Coordenação e demais docentes do Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas/UEM, pela oportunidade de realização desse curso. À Capes pela bolsa de estudo concedida. À Embrapa Gado de Corte pela oportunidade de execução deste trabalho. À UNIPASTO e à Fundect pelos recursos financeiros destinados ao desenvolvimento desta pesquisa. À minha orientadora Dra Maria Suely Pagliarini, a quem admiro, muito pela orientação segura, amizade, confiança, determinação, dedicação e constante apoio e que soube transmitir com profissionalismo seus conhecimentos. À Drª Cacilda Borges do Valle, pesquisadora do Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Corte/Embrapa (Campo Grande-MS), pela co-orientação e concessão do material analisado. Às amigas, Andréa, Eleniza, Neide e Cristiane, pelo carinho e presença constante em todos os momentos e, principalmente, pela amizade. A todos os colegas de curso e de laboratório, pela amizade e convivência. À minha irmã, Cristina, pela força e compreensão nos momentos difíceis. Em especial, agradeço à minha família, cuja força e apoio foram determinantes para a realização deste trabalho e pelo carinho demonstrado nas horas mais difíceis.

9 APRESENTAÇÃO Esta tese é composta por três artigos originados a partir da análise do comportamento meiótico em três acessos de Brachiaria humidicola coletados junto à coleção de germoplasma desta gramínea, alocada na Embrapa Gado de Corte (Campo Grande, MS). Os artigos estão apresentados de acordo com as normas estabelecidas pelas revistas a que foram submetidos. 1. Kellen Regina Boldrini, Pâmela Lonardoni Micheletti, Patrícia Helena Gallo, Andréa Beatriz Mendes-Bonato, Maria Suely Pagliarini and Cacilda Borges do Valle. About the origin of a polyploid accession of Brachiaria humidicola (Rendle) Schweick. (Poaceae: Panicoideae: Paniceae). Enviado para publicação no periódico BIOLOGICAL RESEARCH. 2. Kellen Regina Boldrini, Maria Suely Pagliarini, and Cacilda Borges do Valle. Evidence of natural hybridization in Brachiaria humidicola (Rendle) Schweick. (Poaceae: Panicoideae: Paniceae). Enviado para publicação no períodico JOURNAL OF GENETICS. 3. Kellen Regina Boldrini, Maria Suely Pagliarini, and Cacilda Borges do Valle. Meiotic behavior of a nonaploid accession endorses x = 6 for Brachiaria humidicola (Poaceae). A ser submetido ao períodico PLANT BREEDING.

10 Acessos alopoliplóides, níveis ímpares de ploidia e assincronia na microsporogênese como evidências citológicas de número básico de cromossomos x = 6 em Brachiaria humidicola (Poaceae) Kellen Regina Boldrini Maria Suely Pagliarini (Orientadora) Cacilda Borges do Valle (Co-orientadora) Resumo Poliploidização é um elemento chave da evolução de plantas. Mais de 70% das espécies de plantas superiores são poliplóides, mostrando que a maioria das angiospermas passou por poliploidização pelo menos uma vez. Considerando que a duplicação de genomas surgiu no Cretáceo e que ainda continua ocorrendo, muitas angiospermas experimentaram vários ciclos de poliploidização ao longo de sua evolução. Assim, a maioria das angiospermas pode ser considerada paleopoliplóide. Ciclos de poliploidização, seguidos por diploidização e estabilização da meiose levando ao pareamento de cromossomos homólogos tem sido um dos principais componentes da evolução do genoma em plantas. Poliploidia e aneuploidia são considerados eventos comuns na evolução cromossômica dentre as Poaceae. O número cromossômico básico para as Poaceae não é conhecido mas é assunto de muita especulação. Os números básicos de cromossomos primários sugeridos são x = 5, 6 e 7. Na tribo Paniceae, que inclui o gênero Brachiaria, o número básico mais comum é x = 9. A predominância do número básico x = 9 no gênero Brachiaria foi descrita para muitas espécies, enquanto x = 7 ocorre em poucos acessos. Recentemente, um novo número de cromossomos, x = 6, foi determinado para B. dictyoneura. Existe uma grande predominância de formas poliplóides entre acessos e espécies no gênero Brachiaria, sendo que a tetraploidia predomina. A origem da poliploidia, contudo, nunca foi adequadamente investigada. Evidências citológicas obtidas a partir do comportamento meiótico, como o pareamento de cromossomos na diacinese, tem levado alguns autores a sugerir que autotetraploidia e alopoliploidia segmental podem ter contribuído para a evolução de algumas espécies. Por outro lado, dois acessos pentaplóides de B. brizantha (2n = 5x = 45), derivados de x = 9, mostraram clara evidência de alopoliploidia. Muitos gêneros da família Poaceae são gramíneas forrageiras importantes. Este é o caso de Brachiaria, a forrageira de maior utilização nos trópicos. Este gênero é nativo das savanas africanas, e engloba mais de 100 espécies. Todavia, as gramíneas forrageiras deste gênero exploradas no mundo pertencem a quatro espécies: B. brizantha, B. decumbens, B. humidicola e B. ruziziensis. Sua importância econômica é maior na América tropical, onde a vasta adoção nas últimas décadas teve um impacto revolucionário na pecuária, tornando o Brasil o maior exportador de carne do mundo. Das oito cultivares de Brachiaria que são comercializadas no Brasil por uma pujante indústria de sementes, sete delas foram originadas por seleção direta do germoplasma coletado na África. Brachiaria humidicola é uma espécie originalmente encontrada em solos mal drenados da África. Uma cultivar desta espécie é amplamente usada nas pastagens do Brasil e em outros países tropicais, especialmente em áreas de solos ácidos e mal drenados. Esta cultivar é tolerante, mas não resistente à cigarrinha-daspastagens, a praga mais importante das pastagens. As poucas cultivares disponíveis plantadas sobre milhões de hectares e a apomixia, que restringe a diversidade genética,

11 motivaram a busca por novas cultivares que pode ser feita através da seleção direta da variabilidade existente na coleção de germoplasma ou através de hibridizações intra ou interespecíficas, o que requer compatibilidade no nível de ploidia. Considerando que a poliploidia está largamente correlacionada com meiose anormal e apomixia em Brachiaria e que as plantas apomíticas são pseudogâmicas, o que significa que gametas férteis são necessários para o desenvolvimento do endosperma, a presente pesquisa teve por objetivo avaliar o comportamento meiótico dos acessos de B. humidicola disponíveis na coleção de germoplasma da Embrapa Gado de Corte como um subsídio para a seleção daqueles com maior estabilidade para atuarem como doadores de pólen em cruzamentos intra ou interespecíficos. Todos os acessos analisados foram coletados nas savanas da África pelo Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT), entre Inflorescências para estudos meióticos foram coletadas em plantas da coleção de germoplasma na Embrapa Gado de Corte, localizada em Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brasil. As inflorescências foram fixadas em uma mistura de etanol 95%, clorofórmio e ácido propiônico (6:3:2) por 24 horas, transferidas para álcool 70% e estocadas sob refrigeração até o momento de serem utilizadas. Os microsporócitos foram preparados pela técnica de esmagamento e corados com carmim propiônico 0,5%. As anormalidades foram consideradas em cada fase da microsporogênese. As fotomicrografias foram feitas em microscópio Wild Leitz, usando-se filme branco e preto, Kodak Imagelink HQ, ISO 25. A análise citológica efetuada na Universidade Estadual de Maringá em 54 acessos desta espécie revelou a ocorrência de 21 acessos 2n = 36, 5 acessos 2n = 42 e 28 acessos 2n = 54 cromossomos. Reporta-se nesta pesquisa o comportamento incomum durante a microsporogênese em três acessos de B. humidicola com nível ímpar de ploidia (H003, BRA004812; H030, BRA005070; e H038, BRA006165), todos derivados de x =6, e focaliza-se as implicações deste comportamento meiótico particular sobre o processo evolutivo e melhoramento. O acesso H030, com 2n = 42 cromossomos, é provavelmente um heptaplóide (2n = 7x = 42) derivado de x = 6, contrastando com a maioria dos acessos do gênero Brachiaria, com número básico de cromossomos x = 9. Em H030, seis cromossomos univalentes foram encontrados na diacinese e metáfase I, e comportaram-se como retardatários em anáfase I, portanto, possivelmente ambos os genitores eram derivados de x = 6, e o acesso seria heptaplóide (2n = 7x = 42). Os genomas parentais não mostraram o mesmo ritmo meiótico, especialmente em anáfase, quando um genoma constituído por seis cromossomos univalentes permaneceu como retardatário e sofreu segregação de cromátides irmãs. Na telófase, 18 cromossomos podiam ser visualizados em cada pólo. O genoma retardatário não alcançou os pólos em tempo de ser incluído nos núcleos e foi eliminado como micronúcleos. O acesso H003 também apresentou 2n = 42 cromossomos e foi caracterizado como um heptaplóide com número básico x = 6 (2n = 7x = 42). Este acesso também exibiu assincronia na meiose, pois os dois genomas não apresentaram o mesmo ritmo de divisão. Enquanto um genoma constituído por 12 cromossomos univalentes permaneceu em anáfase I e sofreu segregação cromatídica, o outro genoma, constituído por 30 cromossomos passou pela segregação de homólogos e 15 cromossomos foram observados em cada pólo. Embora permanecendo como retardatário em anáfase I e II, este genoma alcançou os pólos em tempo de ser incluído nos núcleos telofásicos, dando origem a tétrades normais. O comportamento meiótico do acesso H038 também foi consistente com uma origem alopoliplóide. Associações cromossômicas multivalentes na diacinese, a partir de tri até nonavalentes, associada com a presença de dois nucléolos em algumas células, seis cromossomos univalentes não congregados na placa metafásica na metáfase I, e seis univalentes retardatários que sofreram segregação cromatídica na anáfase I, permitiram identificar este acesso como nonaplóide (2n = 9x = 54), derivado de x = 6. A assincronia no ritmo meiótico entre os genomas corroborou com esta hipótese. A origem destes três acessos de B. humidicola pode ter resultado de cruzamento entre duas espécies relacionadas com diferentes ritmos na meiose. O

12 comportamento meiótico destes acessos reforça a hipótese da existência de um novo número básico de cromossomos (x = 6) para o gênero Brachiaria, principalmente para algumas espécies do grupo taxonômico 6. Para produzir gametas viáveis, os alopoliplóides devem se comportar efetivamente como diplóides durante a meiose, de tal forma que somente os cromossomos homólogos sofram pareamento. O objetivo dos estudos citogenéticos no gênero Brachiaria é selecionar acessos compatíveis com estabilidade meiótica e o mesmo nível de ploidia e para produzir híbridos intra e interespecíficos, criando nova variabilidade genética adaptada às condições edafoclimáticas dos trópicos. Em B. humidicola, especificamente, acessos com 2n = 36 cromossomos e meiose estável são desejáveis para serem cruzados com o único acesso sexual, também 2n = 36, recentemente encontrado na coleção de germoplasma desta espécie. Acessos de origem alopoliplóide, apresentando meiose irregular, semelhante aos descritos aqui, não devem ser usados no programa de melhoramento com propósitos de hibridização. Embora estes acessos não tenham valor para o programa de melhoramento devido seu comportamento cromossômico irregular, eles trouxeram valiosas informações para se estudar a origem das séries poliplóides nesta espécie e no gênero Brachiaria. Este tipo de estudo também estimula a busca de outros acessos sexuais de B. humidicola ao redor dos locais de coleta destes acessos na África a fim de tentar identificar os acessos parentais que deram origem a estes eventos de poliploidização.

13 Allopolyploidy, odd levels of ploidy and asynchrony in microsporogenesis as cytological evidences of a new basic chromosome number x = 6 in Brachiaria humidicola (Poaceae) Kellen Regina Boldrini Maria Suely Pagliarini (Adviser) Cacilda Borges do Valle (Co-adviser) Abstract Polyploidization is a key component of plant evolution. Known polyploid species include up to 70% of flowering plants, thus the majority of angiosperms have undergone polyploidization at least once. Because genome doubling appeared in the Cretaceous and because this remains an active and ongoing process, many angiosperm genomes have experienced several cycles of polyploidization at various times in the past. Thus most angiosperms are appropriately considered as paleopolyploid. Rounds of polyploidization, followed by diploidization and stabilization of meiotic features leading to pair of homologous chromosomes have been a major component of genome evolution in plants. Polyploidy and aneuploidy are conspicuous features of chromosomal evolution in the Poaceae. The original basic chromosome number for the Poaceae is not known and has been the subject of much speculation. The most probable primary basic chromosome numbers are x = 5, 6, and 7. In the large tribe Paniceae, which includes the genus Brachiaria, the most common basic chromosome number is x = 9. The predominance of this basic number x = 9 in the Brachiaria genus has been reported in several studies, whereas x = 7 was reported in a few cases. Recently, a new chromosome number, x = 6, was determined for B. dictyoneura. There is a large predominance of polyploid forms among species and accessions in the genus Brachiaria and tetraploids prevail but the origin of polyploidy has never been pursued. Cytological evidences obtained from analysis of meiotic behavior, such as chromosome pairing at diakinesis, led authors to suggest that autotetraploidy and segmental allopolyploidy could have contributed for the evolution some species. On the other hand, in two pentaploid accessions of B. brizantha (2n = 5x = 45), derived from x = 9, there was clear evidence of allopolyploidy. Many genera of the Poaceae family are economically important forage grasses. Such is the case of Brachiaria, the most widespread cultivated pasture in the tropics. The genus is native to the African savannas, and encompasses more than 100 species. The commercially exploited brachiariagrasses around the world belong to four African species: B. brizantha (palisadegrass), B. decumbens (signalgrass), B. humidicola (koroniviagrass), and B. ruziziensis (ruzigrass). Their economic importance is greatest in tropical America where extensive adoption over the past several decades has had a revolutionary impact on cattle productivity placing Brazil as the largest beef exporter in the world. Although eight cultivars of Brachiaria are commercialized in Brazil by a thriving seed industry, seven of them were originated as direct selections from germplasm collected in Africa. Brachiaria humidicola is a species originally found in water margins and poorly drained soils of Africa. One cultivar is widely used as pasture in Brazil and elsewhere in the tropics, especially in acid and waterlogged areas. It is tolerant, but not resistant to spittlebugs, the most important insect pest in pastures. The few available cultivars planted over millions of hectares and apomixis restricting genetic diversity

14 prompted the search for new candidate cultivars either from selection in existing collections or through breeding, which requires ploidy compatibility. Considering that polyploidy is largely correlated to abnormal meiosis in Brachiaria and the fact that apomictic plants are pseudogamic, which means that fertile gametes are necessary for endosperm development, the current research aimed to evaluate the meiotic behavior in accessions of B. humidicola from the Embrapa Beef Cattle Research Center in order to select the best ones to act as male genitors in intraspecific and interspecific crosses. All the accessions analyzed were collected in the wild African savannas by the Internacional Center for Tropical Agriculture (CIAT), between Inflorescences for meiotic studies were collected from plants growing at Embrapa Beef Cattle germplasm collection, located in Campo Grande, Mato Grosso do Sul, Brazil. They were fixed in a mixture of ethanol 95%, chloroform and propionic acid (6:3:2) for 24 hours, transferred to 70% alcohol and stored under refrigeration until use. Microsporocytes were prepared by squashing and staining with 0.5% propionic carmine. Meiotic abnormalities were observed in each phase of microsporogenesis. Photomicrographs were made with a Wild Leitz microscope using Kodak Imagelink HQ, ISO 25 black and white film. Cytological analysis performed at the State University of Maringá in 54 accessions of this species revealed the occurrence of 21 accessions with 2n = 36, 5 accessions with 2n = 42, and 28 accessions with 2n = 54 chromosomes. Here we report the unusual cytological behavior in the meiosis of three accessions of B. humidicola (H003, BRA004812; H030, BRA005070; and H038, BRA006165) with odd ploidy level, all of them derived from x = 6. The implications of their particular meiotic behavior in evolution and breeding is discussed. Accession H030, with 2n = 42 chromosomes, is most likely a heptaploid (2n = 7x = 42) derived from x = 6 contrasting with the majority of accessions in the genus Brachiaria, with a basic chromosome number of x = 9. In H030, six univalent chromosomes were found in diakinesis and metaphase I, and behaved as laggard in anaphase I, thus probably the ancestors of this genotype were also derived from x = 6. The two parental genomes did not show the same meiotic rhythm, especially during anaphase, when one genome constituted by six univalents remained as laggard and underwent sister-chromatid segregation. At telophase, 18 segregated chromosomes were found in each pole. The laggard genome did not get to the poles either in telophase I or II in time to be included in the nucleus and was eliminated as micronuclei. Accession H003 also presented 2n = 42 chromosomes and was also characterized as a polyploid with a basic chromosome number x = 6. Thus, the accession is also a heptaploid (2n = 7x = 42). This accession also exhibited an unusual behavior during meiosis: parental genomes did not show the same meiotic rhythm, especially during anaphase, when one genome, constituted by 12 univalents, remained as laggard in anaphase I and underwent sister-chromatid segregation. At telophase, 15 segregated chromosomes were found in each pole. Although lagging behind in anaphase I and II, this genome got the poles in time to be included in the telophase nuclei, giving rise to normal tetrads. The meiotic behavior of the accession H038 was also consistent with that of a plant of an allopolyploid origin. Multivalent chromosome association at diakinesis, from tri- to nonavalents, together with the presence of two nucleoli in some cells, six noncongregated univalent chromosomes at metaphase plate in metaphase I, and six laggard univalent in anaphase I, that underwent sister-chromatid segregagtion, suggested that this is a nonaploid accession (2n = 9x = 54), derived from x = 6. The asynchrony between the genomes during microsporogenesis also corroborated this assumption. The origin of these three accessions of B. humidicola could be from a crossing between two related species with a different rhythm in meiosis. The meiotic behavior of these accessions reinforces the hypothesis of the existence of a new basic chromosome number (x = 6) for Brachiaria, mainly for some species of the 6 th taxonomic group. To produce viable gametes, allopolyploids must behave effectively as diploids during meiosis, so that only identical chromosomes (homologous) pair. This is not the case for these three accessions studied.

15 The objective of the cytogenetic studies in the Brachiaria genus is to select compatible accessions with meiotic stability and of the same ploidy level to produce intra- and interspecific hybrids, creating new varieties well adapted to the edaphoclimatic conditions of the tropics. In B. humidicola, specifically, accessions with 2n = 36 with a regular meiosis are desirable to be crossed with the only sexual accession, also 2n = 36, recently found in the germplasm collection of this species. Accessions of allopolyploid origin, presenting irregular meiosis, such as those reported here, should not be used for hybridization purposes. Although these accessions have no practical value for breeding due to their unusual chromosome behavior, they provided important information in the study of the origin of a polyploid series in this species and in the genus. This type of study fosters the search for other sexual B. humidicola accessions around the site of collection of these accessions in Africa, to try to identify the parental material that gave rise to these events of polyploidy.