Trabalho de Conclusão de Curso

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1 Trabalho de Conclusão de Curso Correlação entre eosinofilia sérica e eosinofilia tecidual associada ao tumor em pacientes com carcinoma de células escamosas oral Hannah Karyn da Silva Universidade Federal de Santa Catarina Curso de Graduação em Odontologia

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3 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA Hannah Karyn da Silva CORRELAÇÃO ENTRE EOSINOFILIA SÉRICA E EOSINOFILIA TECIDUAL ASSOCIADA AO TUMOR EM PACIENTES COM CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL Trabalho apresentado à Universidade Federal de Santa Catarina, como requisito para a conclusão do Curso de Graduação em Odontologia Orientador: Prof. Dr. Rogério de Oliveira Gondak Florianópolis 2018

4 Hannah Karyn da Silva CORRELAÇÃO ENTRE EOSINOFILIA SÉRICA E EOSINOFILIA TECIDUAL ASSOCIADA AO TUMOR EM PACIENTES COM CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL Este Trabalho de Conclusão de Curso foi julgado, adequado para obtenção do título de cirurgião-dentista e aprovado em sua forma final pelo Departamento de Odontologia da Universidade Federal de Santa Catarina. Banca Examinadora: Florianópolis, 22 de maio de 2018.

5 Dedico este trabalho aos meus pais, José Fernando e Julia, pelo apoio durante toda minha vida e por acreditarem em mim e não medirem esforços para minha formação. Também dedico ao meu namorado, Felipe Higa, por todo o amor e carinho e por estar sempre ao meu lado me apoiando.

6 AGRADECIMENTOS Agradeço a Deus, por me dar força para seguir em frente nos momentos mais difíceis. Aos meus pais, José Fernando e Julia, por serem pais exemplares e por abdicar de tantas coisas para que eu conseguisse alcançar meus sonhos. Obrigado também por me ensinarem a superar as dificuldades sempre acreditando em minha capacidade. Ao meu namorado, Felipe Higa, pela compreensão nos momentos em que me ausentei. Por acreditar em mim e me incentivar a realizar trabalhos acadêmicos. Obrigado por permitir que eu estivesse ao seu lado nessa caminhada. Ao meu orientador Prof. Dr Rogério de Oliveira Gondak, que teve um papel determinante na concretização deste trabalho, ensinando-me a fazer pesquisa com qualidade e seriedade. Agradeço ainda pelos ensinamentos passados, pela sabedoria, paciência e compreensão perante minhas limitações. À Profª Drª Maria Claudia Santos da Silva, chefe do Laboratório de Oncologia Experimental e Análises Clínicas da Universidade Federal de Santa Catarina, pelo apoio na triagem laboratorial dos pacientes envolvidos na pesquisa. À Doutoranda Georgia Martini pela contribuição na etapa de levantamento de dados clínicos dos pacientes. Agradeço também por dividir conhecimentos comigo. À Sonia, ex-funcionária do Laboratório de Patologia Bucal da UFSC, pela disposição em auxiliar durante a execução dos procedimentos laboratoriais. À minha família e amigos, pois foram eles que me incentivaram e inspiraram através de gestos e palavras a superar todas as dificuldades.

7 Os que desprezam os pequenos acontecimentos nunca farão grandes descobertas. Pequenos momentos mudam grandes rotas. (Augusto Cury, 2009)

8 RESUMO Fatores clínicos e histopatológicos interferem diretamente no prognóstico e na sobrevida dos pacientes com carcinoma de células escamosas (CCE) oral. Nesse contexto, a eosinofilia tecidual associada ao tumor (ETAT) e a eosinofilia sérica (ES) podem estar diretamente relacionadas à progressão e à agressividade tumoral, e vêm sendo relacionada com diversas neoplasias, incluindo o câncer oral. Os objetivos deste estudo foram testar três protocolos (DORTA et al., 2002; JOSHI e KAIJKAR, 2013; e JAIN et al., 2014) para identificação de ETAT utilizando a coloração histoquímica do vermelho Congo; realizar uma avaliação retrospectiva de dados clínicos de pacientes diagnosticados com CCE; revisar as lâminas histológicas; identificar e quantificar ETAT e coletar dados hematológicos relacionados à eosinofilia sérica durante o período de diagnóstico da doença neoplásica. Os dados clínicos e anatomopatológicos foram obtidos a partir dos prontuários do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina e do Centro de Pesquisas Oncológicas entre 2006 e Os tumores foram classificados de acordo com o grau de diferenciação histológica, e divididos em dois grupos: CCE bem diferenciados (grupo 1) e CCE moderadamente ou pouco diferenciados (grupo 2). Para a análise da ETAT, as lâminas histológicas foram coradas com vermelho Congo e os eosinófilos presentes no estroma foram quantificados em alta magnificação (400x) utilizando o software Image J A contagem de ES foi realizada usando o sistema automatizado XE-2100D Sysmex após a punção venosa. Para a análise estatística, foram aplicados testes não-paramétricos utilizando o software SPSS versão O melhor protocolo para identificação de TATE, de acordo com a qualidade obtida e reprodutibilidade foi de Jain et al. (2014). Dos 113 pacientes estudados, 83 pertenciam ao grupo 1 e 30 ao grupo 2. A maioria dos pacientes eram leucodermas, fumantes, etilistas e trabalhadores manuais. Predominou o estágio II da doença e oito pacientes foram a óbito. Não houve diferença estatística entre os grupos estudados em relação ao TATE ou eosinofilia sérica (P>0,05). Houve uma correlação positiva entre a quantificação de ETAT e ES nos pacientes (r=+0,417, P=0,048), demonstrando que a elevação de ETAT está diretamente relacionada à ES. ETAT em tumores da cavidade oral está diretamente relacionado à ES, sem associação com agressividade tumoral, sobrevida ou outros parâmetros clínicopatológicos. Palavras-chave: Neoplasia; Eosinofilia; Vermelho Congo; Prognóstico; Sobrevivência.

9 ABSTRACT Clinical and histopathological factors affect directly the prognosis and survival of patients with oral squamous cell carcinoma (SCC). In this context, tumor-associated tissue eosinophilia (TATE) and serum eosinophilia (SE) may be associated to tumor progression and aggressiveness, and have been linked to several neoplasms, including oral cancer. The aims of this study were to test three protocols (DORTA et al., 2002; JOSHI; KAIJKAR, 2013; and JAIN et al., 2014) for identification of TATE using the Congo red histochemical staining; perform a retrospective evaluation of clinical data from patients diagnosed with oral SCC; review histological slides; identify and quantify TATE and collect hematological data related with SE during the diagnosis period of neoplastic disease. Clinical and anatomopathological data were obtained from the medical records at the University Hospital of the Federal University of Santa Catarina and the Cancer Research Center between 2006 and Tumors were classified according to degree of differentiation histology and divided into two groups: well-differentiated SCC (group 1) and moderately or poorly differentiated SCC (group 2). For tumor-associated tissue eosinophilia analysis, the histological slides were stained with Congo red and the eosinophils present in the stroma were quantified at high magnification (400x) using Image J 1.45 software. SE counts were performed using the automated XE-2100D Sysmex system after venipuncture. For the statistical analysis, non-parametric tests were applied using SPSS software version The protocol from Jain et al. (2014) was the most suitable for identification of TATE according to quality and reproducibility. Of the 113 patients studied, 83 belonged to group 1 and 30 to group 2. Most of the patients were white, smokers, alcoholics and manual workers. Stage II of the disease predominated and eight patients died. There was no statistical difference between the groups studied in relation to TATE or SE (P>0.05). There was a positive correlation between TATE quantification and SE (r=+0,417, P=0,048). TATE in tumors of the oral cavity is directly related to SE, without association with tumor aggressiveness, survival or other clinical-pathological parameters. Keywords: Neoplasm; Eosinophilia; Congo Red; Prognosis; Survival.

10 LISTA DE FIGURAS Figura 1- A, Aspecto histopatológico de carcinoma de células escamosas mostrando intensa concentração de eosinófilos perifericamente às ilhas tumorais (H&E, magnificação 200x). B, Eosinofilia associada ao tumor detectada com o auxílio da coloração histoquímica vermelho Congo (magnificação 200x)...29 Figura 2- Correlação positiva entre eosinofilia tecidual associada ao tumor e eosinofilia sérica em pacientes com carcinoma de células escamosas oral...30

11 LISTA DE TABELAS Tabela 1- Dados clínicos de 113 pacientes com carcinoma de células escamosas oral classificados em bem diferenciados (grupo 1) e moderamente/pouco diferenciados (grupo 2)...26 Tabela 2- Correlação das características histológicas dos tumores com eosinofilia tecidual e eosinofilia sérica...28

12 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS CAAE - Certificado de Apresentação para Apreciação Ética CCE - Carcinoma de Células Escamosas CCL17 - Quimiocina de Resposta Th2 CEPON-SC - Centro de Pesquisas Oncológicas de Santa Catarina ECP - Proteína Catiônica Eosinófila EDN - Neurotoxina Derivada de Eosinófilos EPO - Peroxidise de Eosinófilos ES - Eosinofilia sérica ETAT - Eosinofilia tecidual associada ao tumor GM-CSF - Fator estimulador de colônia de macrófagos e granulócitos H & E - Hematoxilina e eosina IDO - Indolamina 2,3-Dioxigenase IL - Interleucina INF- - Interferon gama K2 EDTA - Dipotássico Ácido Etileno Diamino Tetracético K3 EDTA - Tripotássico Ácido Etileno Diamino Tetracético KOH - Hidróxido de Potássio LPB-UFSC - Laboratório de Patologia Bucal da Universidade Federal de Santa Catarina LTC4 - Leucotrieno C4 MBP - Proteína Básica Principal MMPs - Metaloproteinases de Matriz

13 N0 - Ausência de metástase em linfonodos regionais, segundo a classificação TNM para tumores malignos de boca. NaCl - Cloreto de Sódio NaOH - Hidróxido de Sódio OMS - Organização Mundial de Saúde PA - Pureza Analítica PAF - Fator Ativador de Plaquetas RANTES - Citocina Expressa e Secretada por Linfócitos T SAP-UFSC - Serviço de Anatomia Patológica da Universidade Federal de Santa Catarina T1 - Tumor com 2 cm ou menos em sua maior dimensão, segundo a classificação TNM para tumores malignos de boca. T2 - Tumor entre 2 cm e 4 cm em sua maior dimensão, segundo a classificação TNM para tumores malignos de boca. T3 - Tumor com mais de 4 cm em sua maior dimensão, segundo a classificação TNM para tumores malignos de boca. T4 - Tumor disseminado em estruturas próximas ou em áreas ou tecidos mais profundos. Doença avançada. TARC - Quimiocina de resposta Th2 TCLE - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido TGF-α - Fator de Crescimento Transformante alfa TGF- - Fator de Crescimento Transformante beta Th2 - Subpopulação de Linfócitos T auxiliares TNF-α - Fator de Necrose Tumoral alfa TNM - Classificação clínica de tumores malignos desenvolvida pela União Internacional Contra o Câncer baseada na extensão anatômica da doença

14 LISTA DE SÍMBOLOS % - Porcentagem P - Significância estatística r - Coeficiente de Correlação Linear μm - Micrômetro C - Grau Celsius (χβ) - Qui-quadrado n - Número de pacientes que pertence ao grupo ± - Desvio padrão g - Grama mg - Miligramas ml - Mililitros mm 2 - Milímetro quadrado mm 3 - Milímetro cúbico

15 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO GERAL OBJETIVOS Objetivo geral Objetivos específicos ARTIGO Introdução Materiais e métodos Seleção da amostra Processamento de tecidos Análise microscópica Dados hematológicos Análise estatística Resultados Análise clínica Relação da eosinofilia tecidual associada ao tumor e eosinófilos séricos com a sobrevida dos pacientes Discussão Conclusões Referências CONCLUSÕES REFERÊNCIAS GERAIS APÊNDICE (Metodologia Expandida) Levantamento de dados clínicos e laudos histopatológicos Amostras histológicas, confecção de lâminas e classificação tumoral Colorações histoquímicas (vermelho Congo) Calibração da contagem de eosinófilos (análise do ETAT) Levantamento de dados hematológicos ANEXO 1 (ATA de apresentação do TCC)... ANEXO 2 (Parecer do comitê de ética)

16 16 1. INRODUÇÃO GERAL A eosinofilia tecidual associada a tumores (ETAT) é caracterizada pela infiltração do estroma tumoral por eosinófilos não relacionada à presença de necrose ou ulceração (LEIGHTON et al., 1996; JAIN et al., 2014). A ocorrência de ETAT está associada a malignidades de diferentes sítios anatômicos, como cavidade oral (DORTA et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2009; GOLDSMITH et al., 1987; DERON et al., 1996; ALRAWI et al., 2005; TADBIR et al., 2009; DEBTA et al., 2011; OLIVEIRA et al., 2012; HORIUCHI et al., 1993), nasofaringe (LOOI et al., 1987), laringe (THOMPSON et al., 1994; SAID et al., 2005), esôfago (ISHIBASHI et al., 2006), cólon (FERNANDEZ-ACENERO et al., 2000) e colo do útero (BETHWAITE et al., 1993; VAN DRIEL et al., 1996). A correlação da ETAT com o prognóstico em tumores malignos, incluindo o carcinoma de células escamosas oral, tem mostrado resultados variáveis que vão desde prognóstico favorável (DORTA et al., 2002; ISHIBASHI et al., 2006) até desfavorável (HORIUCHI et al., 1993; VAN DRIEL et al., 1996), que pode ser atribuído ao fato dos eosinófilos terem atividade anti-tumoral direta e indireta bem como promover a angiogênese do tumor através da produção de vários fatores de crescimento associados à proliferação vascular (PEREIRA et al., 2010). Através de estímulos, tais como infecções e tumores, os eosinófilos são capazes de liberar substâncias, como a proteína catiônica eosinófila (ECP), proteína básica principal (MBP), peroxidise de eosinófilos (EPO), neurotoxina derivada de eosinófilos (EDN), Interleucina-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-18, interferon (INF)-, fator de necrose tumoral (TNF)-α, fator de crescimento transformante (TGF)-α, TGF-, quimiocinas (RANTES, endotaxina-1), fator ativador de plaquetas (PAF), leucotrieno C4 (LTC4), neuromediadores e indolamina 2,3-dioxigenase (IDO) (KITA, 1996; ROTHENBERG; HOGAN 2006). Estas substâncias podem causar morte celular e indução de sintomas inflamatórios, bem como contribuir para a progressão ou regulação do tumor (JACOBSEN et al., 2007). Said et al. (2005) relataram aumento da contagem de eosinófilos em neoplasias laríngeas invasivas em comparação com lesões neoplásicas não invasivas, sugerindo que ETAT seja uma característica morfológica associada à invasão tumoral. O estudo de Oliveira et al. (2009) apontou que pacientes com CCE em estágios iniciais T1/T2 apresentaram ETAT ausente/leve,

17 17 enquanto a eosinofilia tecidual intensa foi fortemente associada com tumores em estágios avançados T3/T4. Além disso, a maioria dos pacientes com CCE oral no estágio clínico avançado apresentaram infiltração muscular e ETAT significativamente intenso, enquanto que aqueles com tumores no estágio inicial apresentaram frequentemente eosinofilia ausente/leve, sugerindo uma relação de ETAT e invasão tumoral. O estudo de Falconieri et al. (2008) encontrou severa eosinofilia em linfonodos metastáticos de CCE orais, indicando que fatores tumorais podem estar envolvidos na migração eosinofílica. Oliveira et al. (2012) sugeriu que ETAT é um marcador importante para prever a metástase oculta de linfonodos em pacientes com CCE oral e também um fator adjuvante histopatológico para enfatizar a indicação para o esvaziamento cervical eletivo de pacientes clinicamente N0. Rakesh et al. (2015) verificaram que a recorrência locoregional em CCE orais foi significativamente associada ao grau intenso de ETAT. Esse achado sugere que a análise de ETAT em pacientes com CCE oral pode fornecer uma indicação precoce de recorrência locoregional. Além disso, a realização da biópsia em uma área que represente à frente invasiva do tumor, e onde pode ser feita a análise de ETAT, pode ser um método simples e barato de obter valiosas informações no momento do diagnóstico. Goldsmith et al. (1992) determinou que o alto nível de ETAT é um indicador de prognóstico favorável para câncer de cabeça e pescoço. O ETAT elevado também foi associado com ausência de metástase à distância. Esses achados sugerem que o grau de ETAT é um indicador prognóstico significativo para câncer de cabeça e pescoço. A eosinofilia tecidual e eosinofilia sérica geralmente acontecem separadamente e ocorrem em diferentes circunstâncias (LOWE et al., 1981). A maioria dos casos de tumores malignos com eosinofilia sérica (ES) marcada apresentam doença tardia com metástases disseminadas (MAJUMDAR; ZAHN, 1957; ISAACSON; RAPOPORT, 1946; BRICK; GLAZER, 1951; NAGEL, 1954; LANGE, 1960). Diante das divergências na literatura quanto à associação do ETAT e no comportamento tumoral, a proposta deste estudo é avaliar estes parâmetros em relação às características clínico-patológicas de CCE orais em diferentes estágios da doença.

18 18 2. OBJETIVOS 2.1 Objetivo geral O objetivo principal do presente estudo foi determinar a eosinofilia tecidual associada a tumores em CCE oral e correlacioná-la com os dados clínicos, histopatológicos e hematológicos dos respectivos pacientes. 2.2 Objetivos específicos -Realizar uma busca retrospectiva de dados clínicos (idade, gênero, localização anatômica, modalidade de tratamento, estadiamento e mortalidade) de pacientes atendidos no HU-UFSC e CEPON com diagnóstico de CCE oral; -Identificar a graduação histológica dos tumores por meio da revisão das lâminas histológicas; -Revisar todas as lâminas histológicas obtidas dos pacientes com a finalidade de diagnóstico ou tratamento da doença obtendo assim a graduação histológica dos CCE (bem diferenciado, moderadamente diferenciado e pouco diferenciado), invasão linfática, vascular, perineural e contaminação de margem cirúrgica; -Identificar e quantificar a eosinofilia tecidual associada aos CCE por intermédio de colorações histoquímicas; -Levantar os dados hematológicos relacionados ao número total de eosinófilos avaliados nos hemogramas dos pacientes no período do diagnóstico da doença neoplásica; -Correlacionar os dados clínicos, hematológicos e microscópicos com a sobrevida dos pacientes; -Correlacionar as características histológicas dos CCE incluindo invasão linfática, vascular, perineural, contaminação da margem cirúrgica e ETAT com a diferenciação celular e estadiamento clínico.

19 19 3. ARTIGO CORRELAÇÃO ENTRE EOSINOFILIA SÉRICA E EOSINOFILIA TECIDUAL ASSOCIADA AO TUMOR EM PACIENTES COM CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL Artigo a ser submetido à revista: Oral Diseases

20 20 CORRELAÇÃO ENTRE EOSINOFILIA SÉRICA E EOSINOFILIA TECIDUAL ASSOCIADA AO TUMOR EM PACIENTES COM CARCINOMA DE CÉLULAS ESCAMOSAS ORAL Título curto: Eosinofilia sérica e tecidual associada a carcinoma oral. Silva 1, HK; Gondak 2, RO 1 Hannah Karyn da Silva. Undergraduate student of Dental School, Federal University of Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, SC, Brazil. 2 Rogério de Oliveira Gondak. PhD, DDS, MSc. Department of Pathology, Federal University of Santa Catarina (UFSC), Florianópolis, SC, Brazil.

21 21 RESUMO Vários fatores clínicos e histopatológicos interferem diretamente no prognóstico e na sobrevida dos pacientes com carcinoma de células escamosas (CCE) orais. Nesse contexto, a eosinofilia tecidual associada ao tumor (ETAT) e a eosinofilia sérica (ES) podem estar diretamente relacionadas à progressão e à agressividade tumoral. Os objetivos deste estudo foram avaliar os dados clínicos e histopatológicos de pacientes com CCE e comparar com as quantificações de ETAT e ES durante o período de diagnóstico da doença neoplásica. Os dados clínicos e anatomopatológicos foram obtidos a partir dos prontuários do Hospital Universitário da Universidade Federal de Santa Catarina e do Centro de Pesquisas Oncológicas entre 2006 e Os tumores foram classificados de acordo com o grau de diferenciação histológica, e divididos em dois grupos: carcinomas bem diferenciados (grupo 1) e carcinomas moderadamente ou pouco diferenciados (grupo 2). Para a análise de ETAT, as lâminas histológicas foram coradas com vermelho Congo e os eosinófilos presentes no estroma foram contados em cinco campos consecutivos em alta magnificação (400x). A contagem de ES foi realizada usando o sistema automatizado XE-2100D Sysmex após a punção venosa. Dos 113 pacientes, 83 pertenceram ao grupo 1 e 30 ao grupo 2. A maioria dos pacientes era leucoderma, fumantes, etilistas e trabalhadores manuais. O estágio II da doença predominou em ambos os grupos com 31,10% e 40% nos grupos 1 e 2, respectivamente, e oito pacientes foram a óbito. Não houve diferença estatística entre os grupos em relação ao ETAT ou ES (P = 0,163 e P = 0,193, respectivamente). No entanto, houve uma correlação positiva entre o ETAT e ES (r = + 0,417, P = 0,048). ETAT está diretamente associada à ES em pacientes com CCE, não apresentando associação com agressividade tumoral, sobrevida ou outros parâmetros clínico-patológicos. Palavras-chave: Neoplasia; Eosinofilia; Vermelho Congo; Prognóstico; Sobrevivência.

22 22 Introdução Os eosinófilos são derivados da medula óssea caracterizados pela presença de grânulos específicos que contêm proteínas catiônicas e mediadores inflamatórios como fator de crescimento transformante-alfa, -beta, interleucina-3, fator de necrose tumoral alfa, fator de estimulação de colônias de granulócitos e macrófagos que pode ser relacionado à lise de células tumorais (DORTA et al., 2002; MARTINELLI KLAY et al., 2009). Vários fatores prognósticos foram aplicados à avaliação do comportamento agressivo dos tumores e à sobrevida dos pacientes com carcinoma de células escamosas (CCE) oral como estadiamento TNM, profundidade tumoral (CARVALHO et al., 2004; BRANDWEIN- GENSLER, 2005) invasão linfovascular e perineural (WOOLGAR, 2006; JARDIM et al., 2015) ou eosinofilia tecidual (DORTA et al., 2002; BANKUR et al., (2016). A eosinofilia tecidual associada ao tumor (ETAT) é definida como infiltração estromal de um tumor por eosinófilos não associados à ulceração ou necrose (LEIGHTON et al., 1996; JAIN et al., 2014). Os eosinófilos são conhecidos por desempenhar um papel importante na saúde e na doença (JAIN et al., 2014). Eles estão envolvidos principalmente na iniciação e propagação de várias respostas inflamatórias, incluindo infecções, lesões teciduais e doenças alérgicas, e são conhecidos moduladores da imunidade inata e adaptativa (HOGAN et al., 2008). Vários estudos demonstraram seu papel na progressão ou regulação tumoral (JOSHI; KAIJKAR, 2013). Sob o impacto da iniciação infecciosa ou tumoral, os eosinófilos liberam vários mediadores como interleucinas, interferon gama (INF- ), fator de crescimento transformador alfa e beta (TGF-α, TGF- ), neurotoxina derivada de eosinófilos (EDN), quimiocinas (RANTES, endotaxina-1), Peroxidase Eosinofílica (EPO), Fator Ativador de Plaquetas (PAF), Fator de Necrose Tumoral (TNF), Leucotrieno C4 (LTC4), neuromediadores e indoleamina 2,3-dioxigenase (IDO). Estas moléculas podem promover a morte celular e o aparecimento de sintomas inflamatórios, bem como auxiliar na regulação do tumor (MARTINELLI KLAY et al., 2009). Os eosinófilos têm uma atividade antitumoral direta relacionada à liberação de proteínas citotóxicas e atuam indiretamente nas células tumorais aumentando sua permeabilidade e contribuindo para a penetração de citocinas, responsáveis pela morte de células tumorais. Em contraste, os eosinófilos também produzem vários fatores angiogênicos que podem favorecer a progressão tumoral (PEREIRA et al., 2011).

23 23 O recrutamento inicial e ativação de eosinófilos em direção ao microambiente tumoral está associado à resposta de Th2, embora as células necróticas sejam capazes de estimular tanto a migração quanto a ativação de eosinófilos (STENFELDT; WENNERAS, 2004; CORMIER et al., 2006). Neste contexto, células tumorais necróticas sintetizam interleucinas (IL-3 e -5), eotaxina-1, bem como timo e quimiocinas reguladas por ativação, como TARC e CCL17, que têm a capacidade de agir coletivamente na diferenciação e/ou migração de eosinófilos (DAVIS; ROTHENBERG, 2014). Além disso, os eosinófilos são a principal fonte de eotaxina em CCE de cavidade oral (LORENA et al, 2003), revelando um mecanismo autócrino para a eosinofilia tecidual (DAVIS; ROTHENBERG, 2014). Os eosinófilos que são recrutados para o local do tumor em crescimento, como resposta do tecido conjuntivo ao dano tecidual, secretam fatores de remodelação tecidual, como fator básico de crescimento de fibroblastos, GM-CSF, MMPS, TGF- e fatores antigênicos que podem favorecer o crescimento tumoral (MARTINELLI KLAY et al., 2009; ISHIBASHI et al, 2006; AGARWAL et al., 2006; JACOBSEN et al., 2012). Na coloração de rotina H&E, a presença de eosinófilos pode não ser evidenciada facilmente, pois pode ser ofuscada pelo infiltrado de células inflamatórias ou os eosinófilos podem assumir morfologia defeituosa (JOSHI; KAIJKAR, 2013). Em tais situações, a coloração histoquímica do vermelho Congo provou ser uma valiosa ferramenta diagnóstica para a detecção de eosinófilos devido à sua propriedade única de se ligar a eosinófilos (DEBTA et al., 2011 e DEBTA et al., 2012). A correlação de ETAT com prognóstico ou sobrevida tem mostrado resultados variáveis em CCE oral (JAIN et al., 2014). Embora existam vários estudos que abordam o papel de ETAT nos tumores de cabeça e pescoço, não há pesquisas que investiguem a interferência da ES no aumento da população de eosinófilos no CCE oral. Materiais e Métodos Seleção da amostra Os dados clínicos e histopatológicos de 113 pacientes com diagnóstico de CCE oral foram obtidos e avaliados a partir dos prontuários médicos e laudos anatomo patológicos, do Laboratório de Patologia Bucal e Serviço de Anatomia Patológica da Universidade Federal de Santa Catarina e do Centro de Pesquisas Oncológicas, entre

24 e Foram coletados informações como idade, gênero, etnia, ocupação, localização anatômica do tumor primário, aspecto da lesão, etilismo, tabagismo, estadiamento, tratamento, graduação histológica, contaminação da margem cirúrgica, invasão linfática, vascular e perineural. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Santa Catarina e do Centro de Pesquisas Oncológicas (CAAE: ). Processamento de tecidos Foram obtidas amostras de CCE oral, emblocadas em parafina e secções histológicas de 5 μm de espessura foram submetidas à coloração de hematoxilina e eosina (H&E), para classificação histológica e vermelho Congo para identificação de eosinófilos. O protocolo aplicado nesta pesquisa foi descrito por Jain et al. (2014). Como controle positivo foram utilizadas amostras de histiocitose de células de Langerhans, uma vez que esta lesão possui grande número de eosinófilos. Análise microscópica Após a coloração em H&E, as lâminas foram revisadas por um patologista oral (R.O.G) de acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde (OMS, 2017) para a diferenciação histopatológica (bem diferenciado ou moderadamente/pouco diferenciado), presença de invasão vascular, linfática ou perineural e contaminação das margens cirúrgicas. A frente invasiva do tumor foi selecionada para a quantificação de eosinófilos usando secções coradas com vermelho Congo. Os eosinófilos foram contados por dois observadores cegados (R.O.G e H.K.S) em cinco campos de alta magnificação (aumento de 400x), com área mínima tumoral de 1 mm 2, usando o software Image J 1.45s (Maryland, EUA). Dados hematológicos Os eosinófilos séricos por mm 3 de sangue foram obtidos de pacientes no mesmo momento do diagnóstico histopatológico de CCE oral. A quantificação de ES foi realizada utilizando o sistema automatizado XE-2100D Sysmex. As amostras foram coletadas após a

25 25 punção venosa usando EDTA (K2 ou K3 EDTA) como anticoagulante e analisadas até 4 horas após a coleta. As amostras não processadas neste período foram refrigeradas a entre 2 a 8 C para posterior análise. Análise estatística As diferenças na distribuição das variáveis foram avaliadas pelo teste do qui-quadrado (χβ) e, quando necessário, o teste exato de Fisher. Os testes de Spearman e Mann-Whitney também foram aplicados por meio do software SPSS versão Um valor de P<0,05 foi considerado como estatisticamente significativo. Resultados Análise clínica Dos 113 pacientes diagnosticados com CCE oral, 83 (93,79%) apresentaram tumores classificados como bem diferenciados (Grupo 1) e 30 (6,21%) com tumores moderadamente ou pouco diferenciados (Grupo 2). Houve predominância de pacientes do sexo masculino em ambos os grupos e a idade média dos pacientes nos grupos 1 e 2 foi de 59,55±10,64 e 58,00±9,88 anos, respectivamente. Quanto ao consumo de álcool e tabaco, a maioria dos pacientes eram fumantes (95,31% no grupo 1 e 100% no grupo 2) e etilistas (91,11% no grupo 1 e 100% no grupo 2). A língua e o assoalho bucal foram os sítios anatômicos mais acometidos em ambos os grupos. A maioria dos pacientes foi classificada como doença no estágio II tanto no grupo 1 como no grupo 2. Comparando o estadiamento da doença com ETAT e quantificação de ES, não foi observada significância estatística (P = 0,102 e P = 0,184, respectivamente). Outros parâmetros clínicos analisados em pacientes com CCE oral não apresentaram significância estatística em relação ao ETAT ou quantificação de ES (P>0,208 e P>0,162, respectivamente). Os dados adicionais são mostrados na Tabela 1.

26 26 Tabela 1. Dados clínicos dos 113 pacientes com carcinomas de células escamosas oral bem diferenciados (grupo 1) e moderadamente/pouco diferenciados (grupo 2). Dados clínicos Grupo 1 (n=83) Grupo 2 (n=30) P-Valor Idade 59.55± ± Sexo Masculino 84.34% 86.67% Feminino 15.66% 13.33% Etnia Branco 82.1% Negro 17.9% Localização Língua 24.10% Assoalho 13.25% bucal Lábio 18.07% Rebordo 6.03% alveolar/ gengiva Região 3.61% retromolar Palato 3.61% Amigdala 2.41% Múltiplas 28.92% regiões anatômicas Evolução 0-3meses 41.67% 3-6meses 14.58% 6-12meses 27.08% >12meses 16.67% Ocupação Trabalhadores 15.38% não manuais Trabalhadores 50.77% manuais 74.07% 25.93% 20.00% 23.33% 10.00% 6.67% 0% 10.00% 0% 30.00% 52.38% 23.80% 19.05% 4,77% 13.04% 65.22% Consumo de Álcool Domésticos 33.85% e aposentados Sim 91.11% Não 8.89% 21.74% 100% 0.0% Cigarros/dia <40cigarros 38.89% 40cigarros 61.11% Tamanho T % T % T % T4 4.66% Sintomatologia Presente 74.47% Ausente 25.53% 60.0% 40.0% 35.29% 52.94% 11.77% 0.0% 64.70% 35.30%

27 27 Aspecto Clínico Estadiamento TNM Úlcera/ 68.05% eritroplasia Placa/nódulo 16.67% Eritroleucoplasia 15.28% I 24.45% II 31.10% III 20% IV 24.45% Tratamento Cirurgia 35.55% Quimioterapia 0% Radioterapia 0% *Terapias 64.45% combinadas 86.66% 6.67% 6.67% 28% 40% 12% 20% 40% Eosinófilo ± ± sanguíneo (/mm 3 de sangue) *Terapias combinadas: associação de cirurgia, radioterapia e quimioterapia. A contagem média de ETAT foi maior no CCE oral sem invasão linfática, enquanto a contagem média de ES foi maior no CCE oral com invasão linfática. O CCE oral com invasão perineural ou vascular apresentou maior número de ETAT e ES. Com relação à contaminação das margens cirúrgicas pelo tumor, a contagem média de ES e ETAT foi maior quando as margens estavam comprometidas (Figura 1 e Tabela 2). Houve uma correlação positiva entre a quantificação de ETAT e ES nos pacientes (r = + 0,417, P = 0,048), demonstrando que a elevação do ETAT está diretamente relacionada à ES (Figura 2). 0% 4% 56% 0.355

28 28 Tabela 2. Correlação das características histológicas dos tumores com eosinofilia tecidual e eosinofilia sérica. Características histológicas do tumor TATE (mm 2 /tecidual) n=113 Eosinófilos séricos (mm 3 /sangue) n=33 Eosinófilos teciduais P-Valor Eosinófilos séricos Com invasão linfática 76,30±188,44 364,88±389,25 0,348 0,546 Sem invasão linfática 81,2±211,06 224,75±199,04 Com invasão vascular 87±185,96 244,99±328,13 0,819 0,954 Sem invasão vascular 74±217,51 236,26±198,91 Com invasão perineural 145,07±281,99 337,84±229,59 0,303 0,369 Sem invasão perineural 23,37±37,20 204,51±193,24 Margens livres 77,77±211,89 252,77± ,776 0,790 Margens comprometidas 92,11±195,58 304,20±365.87

29

30 Eosinófilos séricos 30 r=+0,417; P=0,048 Eosinófilos teciduais Figura 2. Correlação positiva entre eosinofilia tecidual associada a tumor e eosinófilos séricos em pacientes com carcinoma de células escamosas oral. Relação de eosinofilia tecidual associada ao tumor e eosinófilos séricos com sobrevida de pacientes A média de idade das pessoas que foram à óbito foi de 60,14 anos. A eosinofilia tecidual presente no infiltrado inflamatório tumoral teve uma contagem média de 64,77±155,59 eosinófilos por mm 2 de tecido tumoral em pacientes vivos e 34,75±56,05 eosinófilos por mm 2 de tecido tumoral em pacientes que foram à óbito. Enquanto isso, a eosinofilia sérica teve uma contagem média de 244,87±247,74 e 228,87±171,15 eosinófilos por mm 3 de sangue em pacientes vivos e falecidos, respectivamente. Assim, os óbitos ocorreram em pessoas que tiveram menor contagem média de eosinófilos séricos e teciduais. No entanto, esse resultado não foi estatisticamente significativo (P> 0,05).

31 31 DISCUSSÃO O presente estudo revelou uma importante correlação entre a eosinofilia tumoral e sérica nos pacientes portadores de CCE oral. Embora alguns estudos associem a agressividade tumoral com uma elevação na contagem de eosinófilos em amostras neoplásicas (BANKUR et al., 2016; YELLAPURKAR et al., 2016), esta pesquisa demostrou que a eosinofilia tecidual está fortemente associada a eosinofilia sérica, sem haver interferência exclusiva dos demais fatores clínicos, ambientais ou histopatológicos ligados ao desenvolvimento do tumor. Segundo Horie et al. (2002) a ES está eventualmente relacionada a tumores malignos e a presença de eosinófilos e células Th2 no sangue pode estar associada à progressão tumoral e ao pior prognóstico (MANCHANDA et al., 2006; WALTER et al., 2002). Além disso, Walter et al. (2002) encontraram aumento da ES e aumento dos níveis de IL-5 no sangue em pacientes com CCE oral metastático. Em nosso estudo, ES e ETAT foram maiores em CCE moderadamente ou pouco diferenciados, com invasão vascular, perineural e contaminação de margens cirúrgicas, porém esses resultados não foram estatisticamente significativos. Yamazaki et al. (2005) mostraram que pacientes com câncer de colo de útero em estágio mais avançado (estágio IV) apresentaram ES menor do que pacientes com doença em estágios menos avançados (I, II e III). Além disso, demonstraram que a taxa de sobrevivência em 5 anos foi maior para pacientes com ES positiva e concluíram que a ES se correlaciona com a classificação do estágio e um bom prognóstico. No nosso estudo, os óbitos aconteceram em pacientes que apresentavam menor contagem média de eosinófilos sanguíneos, porém esses dados não foram estatisticamente significativos. Os óbitos podem ter acontecido devido a complicações relacionadas ao câncer, como metástase, caquexia ou como consequência do tratamento. Em nosso estudo predominou em ambos os grupos pacientes do sexo masculino na quinta década de vida. Bankur et al. (2016) verificaram que os homens têm uma predileção marcada pelos três graus de CCE. Ercan et al. (2005) concluíram que existe uma correlação negativa entre ETAT e idade no CEC de laringe, considerando que pacientes com mais de 60 anos apresentaram menor incidência de ETAT sugerindo que a idade influencia a resposta inflamatória do tecido tumoral. Nosso estudo revelou que a maioria dos pacientes de ambos os grupos apresentou história de etilismo e tabagismo, e esses indivíduos apresentaram o maior número ETAT e ES. Oliveira et al. (2012) encontraram que a ETAT intensa no CCE oral está significativamente

32 associada apenas ao consumo de álcool ou a uma longa história de ingestão combinada de álcool e tabaco. No entanto, Dorta et al. (2002) e Oliveira et al. (2009) não encontraram associação entre ETAT e consumo de álcool e tabaco em CCE oral. Investigações prévias de associação de ETAT com CCE não detectaram diferenças em diferentes regiões orais como língua, assoalho da boca, área retromolar e gengiva inferior (DORTA et al., 2002; OLIVEIRA et al., 2012). Nosso estudo também não apontou variações na distribuição dos eosinófilos entre essas regiões. ETAT tem sido associada a um bom prognóstico em alguns estudos (DORTA et al., 2002; FERNÁNDEZ-ACEÑERO et al., 2000; PRETLOW et al., 1983), enquanto outros estudos afirmam que ETAT é um indicador de prognóstico ruim (HORIUCHI et al., 1983; SAID et al., 2005). Nosso estudo não mostrou melhor comportamento clínico ou histológico em vista da elevação na quantificação de ETAT ou ES. Bankur et al. (2016) concluiu que números médios de eosinófilos teciduais foram mais elevados nos CCE oral bem diferenciados, seguido por moderadamente diferenciados e pouco diferenciados e as diferenças de eosinófilos médios entre os grupos mostrou-se estatisticamente significante. Já no nosso estudo o número médio de eosinófilos foi maior nos carcinomas moderadamente/pouco diferenciados seguido por bem diferenciados, mas esses resultados não foram estatisticamente significativos. Esta ES pode ter sido ocasionado por outras condições ou doenças de base, como alergias ou parasitoses. Yellapurkar et al. (2016) encontraram que os valores médios da contagem de eosinófilos foram maiores em casos bem diferenciados de CCE oral. Além disso, após correlação com fatores prognósticos (recorrência e comprometimento da margem), as contagens de eosinófilos teciduais foram consideradas maiores nos casos que não apresentaram recorrência e não houve comprometimento da margem. Em nosso estudo, CCE oral moderadamente/pouco diferenciado apresentou mais casos com margem comprometida do que CCE oral bem diferenciado. No entanto, esta associação não foi estatisticamente significativa. Nason et al. (2009); Braakhuis et al. (2010) acrescentam que a maioria dos tumores sólidos, incluindo CCE de cabeça e pescoço, o envolvimento das margens cirúrgicas está relacionado à alta taxa de recorrência regional e resulta na diminuição da sobrevida. Said et al. (2005), relataram aumento da contagem de eosinófilos em neoplasias laríngeas invasivas em comparação com lesões neoplásicas não invasivas, sugerindo que ETAT seja uma característica morfológica associada à invasão tumoral. Um estudo de Oliveira et al. (2012), relatou 32

33 33 que um ETAT intenso possa estar fortemente associado a estágios avançados (T3/T4) do carcinoma. Nosso estudo apresentou ETAT maior em carcinomas moderadamente/pouco diferenciados assim como em estágio III e IV da doença, porém, esses resultados não foram significativos estatisticamente. Os pacientes que foram à óbito tiveram uma contagem média mais baixa de eosinófilos séricos e teciduais. Esta condição poderia estar relacionada à deficiência ou fragilidade imunológica que pode ter contribuído para o óbito do paciente. Bankur et al. (2016) encontraram a possibilidade de que a resposta imune do hospedeiro ao tumor tenha origem no recrutamento de eosinófilos para a região. No entanto, os óbitos também podem ter ocorrido devido consequências das complicações provocadas pelo câncer ou pelo tratamento da doença. O presente estudo apresentou algumas limitações. Alguns pacientes após o tratamento não retornaram ao acompanhamento clínico, dificultando a coleta de informações relacionadas à recidiva ou sobrevida. Além disso, como os pacientes foram avaliados hematologicamente apenas no momento do diagnóstico de CCE oral, resultados adicionais poderiam ser extrapolados com a avaliação em diferentes momentos, como após o tratamento. Em conclusão, o presente estudo demonstrou uma correlação positiva entre ETAT e ES. Provavelmente, outros parâmetros imunológicos estão relacionados à densidade de ETAT ou ES, independentemente do estágio ou da graduação neoplásica. Estudos adicionais são necessários para determinar o papel da eosinofilia tecidual e sérica no desenvolvimento neoplásico e seu impacto na agressividade da doença. Referências AGARWAL, A. et al. Disregulated expression of the Th2 cytokine gene in patients with intraoral squamous cell carcinoma. Immunol Invest. v. 32, n. 1-2, p , BANKUR, R. et al. Quantitative analysis of tumor-associated tissue eosinophilia in different histological grades of oral squamous cell carcinoma. Indian J Dent Res. v. 27, n. 5, p , BRAAKHUIS, BJ. et al. Molecular analysis of surgical margins in head and neck cancer: more than a marginal issue. Oral Oncol. v. 46, n. 7, p , 2010.

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38 38 4 CONCLUSÕES -A maioria dos pacientes eram do sexo masculino, tabagistas, etilistas, trabalhadores manuais e estavam na quinta década de vida; -O melhor protocolo para identificação de ETAT foi descrito por Jain et al. (2014); - Nesse estudo, a contagem de ES e ETAT foi considerada maior nos tumores moderadamente/pouco diferenciados em comparação com os bem diferenciados; - Contagem de ETAT e ES foi maior em CCE com invasão vascular, com invasão perineural e com margens comprometidas; -Houve uma correlação positiva entre a quantificação de ETAT e ES nos pacientes, demonstrando que a elevação de ETAT está diretamente relacionada à ES; -Os óbitos aconteceram em pessoas que apresentavam menor contagem média de ETAT e ES.

39 39 Referências gerais AGARWAL, A. et al. Disregulated expression of the Th2 cytokine gene in patients with intraoral squamous cell carcinoma. Immunol Invest. v. 32, n. 1-2, p , ALRAWI, SJ. et al. Tissue eosinophilic infiltration: a useful marker for assessing stromal invasion, survival and locoregional recurrence in head and neck squamous neoplasia. Cancer J. v. 11, n. 3, p , BANKUR, R. et al. Quantitative analysis of tumor-associated tissue eosinophilia in different histological grades of oral squamous cell carcinoma. Indian J Dent Res. v. 27, n. 5, p , BETHWAITE, PB. et al. Effect of tumour associated tissue eosinophilia on survival of women with stage IB carcinoma of the uterine cervix. J Clin Pathol. v. 46, n. 11, p , BRAAKHUIS, BJ. et al. Molecular analysis of surgical margins in head and neck cancer: more than a marginal issue. Oral Oncol. v. 46, n. 7, p , BRANDWEIN-GENSLER, M. et al. Oral squamous cell carcinoma: histologic risk assessment, but not margin status, is strongly predictive of local disease-free and overall survival. Am J Surg Pathol. v. 29, n. 2, p , BRICK, IB.; GLAZER, L. Marked eosinophilia with cancer: a poor prognostic sign. Ann Intern Med. v. 35, n. 1, p , CARVALHO, AL. et al. Trends of oral and oropharyngeal cancer survival over five decades in 3267 patients treated in a single institution. Oral Oncol, v. 40, n. 1, p , CORMIER, SA. et al. Pivotal advance: eosinophil infiltration of solid tumors is an early and persistent inflammatory host response. J Leukoc Biol. v. 79, n. 6, p , DAVIS, BP.; ROTHENBERG, ME. Eosinophils and cancer. Cancer Immunol Res. v. 2, n. 1, p. 1-8, 2014.

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45 45 APÊNDICE - Metodologia expandida Levantamento dos dados clínicos e dos laudos histopatológicos Foram avaliados 113 pacientes e a obtenção dos dados clínicos e histopatológicos foi realizada através dos prontuários médicos e dos laudos anátomo-patológicos que incluíram: sexo, etnia, idade, profissão, localização anatômica do tumor primário, aspecto da lesão, etilismo, tabagismo, estadiamento, modalidade de tratamento, graduação histológica, invasão linfática, vascular e contaminação de margem cirúrgica. Estas informações foram coletadas no Laboratório de Patologia Bucal da Universidade Federal de Santa Catarina (LPB-UFSC), Serviço de Anatomia Patológica da Universidade Federal de Santa Catarina (SAP- UFSC) e Centro de Pesquisas Oncológicas de Santa Catarina (CEPON- SC) entre 2006 e Os pacientes vivos envolvidos nesta pesquisa responderam ao Termo de Consentimento Livre e Esclarecido ou TCLE com o objetivo de autorizar a coleta de informações clínicas e histopatológicas presentes nos prontuários médicos e laudos anatomopatológicos, bem como acesso ao material tecidual emblocado em parafina coletado previamente com finalidade de diagnóstico ou tratamento. Nos casos de pacientes postmortem, foi solicitado ao familiar ou responsável legal pelo paciente a aplicação do TCLE. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Santa Catarina e Centro de Pesquisas Oncológicas (CAAE: ). Amostras histológicas, confecção de lâminas e classificação tumoral Foram obtidas amostras de tecidos tumorais emblocados em parafina e arquivados no LPB-UFSC e SAP-UFSC. Em seguida, os blocos foram seccionados com micrótomo à 5μ de espessura para obtenção de 2 lâminas histológicas de cada paciente para colorações em hematoxilina e eosina (H&E) e colorações histoquímicas para eosinófilos. Após coloração em H&E, os tumores foram revisados de acordo com os critérios da OMS (2017) e divididos em dois grupos: Grupo 1, tumores bem diferenciados e Grupo 2, tumores moderadamente ou pouco diferenciados.

46 46 Colorações histoquímicas (vermelho Congo) Três protocolos de coloração histoquímica para vermelho Congo inicialmente descritos na literatura por Dorta et al. (2002), Joshi e Kaijkar (2013) e Jain et al. (2014) foram testados para estabelecer padronização na identificação de eosinófilos. Para esta fase, amostras de histiocitose das células de Langerhans foram utilizadas como controle positivo da técnica, uma vez que esta lesão possui grande número de eosinófilos. O protocolo descrito por Dorta et al. (2002) consistiu em desparafinizar as lâminas, hidratação e lavagem em água corrente por 5 minutos. Após, as lâminas foram coradas em hematoxilina de Harris por 3 minutos e lavadas em água corrente por 2 minutos. A seguir, foi feita imersão em álcool-ácido, que consistiu em 188ml de álcool com 10 ml de água destilada e 2 ml de ácido clorídrico PA. Posteriormente, as lâminas foram lavadas novamente em água corrente por 5 minutos. As lâminas foram mergulhadas em solução alcalina de uso misturada com a de estoque, sendo que a solução alcalina de uso consistiu em 50ml de água destilada com 0,5 mg de NaOH e a solução alcalina de estoque consistiu em 50 ml de álcool 80% com 2g de cloreto de sódio. As lâminas, então, foram coradas na solução de vermelho Congo, que consistiu em 50ml de álcool com 2g de NaCl e 0,125g de vermelho Congo, por 60 minutos. Por último, as lâminas foram imersas em álcool 80%, álcool/xilol e xilol puro e montadas com lamínulas associadas com resina sintética Entellan. O protocolo descrito por Joshi e Kaijkar (2013) foi realizado corando as lâminas por uma hora em solução de vermelho Congo alcoólica a 1%, que consistiu em 0,5g de vermelho congo com 25 ml de etanol e 25 ml de água destilada. As lâminas foram então colocadas em hematoxilina de Mayer durante 2 minutos, seguido por um enxague com água. Finalmente, as lâminas foram desidratadas e montadas. No protocolo descrito por Jain et al. (2014) primeiramente, as lâminas foram desparafinadas, e hidratadas através de álcoois graduados para água, e em seguida, colocadas em 1% de solução de vermelho Congo durante 8 minutos seguido de lavagem em água. Após, a diferenciação foi feita em solução de KOH a 2,5%, que consistiu em 5g de KOH e 200mg de água destilada, uma vez por imersão. As secções foram contrastadas com hematoxilina de Harris durante 8 minutos, em seguida, lavadas em água corrente. A diferenciação foi feita em álcool-ácido 1%, que consistiu em 188ml de álcool com 10 ml de água destilada e 2 ml ácido clorídrico PA, uma vez por imersão. Por último, as secções foram desidratadas através do álcool e xilol, e montadas com lamínulas associadas com resina sintética Entellan.

47 47 Diante dos protocolos aplicados, o método classificado como mais adequado para a identificação de eosinófilos foi o estabelecido por Jain et al. (2014). Calibração da contagem de eosinófilos (análise do ETAT) Antes da efetiva contagem de eosinófilos nas amostras tumorais da pesquisa, foi aplicado o procedimento de calibração de contagem. Foram capturadas digitalmente imagens microscópicas de nove lâminas histológicas coradas em vermelho Congo com o auxílio de um microscópio de luz (Axiostar plus; Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha) acoplado a câmera digital (Canon Powershot A620; Cannon, Lake Success, NY, EUA). Para a contagem de eosinófilos, dois observadores cegos (ROG e HKS) utilizaram o software Image J 1.45s (Maryland, EUA) através da ferramenta operacional Plugins- Anayze Cell Counter. Após contagem dos campos em aumento de 400x, foi aplicado o teste estatístico Kappa para verificação da concordância inter e intraobservadores, com valor alcançado > 0,75. Posteriormente, as lâminas coradas com vermelho Congo foram fotografadas em 5 campos de alta potência consecutivos totalizando 1 mm 2 de área tumoral, com a ajuda de um fotomicroscópio. Em seguida, usando o software Image J 1.45 (Maryland, EUA), realizamos a quantificação de eosinófilos presentes em amostras de tecido tumoral e o número de eosinófilos por mm 2 de tecido tumoral foi registrado. A frente invasiva do tumor foi escolhida para a estimativa de eosinófilos. As áreas de necrose tumoral foram excluídas da análise. Levantamento de dados hematológicos O número de eosinófilos por mm 3 de sangue foi obtido dos hemogramas realizados pelos pacientes participantes da pesquisa, no Laboratório de Análises Clínicas do Hospital Universitário (HU-UFSC) no período de diagnóstico da neoplasia oral. Os pacientes fizeram o hemograma com jejum mínimo de 4 horas. O equipamento utilizado para geração do hemograma no HU- UFSC foi o XE-2100D da marca Sysmex. As amostras foram colhidas por venopunção, utilizando como anticoagulante o EDTA (K2 EDTA ou K3 EDTA), e analisadas até no máximo 4 horas após a coleta. As amostras não processadas nesse período, foram refrigeradas entre 2 a 8 o C para posterior análise.

48 ANEXO 1- ATA de apresentação do TCC 48

49 49 ANEXO 2 Parecer do comitê de ética

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