MARIA ANTONIA MALAJOVICH

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1 MARIA ANTONIA MALAJOVICH BIOTECNOLOGIA Segunda Edição (2016) ISBN:

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3 MARIA ANTONIA MALAJOVICH BIOTECNOLOGIA 2ª EDIÇÃO Rio de Janeiro Maria Antonia Muñoz de Malajovich 2016 BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

4 Copyright 2016 Maria Antonia Muñoz de Malajovich BIOTECNOLOGIA Maria Antonia Malajovich ISBN: Figuras e fotos dos embriões de Kalanchoe (capa e contracapa) da autora. O meu agradecimento a Elisabeth Lissovsky pela revisão do português. ii

5 SUMÁRIO Seguir o link para ir diretamente ao capítulo de interesse. C A P Í T U L O 1. O QUE É BIOTECNOLOGIA... 1 A biotecnologia tradicional. A biotecnologia moderna. As definições de biotecnologia. O impacto da biotecnologia. Biotecnologia e desenvolvimento. A história da biotecnologia. C A P Í T U L O 2. CÉLULAS E CROMOSSOMOS...9 A célula como unidade estrutural e funcional dos seres vivos. Técnicas laboratoriais. Toda célula deriva de outra preexistente. Os cromossomos e a teoria cromossômica da hereditariedade. As primeiras manipulações gênicas. Nature vs nurture. Células e cromossomos como agentes biológicos. C A P Í T U L O 3. OS MICRORGANISMOS...20 A diversidade microbiana (Eubactérias, algas, arqueas, fungos e vírus). As técnicas microbiológicas. Biossegurança e biosseguridade. Os microrganismos como agentes biológicos. C A P Í T U L O 4. ENZIMAS E ANTICORPOS...32 As proteínas. Estrutura. O proteoma. As bases de algumas técnicas laboratoriais. As enzimas. A catálise enzimática. Os anticorpos. A reação antígeno- anticorpo. A produção de anticorpos no organismo e no laboratório. A utilização dos anticorpos. C A P Í T U L O 5. OS ÁCIDOS NUCLEICOS...46 Os ácidos nucleicos. A dupla hélice. O código genético. A expressão gênica. O fluxo da informação genética em células procarióticas e eucarióticas. O complexo mundo dos RNAs. A diversidade existente. Interferência e silenciamento gênico. O genoma humano: mapeamento e avanços posteriores. O DNA e o RNA como agentes biológicos. C A P Í T U L O 6. BIOPROCESSOS...58 Bioprocessos, processos fermentativos e indústria. Os microrganismos industriais. Noções sobre o metabolismo primário e secundário. As fases de crescimento da população microbiana. Meios de cultura e matéria-prima. A obtenção das linhagens. Os diferentes tipos de bioprocessos (tradicionais e submersos). Do laboratório à indústria (mudança de escala, condução do processo e recuperação do produto. Bioprocessos na indústria: o ácido cítrico e os biofertilizantes. C A P Í T U L O 7. O CULTIVO DE CÉLULAS E TECIDOS...71 A manipulação in vitro de células e tecidos vegetais: as primeiras tentativas, os meios de cultura, as etapas do processo, as diferentes modalidades, melhoramento e conservação da biodiversidade vegetal, a difusão da tecnologia. A manipulação in vitro das células animais: as primeiras tentativas, as diferentes modalidades, os meios de cultivo, as linhagens celulares, condições de cultivo, do laboratório à indústria. C A P Í T U L O 8. A TECNOLOGIA DO DNA...83 As ferramentas disponíveis: as nucleases ou enzimas de restrição, a eletroforese do DNA, hibridização e sondas gênicas, o método de Southern, o Fingerprint, a síntese e amplificação de DNA, o sequenciamento do DNA. Os arrays. C A P Í T U L O 9. A ENGENHARIA GENÉTICA...95 O nascimento da biotecnologia moderna: as primeiras experiências, mitos e realidade. As bibliotecas de genes. A construção de um microrganismo recombinante: Encontrar o gene, inserir o gene e identificar os microrganismos recombinantes. A chegada da comunidade DIY. A construção de plantas transgênicas: o transgene, a transferência dos genes a células vegetais, do laboratório ao campo. Células e animais transgênicos: a transferência gênica a células animais, aplicações. As novas tecnologias de edição gênica baseadas no RNA interferente, nas nucleases sítio-dirigidas: ZFN S E TALEN, na imunidade bacteriana: CRISPR-CAS9.Biossegurança e regulação. C A P Í T U L O 10. BIOTECNOLOGÍA E INDÚSTRIA O processo Weizmann. A indústria química: as vias química e biotecnológica. Os produtos biotecnológicos: metabólitos de interesse comercial, enzimas, biopolímeros e bioplásticos. Os biocombustíveis: etanol, biogás, biodiesel. Panorama atual. Biorrefinarias e novas bioindústrias: os casos Amyris e Solazyme (TerraVia). C A P Í T U L O 11. BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE O desenvolvimento sustentável. As tecnologias limpas: substituição de processos industriais e de insumos agrícolas. A redução dos resíduos: degradação do lixo, tratamento das águas residuais, tratamento dos efluentes industriais, emissões de gases e efeito estufa. A recuperação de recursos naturais: o petróleo, a mineração. O diagnóstico de contaminação ambiental: indicadores biológicos, técnicas genéticas e imunológicas, biossensores. A biorremediação: os vazamentos de petróleo, a radiação. Organismos novos na natureza e biossegurança. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

6 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) C A P Í T U L O 12. BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE A desaparição dos ecossistemas naturais. O homem e as plantas alimentícias, comerciais e medicinais. A biodiversidade ameaçada: erosão genética, expansão do agronegócio, transgênese. A proteção da biodiversidade: centros de diversificação, conservação da biodiversidade. O CGIAR o centro internacional da batata. O protocolo de Cartagena de biossegurança. C A P Í T U L O 13. BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA A evolução das práticas agrícolas. A obtenção de novas variedades: mutação gênica e seleção, alteração do número de cromossomos, engenharia genética. A biossegurança e o princípio de precaução. As PGMs de interesse agronômico: tolerância a herbicidas, resistência a insetos, resistência a vírus, coexistência entre plantas convencionais e PGMs. O cultivo de outros tipos de PGMs: interesse nutricional, produção de medicamentos. O agronegócio: As primeiras empresas produtoras de sementes, os gigantes gênicos, a cadeia produtiva da semente, patentes e inovação tecnológica. A adoção dos cultivos biotecnológicos no mundo: os Estados Unidos e a União Europeia, Israel, África subsaariana, China. A chegada das novas tecnologias. C A P Í T U L O 14. BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS A nutrição dos animais a necessidade de rações, de Liebig à vaca louca, variações sobre a composição das rações, as rações transgênicas. O melhoramento genético do gado: o controle da reprodução, as novas tecnologias. A aquicultura. A saúde dos animais: os modificadores metabólicos, a resistência a doenças, prevenção e tratamento. Novas utilizações dos animais domésticos: modelos de estudo para doenças humanas, xenotransplantes, os animais como biorreatores, o marco conceitual dos três Rs. Os animais de estimação. C A P Í T U L O 15. BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS O pão. O vinho: a vinificação, o cultivo da videira, o rol da levedura na vinificação. A cerveja. Os queijos e iogurtes: a produção de laticínios, o rol de microrganismos e enzimas. A proteína de célula única. Os aditivos: os diversos tipos, os adoçantes. Os alimentos biofortificados. Segurança alimentar C A P Í T U L O 16. BIOTECNOLOGIA E NOVOS ALIMENTOS A entrada dos transgênicos na cadeia alimentar: melhorando a conservação, as propriedades industriais e as características nutricionais. A favor ou contra? O que o consumidor precisa saber: a noção de segurança, a ingestão de DNA, os marcadores de resistência a antibióticos, a composição química, a produção de toxinas, a produção de alérgenos, o risco de câncer, a utilização de um promotor viral (CaMV), outros efeitos, perspectiva histórica. Como garantir a segurança alimentar? O princípio de equivalência substancial, a avaliação de riscos, a rotulagem dos alimentos, rótulo e informação, o rastreamento de um transgene. C A P Í T U L O 17. BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS As doenças infecciosas. A aquisição de imunidade. Os diferentes tipos de vacinas: as vacinas tradicionais ou de primeira geração. As novas vacinas ou de segunda geração, a última geração. A produção de vacinas: pesquisa e desenvolvimento, o marco ético, operações industriais, o mercado das vacinas, um setor estratégico para a sociedade. As vacinas e a erradicação da doença: a varíola, a poliomielite, a influenza, tuberculose, malária e HIV/AIDS. A ameaça das doenças emergentes. Bioterrorismo e biosseguridade. C A P Í T U L O 18. BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / OS TESTES DIAGNÓSTICOS As tendências atuais: dispositivos miniaturizados, o que é um bom teste, as técnicas com base bioquímica, base imunológica e base genética. O diagnóstico das doenças infecciosas. A tipificação de tecidos: sangue, outros tecidos e órgãos. O diagnóstico de doenças genéticas: as limitações dos testes, as estratégias seguidas, diagnóstico preventivo e preditivo. As patentes. O esporte. A prática forense. C A P Í T U L O 19. BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / A INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS O desenvolvimento de um medicamento novo. Patentes, genéricos e biossimilares. Os princípios ativos das plantas: o caso da aspirina, os fitoterápicos, as tendências recentes, a importância de um marco legal. As substâncias antibióticas: o caso da penicilina, os limites ao uso de antibióticos, a necessidade de inovação. As primeiras moléculas terapêuticas: o caso da insulina, a substituição do produto natural. As proteínas recombinantes: as bases tecnológicas, os produtos e suas utilizações. Os medicamentos personalizados: a farmacogenômica, a farmacogenética, as doenças órfãs. O mercado dos biomedicamentos: a tendência geral, América Latina. C A P Í T U L O 20. BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / OS NOVOS TRATAMENTOS A aprovação de um tratamento experimental. Os transplantes: os transplantes de órgãos, os xenotransplantes. A engenharia de tecidos: as terapias celulares, fraudes e desatinos. As imunoterapias: o progresso, os anticorpos monoclonais, o desafio da barreira hematoencefálica. O câncer: uma doença de origem genética, as terapias biológicas, os vírus oncolíticos, as vacinas terapêuticas. As terapias gênicas: terapia somática e germinal, os altos e baixos de uma tecnologia, os resultados alcançados, a FIV triparental. As promessas do RNA: as ribozimas, a tecnologia anti-sense, o RNA interferente, a edição gênica C A P Í T U L O 21. CONSIDERAÇÕES FINAIS B I B L I O G R A F I A iv

7 SUMÁRIO LISTA DE FIGURAS FIGURA 1.1. O campo da Biotecnologia FIGURA 2.1. Representações esquemáticas da estrutura celular FIGURA 2.2. As células-tronco embrionárias FIGURA 2.3: Os cromossomos FIGURA 2.4. Mitose e meiose FIGURA 3.1. Bactérias, clones e intercâmbio de material genético A. A Formação de clones B. B Mecanismos de transferência lateral ou horizontal de material genético FIGURA 3.2. Os vírus A. Estrutura fundamental B. Morfologia de diferentes vírus C. (Os adenovírus e o HIV parasitam células humanas; o bacteriófago, bactérias). D. A multiplicação de um bacteriófago FIGURA 3.3. Logotipos utilizados como indicação de risco biológico FIGURA 4.1. A composição química de uma bactéria FIGURA 4.2. Aminoácidos e proteínas FIGURA 4.3. Cromatografia em coluna FIGURA 4.4. Eletroforese FIGURA 4.5. Difração de raios X FIGURA 4.6. O mecanismo da atividade enzimática A. O modelo chave-fechadura B. A enzima diminui a energia de ativação FIGURA 4.7. A estrutura da molécula de anticorpo (IgG) FIGURA 4.8. Os anticorpos e o reconhecimento do antígeno FIGURA 4.9. O encontro do linfócito B e do antígeno, e a seleção clonal FIGURA A produção de anticorpos no laboratório FIGURA Os ensaios imunológicos A. Associação dos anticorpos com moléculas fluorescentes B. Associação dos anticorpos com enzimas FIGURA 5.1. Composição química dos ácidos nucleicos FIGURA 5.2. A molécula de DNA FIGURA 5.3. O fluxo da informação genética FIGURA 5.4. A organização e regulação dos genes nas células procarióticas FIGURA 5.5. A organização e regulação dos genes nas células eucarióticas FIGURA 5.6. As etapas da síntese de proteínas (Recapitulação) FIGURA 5.7. O silenciamento gênico FIGURA 6.1. O processo fermentativo genérico FIGURA 6.2. Respiração e fermentação FIGURA 6.3. As diversas fases do crescimento de uma população microbiana e a produção de metabólitos A. As fases de crescimento de uma população B. A produção de metabólitos primários e secundários FIGURA 6.4. A metodologia HTS para triagem e evolução dirigida de linhagens bacterianas FIGURA 6.5. Modelos de biorreatores utilizados em processos tradicionais A. Biorreator para fermentações em fase sólida B. A produção de vinagre (Método de Orléans) FIGURA 6.6. Modelo de biorreator utilizado em fermentações submersas FIGURA 6.7. Fermentações, agentes biológicos e biorreatores FIGURA 6.8. A mudança de escala, do laboratório à indústria FIGURA 6.9. A obtenção de ácido cítrico por fermentação FIGURA 7.1. As diversas partes de uma planta angiosperma FIGURA 7.2. O procedimento a seguir para se obter uma cultura asséptica no laboratório FIGURA 7.4. A cultura de meristemas FIGURA 7.5. As diferentes possibilidades dos cultivos de calos FIGURA 7.6. As possibilidades do cultivo de células vegetais FIGURA 7.7. As culturas de células de origem animal A. Etapas da cultura de leucócitos para a análise do cariótipo B. Etapas da cultura de células a partir de um fragmento de tecido FIGURA 8.1: As enzimas de restrição (EcoRI corta o DNA na sequência palindrômica GAATTC) FIGURA 8.2. A eletroforese do DNA FIGURA 8.3. Os polimorfismos FIGURA 8.4. Hibridização de uma sequência de DNA com uma sonda complementar marcada FIGURA 8.5. A técnica de Southern FIGURA 8.6. A síntese de oligonucleotídeos v

8 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA 8.7. A síntese de cdna por transcriptase reversa FIGURA 8.8. A reação em cadeia da polimerase FIGURA 8.9. O sequenciamento de um fragmento de DNA FIGURA Fundamentos da tecnologia de arrays FIGURA 9.1. Cortar, colar, copiar: a experiência que deu origem à engenharia genética FIGURA 9.2. Sapobacter ou Bactosapo? FIGURA 9.3. A construção de bibliotecas de genes FIGURA 9.4. A produção de somatotropina por engenharia genética FIGURA 9.5. Algumas estratégias possíveis de clonagem FIGURA 9.6. A estrutura de um vetor de expressão FIGURA 9.7. Semelhanças entre os Legos e os Biobricks ( A. Classificação hierárquica B. Construções intercambiando as partes FIGURA 9.8. A construção de uma planta transgênica no laboratório FIGURA 9.9. As etapas da construção de uma planta transgênica FIGURA Construção de animais transgênicos A. Microinjeção. B. Transfecção de células-tronco embrionárias FIGURA A edição gênica com CRISPR-Cas9 FIGURA As etapas necessárias para a produção de etanol a partir de diferentes matérias-primas FIGURA A produção de etanol a partir da cana-de-açúcar FIGURA A biodigestão em condições aeróbias e anaeróbias. FIGURA As complexas etapas da produção de biogás dentro do biodigestor FIGURA As utilizações do biogás FIGURA A reação de transesterificação FIGURA O caso Amyris A. Do quinghaosu à artemisina B. Produtos gerados na plataforma tecnológica baseada na engenharia metabólica da levedura (via dos isoprenoides ou terpenos) FIGURA O caso Solazyme FIGURA A indústria de papel e de celulose. FIGURA Controle biológico do Aedes aegypti A. Ciclo de vida do mosquito Aedes aegypti B. Controle por Wolbacchia C. Controle por irradiação D. Controle por engenharia genética FIGURA A compostagem FIGURA O tratamento das águas residuais FIGURA O funcionamento de um biossensor TABELA Os principais contaminantes do meio ambiente FIGURA As estratégias de biorremediação FIGURA O transporte de plantas de um continente a outro FIGURA Distribuição da produção agrícola na área habitável do planeta FIGURA Os vegetais na alimentação humana FIGURA O milho FIGURA A produção de milho híbrido FIGURA As etapas da construção de uma planta transgênica FIGURA Os elos que integram a cadeia produtiva da semente FIGURA O Controle da reprodução em bovinos FIGURA Dolly, um clone obtido por transferência nuclear FIGURA O salmão transgênico AquAdvantage (Aquabounty Technologies) TABELA Significado e alcance dos três Rs (do inglês replacement, reduction, refinement) FIGURA A panificação FIGURA A vinificação FIGURA A produção de laticínios A. Iogurte tradicional e iogurte batido B. Queijo. Os agentes biológicos intervêm nas etapas de coagulação e na maturação de alguns produto FIGURA A produção de xarope de frutose FIGURA O que é um transgênico? FIGURA A estrutura de um transgene FIGURA O símbolo de transgênico adotado no Brasil. FIGURA As respostas primária e secundária do organismo FIGURA A memória imunológica FIGURA A utilização da tecnologia do DNA-recombinante na vacina contra a hepatite B. FIGURA Os diferentes tipos de vacinas FIGURA Imagens comerciais de alguns dispositivos miniaturizados utilizados em testes diagnósticos vi

9 SUMÁRIO FIGURA Imagem comercial dos sistemas API de Biomérieux ( FIGURA O método direto e indireto de um teste positivo de ELISA. FIGURA 18.4: As técnicas com base genética FIGURA O sistema HLA A. A herança dos haplótipos. B. Reação mista ou cross-matching. Colocam-se em contato as células do doador com o soro do receptor, em presença de complemento. Se as células do doador ficam intactas, há compatibilidade. FIGURA O uso de arrays no diagnóstico de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 FIGURA As etapas do desenvolvimento de um medicamento FIGURA 19.2: A fórmula da aspirina FIGURA A fórmula da penicilina FIGURA A insulina humana A. A molécula de insulina B. A síntese da insulina. FIGURA O princípio da clonagem terapêutica FIGURA A transformação de uma célula normal em cancerosa por mutação (câncer de cólon). FIGURA O tratamento com sipuleucel-t (Provenge ). A. Extração das células dendríticas B. Incubação das células com Provenge C. Reinfusão das células modificadas no paciente (3 vezes com 2 semanas de intervalo) FIGURA 20.4: O princípio da terapia gênica. FIGURA 20.5: As tecnologias de silenciamento gênico. A. As ribozimas B. O RNA anti-sense C. O RNA interferente LISTA DE TABELAS TABELA 1.1. Produtos e serviços de origem biotecnológica, em diferentes setores TABELA 1.2. A linha do tempo TABELA 2.1. A função e a distribuição das estruturas celulares TABELA 2.2. As células como agentes biológicos TABELA 3.1. Os microrganismos dentro do marco da uma classificação biológica atual TABELA 3.2. As bactérias (Eubactérias e Arqueas) como agentes biológicos TABELA 3.3. As algas como agentes biológicos TABELA 3.4. Os fungos como agentes biológicos TABELA 4.1. As funções das proteínas no organismo TABELA 4.2. A classificação internacional das enzimas TABELA 4.3. As enzimas como agentes biológicos TABELA 4.4. Os anticorpos como agentes biológicos TABELA 5.1: O código genético TABELA 5.2. Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) como agentes biológicos TABELA 7.1. Os componentes do meio de cultura para células vegetais TABELA 7.2. Os componentes de um meio de cultura básico para células animais TABELA 7.3. Origem e utilização de algumas linhagens celulares TABELA Diversidade de produtos derivados de algumas matérias-primas renováveis TABELA Metabólitos primários e secundários obtidos por fermentação e/ou bioconversão enzimática TABELA O poder calorífico de vários combustíveis. TABELA Alguns exemplos de utilização de agentes biológicos como pesticidas TABELA Os principais contaminantes do meio ambiente TABELA Os principais tipos de vegetais que entram em nossa alimentação TABELA As plantas e a indústria TABELA Os centros de diversificação e os cultivos originários TABELA O risco de escapamento de um animal transgênico TABELA Significado e alcance dos três Rs (do inglês replacement, reduction, refinement) TABELA As plantas geneticamente modificadas no mundo (Dados do ISAAA, março de 2016) TABELA A produção de vacinas no Brasil TABELA As qualidades de um bom teste de diagnóstico. TABELA Algumas das mais de doenças genéticas descritas TABELA A linha do tempo de entrada dos antibióticos e antibacterianos no mercado TABELA Alguns biofármacos de interesse médico TABELA Os medicamentos biológicos mais lucrativos em 2014 (Statista, Phrma) vii

10 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) viii

11 C A P Í T U L O 1 O QUE É BIOTECNOLOGIA A BIOTECNOLOGIA TRADICIONAL Cultivar vegetais, domesticar animais, transformar os alimentos ou aproveitar as propriedades curativas de algumas plantas são atividades que remontam à alvorada da humanidade e se desenvolveram com base no conhecimento empírico, ignorando a existência dos microrganismos ou das leis da hereditariedade. No início do século XIX, a demanda de mão de obra por uma indústria incipiente estimula a migração da população do campo para a cidade. Em condições sanitárias cada vez mais degradadas, as doenças e a fome acompanham o homem. Ao mesmo tempo, o progresso exige processos industriais mais eficientes. A compreensão dos fenômenos naturais torna-se indispensável para responder às necessidades da sociedade. A partir de 1850 surgem novas áreas do conhecimento. Nasce a Microbiologia, a Imunologia, a Bioquímica e a Genética. A Química Industrial desenvolve-se aceleradamente e aumenta, também, a intervenção da Engenharia Agrícola e da Pecuária no gerenciamento do campo. Em 1914, Karl Ereky, um engenheiro agrícola húngaro, desenvolve um gigantesco plano de criação de suínos visando substituir as práticas tradicionais por uma indústria agrícola capitalista baseada no conhecimento científico. Deve-se a Ereky (1919) a primeira definição de biotecnologia, como a ciência e os métodos que permitem a obtenção de produtos a partir de matéria-prima, mediante a intervenção de organismos vivos. Para ele, a era bioquímica substituiria a era da pedra e do ferro. O século XX assiste a um desenvolvimento extraordinário da ciência e da tecnologia. Da convergência entre ambas resultam logros extraordinários em vários setores produtivos, onde os seres vivos constituem a base de itens tão diversos como a produção de variedades vegetais mais produtivas, a fabricação de novos alimentos, o tratamento do lixo, a produção de enzimas e os antibióticos. A BIOTECNOLOGIA MODERNA A proposta de J. D. Watson e F. Crick (1953) de um modelo helicoidal para a molécula de DNA representa, sem dúvida, um marco fundamental na história da Biologia Molecular. Mas a divisória entre a Biotecnologia clássica e a Biotecnologia moderna é uma série de experiências realizadas por H. Boyer e S. Cohen que culmina em 1973 com a transferência de um gene de sapo a uma bactéria. A partir desse momento é possível mudar o programa genético de um organismo transferindo-lhe genes de outra espécie. A importância e os riscos inerentes à nova tecnologia não passaram despercebidos às pessoas envolvidas. Fato inédito na história, em 1975, os cientistas reunidos em Asilomar (USA) estabeleceram uma moratória em seus trabalhos até serem definidas as condições de segurança adequadas, o que aconteceria pouco tempo mais tarde. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

12 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Na passagem de uma biotecnologia de laboratório a uma biotecnologia industrial, a Engenharia Genética ocupa um lugar de destaque como tecnologia inovadora do século XX. Em alguns casos, como os da insulina e do hormônio do crescimento, a inovação consiste em substituir os métodos de obtenção tradicionais. Em outros casos, como o dos anticorpos monoclonais ou do Golden Rice, um arroz com vitamina A, trata-se de produtos inteiramente novos. As técnicas recentes de edição gênica ampliam extraordinariamente as possibilidades de manipulação dos genes. A Biotecnologia abrange uma área ampla do conhecimento que decorre da ciência básica (biologia molecular, microbiologia, biologia celular, genética etc.), da ciência aplicada (técnicas imunológicas e bioquímicas, assim como técnicas decorrentes da física e da eletrônica), e de outras tecnologias (fermentações, separações, purificações, informática, robótica e controle de processos). Trata-se de uma rede complexa de conhecimentos na qual ciência e tecnologia se entrelaçam e se complementam. AS DEFINIÇÕES DE BIOTECNOLOGIA O impacto causado pelas primeiras experiências em Engenharia Genética estimulou numerosas tentativas de redefinição do campo da Biotecnologia. Mediante a substituição da expressão intervenção de organismos vivos por utilização de processos celulares e moleculares tratou-se de diferenciar a Biotecnologia clássica da moderna. Porém, devido à enorme difusão das técnicas de manipulação gênica, elas acabam se superpondo, e, fora do contexto histórico, é difícil distinguir o limite entre ambas. Por outro lado, como a definição de um setor de atividades depende dos interesses dos grupos envolvidos, muitas vezes reflete a visão dos setores profissionais predominantes. Por isso, se revisitarmos os textos da década de 1980, anos em que a expressão biotecnologia se expande, encontraremos mais de uma dúzia de definições diferentes do termo. Levantamos, entre as definições encontradas com maior frequência, as seguintes: o OECD - Organisation for Economic Co-Operation and Development: A aplicação dos princípios da ciência e da engenharia no tratamento de matérias por agentes biológicos na produção de bens e serviços (1982). o OTA Office of Technology Assessment: Biotecnologia, de uma forma abrangente, inclui qualquer técnica que utiliza organismos vivos (ou partes deles) para obter ou modificar produtos, melhorar plantas e animais, ou desenvolver microrganismos para usos específicos (1984). o EFB - European Federation of Biotechnology: Uso integrado da bioquímica, da microbiologia e da engenharia para conseguir aplicar as capacidades de microrganismos, células cultivadas animais ou vegetais ou parte dos mesmos na indústria, na saúde e nos processos relativos ao meio ambiente (1988). o E.H. Houwink: o uso controlado da informação biológica (1989). o BIO - Biotechnology Industry Organization: em sentido amplo, Biotecnologia é "bio" + "tecnologia", isto é o uso de processos biológicos para resolver problemas ou fazer produtos úteis (2003). Observa-se que, com o tempo, o conceito ganha uma expressão mais simples. As definições mais recentes não fazem mais referência aos processos tecnológicos envolvidos; talvez porque, além de complexos e diversos, estes evoluam muito rapidamente. Neste texto consideraremos a biotecnologia de uma maneira ampla, definida como uma atividade baseada em conhecimentos multidisciplinares, que utiliza agentes biológicos para fazer produtos úteis ou resolver problemas. Esta definição é suficientemente abrangente para englobar atividades tão variadas como as de engenheiros, químicos, agrônomos, veterinários, microbiologistas, biólogos, médicos, advogados, empresários, economistas etc. (Figura 1.1). 2

13 O QUE É BIOTECNOLOGIA? O IMPACTO DA BIOTECNOLOGIA Nascida nos laboratórios de Universidades e Centros de Pesquisa, onde ainda permanece, a Biotecnologia se desenvolve também em empresas públicas e privadas de diferente porte, gerando um segmento novo de empresas especializadas em plataformas tecnológicas avançadas que disponibilizam insumos para as outras empresas. Já não se trata de promessas ou de perspectivas futuras; os produtos e processos biotecnológicos fazem parte de nosso dia a dia, trazendo oportunidades de emprego e investimentos. Incluem-se na bioeconomia plantas resistentes a doenças, plásticos biodegradáveis, detergentes mais eficientes, biocombustíveis, e também processos industriais menos poluentes, menor necessidade de pesticidas, biorremediação de poluentes, centenas de testes de diagnóstico e de medicamentos novos (Tabela 1.1) FIGURA 1.1. O campo da Biotecnologia Conhecimentos Agentes biológicos Ciência e tecnologia Organismos, células, organelas, moléculas BIOTECNOLOGIA Fazer produtos úteis Resolver problemas TABELA 1.1. Produtos e serviços de origem biotecnológica, em diferentes setores SETORES Energia Indústria Meio ambiente Agricultura Pecuária Alimentação Saúde TIPOS DE PRODUTOS OU SERVIÇOS Etanol, biogás e outros combustíveis (a partir de biomassa). Butanol, acetona, glicerol, ácidos, vitaminas etc. Numerosas enzimas para outras indústrias (têxtil, de detergentes etc.). Recuperação de petróleo, biorremediação (tratamento de águas servidas e de lixo, eliminação de poluentes). Adubo, silagem, biopesticidas, biofertilizantes, mudas de plantas livres de doenças, mudas de árvores para reflorestamento. Plantas com características novas incorporadas (transgênicas): maior valor nutritivo, resistência a pragas e condições de cultivo adversas (seca, salinidade etc.). Embriões, animais com características novas (transgênicos), vacinas e medicamentos para uso veterinário. Panificação (pães e biscoitos), laticínios (queijos, iogurtes e outras bebidas lácteas), bebidas (cervejas, vinhos e bebidas destiladas) e aditivos diversos (shoyu, monoglutamato de sódio, adoçantes etc.); proteína de célula única (PUC) para rações, alimentos de origem transgênica com propriedades novas. Antibióticos e medicamentos para diversas doenças, hormônios, vacinas, reagentes e testes para diagnóstico, tratamentos novos etc. 3

14 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) BIOTECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO Por se tratar de uma coleção de tecnologias diversas, o uso das biotecnologias não se restringe necessariamente aos países desenvolvidos. Existe um espaço que os países emergentes podem ocupar, em função de suas riquezas naturais, desde que existam prioridades econômicas e políticas definidas claramente. A condição fundamental é contar com instituições competentes que formem uma massa crítica de pesquisadores e pessoal técnico treinado. A China e a Índia contam hoje com uma indústria biotecnológica avançada e diversificada. Assim como a América Latina, concentrada principalmente na Argentina, no Brasil, no Chile, na Colômbia, em Cuba e no México. Países como Uruguai e Venezuela também têm atividade em algumas áreas, assim como, em menor escala, Equador, Costa Rica, Paraguai, Peru e Bolívia. Na região, numerosas empresas incidem em vários setores: meio ambiente e indústria, agroalimentos e pecuária, saúde animal e humana. No entanto, a Biotecnologia suscita ainda opiniões e sentimentos controversos. Enquanto alguns setores a percebem como uma tecnologia baseada em um sólido conhecimento científico, para outros se trata de uma atividade antinatural e perigosa. O enfrentamento de partidários e opositores ocorre com menos frequência no terreno das razões que no das paixões, sejam elas políticas, religiosas ou ideológicas. Ao discutir se a biotecnologia é progressista ou reacionária, boa ou ruim, se esquece que o que caracteriza uma tecnologia é o uso que fazemos dela. Produtos e processos inimagináveis cinquenta anos atrás entram em nosso cotidiano antes que os alicerces científicos e tecnológicos correspondentes se insiram em nossa cultura, através de uma divulgação ampla que atinja também o sistema educativo em todos os seus níveis. Não existe possibilidade alguma de construir uma sociedade moderna se os seus integrantes ignorarem os aspectos mais gerais de ciência e tecnologia. O desconhecimento aumenta o risco de rejeitar tecnologias promissoras, capazes de abrir perspectivas novas, com vistas a um desenvolvimento sustentável em áreas tão críticas como a saúde, a produção de alimentos, a energia e o meio ambiente. A proposta deste livro é revisar os fundamentos das biotecnologias e mostrar como se aplicam em diversos setores produtivos da sociedade, destacando como exemplos alguns empreendimentos latino-americanos bem-sucedidos. Esperamos que ele seja de ajuda para todos os que nos preocupamos com os alcances desta fascinante (r)evolução tecnológica. A HISTÓRIA DA BIOTECNOLOGIA A Tabela 1.2 reúne alguns dos mais importantes acontecimentos relacionados com a Biotecnologia TABELA 1.2. A linha do tempo DATA ACONTECIMENTOS FUNDAMENTAIS ANTIGUIDADE Preparação e conservação de alimentos e bebidas por fermentação (pão, queijo, cerveja, vinho e vinagre); cultivo de plantas (batata, milho, cevada, trigo etc.); domesticação de animais; tratamento de infecções (com produtos de origem vegetal tais como pó de crisântemo e derivados de soja com fungos). IDADE MÉDIA Século XII Destilação do álcool. 4

15 O QUE É BIOTECNOLOGIA? IDADE MODERNA Século XVI Século XVII Século XVIII Cronistas registram a colheita de algas para alimentação, nos lagos do México, pelos astecas. Início da produção comercial de cerveja; extração de metais por ação microbiana na Espanha; cultivo de fungos na França; Hooke descobre a existência de células (1665). Invento da máquina a vapor (1752). A partir de 1750, cresce o cultivo de leguminosas na Europa e se difunde a prática de rotação de cultivos, aumentando a produtividade e melhorando o uso da terra. IDADE CONTEMPORÂNEA 1797 Jenner inocula uma criança com um vírus que o protege contra a varíola Appert utiliza o calor para esterilizar e conservar comida, processo que será utilizado nas campanhas napoleônicas a 1855 Schleiden, Schwann e Virchow enunciam a teoria celular a 1886 Pasteur inventa um processo para conservar alimentos sem alterar suas propriedades organolépticas (Pasteurização, 1863), derruba a teoria da abiogênese (1864), investiga as doenças do bicho-da-seda (1865), identifica a levedura como o agente responsável pela fermentação alcoólica (1876), usa microrganismos atenuados para obter vacinas contra o antraz e a cólera (1881), faz os primeiros testes de uma vacina contra a raiva (1881). Paralelamente, Koch inicia o desenvolvimento de técnicas fundamentais para o estudo dos microrganismos (1876) e enuncia quatro postulados sobre os agentes infecciosos como causa de doenças. Em 1865 Mendel apresenta o seu trabalho Experiências de hibridização em plantas Inauguração em Paris do Instituto Pasteur Descoberta do vírus do mosaico do tabaco; introdução do trator na agricultura Büchner mostra que enzimas extraídas da levedura podem transformar açúcar em álcool Primeiro transplante de um órgão: o rim de um cachorro a outro cachorro Redescobrimento das leis da hereditariedade, já enunciadas por Mendel em 1865, porém esquecidas O primeiro transplante de córnea se realiza com sucesso; isto porque a córnea não tem antígenos Ehrlich descobre o primeiro agente quimioterápico, chamado Salvarsan, que será utilizado contra sífilis Em Manchester, na Inglaterra, começam a ser introduzidos os sistemas de purificação de esgoto baseados na atividade microbiana a 1914 Rhöm obtém a patente de uma preparação enzimática para a lavagem de roupas; Weizmann consegue a produção de acetona e butanol por microrganismos Morgan publica Mechanism of Mendelian Heredity Imobilizam-se as enzimas, uma técnica que facilita sua utilização em processos industriais Morrem de gripe espanhola mais de vinte milhões de pessoas, um número de vítimas superior ao da Primeira Guerra Mundial. Constroem-se biodigestores para a produção de metano (China e Índia) O engenheiro agrícola húngaro Ereky utiliza pela primeira vez a palavra biotecnologia Muller descobre que os raios X causam mutações F. Griffith descobre a transformação, isto é, a transferência de informação genética de uma linhagem bacteriana a outra Comercialização do milho híbrido, isto é, de sementes de milho mais produtivas Obtenção de ácido cítrico por fermentação Na França, produção comercial de um biopesticida (Bacillus thuringiensis). 5

16 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) a 1950 Avanços na mecanização do trabalho agrícola Produção em grande escala da penicilina (descoberta por Fleming em 1928, desenvolvida por Florey e Chain) Inseminação artificial de gado utilizando sêmen congelado. Descoberta da presença de genes saltatórios no milho por Bárbara Mc Clintock J. D. Watson e F. Crick propõem o modelo (dupla hélice) da estrutura do DNA L.Stevens reconhece a existência de células de camundongo pluripotentes Reinart regenera plantas de cenoura a partir de uma cultura de células (calo) Aumento da produção de ácido láctico, ácido cítrico, acetona e butanol por via fermentativa Descoberta do código genético. Desenvolvimento de uma protease alcalina para uso em sabões para a lavagem de roupas pela empresa dinamarquesa Novo. Inicia-se o cultivo in vitro de células-tronco embrionárias pluripotentes Plantio de novas variedades de trigo mais produtivas, no México, dando início ao que será chamado de Revolução Verde Hayflick observa que as células cultivadas se dividem um número finito de vezes antes de morrer Primeiro transplante de coração, na África do Sul; o paciente sobrevive 18 dias Produção industrial de aminoácidos utilizando enzimas imobilizadas Havendo desenvolvido técnicas de corte e reunião do DNA, Cohen e Boyer transferem um gene a um organismo de outra espécie. Lançado no Brasil o programa de produção de álcool a partir de biomassa (Proálcool) G. J. F. Köhler e C. Milstein desenvolvem a tecnologia de hibridomas e obtêm anticorpos monoclonais. A empresa Novo produz xarope com alto conteúdo de frutose por via enzimática como adoçante alternativo à sacarose A Conferência de Asilomar pede ao National Institute of Health (NIH) que sejam estabelecidas normas para a regulação dos experimentos com DNA-recombinante, o que acontecerá meses mais tarde Utilização da técnica de hibridização molecular no diagnóstico pré-natal da alfa talassemia F.Sanger e W.Gilbert elaboram o primeiro método de sequenciamento do DNA Genentech, Inc., a primeira empresa biotecnológica, fundada um ano antes por Boyer e Swanson, obtém a proteína somatotropina (hormônio de crescimento) mediante a tecnologia do DNA-recombinante. Nasce na Inglaterra Louise Brown, o primeiro bebê de proveta Produção do hormônio de crescimento humano, utilizando a tecnologia do DNA-recombinante A Suprema Corte de Justiça dos Estados Unidos aprova o princípio de patentes para as formas de vida de origem recombinante. As primeiras patentes são de A. N. Chakrabarty, para um microrganismo para biorremediação de petróleo, e de H. Cohen e S.Boyer, pelo processo de Erradicação da varíola A insulina humana de origem recombinante da Genentech, Inc. é comercializada. Uma licença será obtida mais tarde pela empresa Eli Lilly, que a venderá com o nome de Humulina. A primeira vacina de DNA-recombinante para o gado é comercializada na Europa. S. Prusiner descobre os príons Realizam-se as primeiras experiências de Engenharia Genética em plantas (petúnia). Syntex Corporation recebe a aprovação da Food and Drug Administration (FDA) de um teste para Chlamydia trachomatis baseado na utilização de anticorpos monoclonais. Isolado o vírus HIV no Instituto Pasteur (França) e no NIH (National Institute of Health, Estados Unidos). Anunciada a obtenção das primeiras plantas geneticamente modificadas por quatro grupos independentes da Universidade de Washington (St. Louis), a empresa Monsanto (Missouri), e a Universidade de Gent (Bélgica). K. Mullis aporta modificações fundamentais à técnica da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR). 6

17 O QUE É BIOTECNOLOGIA? 1984 A. Jeffreys introduz a técnica do Fingerprint (impressões digitais), que, um ano depois, será utilizada pelos tribunais para a identificação de suspeitos. Clonagem e sequenciamento do genoma do HIV pela empresa Chiron Corp A Environmental Protection Agency (EPA) dos Estados Unidos aprova a liberação de plantas de tabaco transgênicas. Um grupo de especialistas em segurança em Biotecnologia da Organização para a Cooperação Econômica e o Desenvolvimento (OECD) declara que a previsibilidade das mudanças genéticas obtidas por Engenharia Genética é frequentemente maior que a correspondente às técnicas tradicionais, e que os riscos associados com organismos transgênicos podem ser avaliados do mesmo modo que os riscos associados aos outros organismos. Aprovada a primeira vacina biotecnológica para uso humano, trata-se de Recombivax-HB, contra a hepatite B. alfa interferon para tratamento de câncer (Biogen) 1987 Advanced Genetic Sciences libera em campo bactérias DNA-recombinante (Frostban) que inibem a formação de gelo nos cultivos de morango, na Califórnia; a FDA aprova o fator ativador de plasminogênio, obtido por engenharia genética, para o tratamento de ataques cardíacos A Universidade de Harvard obtém a patente de um rato transgênico desenvolvido especialmente para o estudo do câncer; na mesma década, os europeus obterão a patente de outro rato transgênico, sensível a substâncias carcinogênicas. Genencor International Inc. obtém a patente de um processo que permite obter enzimas (proteases) resistentes a alvejantes (processo bleach) para a fabricação de sabões para a lavagem de roupa Com a criação do National Center for Human Genome Research se inicia o mapeamento do genoma humano. Amgem libera o Epogen para tratamento de anemia Primeira experiência de terapia gênica para uma doença rara (ADA) em uma menina de 4 anos. Pfizer comercializa Chy-Max TM, uma enzima de origem recombinante para a preparação de queijos. GenPharm International, Inc. consegue uma vaca transgênica que produz no leite proteínas humanas para alimentação infantil. A Universidade da Califórnia (UCSF) e a Universidade de Stanford contabilizam 100 patentes relativas ao DNA-recombinante. Aplicação da cultura de células na produção de agentes bioterapêuticos Obtida por engenharia genética a enzima β-glucorcerebrosidase para a doença de Gaucher (Genzyme). Affymax lança os primeiros chips de DNA Uma técnica, elaborada por cientistas americanos e britânicos, permite testar anormalidades como a fibrose cística e a hemofilia em embriões in vitro. A FDA declara que os alimentos de origem transgênica não demandam uma regulação especial. Convenção Internacional sobre Diversidade Biológica (CDB) Aprovada a utilização do hormônio de crescimento bovino rbgh/rbst, produzido por Monsanto Co., para aumentar a produção de leite Lançamento no mercado do tomate FlavSavr, que, devido à inativação de um gene, amadurece na planta Decifrado o primeiro genoma de uma bactéria, Haemophilus influenzae Sequenciado o primeiro genoma de um organismo eucarionte, a levedura Saccharomyces cerevisiae. Desenvolve-se o primeiro GeneChip (Stanford, Affymetrix). Isolamento e cultivo das primeiras células-tronco extraídas de embriões humanos supernumerários originados por fecundação in vitro No Reino Unido, nascem Dolly, uma ovelha clonada, e, meses mais tarde, uma segunda ovelha, Polly, clonada e geneticamente modificada. Os cultivos transgênicos são introduzidos em vários países Contabilizam-se mais de empresas de Biotecnologia nos Estados Unidos e mais de no mundo. Células-tronco embrionárias são utilizadas para regenerar tecidos. Sequenciamento do primeiro genoma animal, o verme Caenorrabditis elegans. Isolada a primeira linhagem de células-tronco embrionárias humanas. A.Z. Fire e C. Mello descobrem o silenciamento gênico, a resposta antiviral a um RNA de filamento duplo Sequenciamento do primeiro cromossomo humano. Pesquisadores descobrem que as célulastronco podem ser induzidas a se diferenciar em diversos tipos celulares. 7

18 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) O rascunho do sequenciamento do genoma humano é anunciado simultaneamente por Collins, do Consórcio do Genoma Humano, e Venter, da Celera Inc. Sequenciados também o genoma da mosca Drosophila melanogaster, o primeiro genoma de uma planta (Arabidopsis thaliana) e, no Brasil, o de uma bactéria que ataca os cítricos (Xylella fastidiosa). Protocolo de Cartagena. Moratória relativa ao uso da tecnologia Terminator, previamente patenteada por Delta&Pine O rascunho do sequenciamento do Genoma Humano é publicado simultaneamente nas revistas Science e Nature. Sequenciamento do genoma de plantas de interesse agronômico para os países em desenvolvimento (arroz, banana). Sequenciamento do genoma de bactérias de importância agronômica. Obtenção de células sanguíneas a partir de células-tronco embrionárias Completados o rascunho do proteoma funcional da levedura e o sequenciamento do genoma do agente e do vetor transmissor da malária. Identificam-se mais de 200 genes envolvidos na diferenciação das células-tronco. Descoberta da participação de moléculas de RNA na regulação de vários processos celulares. Em diversos países inicia-se a utilização de células-tronco adultas para o tratamento experimental de diversas doenças (leucemia, mal de Chagas, diabetes e anemia falciforme) Comercialização como mascote, do GloFish, um peixe transgênico que brilha na escuridão, originalmente criado para detectar poluentes. Clonagem de vários tipos de animais e de espécies ameaçadas de extinção. O Genoma Humano é completado. O Massachussets Institute of Technology (MIT) organiza a primeira igem (International Genetically Engineered Machine) Comercialização de novos medicamentos (Avastin ou bevacizumab) e testes de diagnósticos. Comercialização do peixe GloFish Publicação dos resultados do projeto HApMap com o mapa das variações do Genoma Humano O grupo de pesquisadores liderado por S. Yamanaka consegue induzir a pluripotencialidade celular em células somáticas. Criada a Biobricks Foundation, um registro de Partes Biológicas Standard - Open Source. Mantida a moratória sobre a tecnologia Terminator (Curitiba) As autoridades europeias de segurança alimentar concluem que os genes marcadores de resistência aos antibióticos não apresentam riscos relevantes para a saúde humana ou animal nem para o meio ambiente. Vacina contra o papilomavírus humano: primeira vacina contra o câncer. Nova técnica mais eficiente de sequenciamento Pesquisadores japoneses desenvolvem a primeira rosa azul, geneticamente modificada. Plataformas next generation diminuem os custos e aumentam a velocidade do sequenciamento. Uma equipe de pesquisadores de Harvard cria linhagens de células-tronco para 10 doenças genéticas Um grupo internacional obtém as primeiras células-tronco ips, sem utilizar virus. Comercialização de soja com alta concentração de ômega 3, o primeiro alimento biofortificado Autorizada na União Europeia a comercialização da batata transgênica Amflora (Basf) para uso industrial. Pesquisadores do Instituto Craig Venter constroem a primeira célula sintética. Desvendado o genoma do Neanderthal. Primeiro teste clínico com células-tronco Publicação dos resultados do Projeto ENCODE descrevendo as regiões ativas do genoma humano. J.Doudna e E. Charpentier descrevem a técnica CRISPR-Cas de edição de genomas F.Zangh mostra que CRISPR/Cas9 também funciona em células de mamíferos, inclusive humanas Publicado o primeiro rascunho do proteoma humano. 8

19 C A P Í T U L O 2 CÉLULAS E CROMOSSOMOS A CÉLULA COMO UNIDADE DOS SERES VIVOS UNIDADE ESTRUTURAL A célula é a unidade estrutural dos seres vivos. Trate-se de bactérias, amebas, espermatozoides ou neurônios, todas as células são formadas por água, íons inorgânicos e moléculas orgânicas (proteínas, carboidratos, lipídios e ácidos nucleicos). E todas elas apresentam uma membrana plasmática que separa o citoplasma do meio externo e permite o intercâmbio de moléculas entre ambos. As células procarióticas se encontram exclusivamente no reino Monera. Pequenas (0,001 a 0,005 mm) e com requerimentos nutricionais simples, estas células se multiplicam rapidamente. A informação genética se encontra em um cromossomo circular formado por uma molécula de DNA e associado a uma invaginação da membrana plasmática (mesossomo). Pequenas moléculas circulares adicionais (plasmídeos) podem também estar presentes. Numerosos ribossomos asseguram a síntese proteica (Figura 2.1). Bem mais complexa é a estrutura das células eucarióticas, presentes nos quatro reinos restantes (Protista, Fungo, Planta e Animal). Com um tamanho variando entre 0,01 e 0,10 mm, estas células são dez vezes maiores que as procarióticas. A presença de compartimentos diferenciados, ou organelas, que cumprem atividades específicas, resulta em uma subdivisão do trabalho que garante a eficiência do funcionamento celular (Figura 2.2). O citoplasma é percorrido por um sistema de membranas, o retículo endoplasmático, que está associado aos ribossomos e, por conseguinte, à síntese de proteínas. Processados no aparelho de Golgi, os produtos celulares são secretados ou distribuídos em outras estruturas (lisossomos, membrana celular). O metabolismo energético está associado a organelas citoplasmáticas, complexas e rodeadas de membranas (mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos). Um citoesqueleto, formado por túbulos e filamentos proteicos, mantém a forma da célula, além de assegurar o transporte interno das organelas e os movimentos celulares. A informação genética está distribuída em cromossomos, cada um deles formado por uma molécula linear de DNA associada a proteínas. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

20 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA 2.1. Representações esquemáticas da estrutura celular Célula procariótica (bacteriana) Célula eucariótica (vegetal) Célula eucariótica (animal) 10

21 CÉLULAS E CROMOSSOMOS Os cromossomos e o nucléolo se encontram no núcleo, que funciona como um centro de controle celular. A membrana nuclear, um envoltório com poros que separa o núcleo do citoplasma, permite o intercâmbio de substâncias entre ambos. Apesar de ter uma organização muito parecida, as células animais diferem das células vegetais em alguns aspectos (Tabela 2.1). Nas células vegetais encontramos uma parede celular ao redor da membrana plasmática; o citoplasma contém cloroplastos, onde ocorre a fotossíntese, e grandes vacúolos, onde se armazenam substâncias e degradam macromoléculas. Nenhuma dessas estruturas se observa nas células animais; estas têm um centríolo que falta nas células vegetais. A célula também é a unidade funcional de um organismo. O citoplasma é uma solução viscosa onde continuamente ocorrem reações de síntese e degradação de substâncias, consumindo ou liberando energia. Estas reações constituem o que denominamos metabolismo TABELA 2.1. A função e a distribuição das estruturas celulares Estrutura FUNÇÃO CÉLULA BACTERIANA CÉLULA ANIMAL Parede celular Membrana plasmática Carioteca ou membrana nuclear Cromossomo(s) Manutenção da forma e proteção da célula. Manutenção da estabilidade do meio intracelular; controle das trocas entre a célula e o meio extracelular. Controle do fluxo de substâncias entre o núcleo e o citoplasma. Controle da estrutura e do funcionamento celular. CÉLULA VEGETAL Presente ou ausente Ausente Presente Ausente Único e circular; apenas DNA. Presente Presente Múltiplos e lineares; DNA e proteínas. Nucléolo(s) Formação de ribossomos. Ausente(s) Presente(s) Centríolos Formação de cílios e flagelos; participação na divisão celular. Ausentes Presentes Ausentes Ribossomos Síntese de proteínas. Presentes Retículo endoplasmático rugoso Retículo endoplasmático liso Complexo de Golgi Mitocôndrias Vacúolo central Lisossomos Síntese de proteínas. Síntese de lipídios; armazenamento e inativação de substâncias. Secreção celular. Respiração celular aeróbia. Equilíbrio osmótico e armazenamento. Digestão intracelular. Ausentes Ausente Presentes Presentes Presente Ausentes Cloroplastos Fotossíntese. Ausentes Ausentes Presentes Citoesqueleto Manutenção da forma celular; contração e ancoragem de organelas. Ausente Presente 11

22 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) UNIDADE FUNCIONAL As reações metabólicas são facilitadas por proteínas com atividade catalítica, denominadas enzimas. Assim como as proteínas estruturais, as enzimas se sintetizam nos ribossomos, que são pequenos componentes citoplasmáticos, não membranosos. A estrutura das proteínas depende da informação genética codificada no ácido desoxirribonucleico (DNA), transcrita no ácido ribonucleico (RNA) e traduzida nos ribossomos. As semelhanças de estrutura e funcionamento celulares decorrem de uma origem evolutiva comum, aproximadamente 3,8 bilhões de anos atrás. Os dois tipos celulares que reconhecemos hoje, as células procarióticas e as eucarióticas, apareceram entre um e um bilhão e meio de anos mais tarde. TÉCNICAS LABORATORIAIS O estudo das células se vê facilitado por um conjunto de técnicas laboratoriais, tais como: o Técnicas microscópicas que permitem uma visualização detalhada da célula. - Microscopia óptica, que se utiliza para observar os cortes de tecidos. Geralmente, estes são fixados (álcool, ácido acético, formaldeído) e tingidos com corantes que reagem com as proteínas ou com os ácidos nucleicos, aumentando o contraste da imagem. - Microscopia de contraste de fase, que transforma as diferenças de espessura ou de densidade do fragmento observado em diferenças de contraste. - Microscopia fluorescente, que associa anticorpos específicos a um reagente como o PVF (proteína verde fluorescente de medusa), de forma a marcar as moléculas e visualizar sua distribuição nas células. - Microscopia confocal, que combina a microscopia fluorescente com a análise eletrônica da imagem, fornecendo uma imagem tridimensional. - Microscopia eletrônica, que permite a observação em um plano de cortes tingidos com sais de metais pesados (microscopia de transmissão) e a observação tridimensional de células (microscopia de varredura). - Microscopia de tunelamento, com os diversos tipos de microscópios de varredura por sonda (SPM, do inglês scanning probe microscope) que, além de fornecer uma imagem de moléculas e átomos, permitem medições e a manipulação de moléculas e átomos. - Nanoscopia, baseada na utilização de moléculas fluorescentes, permite a visualização de moléculas individuais dentro da célula viva (STED, do inglês Stimulated emission depletion microscopy; SMM, do inglês single-molecule microscopy). o Técnicas físicas como a centrifugação diferencial (ultracentrifugação, centrifugação em gradiente) para separar os componentes celulares para estudos bioquímicos posteriores. o Técnicas instrumentais que possibilitam a contagem de células e a separação de populações celulares (cell sorter) ou de cromossomos (flow sorter). o Técnicas de cultura de células com objetivos diversos. TODA CÉLULA DERIVA DE OUTRA PREEXISTENTE Assim como uma planta se forma a partir de outra planta e um animal de outro animal, toda célula deriva de outra preexistente. Este conceito, enunciado por R. Virchow em 1855, não foi plenamente 12

23 CÉLULAS E CROMOSSOMOS aceito até dez anos mais tarde, quando L. Pasteur mostrou experimentalmente que a proliferação de microrganismos em um meio orgânico estéril se deve à contaminação deste com os microrganismos presentes no ar, que, ao encontrar um meio propício, se multiplicam rapidamente. Todo organismo multicelular resulta da multiplicação de uma única célula-ovo ou zigoto. As células embrionárias diferenciam-se, formando centenas de tipos celulares com funções específicas, cuja integração assegura a unidade do organismo. Nos vegetais, a persistência de tecidos embrionários totipotentes (meristemas) na planta adulta permite o crescimento e a regeneração durante a vida toda do organismo. Em condições apropriadas, células especializadas podem reverter a um estado não diferenciado com a capacidade de regenerar um organismo completo. Nessa propriedade se fundamenta a propagação de plantas in vitro. Nos animais superiores, a totipotência se restringe às células do embrião com menos de quatro dias, que são as únicas capazes de regenerar um organismo inteiro. Contudo, uma vez passado esse período, algumas células internas pluripotentes do blastócito (células-tronco embrionárias) conservam a capacidade de originar todos os tecidos do organismo (Figura 2.2). Algumas células-tronco permanecem nos tecidos adultos, onde se multiplicam durante longos períodos de tempo sem que ocorra a diferenciação. Estas células têm sido encontradas em órgãos como a medula óssea e o cordão umbilical, o sangue, a córnea e a retina, a polpa dentária, o fígado, a pele, o trato digestivo e o pâncreas. Em determinadas condições fisiológicas, as células-tronco adultas originam células especializadas de vários tipos que asseguram a manutenção e o reparo do tecido onde se encontram. Um único tipo de célula-tronco multipotente da medula óssea, por exemplo, gera todas as células sanguíneas (hemácias, leucócitos e plaquetas). Na pele, células-tronco unipotentes se diferenciam unicamente na linhagem celular dos queratinócitos. As células-tronco adultas encontraram rapidamente aplicações terapêuticas promissoras, como o transplante de células-tronco hematopoéticas em casos de leucemia aguda ou de linfoma. Não aconteceu o mesmo com as células-tronco embrionárias, cuja utilização está limitada a pesquisas e estudos laboratoriais. As células-tronco embrionárias podem ser extraídas de um embrião obtido por transferência de um núcleo a um ovócito anucleado, ou dos embriões supranumerários congelados nas clínicas de fertilização assistida. Os dois métodos suscitaram grandes debates éticos em torno de quem forneceria os ovócitos e do status do embrião FIGURA 2.2. As células-tronco embrionárias As células-tronco embrionárias extraídas do blastócito (5 a 7 dias) e cultivadas in vitro diferenciam-se, em condições experimentais adequadas, nos diferentes tipos celulares. Espermatozóides Óvulo Massa interna de células Células de pâncreas Células de medula óssea Zigoto Cultura de Blastocisto (corte) células-tronco Células de 5 a 7 dias embrionárias músculo cardíaco 13

24 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A polêmica esmoreceu em 2006 com o desenvolvimento, por K. Takahashi e S. Yamanaka, da tecnologia que permite, a partir de células somáticas, obter células ips (do inglês, induced pluripotent stem cells). Com algumas pequenas diferenças na expressão gênica, suas propriedades são semelhantes às das células-tronco embrionárias. A indução de pluripotencialidade mediante a inserção de alguns genes em células adultas é um passo importante, porque acaba com a necessidade de utilizar embriões congelados. Ainda no terreno laboratorial, a tecnologia de reprogramação celular se desenvolve rapidamente, aumentando nosso conhecimento sobre o controle genético da diferenciação e abrindo uma nova senda para a implementação de testes, medicamentos e tratamentos novos. Entender os mecanismos que controlam o crescimento e a diferenciação celular é um dos maiores desafios atuais, porque as células-tronco possibilitarão novos tratamentos de regeneração celular para doenças cardíacas, diabetes e doença de Parkinson FIGURA 2.3: Os cromossomos Os nucleossomos são pequenas unidades estruturais que se repetem ao longo do cromossomo, formando a cromatina. Sua condensação explica que 2 m de DNA estejam concentrados em um núcleo de 5 µm de diâmetro. A Morfologia do cromossomo B- Estrutura da cromatina DNA Genes Centrômero DNA enrolado sobre as histonas (nucleossomos) Cromátides irmãs Nucleossomos compactados (cromatina) Sem duplicar Duplicado C. Representação dos cromossomos humanos (Cariótipo) O arranjo segue uma classificação convencional que leva em conta o tamanho, a posição do centrômero (tracejado no esquema) e o padrão das bandas de cada cromossomo. Fonte: 14

25 CÉLULAS E CROMOSSOMOS OS CROMOSSOMOS A observação microscópica dos cromossomos durante a divisão celular permite diferenciá-los pelo tamanho e a posição do centrômero, uma constrição que os divide em dois braços. Cada cromossomo está composto por um filamento de DNA enrolado a espaços regulares sobre várias proteínas (histonas), formando pequenas estruturas denominadas nucleossomos. No resto do ciclo celular, os cromossomos distendidos formam uma rede de filamentos finos, denominada cromatina, (Figura 2.3). O número de cromossomos (n) é constante em todos os indivíduos de uma mesma espécie: n = 4 em Drosophila melanogaster e n = 23 no homem, por exemplo. Como nas células somáticas, os cromossomos se encontram sempre em pares; na espécie humana, o número de cromossomos (2n) é de 46, sendo que um par determina o sexo. Os cromossomos sexuais são idênticos na mulher (46, XX) e diferentes no homem (46, XY). Em outras espécies, a determinação do sexo segue mecanismos diversos. Um pouco antes da divisão de uma célula, os cromossomos se duplicam, de modo que cada uma das células filhas receba (2n) cromossomos. A mitose mantém constante o número de cromossomos nas células somáticas dos indivíduos de uma mesma espécie. Já nas células reprodutivas, a meiose reduz a (n) o número de cromossomos. Durante o processo, o entrecruzamento dos cromossomos permite a permuta de material e a recombinação dos genes (Figura 2.4). Na fecundação, a fusão dos gametas restaura o número (2n) característico da espécie. Durante a formação dos gametas podem ocorrer erros na disjunção dos cromossomos, dando origem a indivíduos com fórmulas cromossômicas alteradas. Na síndrome de Down, por exemplo, a pessoa apresenta geralmente um cromossomo 21 supranumerário (mulheres 47, XX + 21; homens 47, XY + 21). Estima-se que a percentagem de recém-nascidos com alguma anomalia cromossômica estaria em torno de 0,85%, dos quais só alguns apresentariam algum sintoma. Alterações cromossômicas também podem ser relacionadas com alguns tipos de câncer. Na leucemia mieloide crônica, por exemplo, observa-se a translocação recíproca de dois pedaços dos cromossomos 9 e 22. De um modo geral, é frequente encontrar alterações no número de cromossomos das células cancerosas. A TEORIA CROMOSSÔMICA DA HEREDITARIEDADE Em 1865, Gregor Mendel apresentou seu trabalho Experiências de hibridização em plantas ; este reunia os resultados experimentais realizados com ervilhas (Pisum sativum), durante sete anos, no jardim do monastério Agostino de Brno (Morávia). Apesar de passar quase despercebido, o trabalho acabou sendo distribuído por várias bibliotecas da Europa e América, graças a sua publicação, um ano mais tarde, nos Anais da Sociedade de História Natural. No texto figuram algumas generalizações. Conhecida como Primeira Lei de Mendel, Lei de Segregação ou Monoibridismo, a primeira delas se refere à segregação dos fatores (alelos) de um par (um gene) na formação de gametas. A segunda, que é conhecida como Segunda Lei de Mendel, Lei de Segregação Independente ou Diibridismo, se refere à segregação dos fatores (alelos) de dois ou mais pares (dois ou mais genes) independentes na formação de gametas. Em 1900, depois de chegar de maneira independente a conclusões semelhantes, os pesquisadores K. Correns, E. Von Tschermak e H.de Vries redescobriram nas bibliotecas o trabalho de Mendel. Nesse intervalo de 35 anos tinha sido descrita a divisão celular (mitose, 1875; meiose, 1890); o próximo passo correspondeu a Sutton e Boveri (1902), sugerindo que os fatores hereditários de Mendel estariam nos cromossomos. 15

26 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A confirmação desta hipótese decorreu dos trabalhos de T.H.Morgan e sua brilhante equipe na Universidade de Columbia (Nova York), com a mosca da fruta, Drosophila melanogaster. Em 1910, depois de uma série de cruzamentos e de análises estatísticas, Morgan mostrou que a herança da cor branca do olho do mutante white está associada à transmissão do cromossomo X, que determina o sexo. Morgan e seus colaboradores identificaram numerosos outros mutantes de Drosophila melanogaster com um padrão mendeliano de hereditariedade. Além de moscas com olhos brancos em vez de vermelhos, encontraram outras com asas curtas em vez de longas, com corpo de cor marrom ou preta em vez de amarela etc. Os genes correspondentes foram classificados em quatro grupos de ligação, sendo que cada um deles está associado a um dos quatro pares de cromossomos da Drosophila. Como durante a meiose se produzem permutas entre segmentos cromossômicos, nos cruzamentos aparecem indivíduos recombinantes, isto é, com outras combinações gênicas diferentes das previstas pelas leis mendelianas (Figura 2.4). A partir dos dados obtidos em milhares de cruzamentos sobre a recombinação dos genes de um mesmo grupo de ligação chega-se a estabelecer a distância genética entre eles FIGURA 2.4. Mitose e meiose MEIOSE MITOSE EIOSE 16

27 CÉLULAS E CROMOSSOMOS Com a descoberta de células com cromossomos gigantes (politênicos) nas glândulas salivares das larvas de drosófila, começaram os primeiros trabalhos de mapeamento. A observação microscópica das bandas nos cromossomos mostrou, com enorme riqueza de detalhes, uma sucessão consistente de bandas largas e estreitas. Da associação entre os métodos genéticos e os métodos citológicos surgiram os primeiros mapas físicos, associando uma região cromossômica a cada gene. Das descobertas de Morgan e sua equipe, nasce a Teoria Cromossômica da Hereditariedade ou Teoria do Gene, segundo a qual: o Os caracteres de um indivíduo correspondem a elementos pares, os genes. o Os genes estão ligados uns aos outros nos cromossomos, formando um determinado número de grupos de ligação. o Os genes de cada par se separam durante a gametogênese, de acordo com a Primeira Lei de Mendel e, em consequência, cada gameta fica contendo apenas um conjunto de genes. o Os genes pertencentes a grupos de ligação diferentes segregam independentemente, de acordo com a Segunda Lei de Mendel. o Entre os elementos pertencentes a cada grupo de ligação, ocorre uma troca ordenada chamada permuta ou crossing-over, que leva à recombinação dos genes (Figura 2.4). A frequência da permuta fornece a prova da linearidade dos genes em cada grupo de ligação e permite determinar sua posição relativa. AS PRIMEIRAS MANIPULAÇÕES GÊNICAS Na genética clássica, um caráter pode ser considerado hereditário quando duas variações fenotípicas podem ser atribuídas a dois alelos de um mesmo gene. Os primeiros mutantes de Drosophila apareceram por acaso e em uma frequência tão baixa que limitava os estudos de análise genética. Era necessário encontrar um método que acelerasse a obtenção de mutantes para poder avançar. Já na década de 1920, H. Muller, um dos integrantes do grupo das moscas liderado por Morgan, iniciou os experimentos de exposição das drosófilas a diferentes tipos de radiação. O tratamento gerou em poucas semanas mais de 100 mutantes, um número equivalente à metade dos mutantes espontâneos encontrados nos 15 anos anteriores. A radiação podia causar pequenas mutações de ponto, afetando um único gene e originando uma pequena variação fenotípica. Contudo, os efeitos da radiação também podiam ser letais para a descendência e/ou produzir vários tipos de alterações cromossômicas: translocações, inversões, deleções, duplicações. Muller viu claramente a importância do tratamento com radiação para a obtenção de novas variáveis vegetais e no melhoramento agrícola; datam dessa época as primeiras mutações em plantas de milho. A radiação é utilizada como agente mutagênico até os dias de hoje, sendo uma prática considerada aceitável pelos agricultores orgânicos. Percebendo o risco que a manipulação indiscriminada da radiação representava para o ser humano, Muller teve um rol preponderante na conscientização dos trabalhadores da indústria e da saúde sobre medidas de proteção e participou ativamente nas campanhas antinucleares das décadas de NATURE vs NURTURE Assim como muitos outros posteriores, os estudos da equipe de Morgan mostraram a complexidade dos padrões de hereditariedade, que incluem casos de: 17

28 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) o Alelismo múltiplo, quando um gene admite múltiplos alelos; dominantes, recessivos ou codominantes (Sistema ABO, por exemplo). o Pleiotropia, quando um gene determina diversos caracteres (pelagem e sobrevivência em ratos, por exemplo). o Herança poligênica, quando um caráter está determinado por vários genes de efeito cumulativo (altura, cor dos olhos). o Interação gênica, quando uma característica depende da ação de muitos genes. Contudo, a variação observada nos seres vivos não se deve exclusivamente à hereditariedade: o desenvolvimento de um ser vivo resulta de uma delicada inter-relação entre os genes e o ambiente. No século XX, duas interpretações extremas sobre sua importância relativa causaram grandes danos à humanidade. Uma delas é o determinismo genético, base ideológica do eugenismo, movimento que postula o melhoramento genético do homem mediante a esterilização dos indivíduos considerados deficientes físicos ou mentais, uma categoria que incluía também os desajustados sociais. Teve grande influência nos Estados Unidos, na Inglaterra, nos países do Báltico, na Alemanha e no Japão. No outro extremo, encontramos o determinismo ambiental, que, negando a influência dos genes, se afirmou na União Soviética durante o período staliniano. Defendido por T. Lyssenko, esse preceito foi uma das principais causas do fracasso da agricultura e da escassez de alimentos sofrida pela população no período posterior à Segunda Guerra Mundial. Em uma perspectiva histórica, os argumentos utilizados no debate atual sobre os organismos geneticamente modificados conservariam algumas raízes nessa visão antagônica do século XX sobre ciência burguesa reacionária vs ciência proletária progressista, ou ainda capitalismo-direitadeterminismo genético vs socialismo-esquerda-ambientalismo. Para os geneticistas, o fenótipo de um indivíduo é o resultado da interação entre o genótipo e o ambiente em que este se expressa. Os genes determinam o desenvolvimento dos seres vivos, mas existem muitos traços que não são determinados exclusivamente pelos genes e dependem, em maior ou menor grau, de influências ambientais. CÉLULAS E CROMOSSOMOS COMO AGENTES BIOLÓGICOS Um dos testes pioneiros de diagnóstico genético está baseado na observação microscópica dos cromossomos de células somáticas durante a divisão celular (mitose). A identificação se vê facilitada pela presença de regiões ou bandas reveladas mediante algumas técnicas de coloração. O número e a estrutura dos cromossomos são analisados e apresentados em um arranjo (cariótipo) que segue uma classificação convencional (Figura 2.3). Os testes de diagnóstico genético envolvendo a análise de cariótipos estão amplamente difundidos na prática médica, sendo facilitados atualmente pela utilização de corantes específicos para cada par cromossômico. Como agentes biológicos, as células encontram outras aplicações (Tabela 2.2). Células vegetais cultivadas in vitro produzem substâncias de alto valor agregado, importantes para as indústrias alimentar, cosmética e farmacêutica. Também são utilizadas para regenerar plantas. A multiplicação de vírus em cultivos de células de insetos permite a comercialização de práticas de controle biológico. A síntese de algumas substâncias importantes para a indústria farmacêutica, como o fator ativador de plasminogênio, depende do cultivo in vitro de células animais. Estas também substituem os animais nos testes toxicológicos e são utilizadas na multiplicação de vírus para a preparação de vacinas. Também possibilitam a produção de anticorpos. 18

29 CÉLULAS E CROMOSSOMOS As células-tronco são ferramentas fundamentais na pesquisa básica sobre diferenciação celular. Sua utilização tem permitido avanços notáveis nos testes de toxicidade, na triagem de medicamentos e na modelagem de doenças. Combinando as técnicas de cultivo celular com o desenvolvimento de materiais biológicos semelhantes ao colágeno, uma área nova de engenharia de tecidos visa a reparação ou substituição de tecidos lesionados. Os enxertos de pele artificial, cultivada in vitro, saram ferimentos e/ou queimaduras em seres humanos TABELA 2.2. As células como agentes biológicos CÉLULAS Vegetais Animais e/ou humanas Indústria alimentar e cosmética (adoçantes, corantes, flavorizantes e aromatizantes). Indústria farmacêutica (alcaloides e esteroides). Estudos toxicológicos. Diagnóstico clínico e aconselhamento genético (cariótipos). Indústria farmacêutica (produção de anticorpos e vacinas, testes de toxicidade, triagem de medicamentos). Medicina regenerativa (produção de tecidos de substituição). 19

30 C A P Í T U L O 3 OS MICRORGANISMOS A DIVERSIDADE MICROBIANA O termo microrganismos se aplica a um grupo heterogêneo de seres que vivem como células independentes ou como agregados celulares: bactérias, arqueas, protozoários, algas e fungos e, também, vírus (Tabela 3.1). Salvo estes últimos, que estão na fronteira entre o vivo e o não vivo, os encontramos dentro dos três domínios em que se classificam os seres vivos: Bacteria, Archaea e Eukarya. Os microrganismos mostram uma diversidade surpreendente de estrutura e modos de vida. Alguns são procariontes, como as bactérias; outros eucariontes, como os protozoários, as algas e os fungos. Os aeróbios crescem se houver oxigênio, os anaeróbios, se não o houver. Formas livres colonizam todos os ambientes terrestres, desde o cume das montanhas até as profundidades dos oceanos. Mas há também parasitas que crescem à custa de outros seres vivos, onde encontram abrigo e alimento, e os que mostram diversos graus de dependência de outros seres vivos TABELA 3.1. Os microrganismos dentro do marco da uma classificação biológica atual DOMÍNIO BACTERIA ARCHAEA EUKARYA REINO EUBACTERIA ARCHAEBACTERIA PROTOCTISTA FUNGI PLANTAE ANIMALIA TIPO DE CÉLULA Procariótica Procariótica Eucariótica Eucariótica Eucariótica Eucariótica ESTRUTURA CELULAR Parede celular com peptidoglicano. Parede celular sem peptidoglicano. Parede celular de celulose, em alguns. Presença de cloroplastos, em alguns. Parede celular de quitina. Ausência de cloroplastos. Parede celular de celulose. Presença de cloroplastos. Sem parede celular nem cloroplastos. ORGANIZAÇÃO Unicelular Unicelular Uni ou pluricelular Uni ou pluricelular Pluricelular Pluricelular NUTRIÇÃO (*) Autotrófica ou Heterotrófica Autotrófica ou Heterotrófica Autotrófica ou Heterotrófica Heterotrófica (absorção) Autotrófica Heterotrófica (ingestão) EXEMPLOS Eubactérias Arqueas Protozoários e Algas Leveduras, Mofos, Bolores e Cogumelos. Briófitas (musgos), Pteridófitos (samambaias), Gimnospermas e Angiospermas. Invertebrados e Cordados * Nutrição Autotrófica: o organismo produz seu próprio alimento a partir de substâncias inorgânicas e de uma fonte de energia. Os seres autotróficos podem realizar fotossíntese (para a qual a fonte de energia é a luz solar) ou quimiossíntese (para a qual a fonte de energia é uma reação química exotérmica). Heterotrófica: o organismo se alimenta de moléculas orgânicas elaboradas por outros seres vivos por absorção (captação de nutrientes dissolvidos na água), ou ingestão (entrada de partículas de alimentos não dissolvidas). BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

31 OS MICRORGANISMOS Os autótrofos sintetizam seus alimentos a partir de dióxido de carbono; os fotossintéticos utilizam a luz como fonte de energia; e os quimiossintéticos, algumas reações químicas inorgânicas. Os heterótrofos dependem das moléculas orgânicas elaboradas pelos autótrofos, que absorvem ou ingerem. O fato de mantê-los agrupados sob a denominação de microrganismos talvez obedeça menos a uma questão de semelhança que a razões práticas; já que os mesmos métodos básicos de estudo (isolamento, cultura in vitro, identificação) podem ser aplicados, com pequenas variações, a esses grupos. Em condições favoráveis de umidade, acidez e temperatura, as bactérias se multiplicam rapidamente por fissão celular, produzindo em poucas horas milhões de células ou clones, em uma das acepções da palavra. Algumas espécies bacterianas também mantêm formas de reprodução sexuada, possibilitando a recombinação do material genético de plasmídeos. A transferência horizontal de genes entre bactérias e arqueas ocorre em consequência da infecção com bacteriófagos ou simplesmente por entrada de um DNA nu (Figura 3.1). AS EUBACTÉRIAS As eubactérias ou bactérias são organismos unicelulares procarióticos em que uma parede celular pode cumprir uma função protetora. Além do DNA cromossômico, podem apresentar moléculas circulares extras de DNA denominadas plasmídeos. As eubactérias formam um grupo com mais de 5 mil espécies conhecidas. Pequenas (0,0005-0,005 mm) e de formas diversas (esféricas, bastonetes, helicoidais), elas podem ser encontradas isoladas ou em pares, cadeias ou agregados. Algumas se locomovem livremente, mediante um ou mais flagelos distribuídos na superfície celular, outras aderem, mediante pelos ou fímbrias, a um organismo hospedeiro. O grupo inclui as cianobactérias, que serão comentadas mais adiante, junto com as algas. Em condições desfavoráveis, algumas bactérias formam esporos que resistem em forma latente até que a situação mude, germinando e retomando sua atividade fisiológica. Um exemplo interessante, na Europa do século XIX, é o da existência de campos malditos, onde as ovelhas não deviam transitar, devido ao alto risco de contrair o carbúnculo ou antraz. De fato, os bacilos presentes nos animais vitimados pela doença e enterrados nesses campos formavam esporos que, trazidos à superfície pelas minhocas, contaminavam as pastagens. Uma técnica laboratorial (coloração de Gram) permite diferenciar as bactérias pela estrutura da parede celular. Entre as Gram-positivas, cuja parede celular é mais simples, encontramos gêneros como Clostridium, Bacillus, Mycobacterium (com algumas espécies que causam a tuberculose e a lepra) e os Actinomicetes, como Streptomyces, produtora de antibióticos como a estreptomicina. Entre as Gram-negativas, encontramos os micoplasmas, Escherichia coli, uma colonizadora do trato digestivo de muitos organismos; Salmonella, um agente de muitas intoxicações alimentares; as cianobactérias fotossintéticas; as espiroquetas (Treponema pallidum e Borrelia burgdorferi, causantes da sífilis e da doença de Lyme, respectivamente); e as clamídias (responsáveis por tracoma e uretrites). Estima-se que as bactérias sejam responsáveis por aproximadamente metade das doenças humanas, porém nem todas são patogênicas. As Gram-negativas são mais difíceis de tratar que as Gram-positivas, devido a uma camada adicional na parede celular que as protege e dificulta a entrada de antibióticos. Assim como o homem, os animais e as plantas também são afetados por patógenos bacterianos. O dano decorre da invasão dos tecidos do hospedeiro ou da liberação de substâncias tóxicas (exo e endotoxinas). Pessoas diferentes, em lugares diferentes ou em um mesmo lugar, sejam sadias ou doentes, não apresentam os mesmos microrganismos. Algumas comunidades microbianas desenvolvem-se na 21

32 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) superfície e no interior de um organismo. Denominadas microbiomas, essas comunidades são provavelmente necessárias para o hospedeiro. Técnicas avançadas de amplificação e sequenciamento de DNA permitem identificar os microrganismos que se desenvolvem em diferentes localizações, seja a pele ou o tubo gastrointestinal FIGURA 3.1. Bactérias, clones e intercâmbio de material genético Por divisão binária, uma bactéria gera um clone de bactérias semelhantes. O intercâmbio de material genético entre bactérias responde a três mecanismos, mediados por DNA livre (transformação), por plasmídeos (conjugação) ou por bacteriófagos (transdução). A Formação de clones Bactéria Clones B Mecanismos de transferência lateral ou horizontal de material genético Conjugação Bactéria doadora Bactéria receptora Transdução Bacteriófago Infecção Incorporação do DNA Bactéria infectada com um fragmento exógeno (Lisogenia) de DNA bacteriano Transformação natural Lise celular Bactéria competente Bactéria transformada 22

33 OS MICRORGANISMOS Em relação ao meio ambiente, a participação bacteriana na reciclagem dos elementos é fundamental do ponto de vista ecológico. Dela dependem o tratamento de resíduos e de águas servidas e, também, a eliminação de compostos recalcitrantes (biorremediação) e a extração de minérios (biolixívia). A fixação de nitrogênio e a produção de toxinas pesticidas por bactérias contribuem para melhorar as práticas agrícolas. Devido a suas propriedades metabólicas, muitas eubactérias são utilizadas na produção de alimentos (laticínios, vinagre, picles e azeitonas) e de aditivos (vitaminas, aminoácidos, gomas emulsificantes e estabilizantes), na indústria química (acetona, butanol e plásticos biodegradáveis) e na indústria farmacêutica (vacinas, toxinas e antibióticos). Também são usadas na produção de enzimas para uso industrial e médico (Tabela 3.2). Nos últimos anos começaram a ser estudados os biofilmes, comunidades microbianas protegidas em uma matriz extracelular aderente. Tanto se fixam nos dentes, onde formam a placa dentária, como na cortina do chuveiro, na pia da cozinha, nos tubos metálicos, nos sistemas de ar condicionado, ou nos cateteres médicos e equipamentos de hemodiálise. Os biofilmes são extremamente resistentes aos ataques dos agentes antimicrobianos. AS ARQUEAS As arqueobactérias, ou arqueas, diferem das eubactérias pela estrutura da parede celular e, também, por alguns aspectos metabólicos relacionados com a síntese de proteínas que as aproximam dos eucariontes. Algumas vivem em habitats inóspitos, como as solfataras dos vulcões ou gêiseres, a temperaturas superiores a C (Islândia, Costa Rica). Outras prosperam em lagos onde a concentração salina é altíssima, como o Grande Lago Salgado (Estados Unidos) ou o Mar Morto (Israel). Entre as arqueas existem também alguns gêneros com vias metabólicas peculiares que as tornam dependentes de enxofre ou produtoras de metano. Devido a estas características, nos últimos anos tem-se acelerado a prospecção de arqueas para serem utilizadas em processos industriais que exijam condições ambientais extremas. Contudo, estudos recentes de ecologia molecular mostram que as arqueas não se limitam a ambientes extremos e que sua diversidade é bem maior do que o imaginado previamente. OS PROTOCTISTAS Os Protozoários se classificam no reino Protoctista, um grupo mal definido de seres eucarióticos unicelulares ou pluricelulares, autótrofos ou heterótrofos, de reprodução sexuada ou assexuada. Trata-se de organismos unicelulares heterotróficos, cujo tamanho varia entre 0,002 e 1mm. Alguns vivem livres em ambientes marinhos, de água doce, ou simplesmente muito úmidos. Outros parasitam outras espécies, nas quais causam doenças: Giárdia, Amoeba, Trichomonas, Plasmodium, Toxoplasma, Leischmania etc. De importância fundamental para o ser humano, do ponto de vista médico, sua caracterização molecular pode dar origem a testes diagnósticos e vacinas. Classificadas junto com os protozoários no reino Protoctista, as algas são organismos uni ou pluricelulares, autotróficos e aquáticos. Situadas na base das cadeias alimentícias aquáticas, as algas cumprem um papel fundamental na biosfera por serem capazes de fixar gás carbônico e produzir oxigênio. Algumas participam na formação de solos e na fixação de nitrogênio. Apesar de não ter órgãos diferenciados, as macroalgas marinhas (algas pardas, algas vermelhas e parte das algas verdes) formam filamentos e talos que podem chegar a medir mais de trinta metros. São utilizadas como adubo e, também, na alimentação humana (Porphyra ou nori e Laminaria, como o kombu, no Oriente; cochayuyo, no Chile). Devido a sua capacidade de formar géis e emulsões, os ficocoloides extraídos dessas algas (ágar, carragenina, alginato) são empregados em análises clínicas 23

34 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) (preparação de meios de cultivo para cultivo de bactérias e fungos) e em várias indústrias, tais como a alimentícia (sorvetes, cremes, geleias etc.), a farmacêutica (laxantes, cápsulas de remédios) e a cosmética (cremes, sabonetes, xampus, dentifrícios etc.) TABELA 3.2. As bactérias (Eubactérias e Arqueas) como agentes biológicos AGENTES BIOLÓGICOS Bactérias APLICAÇÕES Tratamento de resíduos e de águas servidas. Produção de energia (metano). Biorremediação, extração de minério. Indústria química (acetona, butanol, ácido láctico, ácido acético). Enzimas industriais. (*) A dextrana também tem usos médicos. Agricultura (rizóbios, biopesticidas). Alimentos (laticínios, vinagres, picles, azeitonas, silagem). Indústria de alimentos (vitaminas B 12 e β-caroteno, aminoácidos lisina e ácido glutâmico; polissacarídeos xantana e dextrana*). Indústria farmacêutica (enzimas de uso médico, antibióticos, vacinas e toxinas). TABELA 3.3. As algas como agentes biológicos AGENTES BIOLÓGICOS Biomassa Algas Moléculas APLICAÇÕES Tratamento de efluentes, biomonitoramento de poluição, obtenção de energia. Agricultura (adubo). Produção de alimentos (alimentação humana, ração para avicultura e aquicultura). Indústria de alimentos (aditivos, complementos nutricionais, substitutos proteicos, espessantes e emulsionantes). Indústria de cosméticos (ácidos graxos e outras substâncias tais como ficocoloides, pigmentos, glicerol, abrasivos finos etc.). Indústria farmacêutica (compostos biologicamente ativos, tais como toxinas, antibióticos, antivirais e antitumorais). TABELA 3.4. Os fungos como agentes biológicos AGENTES BIOLÓGICOS Fungos APLICAÇÕES Agricultura (controle biológico de insetos e nematoides, micorrizos). Produtos de fermentação (etanol, glicerol, ácido cítrico). Enzimas industriais. Biomassa (fermento de padaria, micoproteína). Indústria de alimentos (panificação, queijaria). Indústria de bebidas (cervejas e vinhos, destilados). Produtos metabólicos (extrato de levedura, hormônios de crescimento vegetal). Indústria farmacêutica (antibióticos, vitaminas, vacinas, esteroides). 24

35 OS MICRORGANISMOS As microalgas representam um grupo extremamente diversificado de umas espécies das quais só um pequeno grupo está bem estudado. Este compreende aproximadamente cinquenta espécies de microrganismos fotossintéticos, tanto eucariontes (diatomáceas, dinoflagelados, euglenoides e outras algas verdes) como procariontes (cianobactérias, antigamente algas azul-esverdeadas). A proliferação de microalgas como florações na natureza (marés vermelhas) ou em reservatórios, geralmente devido à eutrofização das águas, causa a morte de outros organismos, sendo muito perigosa se estiver acompanhada pela liberação de toxinas. Porém, em alguns sistemas de tratamento de efluentes, as microalgas são incorporadas nos tanques para remover nutrientes inorgânicos e adicionar oxigênio. Também são usadas como indicadores de poluição. O metano é um gás combustível que resulta da degradação de biomassa de algas por microrganismos anaeróbios. Por outro lado, a produção de hidrogênio por algas representa uma alternativa energética promissora. As microalgas são aproveitadas na alimentação animal como ração para a avicultura e a aquicultura. Algumas das substâncias que elas sintetizam são incluídas na alimentação humana como complementos nutricionais e substitutos proteicos; trata-se de aminoácidos, ácidos graxos e vitaminas (B12, -caroteno ou provitamina A). Também são utilizadas na formulação de cosméticos e na indústria farmacêutica (Tabela 3.3). OS FUNGOS O Reino Fungi comporta mais de espécies. Os fungos são organismos eucarióticos, uni ou pluricelulares, com uma parede celular formada por quitina. Todos eles são heterótrofos e podem se reproduzir sexuada ou assexuadamente. As leveduras são fungos unicelulares que se desenvolvem em lugares úmidos e se reproduzem por brotamento. Pertence a esse grupo um dos microrganismos de maior importância econômica: Saccharomyces cerevisiae, o popular levedo de cerveja (ou, simplesmente, levedura) utilizado tradicionalmente na preparação de alimentos e de bebidas, assim como na produção de etanol, vitaminas e outros metabólitos. Transformada mediante técnicas de engenharia genética, esta levedura produz uma vacina contra a hepatite B (Tabela 3.4). Entretanto, nem todas as leveduras são benéficas; Candida albicans, um microrganismo oportunista da flora normal humana pode, em certas condições, proliferar de maneira anormal, tornando-se patogênica. Nos bolores e mofos, as células formam um emaranhado de filamentos ou hifas, denominado micélio. Os mofos crescem rapidamente por fragmentação do micélio e se disseminam mediante esporos; como Aspergillus niger, um produtor de ácido cítrico; ou como Rhizopus, o fungo preto do pão, que se expande sobre a superfície deste apesar dos conservantes acrescentados; ou ainda como Aspergillus flavus, um bolor que ataca as sementes de leguminosas (amendoim, feijão, soja) e produz uma toxina poderosa, a aflatoxina, causando graves intoxicações. Neste grupo também se encontra o Penicillium, um gênero que conta com diversas espécies, uma das quais é utilizada na indústria farmacêutica, para a produção de penicilina, e outras na indústria de alimentos, para a maturação de queijos como o Roquefort, o Gorgonzola e o Camembert. Os cogumelos são os corpos reprodutivos de muitos fungos. Alguns são venenosos (Ammanita), outros produzem substância alucinógena, tais como a psilobicina, utilizada por grupos nativos mexicanos em rituais religiosos, ou a ergotamina, sintetizada quimicamente no século XX com o nome de LSD (ácido lisérgico). Mas também os há comestíveis como o Agaricus ou champignon, o Shiitake e o Pleurotus, que são cultivados e comercializados pelo homem. Em termos ambientais, um quarto da colheita de frutas e vegetais é destruído pelos fungos; pragas como a ferrugem do café, o esporão do centeio e a vassoura-de-bruxa afetam gravemente a 25

36 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) agricultura. Na Irlanda no século XIX, o Phytophtora infestans atacou a batata, destruindo a fonte básica de alimentação; a praga causou um milhão de mortes e a emigração forçada de boa parte da população. Os liquens resultam da simbiose entre um fungo e uma alga. Alguns são comestíveis, supondo-se que a Lecanora esculenta seja o maná referido na Bíblia. O grupo não tem sido muito explorado economicamente, apesar de ter encontrado aplicações como corantes (tintura de tornassol, um indicador de ph), no tingimento de tecidos e como fixadores na indústria de perfumes. Também são indicadores de poluição (biomonitoramento). Em contrapartida, outra associação, desta vez entre um fungo filamentoso e as raízes das plantas vasculares, os micorrizos, ocupam um lugar de destaque na agricultura em solos tropicais por facilitarem a solubilização dos fosfatos. OS VÍRUS, NA FRONTEIRA DO VIVO E DO NÃO VIVO Os vírus são partículas sem nenhuma atividade metabólica; atravessam os filtros de porcelana e cristalizam. O seu tamanho varia entre 20 e 300 nanômetros (1 nm = 10-4 mm). Sendo parasitas obrigatórios de bactérias, plantas ou animais, ao infetar uma célula viva os vírus passam a utilizá-la para sua própria reprodução. Apesar de variar muito em complexidade, uma partícula viral típica compreende um ácido nucleico (DNA ou RNA, como filamento simples ou duplo) dentro de uma capa proteica ou capsídeo e algumas enzimas que serão liberadas dentro da célula hospedeira: DNA polimerase no caso dos poxvirus de DNA duplo que se multiplicam no citoplasma: transcriptase reversa nos retrovírus; RNA replicase nos vírus que se replicam sem passar por DNA. Alguns vírus que se integram no genoma da célula infectada (bacteriófagos, retrovírus) têm sido utilizados na engenharia genética como vetores para introduzir genes em uma célula hospedeira (Figura 3.2). A entrada do vírus na célula depende do reconhecimento de um receptor na membrana celular do hospedeiro, que seja específico para o vírus e essencial para a célula. A seguir, vários cenários são possíveis: morte da célula infectada pelo sistema imune do hospedeiro; lise celular e dispersão de partículas virais (vírus da influenza, poliovírus); brotação e saída envelopada; permanência latente (herpesvírus); integração no hospedeiro e eventual transformação das células em cancerosas (tumores devidos aos vírus da hepatite B e de Epstein-Barr). Várias doenças humanas são causadas por vírus (poliovírus, HIV, coronavírus [responsável pela síndrome aguda respiratória ou SAR] etc.). A destruição de habitats naturais pelo homem e as mudanças climáticas alteram a dinâmica das populações naturais, em que a relação entre parasita e hospedeiros está bem estabelecida. O contato dos vírus com outros hospedeiros possibilita a aparição de algumas doenças emergentes como o Ebola, que assolou recentemente vários países da África ocidental, e o Zika, introduzido recentemente no Brasil. A dispersão dos vírus se vê acelerada por fatores culturais e sociais e pelo incremento do comércio e das viagens internacionais. Na agricultura, o combate à lagarta da soja com o baculovírus evita a aplicação de 1,2 milhão de litros de inseticidas por ano nas lavouras brasileiras. Em relação ao meio ambiente, pouco se sabe do rol dos vírus, e dos microrganismos, nos oceanos. Uma questão relevante, considerando que 1 litro de água de mar contém pelo menos 10 bilhões de micróbios e 100 bilhões de vírus, e que a maioria não está caracterizada nem identificada. Estudos recentes destacam sua importância nos ciclos biogeoquímicos e, particularmente, na reciclagem do carbono; a morte microbiana por infecção viral libera, na cadeia alimentar, de 370 milhões a 630 milhões de toneladas de carbono por ano. Os príons são pequenas proteínas que podem agir como agentes transmissíveis de algumas doenças raras do sistema nervoso central. Possivelmente ativam mecanismos do hospedeiro para produzir proteínas semelhantes que polimerizam, causando danos locais (Kuru, doença de Creutzfeldt-Jakob). 26

37 OS MICRORGANISMOS FIGURA 3.2. Os vírus A. Estrutura fundamental Envelope (só nos vírus que se reproduzem por brotação) Capsídeo (proteína) Ácido nucleico (DNA ou RNA) Enzimas virais (polimerases, transcriptase reversa) B. Morfologia de diferentes vírus (Os adenovírus e o HIV parasitam células humanas; o bacteriófago, bactérias). HIV Adenovírus Bacteriófago C. A multiplicação de um bacteriófago A infecção da bactéria pelo bacteriófago destrói a célula (ciclo lítico). Em alguns casos, o DNA viral se integra no cromossomo, sendo transmitido às células filhas; em determinadas condições, o vírus retoma sua atividade, reiniciando o ciclo lítico. Bacteriófago Bactéria Infecção DNA viral Infecção Adesão do bacteriófago à parede celular e injeção e injeção do DNA viral Eventualmente DNA viral O DNA viral se integra no cromossomo bacteriano CICLO LISOGÊNICO e se transmite às células-filhas CICLO LÍTICO Lise da bactéria e liberação de novas partículas de vírus Podendo voltar a se ativar Multiplicação do DNA viral Formação de novos vírus Síntese de proteínas virais e destruição do cromossomo bacteriano 27

38 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) AS TÉCNICAS MICROBIOLÓGICAS Diversos tipos de técnicas facilitam o trabalho laboratorial. A identificação de um microrganismo demanda a observação microscópica e a utilização de alguns métodos específicos de coloração, complementados por testes bioquímicos e eventualmente genéticos e imunológicos. Encontrar e manter um microrganismo no laboratório demanda a aplicação de técnicas bacteriológicas aplicáveis também, com algumas variações, a fungos e algas. Cultivar microrganismos exige, além do desenho de um meio nutriente que satisfaça suas necessidades metabólicas, um cuidado especial com as condições de temperatura e iluminação em que este será incubado. Os meios nutrientes se empregam líquidos ou solidificados com ágar, uma substância que lhes confere uma consistência gelatinosa. Os recipientes mais comuns são tubos de ensaio e placas circulares de vidro com tampa (placas de Petri); e, para inocular os meios, se utilizam alças de platina e pipetas de diferentes tipos. A grande dificuldade do laboratório microbiológico está em conseguir a multiplicação do microrganismo desejado evitando as contaminações, isto é a multiplicação de outros microrganismos. Trabalha-se em condições assépticas, o que demanda a esterilização prévia do material de vidro, dos meios nutrientes e dos instrumentos (alças, pipetas) que serão utilizados. E, na transferência do material biológico, evita-se cuidadosamente toda contaminação com os microrganismos do ar. Equipamentos especialmente desenhados para trabalhar sob um fluxo de ar esterilizado ajudam o profissional. Também se evitam as contaminações na hora de eliminar o material utilizado, a fim de não liberar microrganismos prejudiciais no ambiente. Os microrganismos são isolados a partir de amostras de solo, água, ar ou fluidos corporais. As linhagens obtidas se conservam como culturas puras. Microrganismos com características diferentes são obtidos induzindo mutações e selecionando as linhagens mutantes. Cada laboratório mantém os estoques microbianos necessários, que também podem ser solicitados a centros especializados (Coleções de Cultura). O número de microrganismos em uma amostra pode ser estimado por diversos métodos: contagem microscópica, contagem eletrônica, contagem em placa, turvação do meio, massa seca, conteúdo de nitrogênio ou medidas indiretas da atividade microbiológica. Em geral, as técnicas clássicas são trabalhosas e muito demoradas para o diagnóstico clínico, por isso estão sendo substituídas por técnicas miniaturizadas mais rápidas que identificam os microrganismos com base em algumas reações bioquímicas em kits padronizados. A tendência geral é de automatização do laboratório microbiológico e de utilização de técnicas moleculares. A identificação de bactérias e arqueas pode ser realizada hoje por comparação do RNA ribossômico. A centrifugação dos ribossomos em gradiente de cloreto de césio separa os componentes, RNA 5S e RNA 23S na unidade maior e RNA 16S na menor. Modificações na estrutura primária desta última fração não afetam sua função, de modo que, se uma pequena parte está altamente conservada, o restante do rrna de 16S varia entre as espécies, tendo se transformado em um elemento chave para a classificação. A Microbiologia Ambiental nos traz uma nova visão das populações microbianas presentes na natureza. Nossa ignorância é ainda enorme: o número de espécies que conseguimos cultivar no laboratório não representa mais do que 1 a 5 % da totalidade existente. Dependemos dos avanços na área da genômica para ampliar nosso conhecimento das comunidades microbianas do ambiente e para identificar genes de interesse para a indústria (metagenômica). 28

39 OS MICRORGANISMOS BIOSSEGURANÇA E BIOSSEGURIDADE De acordo com a Organização Mundial da Saúde, o termo biossegurança abrange os princípios, técnicas e práticas necessárias para evitar a exposição acidental a patógenos e toxinas assim como sua liberação acidental (Figura 3.3). Os microrganismos são classificados segundo o risco de causarem danos aos profissionais que trabalham com eles e à coletividade. Os critérios são: a patogenicidade para o homem, a virulência, o modo de transmissão, a endemicidade e a existência ou não de uma terapêutica eficaz. Segundo a Organização Mundial da Saúde, definem-se assim quatro grupos de risco: o Grupo de Risco (nenhum ou baixo risco individual e coletivo). Um microrganismo que provavelmente não pode causar doença no homem ou num animal. Exemplos: Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Escherichia coli (algumas linhagens), Lactobacillus sp. o Grupo de Risco 2 (risco individual moderado, risco coletivo baixo). Um agente patogênico que pode causar uma doença no homem ou no animal, mas que é improvável que constitua um perigo grave para o pessoal dos laboratórios, a comunidade, o gado ou o ambiente. A exposição a agentes infecciosos no laboratório pode causar uma infecção grave, mas existe um tratamento eficaz, além de medidas de prevenção, com risco de propagação de infecção limitado. Exemplos: Salmonella, Toxoplasma, Schistosoma mansoni, Streptococcus sp, vírus da rubéola, vírus do sarampo e vírus da hepatite B. o Grupo de Risco 3 (alto risco individual, baixo risco coletivo). Um agente patogênico que causa geralmente uma doença grave no homem ou no animal, mas que não se propaga habitualmente de uma pessoa a outra. Existe um tratamento eficaz, bem como medidas de prevenção. Exemplos: Mycobacterium tuberculosis, Bacillus anthracis e vírus da imunodeficiência humana (HIV). o Grupo de Risco 4 (alto risco individual e coletivo). Um agente patogênico que causa geralmente uma doença grave no homem ou no animal e que se pode transmitir facilmente de uma pessoa para outra, direta ou indiretamente. Nem sempre estão disponíveis um tratamento eficaz ou medidas de prevenção. Exemplos: vírus Ebola, vírus Lassa e vírus Marburg. A classificação anterior é válida exclusivamente para o trabalho laboratorial. A cada grupo de microrganismos correspondem normas estritas de trabalho, que abrangem desde a arquitetura do laboratório e as características dos equipamentos até as precauções que devem ser tomadas pelos profissionais e a forma como o lixo será descartado. O conceito de biossegurança se complementa com o de biosseguridade, isto é, o conjunto de medidas de proteção de uma instituição e dos trabalhadores necessárias para evitar a perda, o roubo, o uso incorreto ou a liberação intencional de patógenos e toxinas (bioterrorismo). Um exemplo é o envio de carta com antraz depois do atentado das Torres Gêmeas em Nova York (2001), mas existem outros relacionados com aspectos econômicos, tais como a disseminação de pragas agrícolas do café, do cacau, da soja etc FIGURA 3.3. Logotipos utilizados como indicação de risco biológico Biossegurança Biosseguridade 29

40 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) OS MICRORGANISMOS COMO AGENTES BIOLÓGICOS A Tabela 3.5 apresenta uma lista dos principais agentes biológicos microbianos e suas utilizações TABELA 3.5. Principais destaques entre os agentes biológicos microbianos ARQUEOBACTÉRIAS Thermus aquaticus Bactérias metanogênicas UTILIZAÇÃO Isolada em uma poça do parque nacional de Yellowstone (Estados Unidos), esta bactéria produz uma enzima que copia o DNA a uma temperatura alta. Esta enzima permite obter milhões de cópias de um fragmento de DNA em um processo automatizado que revolucionou a Biotecnologia, chamado PCR (Polymerase Chain Reaction ou Reação em cadeia da polimerase). Vivem em lugares onde há ausência de oxigênio, seja no tubo digestivo de alguns animais (gado, cupins) ou nos pântanos. Estas bactérias transformam o acetato resultante da degradação de celulose por outras bactérias em metano, um gás combustível. ALGAS Spirulina Dunaliella UTILIZAÇÃO O seu alto teor proteico, que corresponde a 60% do peso seco, lhe confere um elevado valor nutritivo; as proteínas representam aproximadamente 2% do peso seco da batata e 6-10% do trigo. Quando da chegada dos espanhóis, os astecas já preparavam umas bolachas (tecuitlatl) com a Spirulina coletada no lago Texcoco. Na África, no lago Tchad, ainda hoje ela é coletada e consumida como alimento. Spirulina, assim como Chlorella, são vendidas em tabletes como complemento nutritivo. Acumula glicerol em condições de alta salinidade, com o qual consegue evitar a desidratação. Pode crescer no Mar Morto, sendo também cultivada em tanques ou lagoas, perto do Mar Vermelho, para a extração de outros produtos metabólicos (glicerol e -caroteno). FUNGOS Saccharomy ces cerevisiae Aspergillus Penicillium UTILIZAÇÃO Conhecido como levedo de cerveja ou levedura, é utilizado na preparação de alimentos (pão, biscoitos, fermento de padaria) e de bebidas (cerveja, vinho e destilados), assim como na produção de outras substâncias de importância industrial (etanol, vitaminas e outros metabólitos). A levedura cresce facilmente em laboratório. Também pode ser manipulada geneticamente. Nos fermentadores ou biorreatores industriais, onde se multiplica rapidamente a partir de matérias-primas de baixo custo, ela permanece ativa durante períodos longos e, ao concluir o processo, pode ser separada por filtração ou centrifugação. Com de pares de bases e genes em 16 cromossomos, Saccharomyces cerevisiae foi, em 1997, o primeiro organismo eucariótico a ter o seu genoma sequenciado. Algumas espécies alcançam grande importância industrial, como A.niger, utilizada para a produção de ácido cítrico ou de enzimas (em linhagens modificadas geneticamente). Algumas espécies são utilizadas na indústria farmacêutica (penicilina) ou indústria de alimentos (queijos azuis, como o Roquefort e o Gorgonzola; queijo Camembert). 30

41 OS MICRORGANISMOS EUBACTÉRIAS Bactérias lácticas Bacillus thuringiensis Streptomyces Pseudomonas Agrobacterium tumefaciens Bactérias butíricas Escherichia coli UTILIZAÇÃO Os gêneros Lactobacillus e Streptococcus são responsáveis por vários processos, tais como a elaboração de queijos e de iogurtes, o envelhecimento dos vinhos, a conservação de alimentos (sauerkraut ou repolho fermentado, silagem para o gado); a produção de ácido láctico, um aditivo utilizado na indústria de alimentos como acidulante e estabilizante. Este microrganismo prolifera no solo e na superfície das plantas, sintetizando uma toxina fatal para as larvas de insetos. Esta é produzida comercialmente há mais de 40 anos, representando 90% das vendas de inseticidas biológicos e reduzindo a necessidade de aplicação de pesticidas químicos nas lavouras. Nos últimos anos, o gene codificador da toxina tem sido transferido a plantas (algodão, milho) para que estas sintetizem diretamente o inseticida. Além do cheiro característico da terra removida, este gênero de bactérias do solo produz substâncias antibióticas (estreptomicina, tetraciclina, eritromicina), antifúngicas (nistatina), herbicidas, antitumorais e supressoras de rejeição a transplantes. Várias linhagens são utilizadas na eliminação de poluentes. Algumas quebram moléculas de hidrocarbonetos, como os existentes nos acidentes de derramamento de petróleo; outras podem remover o mercúrio aquático. Agente patogênico para as plantas dicotiledôneas que desenvolvem um tumor ou galha quando infectadas. Com a remoção de um gene, perde a capacidade de provocar tumores, conservando a capacidade infecciosa, utilizada na engenharia genética de vegetais. Na indústria têxtil, Clostridium butiricum libera as fibras vegetais durante a maceração do cânhamo e do linho. Clostridium acetobutyricum é utilizado na produção industrial de acetona e butanol. Clostridium botulinum produz uma toxina poderosíssima; calculase que um grama desta bastaria para matar um milhão de pessoas. A ingestão de conservas contaminadas e mal esterilizadas resulta quase sempre em um desfecho fatal. Devido a sua ação inibitória da contração muscular, a toxina botulínica é utilizada em concentrações muito pequenas, para reduzir as rugas e marcas de expressão durante certo tempo (efeito cosmético). Descoberta em 1855, esta bactéria Gram-negativa vive no trato digestivo do homem e de outros animais. Tem forma de bastonete (0,002 mm de comprimento, 0,0008 mm de diâmetro), 1 a 4 moléculas de DNA e a ribossomos. Flagelos e pelos permitem que se movimente rapidamente. Algumas linhagens são patogênicas, podendo contaminar os alimentos (carne, leite, vegetais), que devem ser cozidos adequadamente. Os seus requerimentos nutricionais básicos são simples. Água, sais minerais, uma fonte de nitrogênio e uma fonte de energia. Em condições adequadas, se divide a cada minutos; também pode se reproduzir de maneira sexuada (conjugação). Devido à facilidade com que ela pode ser cultivada no laboratório, Escherichia coli tem se tornado uma ferramenta indispensável para estudos bioquímicos e genéticos, incluindo a Engenharia Genética. O seu genoma compreende 4,6 milhões de pares de bases que codificam em torno de proteínas diferentes. A introdução de transgenes em Escherichia coli K12, uma linhagem inofensiva de laboratório, possibilitou os primeiros processos de produção de insulina, de interferon e de hormônio de crescimento. Entretanto, por se tratar de uma célula procariótica, nem sempre é a melhor opção de "fábrica" para a síntese de produtos de origem animal ou vegetal, tendo sido aos poucos substituída por outras células eucarióticas, como a levedura. 31

42 C A P Í T U L O 4 ENZIMAS E ANTICORPOS AS PROTEÍNAS Todos os organismos estão formados por água e moléculas de diversos tipos, inorgânicas e orgânicas (Figura 4.1). Entre estas últimas, há um grupo de macromoléculas, as proteínas, que participam em numerosas atividades, cumprindo um papel fundamental para os seres vivos (Tabela 4.1). Pertencem a este grupo as enzimas, moléculas de ação catalítica, e os anticorpos, moléculas que participam na defesa do organismo FIGURA 4.1. A composição química de uma bactéria Íons, moléculas pequenas (4%) Fosfolipídios (2%) DNA (1%) Outras moléculas (30%) RNA (6%) MACROMOLÉCULAS Água (70%) Proteínas (15%) Polissacarídeos(2%) TABELA 4.1. As funções das proteínas no organismo FUNÇÃO Componentes estruturais Substâncias de reserva Ação catalítica Outras EXEMPLOS Queratina do cabelo, colágeno da derme, actina e miosina das fibras musculares. Albumina do ovo, caseína do leite. Enzimas que controlam as reações químicas celulares. Transmissão de informação (hormônios proteicos), participação nos mecanismos de defesa (anticorpos, citocinas), transporte e armazenamento de pequenas moléculas (hemoglobina). BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

43 ENZIMAS E ANTICORPOS FIGURA 4.2. Aminoácidos e proteínas A. Fórmula dos aminoácidos AMINOÁCIDO 1 AMINOÁCIDO 2 Grupo carboxila Grupo carboxila Grupo amino Grupo amino Cadeia lateral Cadeia lateral B. Formação da união peptídica Aminoácido 1 Aminoácido 2 União peptídica C. Estrutura de uma proteína Aminoácidos Folha pregueada Hélice (Conformação β) (Conformação α) α hélice Folha pregueada ESTRUTURA PRIMÁRIA ESTRUTURA SECUNDÁRIA ESTRUTURA TERCIÁRIA ESTRUTURA QUATERNÁRIA ESTRUTURA As proteínas são macromoléculas formadas por 20 aminoácidos diferentes, que se distinguem por ter, unidos ao átomo de carbono, um grupo amino (básico), um grupo carboxila (ácido) e um radical variável (Figura 4.2 A). A presença de um carbono assimétrico resulta em duas formas moleculares (L) e (D) que diferem por suas propriedades ópticas. Os aminoácidos que compõem as proteínas correspondem à forma (L). A reação de condensação entre o grupo carboxila de um aminoácido e o grupo amina de outro cria uma ligação peptídica (Figura 4.2 B). A união de vários aminoácidos forma uma cadeia peptídica que se caracteriza não só pelo número e tipo de aminoácidos que a compõem, como pela sequência em que estes se encontram, denominada estrutura primária. Ao se estabelecerem ligações entre os grupos que formam os enlaces peptídicos, a cadeia adota uma estrutura regular ou estrutura secundária, geralmente em forma de hélice ou de folha. As interações entre as cadeias laterais dos aminoácidos causam o dobramento da proteína, resultando uma configuração espacial que é chamada de estrutura terciária. A forma final de uma proteína dependerá ainda da associação entre vários polipeptídios, no que se denomina de estrutura quaternária (Figura 4.2 C). Quando sintetizada dentro da célula, uma proteína adotará espontaneamente a configuração 33

44 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) espacial que decorre de sua estrutura primária. Fatores ambientais como o ph, a concentração salina ou a temperatura podem causar alterações momentâneas ou definitivas na forma da molécula. O PROTEOMA Uma das grandes surpresas reveladas pelos estudos do genoma humano foi encontrar um número baixo de genes codificadores de proteínas, inferior ao esperado quando considerada a diversidade de proteínas necessárias para o funcionamento celular. Diferentes tipos de processamento no núcleo e modificações das proteínas no citoplasma explicam como, a partir do pequeno número de genes conhecido, se formam todas as proteínas necessárias. Essas observações chamaram a atenção sobre o proteoma, definido como o conjunto de proteínas que uma célula, um tecido ou um organismo expressam em um momento dado, sob determinadas condições. Também deram origem a uma nova disciplina, a proteômica. Diferente do genoma que permanece essencialmente constante no tempo e em todas as células do organismo, o proteoma abrange uma infinidade de variantes proteicas, diferentes em cada célula e a cada momento. Publicado em 2014, o primeiro rascunho do proteoma humano identificou os produtos correspondentes a 84% dos genes codificadores de proteínas, que representam 1,5% do genoma. As aplicações da proteômica abrangem desde os estudos estruturais para elaborar modelos tridimensionais até a identificação das proteínas associadas a uma organela, descobrindo sua função e sua relação com outras proteínas. Também compreendem estudos da expressão quali e quantitativa das proteínas em duas condições, uma normal e a outra alterada por stress ou doença. Na área de saúde, as modificações do proteoma em células normais e cancerosas possibilitam a identificação de biomarcadores para diagnóstico e monitoramento dos tratamentos. Em agronomia, a proteômica pode esclarecer a inter-relação patógeno-hospedeiro nas infecções microbianas ou na resposta das plantas aos animais herbívoros. Na área de microbiologia possibilita o controle de qualidade nas diferentes etapas de produção de alimentos, com ênfase em aspectos de biossegurança. AS BASES DE ALGUMAS TÉCNICAS LABORATORIAIS O estudo das proteínas depende do objetivo a alcançar. Se este for simplesmente a obtenção de uma proteína para pesquisa ou uso comercial, as etapas a seguir envolverão sua separação, purificação e medida da concentração e/ou quantidade obtida. As técnicas bioquímicas utilizadas são clássicas e dependem dos recursos disponíveis. Mas se o objetivo for a determinação das estruturas primária, secundária e terciaria dessa proteína, as técnicas são bem mais complexas. CROMATOGRAFIA A cromatografia permite separar as substâncias de uma mistura com fins analíticos e preparativos. Está baseada na migração diferencial das moléculas de uma mistura, colocada em uma fase móvel, sobre um suporte estacionário ou matriz (Figura 4.3). A separação obedece a três tipos de mecanismos: o Troca iônica. A matriz está formada por pequenas partículas carregadas que retêm as moléculas de carga contrária. Como a associação depende de fatores como o ph e a força iônica da solução, a modificação destes fatores permite controlar a separação. o Filtração em gel. A matriz consiste em partículas porosas que separam as proteínas em função de seu tamanho, como uma peneira molecular. o Afinidade. As partículas da matriz estão unidas por ligações covalentes a moléculas (enzimas, anticorpos) que interagem com a proteína de interesse. Para liberar a proteína retida na coluna, muda-se o ph ou a concentração salina. Desse modo, consegue-se a proteína purificada. 34

45 ENZIMAS E ANTICORPOS FIGURA 4.3. Cromatografia em coluna O processo está baseado na velocidade de migração diferencial das moléculas proteicas em uma matriz imersa em um solvente. Amostra Solvente Matriz Saída do solvente Tempo Frações coletadas FIGURA 4.4. Eletroforese Separação dos peptídeos de uma mistura, por migração diferencial em um campo elétrico. Mistura de peptídeos Cátodo Ânodo Aplicação de um campo elétrico Migração e separação dos peptídeos FIGURA 4.5. Difração de raios X Raios X Cristais Difração dos Raios X Filme 35

46 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Diferentes modalidades dependem das características da fase estacionária: cromatografia em papel, em camada delgada, cromatografia em gás, cromatografia líquida etc. Na cromatografia em coluna, a separação das proteínas de uma mistura depende da estrutura da matriz, sólida e permeável, que se encontra imersa em um solvente. A resolução é maior com a técnica denominada HPLC (do inglês, High-Pressure Liquid Chromatography), que separa os aminoácidos de uma mistura. ELETROFORESE Uma técnica analítica fundamental é a eletroforese, baseada na migração diferencial de moléculas ionizadas colocadas em um campo elétrico. Se a carga for positiva, elas migrarão para o polo negativo ou cátodo e, inversamente, se ela for negativa, a migração ocorrerá na direção do polo positivo ou ânodo (Figura 4.4). Por outro lado, moléculas de menor peso molecular migram mais rapidamente que moléculas maiores. Se uma mistura de peptídeos for colocada em um campo elétrico, eles migrarão de acordo com sua carga, forma e tamanho, formando cada um deles uma banda característica que será visualizada mediante um corante ou uma reação química específica. Observe-se que a carga de um peptídeo resulta da soma das cargas correspondentes aos grupos amina e carboxila terminais e dos radicais dos aminoácidos que o compõem, e que essa carga varia com o ph do meio. A eletroforese permite separar os componentes de uma mistura. Existem numerosas variações da técnica em função do suporte (papel de filtro, sílica-gel, membranas de acetato de celulose, gel de agarose, amido ou poliacrilamida), da disposição da cuba (horizontal ou vertical), da direção da migração (unidirecional ou bidirecional) etc. Na variante SDS-PAGE (do inglês SDS-Polyacrilamide Gel Electrophoresis), por exemplo, as proteínas desnaturalizadas com dodecilsulfato de sódio (SDS) migram em um gel de poliacrilamida. OUTRAS TÉCNICAS Utilizando métodos de ionização adaptados às moléculas biológicas como o MALDI (do inglês, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization), a espectrometria de massa se tornou nos últimos anos uma ferramenta indispensável na identificação de proteínas, por comparação da massa molecular com outras de um banco de dados. Também fornece uma análise estrutural da molécula, indicando a sequência de aminoácidos. A espectrometria de massa permite estudar o conjunto de proteínas de um organismo (proteoma) e dissecar as interações das proteínas com outras moléculas. Por ser um método automatizado e rápido, tem alcançado múltiplas aplicações em farmacologia e diagnóstico. Os métodos mais adequados para determinar a estrutura tridimensional das proteínas são a ressonância magnética nuclear (NMR) e a cristalografia de raios X. O primeiro revela a estrutura atômica tridimensional de uma macromolécula em uma amostra em solução, aplicando um campo magnético e interpretando o espectro resultante. O segundo fornece uma imagem digital tridimensional da molécula, baseada na difração dos raios X ao atravessar um cristal (Figura 4.5). A bioinformática é uma ferramenta fundamental para a modelagem molecular e a interpretação dos dados. Existem hoje bases de dados de sequências de proteínas de diferentes organismos que permitem a identificação de moléculas e a comparação de sequências similares. 36

47 ENZIMAS E ANTICORPOS AS ENZIMAS A CATÁLISE ENZIMÁTICA As reações químicas que ocorrem nos seres vivos dependem da atividade catalítica de um tipo de proteínas, as enzimas. Estas moléculas agem diminuindo a energia de ativação necessária de uma reação química, sendo capazes de promovê-las e acelerá-las, sem ser alteradas ou destruídas. A molécula de enzima reconhece um substrato específico (S), formando com ele um complexo molecular ou estado de transição (SE). O encaixe no sítio ativo da molécula facilita a transformação do substrato no(s) produto(s) da reação (P). A enzima é recuperada no fim da reação, podendo atuar inúmeras vezes (Figura 4.6). A reação pode ser representada como a seguir: S + E SE P + E A primeira característica das enzimas é a especificidade; uma enzima como a lactase, que opera sobre a lactose, não agirá sobre a sacarose; duas enzimas que hidrolisem o amido poderão fazê-lo cortando a molécula de maneira diferente, como a -amilase e a -amilase. A segunda é que, em função de sua origem biológica, as enzimas são biodegradáveis e agem em condições brandas de temperatura e ph. A ação enzimática depende do ph, da temperatura, da presença de cofatores inorgânicos (zinco, ferro, cobre) e/ou orgânicos (coenzimas, muitas das quais são vitaminas). Os metais pesados alteram a estrutura molecular da enzima de maneira irreversível, impedindo sua ação catalítica (desnaturação). Uma inibição da atividade enzimática ocorre quando moléculas muito parecidas com o substrato competem com este para ocupar o sítio ativo da enzima (inibição competitiva), ou quando outras moléculas se ligam a determinadas partes da enzima, alterando a estrutura espacial e dificultando o encaixe com o substrato (inibição não competitiva). OS DIVERSOS TIPOS DE ENZIMAS Uma forma de classificar as enzimas é pelo tipo de reação que catalisam, acrescentando o sufixo ase ao nome do substrato que é transformado: protease, lactase, amilase, lipase, celulase. Também se pode adicionar ase ao nome da reação catalisada: hidrolase, oxirredutase. Quando combinadas as duas regras anteriores, mencionam-se o nome do substrato e da reação catalisada adicionando ase como, por exemplo, em DNA-polimerase. Porém, algumas enzimas, como a renina ou a trombina, conservam seus nomes tradicionais (Tabela 4.2). IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DAS ENZIMAS As enzimas apresentam numerosas vantagens quando utilizadas como agentes biológicos em processos tecnológicos: especificidade, operação em condições facilmente controláveis e biodegradabilidade. De um modo geral, os tratamentos enzimáticos diminuem a carga poluidora dos efluentes industriais. O mercado se distribui fundamentalmente entre as proteases (59%), as carboidrases (28%) e as lipases (3%), três grandes conjuntos de enzimas que são utilizadas por diversas indústrias; os 10% restantes do mercado correspondem às enzimas analíticas e farmacêuticas (Tabela 4.3). Nos sabões lava-roupas, as enzimas prometem ao consumidor roupas limpas e com aparência de novas. Um exército constituído por proteases, amilases e lipases digere as manchas difíceis (sangue, leite, molho de tomate, capim, chocolate, batom etc.), enquanto que as celulases removem as microfibrilas de celulose das roupas. 37

48 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Não sendo mais necessário esfregar as manchas, a limpeza se realiza com pouco esforço e sem desgaste do tecido; como estas moléculas trabalham a temperaturas baixas, o consumo de energia é menor. Com mais uma vantagem para o fabricante: as enzimas não representam mais que uma fração muito pequena do sabão (0,4-0,8%), correspondente a 1% do seu custo. Em 1988, a empresa Novozymes introduziu no mercado de detergentes a primeira enzima degradadora de lipídios (Lipolase), obtida por engenharia genética. As enzimas são empregadas também no acabamento de roupas. Para conseguir o aspecto usado, os jeans eram lavados com pedras (stone washed), um processo que tinha o inconveniente de causar a abrasão da maquinaria e o desgaste do tecido. Nos últimos anos, as pedras foram substituídas por celulases, com resultados satisfatórios. Os curtumes, em vez de excrementos de cachorro ou de pombo, se valem hoje de enzimas pancreáticas para amaciar e desengordurar as peles. Na indústria de alimentos e bebidas, as enzimas participam na produção de adoçantes, de pão, biscoitos e bolachas e de queijos. Na extração de sucos de frutas, as pectinases aumentam substancialmente o rendimento do processo, ao liberar o suco retido na pectina das paredes celulares vegetais. Também facilitam a clarificação de vinhos e cervejas FIGURA 4.6. O mecanismo da atividade enzimática A. O modelo chave-fechadura Substrato Produtos Enzima Complexo enzima-substrato Enzima B. A enzima diminui a energia de ativação Reação sem enzima Energia de ativação (sem a enzima) Energia de ativação Reagente Reação (com a enzima) com enzima Nível inicial de energia Nível final de energia Produtos 38

49 ENZIMAS E ANTICORPOS As enzimas são utilizadas em desodorantes e artigos para a higiene bucal. Em dermatologia e cosmética, algumas das aplicações mais frequentes estão no combate ao envelhecimento (proteases, lipases), no tratamento de acne e de caspa, no desbridamento e limpeza de ferimentos infetados e na destruição de tecidos necrosados. Como medicamentos, as enzimas são utilizadas em vários contextos, especialmente em quimioterapia e nas terapias trombolíticas. E muitos entre os mais corriqueiros testes de diagnóstico dependem de reagentes enzimáticos. As enzimas permitem a resolução de misturas de moléculas racêmicas, nas que há duas formas isoméricas, tipo mão direita e mão esquerda, com diferente atividade biológica. Desse modo, poderão ser evitados problemas como o da talidomida, um medicamento que causou o nascimento de numerosos bebês com deformações congênitas, na década de A tragédia teria sido consequência da presença no produto comercial da forma molecular tipo mão direita, de ação teratogênica, junto ao tipo mão esquerda, de ação calmante. Atualmente, estão sendo estudados métodos enzimáticos para eliminar os príons responsáveis pela denominada doença da vaca louca. Também se cogita a utilização de enzimas para limpar áreas contaminadas com agentes químicos como o gás sarin TABELA 4.2. A classificação internacional das enzimas CLASSE TIPO DE REAÇÃO CATALISADA EXEMPLOS Oxirredutases Reações onde se transferem elétrons. Desidrogenases, oxidases. Transferases Reações onde se transferem grupos químicos. Transaminases, fosforilases. Hidrolases Liases Isomerases Ligases Reações de hidrólise, isto é, de transferência de grupos funcionais para a água. Adição de grupos a duplas ligações ou formação de duplas ligações por eliminação de grupos. Produção de isômeros por transferência de grupos dentro de moléculas. Formação de ligações C-C, C-S, C-O e C-N por reações de condensação. Proteases, carboidrases, peptidases, lipases. Decarboxilases (renina, trombina). Isomerases, mutases. Sintetases. TABELA 4.3. As enzimas como agentes biológicos AGENTES BIOLÓGICOS ENZIMAS APLICAÇÕES Indústria de alimentos e bebidas (clarificação de vinhos e sucos de frutas, substituição da maltagem pelo tratamento do amido na elaboração de cervejas, fabricação de pão, biscoitos e bolachas, produção de adoçantes, fabricação de laticínios, suplementação de rações animais). Produtos de limpeza (detergentes e lava-roupas para a remoção de manchas difíceis, produtos para limpar dentaduras e lentes de contato). Indústria têxtil (desengomado de tecidos, acabamento de jeans). Curtumes (amaciamento de couros). Indústrias de papel e celulose (branqueamento de polpa de celulose). Cosmética (produtos de higiene bucal, depilatórios, tratamento da acne e da caspa, cosmocêuticos em geral). Indústria farmacêutica (reagentes para uso em análises clínicas, nucleases para a manipulação gênica, bioconversões). Tratamentos médicos (combate de inflamações, edemas e lesões; dissolventes de coágulos sanguíneos; agentes terapêuticos em transtornos digestivos). 39

50 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) OS ANTICORPOS Assim como os animais vertebrados, os invertebrados e as plantas devem se proteger do ataque de parasitas (vírus e bactérias) e da proliferação de células estranhas ou aberrantes. Também devem reparar órgãos e tecidos de modo a conservar sua integridade. Estudos recentes indicariam que todos os seres vivos apresentam algum tipo de resposta imune inata e adquirida. Dentro da estratégia de defesa de um vertebrado, os anticorpos são proteínas fundamentais no reconhecimento do eu e na eliminação do não eu (antígeno). Uma parte importante da resposta imune envolve a produção de anticorpos que reconhecem o antígeno, desencadeando os mecanismos de destruição adequados. A REAÇÃO ANTÍGENO- ANTICORPO Os anticorpos são proteínas globulares (PM ) que contém um número pequeno de grupos carboidrato presentes no soro e em outros fluidos dos vertebrados. Sua produção é induzida quando o sistema linfoide do indivíduo entra em contato com um antígeno (Ig = imunoglobulinas). Existem diferentes tipos de imunoglobulinas que cumprem funções diferentes no organismo, mas, devido a sua importância como agentes biológicos de importância para as biotecnologias, neste texto nos referiremos aos anticorpos contidos na fração proteica do soro sanguíneo caracterizada por eletroforese como -globulina. A molécula de IgG é formada por duas cadeias polipeptídicas leves e duas pesadas em forma de Y, ao qual se associa um pequeno número de grupos carboidrato. Uma parte da molécula é constante; as regiões variáveis localizadas nas extremidades dos braços do Y respondem pelo reconhecimento do antígeno (Figura 4.7). Em condições experimentais de laboratório, essa reação antígeno-anticorpo ocorre quando os reagentes se encontram em meio líquido e nas concentrações adequadas, sendo visualizada como uma precipitação, se os antígenos estiverem dissolvidos em um meio líquido ou em um gel (poliacrilamida) ou uma aglutinação, se os antígenos estiverem localizados sobre partículas (hemácias ou bactérias). A união antígeno-anticorpo ocorre quando um anticorpo encontra no antígeno uma forma complementar, geralmente parte de uma molécula livre ou ancorada na membrana celular. Um antígeno pode ter várias destas formas (epítopos ou determinantes antigênicos) e ser reconhecido por anticorpos diferentes (Figura 4.8) FIGURA 4.7. A estrutura da molécula de anticorpo (IgG) Cadeia leve Sítio de ligação com o antígeno Cadeia pesada Região constante Região variável 40

51 ENZIMAS E ANTICORPOS A PRODUÇÃO DE ANTICORPOS NO ORGANISMO As células responsáveis pela produção de anticorpos são os linfócitos B, que se formam na medula óssea. Depois de um processo de diferenciação que envolve uma série de rearranjos genéticos, cada linfócito pode reconhecer um único epítopo (Figura 4.9). Ao encontrar o epítopo específico, o linfócito B prolifera, originando um clone de células secretoras de anticorpos. Uma vez eliminado o antígeno, algumas células desse clone permanecerão no organismo como células-memória. Em um contato posterior com o mesmo epítopo, as célulasmemória darão início à resposta imune, que será mais rápida e mais intensa que a primeira. Apesar de cada linfócito ser capaz de reconhecer um único epítopo, todos os linfócitos podem reconhecer aproximadamente 10 8 epítopos diferentes, o que explica a eficiência da resposta imune FIGURA 4.8. Os anticorpos e o reconhecimento do antígeno Observe-se que, ao compartilhar estruturas (determinantes antigênicos ou epítopos), alguns antígenos podem ser reconhecidos por um mesmo anticorpo, dando origem a uma reação cruzada. Antígeno 1 Antígeno 2 Anticorpos Anticorpos Antígeno 3 Antígeno 4 Anticorpos Anticorpos FIGURA 4.9. O encontro do linfócito B e do antígeno, e a seleção clonal Antígeno Linfócitos B de diferente especificidade Seleção do linfócito específico Proliferação celular e secreção do anticorpo correspondente 41

52 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A PRODUÇÃO DE ANTICORPOS NO LABORATÓRIO Os anticorpos ocupam um lugar de destaque nos testes de diagnóstico clínico, por reunir duas propriedades que os transformam em uma ferramenta ideal: especificidade e diversidade. A injeção de animais (ratos, ovelhas, coelhos) com um antígeno induz em pouco tempo a produção de anticorpos específicos que podem ser separados do soro sanguíneo do animal FIGURA A produção de anticorpos no laboratório. Obtenção de anticorpos policlonais B. Obtenção de anticorpos monoclonais Injeção de uma mistura de moléculas Linfócitos B Células de mieloma Hibridomas A: A produção de anticorpos policlonais. Recolhe-se o soro de um animal imunizado contra uma mistura de moléculas entre as quais está a molécula X. No soro se encontrarão misturados anticorpos de diferente especificidade, um dos quais reconhece X. Cada hibridoma origina um clone B: A produção de anticorpos monoclonais. Injeta-se em um animal a mesma mistura de moléculas; dias mais tarde, extrai-se o baço do animal e fusionam-se os linfócitos B (alguns dos quais reconhecem a molécula X) com células de mieloma. Os hibridomas são separados, cultivados e testados para identificar os que produzem anticorpos contra X. Cada clone origina um único tipo de anticorpo 42

53 ENZIMAS E ANTICORPOS FIGURA Os ensaios imunológicos A. Associação dos anticorpos com moléculas fluorescentes O anticorpo marcado pode reconhecer diretamente o antígeno (reação direta) ou reconhecer o anticorpo unido ao antígeno (reação indireta). REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA Antígeno Anticorpo específico do antígeno, associado a uma molécula fluorescente REAÇÃO DE IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA Antígeno Anticorpo Anticorpo específico para a fração específico constante dos anticorpos, associado do antígeno a uma molécula fluorescente B. Associação dos anticorpos com enzimas O antígeno pode ser reconhecido por um anticorpo associado a uma enzima que reage com o seu substrato, formando um produto colorido (reação direta). Também pode ser reconhecido por um anticorpo específico, e este por um anticorpo que reconhece a fração constante do anticorpo. O segundo anticorpo está associado a uma enzima que, ao reagir com o seu substrato específico, forma um produto colorido (reação indireta). REAÇÃO IMUNOENZIMÁTICA DIRETA Substrato específico da enzima Antígeno Anticorpo específico Formação de um produto do antígeno, associado à enzima colorido REAÇÃO IMUNOENZIMÁTICA INDIRETA Substrato específico da enzima Antígeno Anticorpo Anticorpo específico para a específico fração constante dos anticorpos, Formação de um produto do antígeno associado à enzima colorido 43

54 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Se o antígeno utilizado possuir vários epítopos, no soro extraído se encontrará uma mistura de anticorpos, chamados policlonais, resultantes da ativação de vários clones de linfócitos B, cada um dos quais reconhece um dos epítopos do antígeno. Observe-se que, além dos anticorpos específicos, o soro também terá anticorpos contra eventuais impurezas do antígeno, e anticorpos contra outros antígenos aos que o animal esteve exposto anteriormente. Em consequência, a purificação de um soro será um processo longo e complexo a ser repetido a cada extração de sangue do animal. Contudo, reagentes de laboratório deste tipo foram utilizados normalmente até a década de Não é possível cultivar separadamente os linfócitos porque sobrevivem pouco tempo in vitro. A obtenção de clones que sintetizem anticorpos específicos contra um único epítopo (monoclonais) só se tornou possível com o desenvolvimento da tecnologia de hibridomas (G. Kohler e C. Milstein, 1975). Um hibridoma resulta da fusão entre um linfócito B e uma célula cancerosa de mieloma. Reunindo as propriedades de ambas as células, cada hibridoma é capaz de sintetizar um único tipo de anticorpo (monoclonal) e de se multiplicar indefinidamente no laboratório, seja em cultivo de tecidos, seja na cavidade do peritoneu de um animal hospedeiro (Figura 4.10). A UTILIZAÇÃO DOS ANTICORPOS Os anticorpos monoclonais encontraram imediatamente aplicações, substituindo praticamente os anticorpos policlonais, tanto na purificação de biomoléculas e células como nos testes de diagnóstico clínico ou ambiental ou no controle de qualidade dos alimentos. Anticorpos específicos fixados nas partículas de uma coluna de afinidade permitem separar moléculas de uma mistura que circule por ela. Outra utilização extremamente engenhosa está na separação de populações celulares em um aparelho denominado cell sorter. As células são marcadas com anticorpos ligados a uma molécula fluorescente; ao passar através de raios laser, adquirem cargas elétricas, sendo separadas mediante uma placa defletora do equipamento. A visualização da reação entre o antígeno e o anticorpo se vê facilitada quando o anticorpo recebe alguma marcação direta, fluorescente ou radiativa, ou indireta, por associação com uma enzima que, em presença do substrato correspondente, forma um produto colorido. No Western blotting, por exemplo, um anticorpo marcado reconhece a presença de uma proteína determinada em uma amostra, após eletroforese e transferência a uma membrana de nitrocelulose. Associados a uma molécula radiativa, os anticorpos são utilizados na dosagem de substâncias presentes nos fluidos corporais, sendo quantificada a radioatividade por exposição de uma placa sensível. Em cortes histológicos, o antígeno é localizado pelos anticorpos acoplados a uma molécula fluorescente que possa ser identificada microscopicamente (Figura 4.11). A obtenção de anticorpos contra a fração constante da molécula de anticorpos humanos representa um avanço considerável na produção de reagentes para o diagnóstico clínico. Nos ensaios imunoenzimáticos como o teste ELISA (do inglês, Enzyme-linked Immunosorbent Assay), que detecta anticorpos específicos no soro humano e tem numerosas aplicações em diagnóstico, utilizam-se os anticorpos acoplados a uma enzima que reage com o seu substrato, formando um produto colorido (Figura 4.11). A utilização de anticorpos monoclonais com fins terapêuticos demorou muito mais que o esperado. Sendo produzidos por células de camundongo ou de rato, eles são reconhecidos como estranhos quando injetados no homem, formando-se complexos imunes que lesionam gravemente os rins. A fim de evitar essas reações, começaram a ser elaborados anticorpos monoclonais quiméricos (33% de proteína animal) e humanizados (10% de proteína animal). Estes conservam parte das sequências animais, especialmente nas partes que reconhecem o antígeno, sendo o restante da molécula substituído por sequências humanas. A obtenção de anticorpos monoclonais humanos mediante técnicas de engenharia genética abre novos caminhos para o diagnóstico e o tratamento de doenças (Tabela 4.4). 44

55 ENZIMAS E ANTICORPOS TABELA 4.4. Os anticorpos como agentes biológicos AGENTES BIOLÓGICOS APLICAÇÕES Purificação de moléculas. Anticorpos Reagentes de laboratório. Reagentes para diagnóstico. Imunoterapias. 45

56 C A P Í T U L O 5 OS ÁCIDOS NUCLEICOS OS ÁCIDOS NUCLEICOS Embora descobertos em 1869, por F. Miescher, no pus das bandagens de ferimentos, o papel dos ácidos nucleicos (DNA e RNA) na hereditariedade e no controle da atividade celular começou a ser esclarecido apenas em meados do século XX. O ácido desoxirribonucleico (DNA) carrega em sua estrutura as instruções necessárias para a construção de um organismo, direcionando o desenvolvimento de suas características bioquímicas, fisiológicas, anatômicas e, inclusive, algumas das comportamentais. Nos cromossomos o DNA se encontra associado a diversas proteínas de importante ação regulatória. O ácido ribonucleico (RNA) pode ser encontrado tanto no núcleo como no citoplasma. As células procarióticas contêm um cromossomo circular de DNA e uma ou duas moléculas adicionais de DNA extracromossômico, denominadas plasmídeos. Nas células eucarióticas, os cromossomos estão formados por moléculas lineares de DNA. O DNA está localizado principalmente dentro do núcleo celular, mas há também DNA em algumas organelas, como os cloroplastos e as mitocôndrias. Do ponto de vista químico, os ácidos nucleicos (ácido ribonucleico e desoxirribonucleico) são macromoléculas formadas por unidades chamadas nucleotídeos, unidos por ligações químicas covalentes (Figura 5.1). Um nucleotídeo resulta da associação de três tipos de elementos: uma molécula de ácido fosfórico, um açúcar de cinco carbonos (ribose ou desoxirribose) e uma base cíclica nitrogenada: adenina, citosina, guanina, timina ou uracila. Da união dos nucleotídeos entre as extremidades 5' e 3', formam-se as cadeias de polinucleotídeos. A DUPLA HÉLICE Já na década de 1940, vários trabalhos indicavam que o material responsável pela hereditariedade era o DNA, mas não se entendia como até 1953, quando J. D. Watson e F. Crick formularam um modelo da estrutura tridimensional do DNA que, segundo suas próprias palavras, apresentava considerável interesse biológico. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

57 OS ÁCIDOS NUCLEICOS No modelo de Watson e Crick, duas cadeias de nucleotídeos formam uma figura parecida com uma escada de corda torcida, a dupla hélice. Nessa escada, o ácido fosfórico e o açúcar são as partes verticais (corrimãos) e as bases nitrogenadas são os degraus (Figura 5.1). As cadeias são antiparalelas, isto é, se uma corre na direção 5' 3' a outra corre na direção 3' 5. Ambas as cadeias estão unidas entre si por pontes de hidrogênio entre as bases, sendo que as ligações ocorrem sempre entre adenina e timina (2 pontes) e entre citosina e guanina (3 pontes). De acordo com o modelo, quando em um filamento a sequência de bases é AGTACG, no outro filamento ela será TCATGC. Como as sequências são complementares, cada filamento pode servir como molde para a síntese de uma nova molécula. E, no momento da divisão celular, cada célula-filha poderá receber uma molécula semelhante à da célula-mãe (Figura 5.2). O CÓDIGO GENÉTICO O funcionamento de uma célula depende, fundamentalmente, de dois tipos de moléculas: os ácidos nucleicos e as proteínas. Ambos estão relacionados, porque segmentos de DNA (genes) codificam a estrutura primária de peptídeo. O código é simples: a cada trinca de bases corresponde um aminoácido FIGURA 5.1. Composição química dos ácidos nucleicos Observe-se a posição dos grupos 3 e 5 no açúcar O FOSFATO Ácido fosfórico Íon fosfato Também representado como O AÇÚCAR Também representado como UM DESOXIRRIBONUCLEOTÍD AS BASES Purinas: adenina (A), guanina (G) na ribose na desoxirribose Pirimidinas: citosina (C), timina (T) e uracila (U) Ao carbono 1 da pentose Ao carbono 1 da pentose 47

58 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA 5.2. A molécula de DNA Na molécula de DNA, o pareamento das bases ocorre sempre entre uma purina e uma pirimidina: adenina e timina ou uracila; guanina e citosina. Na duplicação, a síntese de duas moléculas semelhantes permite que cada célula receba uma cópia do material genético, com as instruções necessárias para a construção e funcionamento do indivíduo. Observe-se que o processo de duplicação envolve numerosas enzimas, sendo bem mais complexo do que está representado. A DUPLA-HÉLICE DE DNA A DUPLICAÇÃO DO DNA Extremidade 3 Nucleotídeo Nucleotídeo Extremidade 5 TABELA 5.1: O código genético Abreviaturas: Asp = Ácido Aspártico; Glu = Ácido Glutâmico; Ala = Alanina; Arg = Arginina; Asn = Asparagina; Cys = Cisteína; Phe = Fenilalanina; Gly = Glicina; Gln = Glutamina; His = Histidina; Ile = Isoleucina; Leu = Leucina; Lys = Lisina; Met = Metionina; Pro = Prolina; Ser = Serina; Tyr = Tirosina; Thr = Treonina; Trp = Triptófano; Val = Valina. PRIMEIRA BASE URACILA (U) CITOSINA (C) ADENINA (A) GUANINA (G) SEGUNDA BASE URACILA (U) CITOSINA (C) ADENINA (A) GUANINA (G) Phe Ser Tyr Cys Phe Ser Tyr Cys Leu Ser Stop Stop Leu Ser Stop Trp Leu Leu Leu Leu Ile Ile Ile Met Val Val Val Val Pro Pro Pro Pro Thr Thr Thr Thr Ala Ala Ala Ala His His Gln Gln Asn Asn Lys Lys Asp Asp Glu Glu Arg Arg Arg Arg Ser Ser Arg Arg Gly Gly Gly Gly TERCEIRA BASE (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G) (U) (C) (A) (G) 48

59 OS ÁCIDOS NUCLEICOS A tabela 5.1 mostra quais aminoácidos correspondem às diferentes trincas de bases ou códons de mrna. Alguns são codificados por uma única trinca, como o triptófano (UGG) ou a metionina (AUG); outros admitem vários códons que geram sinonímia como, por exemplo, a prolina (CCU, CCC, CCA, CCG). O início da sequência é sinalizado por AUG, o códon correspondente a metionina, sendo este aminoácido removido posteriormente; o fim da sequência é sinalizado por UAA, UAG ou UGA, três códons que significam stop. Mudanças na sequência de bases do DNA podem ter como consequência a substituição de um aminoácido por outro. No exemplo da figura 5.3, se GUG for substituído por CGU, no peptídeo correspondente a valina será substituída por leucina. Mas, em função da sinonímia do código, se a trinca GUG for substituída por GUA ou GUC, o aminoácido codificado continuará sendo a valina. Perdas ou adições de uma base modificam o resto da sequência do peptídeo. A frequência com que ocorrem estas pequenas mudanças aumenta em presença de alguns agentes químicos e físicos como a luz ultravioleta e os raios X. A EXPRESSÃO GÊNICA O FLUXO DA INFORMAÇÃO GENÉTICA A informação codificada no DNA é transcrita em uma molécula mensageira que a leva até os ribossomos onde, após a tradução da linguagem dos ácidos nucleicos à linguagem das proteínas, será montado o peptídeo correspondente. Deste modo, se estabelece na célula um fluxo da informação genética que segue em uma direção única: do DNA ao RNA, do RNA ao peptídeo (Figura 5.3) FIGURA 5.3. O fluxo da informação genética DNA Filamento codificador Filamento molde TRANSCRIÇÃO E PROCESSAMENTO r RNA mrna trna + aminoácidos Ribossomo Onde ocorre a síntese TRADUÇÃO Transporta os aminoácidos e os coloca no lugar adequado Peptídeo 49

60 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Uma exceção a esta regra é a dos retrovírus, cujo material hereditário é RNA e que contam com uma enzima (transcriptase reversa) que lhes permite transcrever a informação no sentido RNA DNA. Na síntese de proteínas intervêm, basicamente, um RNA codificador (RNA mensageiro ou mrna) e dois RNAs não codificadores, o RNA ribossômico (rrna) e o RNA de transferência (trna). As células procarióticas e eucarióticas apresentam algumas diferenças em relação às etapas da síntese de proteínas e aos mecanismos de regulação correspondentes (Figura 5.3). No entanto, em ambos os tipos de organismos, a informação genética codificada no DNA é transcrita no mrna e traduzida no ribossomo com a participação dos trnas. O produto final é um peptídeo. CÉLULAS PROCARIÓTICAS Uma bactéria pode contar com aproximadamente genes; nem todos funcionando simultaneamente. Se houver lactose no meio (e faltar glicose), as bactérias sintetizarão aquelas enzimas que possibilitem sua utilização. E se faltar o aminoácido triptófano no meio, produzirão os vários tipos de enzimas necessárias para sintetizá-lo FIGURA 5.4. A organização e regulação dos genes nas células procarióticas O funcionamento do óperon depende da função exercida pelos genes (degradação ou síntese). Por isso, a presença de lactose induz a transcrição do óperon lac, sendo sintetizadas várias enzimas necessárias para degradá-la; em ausência de lactose, o óperon deixa de funcionar. Já no óperon Trp, a presença de triptófano reprime a transcrição das enzimas necessárias para sintetizar esse aminoácido. Óperon Gene Gene Gene regulador promotor operador Genes estruturais Gene 1 Gene 2 Gene 3 Sequência transcrita Fim da transcrição Em alguns óperons, o produto do gene regulador bloqueia a entrada da RNA-polimerase no operador; em outros a desbloqueia FIGURA 5.5. A organização e regulação dos genes nas células eucarióticas As sequências sinalizadoras UTR não são traduzidas. Gene Sequências reguladoras promotoras da transcrição UTR Sequências reguladoras finalizadoras da transcrição UTR DNA Início da transcrição Unidade de transcrição Inclui as sequências iniciais e finais, os éxons e os íntrons Fim da transcrição 50

61 OS ÁCIDOS NUCLEICOS Isso se vê facilitado pela agrupação dos genes correspondentes em baterias (óperons), que são ligadas ou desligadas em conjunto (Figura 5.4), permitindo que a célula se adapte rapidamente e com economia de recursos às condições ambientais. O processo de ligar e desligar envolve três regiões anteriores à sequência codificadora: o promotor, o operador e o regulador. Para iniciar a síntese do mensageiro, a enzima RNA-polimerase deve encaixar no promotor, de onde começará a se deslocar ao longo do gene. O deslocamento depende de proteínas sintetizadas pelo gene regulador, que agem no operador de modo a abrir ou bloquear a passagem. Este sistema regula a indução ou repressão da transcrição da sequência codificadora. Uma bactéria pode contar com aproximadamente genes; nem todos funcionando simultaneamente. Se houver lactose no meio (e faltar glicose), as bactérias sintetizarão aquelas enzimas que possibilitem sua utilização. E se faltar o aminoácido triptófano no meio, produzirão os vários tipos de enzimas necessárias para sintetizá-lo. Isto se vê facilitado pela agrupação dos genes correspondentes em baterias (óperons), que são ligadas ou desligadas em conjunto (Figura 5.4), permitindo que a célula se adapte rapidamente e com economia de recursos às condições ambientais. Na célula procariótica, além dos genes funcionarem em bloco, a síntese proteica começa quando o mrna está ainda sendo transcrito, de maneira que a transcrição e a tradução são simultâneas. Uma sequência específica que não é traduzida indica o sítio de união ao ribossomo. CÉLULAS EUCARIÓTICAS As bactérias não são as únicas que ligam e desligam os seus genes, mas, salvo em nematódeos, não foram achados óperons nas células eucarióticas; os genes responsáveis por uma sequência de reações metabólicas se encontram dispersos em um ou em vários cromossomos. O controle da transcrição começa na compactação do cromossomo em redor das histonas e na metilação de algumas bases, podendo dificultar o acesso da maquinaria de transcrição ao DNA. Esta inclui fatores de ativação, fatores de transcrição e proteínas reguladoras, algumas das quais dependem de outras sequências, estimuladoras e inibidoras, distantes do gene em até vários milhares de bases (Figura 5.5). Fatores externos influenciam a expressão gênica nas células somáticas. No entanto, estudos recentes indicam que esses efeitos epigenéticos podem gerar alterações nos gametas, sendo transmitidos às seguintes gerações. A TRANSCRIÇÃO Ao reconhecer a presença dos fatores e proteínas reguladoras na região anterior ao gene, a RNApolimerase encaixa-se nas sequências promotoras da transcrição. Associada a outros fatores adicionais, a enzima se desloca abrindo a dupla hélice e transcrevendo a sequência codificadora de um ou outro filamento no RNA. A enzima avança na direção 5-3, sendo que várias moléculas de RNApolimerase podem estar transcrevendo o mesmo gene simultaneamente em algo parecido com uma fila indiana. Quando a RNA-polimerase encontra uma sequência finalizadora, a síntese acaba e a molécula de RNA-polimerase será liberada. Regiões denominadas UTR (do inglês untranslated regions), portadoras de sequências sinalizadoras que não serão traduzidas, se localizam a montante e a jusante da unidade de transcrição. As sequências reguladoras levam, além do sítio de união ao ribossomo, outras que podem determinar quando, por quanto tempo e em que células o gene será transcrito. O PROCESSAMENTO DO RNA TRANSCRITO Nos organismos eucarióticos, a estrutura do gene é fragmentada (Figura 5.5). A sequência gênica é transcrita por inteiro no RNA e, posteriormente, um mecanismo de corte e reunião irá eliminar algumas das sequências intercalares. Estas permanecerão no núcleo (íntrons) enquanto as restantes 51

62 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) (éxons) formarão o RNA mensageiro que sairá do núcleo na direção do citoplasma. O número e o tamanho das sequências intercalares variam em diferentes genes. As consequências biológicas deste mecanismo são importantes. Basta um número pequeno de genes para codificar numerosas proteínas que serão sintetizadas utilizando as vias alternativas de corte e reunião. Também permite que um único gene se expresse de maneira diferente em diversos tecidos. O corte e reunião dos fragmentos não é a única modificação do RNA transcrito; este recebe um revestimento inicial ou cap (7-metilguanosina) que o dirigirá ao ribossomo, e uma cauda de poli(a) que lhe dará estabilidade na sua viagem até a maquinaria de tradução. A TRADUÇÃO E O DESTINO DAS PROTEÍNAS A síntese proteica se inicia depois do mrna atravessar a membrana nuclear e migrar para o citoplasma. Assim como a transcrição, a tradução envolve a participação de numerosas enzimas e proteínas reguladoras. Algumas moléculas de mrna levam sequências sinalizadoras que as dirigem até os ribossomos associados ao retículo endoplasmático, sendo as proteínas sintetizadas secretadas fora da célula. Outras moléculas de mrna serão traduzidas nos ribossomos livres no citosol, sendo as proteínas resultantes utilizadas no mesmo lugar ou nas organelas celulares FIGURA 5.6. As etapas da síntese de proteínas (Recapitulação) A. Célula eucariótica B. Célula procariótica Citoplasma Núcleo DNA Íntrons Éxons mrna DNA hnrna Gene TRANSCRIÇÃO Proteínas PROCESSAMENTO mrna mrna Proteína TRADUÇÃO Na célula eucariótica, o processamento envolve a adição de um revestimento inicial e de uma cauda de poli-a, além dos mecanismos de corte e reunião 52

63 OS ÁCIDOS NUCLEICOS O mrna reconhece o ribossomo mediante uma sequência específica, e a associação entre ambos dá início à síntese peptídica. Cada trna carrega o aminoácido correspondente até o ribossomo, onde a complementariedade entre seu anticódon e um dos códons do mrna garante que este coloque o aminoácido no lugar adequado na sequência. Existem vários mecanismos de regulação. Um deles envolve a ação de proteínas associadas ao complexo ribossômico, outro determina variações na vida média do mrna e a tradução do mrna por vários ribossomos ao mesmo tempo. O peptídeo sintetizado passará por diversas modificações e associações, até se constituir no produto final ativo, uma proteína com uma estrutura quaternária determinada. Uma visão geral comparativa da síntese proteica em células eucarióticas e procarióticas (Figura 5.6). O COMPLEXO MUNDO DOS RNAs A DIVERSIDADE EXISTENTE Na síntese proteica, o mrna carrega uma parcela de informação genética do DNA até os ribossomos, estruturas celulares formadas por rrna e proteínas onde ocorre a síntese proteica. Os aminoácidos são carregados por um dos 61 tipos de trna, cada um dos quais é capaz de reconhecer simultaneamente um aminoácido e um códon do mrna. Tanto o rrna como os trna são transcritos a partir de genes não codificadores de proteínas. A participação dos RNAs na regulação da expressão gênica é bem conhecida. As ribozimas, por exemplo, são RNAs com capacidade catalítica que desempenham funções na replicação e no processamento do mrna, sem necessidade de nenhum componente proteico. A existência deste tipo de moléculas é um argumento a favor da existência de um mundo de RNA prévio à aparição do DNA e das proteínas. Outras moléculas de RNA, os riboswitches, agem como sensores afetando a expressão gênica, em resposta a fatores ambientais ou metabólicos. A atividade regulatória do RNA é possível devido à sua estrutura molecular, que permite o pareamento com uma molécula de sequência complementar. E também a suas propriedades de se associar a proteínas e de desenvolver uma atividade catalítica. Nos últimos anos começou a ser desvendada a existência de pequenas moléculas de RNA não codificadoras (srna, do inglês small RNA), que regulam as atividades celulares. Em procariontes, os srnas determinam modificações metabólicas e estão envolvidos na defesa contra os vírus. Em eucariontes, a variedade é muito ampla: os pequenos RNAs nucleares (snrna) associados a proteínas participam no mecanismo de corte e reunião e na remoção dos íntrons; os pequenos RNAs nucleolares (snorna) processam o RNA ribossômico no nucléolo. Originados a partir de diferentes moléculas precursoras, os micrornas (mirna) participam na repressão do mecanismo de tradução. Novos tipos de RNA, de sequência mais longa (lncrna, do inglês, long non coding DNA) cumprem funções regulatórias, como a inativação do cromossomo X. Menos clara por enquanto é a função dos RNAs transcritos antisense e dos transcritos a partir de pseudogenes, que sempre foram considerados não funcionais. INTERFERÊNCIA E SILENCIAMENTO GÊNICO O fenômeno de interferência foi descoberto quando, com o objetivo de intensificar a produção de pigmentos em petúnias, a inserção de um gene extra originou flores brancas em vez das flores O fenômeno de interferência foi descoberto quando, com o objetivo de intensificar a produção de pigmentos em petúnias, a inserção de um gene extra originou flores brancas em vez das flores 53

64 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) ultracoloridas esperadas. Posteriormente, observou-se um fenômeno similar no desenvolvimento de C. elegans, onde pequenas moléculas de RNA resultantes da clivagem de RNAs transcritos inibem a tradução de diversos mrnas. Os micrornas (mirnas) são pequenas moléculas bifilamentares de 21 a 25 pares de nucleotídeos que agem como silenciadores de mrna, regulando a tradução. Sua descoberta, mostrando como esses mirna controlam a expressão dos genes, valeu a A. Fire e C. Mello o Prêmio Nobel de Medicina de Estima-se que existiriam entre 300 e 500 mirnas regulando pelo menos a quarta parte dos genes humanos. Nos últimos anos, esse fenômeno de silenciamento gênico tem se transformado em uma importante ferramenta de pesquisa. Sintetizadas no núcleo, as moléculas de mirna de filamento duplo são clivadas por enzimas no citoplasma, formando pequenos fragmentos de aproximadamente 20 nucleotídeos. A associação entre um pequeno fragmento de RNA e um complexo proteico (RISC, do inglês RNA-induced silencing complex) desencadeia a degradação de um dos filamentos. O filamento restante permanece associado a RISC, podendo parear com qualquer molécula de RNA, parcial ou totalmente complementar, e causar sua degradação (Figura 5.7). Trata-se de uma forma de controle da expressão gênica na célula, porque o mirna afeta a tradução de qualquer RNA homólogo. Por outro lado, do ponto de vista biológico, o fenômeno de silenciamento constituiria também uma reação de imunidade inata das bactérias à infecção por vírus de RNA. O mecanismo de ação dos RNAs envolvidos é semelhante ao do mirna, porque utilizam a mesma maquinaria enzimática da célula. Contudo, se no caso do mirna de origem endógeno, descrito anteriormente, a molécula precursora originava uma única molécula interferente, no caso da infecção por RNA exógeno formam-se vários tipos de molécula interferente FIGURA 5.7. O silenciamento gênico O silenciamento gênico é uma forma de controle da expressão gênica na célula, porque o mirna interfere na tradução de um mrna homólogo; também é uma forma de resistência à infecção viral. Molécula de mirna de dois filamentos (20 nucleotídeos aproximadamente) Complexo enzimático RISC mrna endógeno ou RNA viral As duas moléculas são complementares (6 bases, mínimo) Pareamento parcial e bloqueio da tradução Pareamento total e destruição do RNA 54

65 OS ÁCIDOS NUCLEICOS O fenômeno existe em bactérias, plantas, drosófilas, camundongos e em seres humanos. Ferramenta poderosa no laboratório, a injeção na célula de um RNA artificial de sequência parcialmente semelhante à do DNA de um gene determinado permite silenciar parcialmente sua expressão, de maneira transiente e sem danificar a célula. Espera-se que algumas das primeiras aplicações do knockdown por silenciamento de mrna estejam relacionadas com testes clínicos e com a repressão de genes implicados no câncer, na degeneração macular devida à idade e na amiloidose. O GENOMA HUMANO O MAPEAMENTO DO GENOMA O termo genoma designa o conjunto completo de cromossomos haploides que contém toda a informação genética de um indivíduo. Na espécie humana, o genoma nuclear compreende as 24 moléculas de DNA que formam os diferentes cromossomos (22 autossômicos, X e Y). Devido à presença de DNA nas mitocôndrias, existe também um genoma mitocondrial de herança exclusivamente materna, que conta com 37 genes, incluindo os genes codificadores de trna e rrna utilizados na síntese proteica dentro dessa organela. Em 1990, teve início o Projeto Genoma Humano (HGP, do inglês Human Genome Project), um dos projetos científicos mais ambiciosos já realizados, envolvendo pesquisadores de mais de 18 países na tarefa de mapear e sequenciar o DNA humano e também o de outros organismos. O projeto encontrou grandes resistências, em parte devido a seu custo faraônico comparável aos dos projetos Manhattan ou Apolo, em parte pelas consequências que poderia trazer para a sociedade. A resposta ao público foi o lançamento como parte integral do projeto do programa The Ethical, Legal and Social Implications (ELSI) Research Program de pesquisa básica e aplicada sobre as implicações éticas, legais e sociais dos estudos sobre o genoma para os indivíduos, as famílias e as comunidades. Paralelamente ao mapeamento do genoma humano, milhares de outros organismos (microrganismos, plantas e animais) foram parcial ou totalmente sequenciados. Em junho do ano 2000, o International Human Genome Sequencing Consortium e a Celera Genomics, uma empresa privada norte-americana, anunciaram simultaneamente ter completado o primeiro rascunho do genoma humano. Os resultados foram publicados em fevereiro de 2001, nas revistas Nature e Science. Em abril de 2003, cinquenta anos depois da descoberta da dupla hélice, o Consórcio anunciou ter completado 99% do mapeamento. Os seus resultados estão armazenados em bancos de dados públicos que podem ser acessados via Internet. As principais conclusões podem ser resumidas da seguinte forma: o O número de bases no genoma humano chega a 3,2 bilhões, e o número de genes a um valor entre e genes; só 1,5% do genoma codificaria proteínas. o O número de genes em organismos como a mosca Drosophila melanogaster ou o verme Caenorrabditis elegans é três vezes menor. Compartilhamos com estes organismos alguns genes e contamos com outros que são característicos dos vertebrados como, por exemplo, vários dos genes referentes ao sistema imune. o A densidade dos genes em diversos cromossomos e em diferentes partes deles varia. Existem grandes espaços entre os genes, às vezes chamados de DNA-lixo. Sequências repetidas, não codificadoras, cuja função direta ainda não é bem conhecida, ocupam pelo menos 50% do genoma. o O tamanho dos genes é variável, sendo na média de bases. Na realidade, o tamanho não parece ter muita importância. Como boa parte dos genes poderia ser lida de diversos modos, o número de proteínas poderia ser bem maior. 55

66 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) o Independentemente de nossa origem étnica, compartilhamos com os outros seres humanos 99,9% da sequência gênica. o As diferenças entre os seres humanos se devem a variações de uma base em de pontos dentro e fora dos genes. Estas variações são denominadas polimorfismos de um nucleotídeo único ou SNPs (do inglês, single nucleotide polymorphisms). Os SNPs podem dar informações sobre a base genética da susceptibilidade a uma série de doenças ou servir como marcadores das mesmas (doença cardiovascular, diabetes, artrite e cânceres). o Em vários genes foram encontradas sequências associadas a doenças (câncer de mama, cegueira, surdez, doenças musculares). Vários países de América Latina (Argentina, Brasil, Chile e México) desenvolveram ou participam em projetos de genômica. De um modo geral, esses projetos envolvem parcerias entre instituições públicas e privadas, sendo beneficiados por acordos internacionais com países desenvolvidos (Estados Unidos, França, Alemanha) ou por redes de cooperação inter-regionais (Brasil, Argentina, Chile, Uruguai e Paraguai). Um dos primeiros êxitos foi o sequenciamento por pesquisadores brasileiros da bactéria Xylella fastidiosa, causadora da praga do amarelinho das videiras (2000). OS AVANÇOS POSTERIORES Nos últimos anos, os custos e o tempo necessários para sequenciar um genoma diminuíram extraordinariamente. Atualmente, muito do trabalho feito por robôs e computadores está altamente automatizado, e a informação está armazenada em grandes bancos de dados, acessíveis pela Internet. O desenvolvimento da Bioinformática, um conjunto de novas tecnologias que utiliza métodos computacionais e matemáticos para analisar a informação, tem sido fundamental para o progresso dos estudos sobre os genomas. Muitos dos estudos atuais não são mais feitos in vivo nem in vitro, mas in silico. Ao Projeto Genoma sucederam outros projetos, alguns deles concluídos e outros em andamento, desenvolvidos por redes de cooperação internacional. O projeto HapMap (do inglês, Map of Human Genetic Variation) publicou um catálogo das variações genéticas que ocorrem nos seres humanos. O projeto ENCODE confirmou ser pouco mais de o número de genes codificadores de proteínas e descobriu que 80% do DNA restante cumpre alguma função reguladora, de modo que não pode ser considerado lixo. O Projeto Epigenoma Humano irá identificar, catalogar e interpretar os padrões de metilação dos genes humanos em cada tecido. Como estes padrões mudam em resposta a fatores exógenos, o epigenoma pode ser um elo unindo genes, doença e ambiente. O Projeto Genoma do Câncer fornece informação sobre a doença e especialmente sobre o câncer de pulmão e o melanoma maligno. O Projeto dos 1000 Genomas visa sequenciar o conjunto de um número amplo de pessoas. O Projeto UK10K do Wellcome Trust, lançado em 2010, visa comparar os genomas de pessoas saudáveis com os de pessoas afetadas por uma doença de presumida origem genética. A Genômica surgiu como uma nova disciplina que tenta responder a algumas questões fundamentais: Onde estão os genes? O que faz cada gene? Como diferem os organismos em relação a seus genes? Cada uma dessas perguntas criou especialidades como a Genômica estrutural, a Genômica funcional ou a Genômica comparativa. No rastro do Genoma, outras perguntas começam a ser formuladas e surgem outras áreas de investigação: o A transcriptômica, concernente ao RNA transcrito ou transcriptoma, isto é, aos padrões de expressão gênica. 56

67 OS ÁCIDOS NUCLEICOS o A proteômica, referente ao conjunto de proteínas da célula ou proteoma, que varia ao se diferenciarem as células e em resposta a estímulos ambientais. o A metabolômica, relativa ao conjunto de substratos e subprodutos de reações enzimáticas que incidem no fenótipo celular. DNA E RNA COMO AGENTES BIOLÓGICOS A genômica encontrou aplicações imediatas no campo médico e farmacológico, como os testes genéticos e de medicamentos novos (Tabela 5.2). Em função da importância econômica dos produtos farmacológicos, a questão das patentes voltou a estar no centro das atenções. Em 2013, a Suprema Corte dos Estados Unidos determinou que o DNA natural não pode ser patenteado. A discussão está centrada atualmente em redor dos procedimentos e de sequências especialmente desenhadas para testes de diagnóstico. Nas áreas de agricultura e saúde, a interferência gênica tem sido utilizada na triagem de genes funcionais em cultivos celulares e organismos modelos. Sabe-se que cumpre uma função reguladora no amadurecimento das células sanguíneas em mamíferos e está envolvido em vários tipos de câncer, obesidade e doenças autoimunes. Vários medicamentos baseados no fenômeno de interferência gênica se encontram em fase de testes clínicos, sendo que a principal dificuldade está na administração do RNA TABELA 5.2. Os ácidos nucleicos (DNA e RNA) como agentes biológicos AGENTES BIOLÓGICOS APLICAÇÕES Identificação de microrganismos patogênicos. Controle da qualidade dos alimentos. DNA, RNA e genômica Medicina molecular (diagnósticos, tratamentos personalizados, terapias gênicas). Testes genéticos (diagnósticos, avaliação dos riscos de saúde). Agronomia e pecuária (métodos seletivos mais eficientes). Indústria farmacológica (proteínas terapêuticas, vacinas recombinantes e de DNA). Prática forense (identificação das pessoas). Estudos antropológicos e evolutivos. 57

68 C A P Í T U L O 6 BIOPROCESSOS BIOPROCESSOS, PROCESSOS FERMENTATIVOS E INDÚSTRIA A produção de vinhos e cervejas é o primeiro processo fermentativo desenvolvido em escala industrial. Ao longo do século XX, a expansão da Microbiologia Industrial possibilitou, mediante o desenvolvimento de processos baseados no metabolismo microbiano, a produção de diversas substâncias (acetona, butanol, etanol, ácido cítrico, antibióticos etc.). Atualmente, as fermentações encontram aplicações novas, tanto no tratamento ambiental como na produção de alimentos e aditivos, de produtos químicos e de medicamentos. Tradicionais ou revigorados pelas possibilidades oferecidas pela manipulação gênica, os bioprocessos ou "fermentações" visam um dos seguintes objetivos: o o o o A multiplicação de microrganismos para a obtenção de biomassa (leveduras, rizobios, proteína de célula única); A obtenção de produtos microbianos (antibióticos, aditivos, álcool, enzimas etc.); A conversão de um substrato em outro, por ação de microrganismos ou de enzimas (transformação de esteroides, isomerização de glicose em frutose) ou A purificação de um solvente (tratamento de efluentes, transformação de algum poluente em alguma substância facilmente degradável etc.). Por motivos históricos, os biotecnólogos ainda utilizam o termo processos fermentativos para qualquer processo microbiano operado em grande escala, independentemente de ser ou não uma fermentação. O recipiente onde ocorre o processo é chamado de biorreator ou fermentador (Figura 6.1). Células animais e vegetais também podem ser cultivadas em escala, como será visto no próximo capítulo sobre cultura de tecidos. OS MICRORGANISMOS INDUSTRIAIS NOÇÕES SOBRE O METABOLISMO PRIMÁRIO E SECUNDÁRIO Denominamos metabolismo o conjunto de reações químicas de degradação (catabolismo) e de síntese (anabolismo) de substâncias em um organismo. As primeiras liberam energia, as outras a consomem. As células e a maioria dos microrganismos retiram dos compostos orgânicos a energia que precisam, para a manutenção de sua estrutura e para suas atividades. Nas vias catabólicas, a degradação de compostos orgânicos em moléculas menores libera energia; uma parte desta será acumulada sob a forma de ATP (trifosfato de adenosina), e a restante dissipada como calor. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

69 OS BIOPROCESSOS Respiração e fermentação são as principais vias catabólicas (Figura 6.2). A quantidade de energia liberada e os produtos finais diferem se a oxidação do composto orgânico for total ou parcial. Na glicólise, a glicose é degradada até uma molécula de três carbonos, o piruvato. Em presença de oxigênio, a entrada do piruvato no ciclo de Krebs e a fosforilação oxidativa permitem a quebra total da glicose em CO 2 e H 2O, liberando uma grande quantidade de energia sob a forma de ATP (respiração aeróbia). Mediante a redução do piruvato ou de algum de seus derivados (fermentação), vários microrganismos geram outras substâncias orgânicas: acetona, butanol, etanol, ácido láctico, ácido acético, glicerol etc. Estas reações ocorrem geralmente em ambientes onde o substrato é abundante, sendo pequena a quantidade de energia obtida. Dependendo das condições ambientais, isto é, da presença ou ausência de oxigênio, algumas leveduras e bactérias (assim como as células musculares) podem respirar ou fermentar. A respiração e algumas fermentações são representadas mediante equações, como a seguir: o Respiração aeróbia: C 6H 12O O ADP + 38Pi Glicose 6 CO H 2O + 38 ATP o Fermentação alcoólica (leveduras como S. cerevisiae e algumas bactérias): C 6H 12O ADP + 2Pi CH 3 CH 2OH + CO ATP Glicose Etanol o Fermentação láctica (bactérias como Streptococcus e Lactobacillus): C 6H 12O ADP + 2Pi Glicose CH 3 CHOH COOH + 2 ATP Ácido láctico No metabolismo, os caminhos de degradação e de síntese se entrecruzam. Em determinados pontos da via catabólica da glicose, outras moléculas (aminoácidos, ácidos graxos) convergem para a produção de energia e de pequenas moléculas simples (CO 2, H 2O e NH 3). Inversamente, alguns dos compostos intermediários do catabolismo são os pontos de partida para vias anabólicas. Entretanto, as vias metabólicas não são reversíveis: o caminho seguido na degradação de uma substância é parcial ou totalmente diferente do caminho de síntese correspondente, podendo inclusive ocorrer em compartimentos celulares diferentes. Esta separação facilita a regulação enzimática do metabolismo, que ocorre com menor desperdício de matéria e energia. AS FASES DE CRESCIMENTO DA POPULAÇÃO MICROBIANA De um modo geral, quando os microrganismos se desenvolvem em um meio com uma quantidade limitada de nutrientes, a população passa por diversas fases (Figura 6.3A). o Fase lag: período de adaptação em que, apesar de não se multiplicar, os microrganismos sintetizam enzimas e constituintes celulares. o Fase log: a população cresce de maneira exponencial, sendo sintetizados numerosos metabólitos primários. o Fase estacionária: devido ao esgotamento dos nutrientes e à acumulação de excretas, algumas células morrem, enquanto outras se dividem. No fim da fase log e início da fase estacionária começam a ser sintetizados os metabólitos secundários. o Fase de declínio: sem a renovação dos nutrientes, as células morrem em um tempo variável. 59

70 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA 6.1. O processo fermentativo genérico FASE DE LABORATÓRIO Preparação do inóculo FASE INDUSTRIAL Preparação do meio Esterilização Ar Esterilização Controles (temperatura, ph) Tratamento final Subprodutos Produtos Resíduos FIGURA 6.2. Respiração e fermentação Na respiração, onde o último aceptor de elétrons é o oxigênio, a oxidação de glicose se completa até chegar a CO2 e H2O, produzindo moléculas de ATP. Na fermentação, o último aceptor de elétrons é o piruvato ou algum outro derivado, produzindo 2 ATP. Glicose GLICÓLISE (2 ATP) Citoplasma Ácido pirúvico Sem O2 FERMENTAÇÃO Substância orgânica (etanol, ácido láctico) Com O2 RESPIRAÇÃO Ciclo de Krebs e cadeia respiratória Citoplasma (procariontes) Mitocôndria (eucariontes) CO2, H2O e ATP 60

71 OS BIOPROCESSOS Além das vias metabólicas primárias, que são comuns a todos os microrganismos, existem outras vias metabólicas secundárias específicas. A ativação de umas e/ou de outras depende do microrganismo e das condições em que ele se desenvolve em seu ambiente natural ou em que irá ser cultivado. Os metabólitos primários estão relacionados com o crescimento dos microrganismos e a transformação de nutrientes em biomassa; sendo os principais exemplos o etanol, o ácido láctico ou os aminoácidos. Mesmo não sendo essenciais, os metabólitos secundários permitem a sobrevivência em ambientes extremamente competitivos e com escassos nutrientes. São metabólitos secundários os antibióticos, os alcaloides, os pigmentos, algumas enzimas e toxinas. Com vistas ao desenvolvimento de um bioprocesso, a escolha do microrganismo terá que ser feita em função de suas vias metabólicas; e as condições de cultivo dependerão do objetivo da fermentação, um metabólito primário ou um metabólito secundário (Figura 6.3B) FIGURA 6.3. As diversas fases do crescimento de uma população microbiana e a produção de metabólitos A. As fases de crescimento de uma população Log do número de células Fase lag Fase log Fase estacionária Fase de declínio Tempo B. A produção de metabólitos primários e secundários Os nutrientes do meio permitem a multiplicação celular e a formação do metabólito primário, que pode ser utilizado pelas células para sintetizar o metabólito secundário (a); este pode também ser sintetizado diretamente a partir de alguma substância do meio (b). Meio nutriente Células Metabólito primário a Metabólito secundário b 61

72 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) MEIOS DE CULTURA E MATÉRIA-PRIMA A composição do meio de cultura depende das necessidades metabólicas do microrganismo escolhido. Este deve conter todos os nutrientes necessários nas concentrações adequadas, que variam em função do microrganismo e do objetivo do processo. Em geral, os meios de cultura utilizados no laboratório incluem: o Água. o Uma fonte de energia e de carbono: glicose, amido etc. o Uma fonte de nitrogênio: inorgânica (sulfato de amônia, nitrato de potássio etc.), orgânica (asparagina, succinato de amônia, glutamato, ureia etc.) ou complexa (farinha de soja, peptona etc.). o Sais minerais, tais como fosfato de potássio (K2HPO4 ou KH2PO4), sulfato de magnésio (MgSO4 7H2O), cloreto de cálcio (CaCl2) etc. o Elementos-traço: ferro, zinco, manganês, cobre, cobalto, molibdênio. Com vistas a uma exploração comercial, os meios definidos são substituídos na indústria por matériasprimas de baixo custo como, por exemplo, soro de leite, melaço de cana ou de beterraba, amido de milho etc. Em alguns casos, a matéria-prima passa por um tratamento prévio com métodos físicos e/ou químicos. No caso de se tratar de um processo enzimático, o meio deverá levar, além do substrato adequado, os elementos necessários para que a enzima possa desenvolver sua atividade catalítica (precursores, cofatores etc.). A OBTENÇÃO DAS LINHAGENS De um modo geral, para que o cultivo em um fermentador resulte economicamente viável, o microrganismo deve ser capaz de se multiplicar rapidamente, sintetizando grande quantidade do produto a partir de uma matéria-prima barata. Existem Bancos e Coleções de Cultura que vendem esse tipo de linhagens de microrganismos como culturas puras, geneticamente estáveis e aptas para o cultivo em grande escala. Apesar de terem sido isoladas do meio ambiente, as linhagens industriais diferem substancialmente das linhagens originais, em virtude de uma série de alterações genéticas (mutações, recombinações) obtidas no laboratório. Atualmente, as grandes empresas selecionam os microrganismos mais eficientes mediante um processo de evolução dirigida, miniaturizado em plataformas robóticas (Figura 6.4). A triagem de alta produtividade (HTS, do inglês high throughput screening) permite a seleção em paralelo de milhares de linhagens e a realização dos ensaios biológicos básicos, em menos tempo e com menor consumo de reagentes que os métodos tradicionais. Testes com centenas de milhares de amostras diárias tornam-se rotineiros e acessíveis, graças aos recentes avanços em métodos fluorescentes e sistemas robóticos que colocam líquidos em quantidades nanométricas. Nas linhagens industriais, algumas vias metabólicas, especialmente as do metabolismo secundário, podem ter sido alteradas, de maneira a aumentar ao máximo a síntese do produto desejado e evitar a produção de algumas substâncias desnecessárias. Em geral, por estar tão selecionadas geneticamente, tendo inclusive algumas vias metabólicas anuladas ou desbalanceadas, estas linhagens sobrevivem pouco tempo no meio ambiente. Porém, como norma geral, as linhagens industriais não devem ser patogênicas nem produzir toxinas. A produção de medicamentos ou de vacinas é um caso crucial, porque exige medidas de segurança estritas. 62

73 OS BIOPROCESSOS Os microrganismos constituem um grupo biológico muito diversificado e, ainda, pouco conhecido, por isso existem muitas expectativas em relação à prospecção de linhagens em ambientes extremos ou pouco usuais. Não se precisa desenvolver um processo novo para cada microrganismo que apresente alguma característica comercial interessante. A tendência atual é transferir os genes correspondentes, por engenharia genética, a algum dos microrganismos conhecidos, adaptados às condições industriais FIGURA 6.4. A metodologia HTS para triagem e evolução dirigida de linhagens bacterianas Biblioteca de mutantes de variantes Gene parental Mutação bacterianas Próxima rodada seletiva Transformação Mutante mais eficiente Triagem Transferência das colônias Triagem por métodos colorimétricos, a microplacas fluorescentes ou por luminescência OS DIFERENTES TIPOS DE BIOPROCESSOS OS PROCESSOS TRADICIONAIS Algumas fermentações se desenvolvem sobre resíduos agroindustriais ou florestais, como grãos, palha, bagaço, serragem etc. Este tipo de fermentação em meio sólido umedecido é utilizada na produção de alimentos como, por exemplo, o levedo da massa na panificação, a maturação de queijos por ação de fungos (roquefort, gorgonzola), o cultivo de fungos, a fermentação do cacau, do café e do chá etc. Na Ásia, a preparação do koji, soja fermentada, é a base de alimentos tradicionais como o tofu, o missô, o shoyu e o sakê. Em alguns lugares, estas fermentações ainda ocorrem artesanalmente, dentro de folhas de bananeira e cestas de bambu ou mesmo em montões; também existem hoje equipamentos sofisticados com bandejas, colunas, frascos e tambores rotativos, alguns totalmente automatizados (Figura 6.5 A). Outra variante interessante do processo fermentativo é a produção tradicional de vinagre (processo francês ou de Orléans) em barris de carvalho. O vinho é inoculado com bactérias do gênero Acetobacter que formam na superfície a "mãe do vinagre", uma película que flutua, presa a um quadriculado de madeira que a impede de afundar. Deste modo, o microrganismo cresce na superfície de um meio líquido, em contato simultâneo com o ar e com o meio. O processo fornece excelentes vinagres, mas é lento e exige muito espaço, sendo a capacidade de cada barril de 200 litros (Figura 6.5 B). Existem outros processos semelhantes, conduzidos por fungos, que formam uma película de micélio na superfície do líquido. 63

74 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA 6.5. Modelos de biorreatores utilizados em processos tradicionais C. Biorreator para fermentações em fase sólida Injeção de ar Umidade Controles Saída de ar Bandejas com a matéria-prima para o cultivo de microrganismos D. A produção de vinagre (Método de Orléans) Tubo para adicionar o vinho Entrada de ar Mãe do vinagre Mosto Retirada do vinagre FIGURA 6.6. Modelo de biorreator utilizado em fermentações submersas Vapor Bomba Motor Entrada de ácido ou de base Indicador de pressão Sonda de temperatura (controle) Misturador Saída de gases Sonda de ph (controle) Vapor Entrada de ar Saída do produto 64

75 OS BIOPROCESSOS OS PROCESSOS SUBMERSOS O desenho do biorreator deve se adequar ao objetivo do processo, respondendo eventualmente a diversos imperativos, tais como a esterilização do sistema, a aeração e homogeneização do meio, o acréscimo de nutrientes e de aditivos antiespumantes, a manutenção do ph etc. A maioria dos processos industriais se desenvolve em cubas de vidro ou de aço. Os agentes biológicos submersos no meio de cultivo ocupam somente 75% da cuba porque, se for necessário injetar ar, formará espuma FIGURA 6.7. Fermentações, agentes biológicos e biorreatores FERMENTAÇÕES SUBMERSAS Podem ser conduzidas por CÉLULAS E ENZIMAS Livres Imobilizadas Reatores com agitação mecânica Reatores com agitação pneumática Em suportes inertes Reatores de leito fixo Entre membranas Reatores de fibra oca Reatores STR Reatores em torre ou com membranas planas ou de leito fluidizado Coluna de bolhas Reatores air-lift 65

76 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Os modelos de fermentadores mais utilizados com microrganismos contam com aeração e agitação mecânica. Esta facilita a distribuição dos nutrientes, mas o calor gerado deve ser eliminado mediante a circulação de água fria (Figura 6.6). Se o processo exigir assepsia, esta será conseguida mediante: o A esterilização do meio, dentro ou fora do fermentador. o A desinfecção ou esterilização do equipamento, por injeção de vapor ou mediante o calor gerado por serpentinas, sendo esta medida extensiva a todos os dutos de entrada e saída e às válvulas correspondentes. o A esterilização do ar, mediante filtros adequados. Existem fermentadores adaptados às necessidades de cada agente biológico e de cada tipo de processos. Nos biorreatores em coluna ou torre, a homogeneização depende da injeção de ar (Figura 6.7). Os tanques podem chegar a m 3 de capacidade como, por exemplo, os fermentadores para a produção de proteínas de célula única, da Imperial Chemical Industries (ICI), no Reino Unido. O monitoramento do processo acompanha o crescimento da população microbiana, ou a quantidade do produto, nas amostras extraídas ao longo da fermentação. Os sistemas submersos são apropriados para o cultivo de microrganismos livres, mas resultam pouco econômicos quando se trabalha com células ou enzimas caras. Neste caso, é preferível a imobilização do agente biológico a um suporte inerte ou sua inclusão dentro de um polímero que permita o contato com o meio de cultura. Além de facilitar a reutilização das células ou das enzimas que permanecem dentro do biorreator, os sistemas imobilizados simplificam a purificação do produto (Figura 6.7) FIGURA 6.8. A mudança de escala, do laboratório à indústria A mudança de escala entre o processo laboratorial e o processo industrial cria vários problemas de índole tecnológica. Bancada Fermentador de laboratório Fermentador piloto Fermentador industrial 1-10 litros litros litros m 3 LABORATÓRIO PILOTO INDÚSTRIA 66

77 OS BIOPROCESSOS DO LABORATÓRIO À INDÚSTRIA A MUDANÇA DE ESCALA Uma operação simples de laboratório pode ser impraticável, ou pouco econômica, quando realizada em grande escala. No laboratório, após a triagem das linhagens mais eficientes ou das primeiras experiências realizadas na bancada, o processo passa a ser estudado em um biorreator de até 10 litros de capacidade, onde se analisam o rendimento da linhagem selecionada e as variáveis físico-químicas em outra escala. A capacidade de uma cuba varia entre 1 e 10 L para um fermentador de laboratório, chegando a l em uma planta piloto e l em uma planta industrial. Ao aumentar o tamanho do equipamento, altera-se a relação superfície/volume, de modo que as condições de operação do fermentador na planta piloto deverão ser ajustadas até se aproximar das correspondentes a um processo comercial. Se a experiência na planta piloto for bem-sucedida, o processo poderá ser desenvolvido em um fermentador industrial (Figura 6.8). A automatização do monitoramento e do controle da fermentação permite que a informação relativa aos parâmetros físicos e químicos (ph, temperatura, oxigênio, velocidade de agitação, o nível do meio etc.) seja recolhida on-line por sondas e sensores. Para que o processo se aproxime das condições ideais, a informação é analisada em relação a um modelo previamente estabelecido. Como este se elabora a partir da experiência obtida com cubas menores (laboratório, piloto), os ajustes à mudança de escala são de grande complexidade. A CONDUÇÃO DO PROCESSO O processo fermentativo pode ser conduzido de maneira contínua ou descontínua (batelada), sendo que ambas as formas apresentam vantagens e inconvenientes. Em um sistema descontínuo de produção, uma vez que o fermentador é carregado com a matéria-prima e o inóculo correspondentes, a fermentação prossegue até o esgotamento dos nutrientes. Concluído o processo e extraído o produto, o fermentador é esvaziado, limpo e esterilizado antes de receber outra carga. Apesar do tempo improdutivo entre uma batelada e a seguinte, o sistema é relativamente flexível, já que o mesmo equipamento pode ser utilizado na fabricação de produtos diferentes. A produção em bateladas é bastante utilizada na indústria farmacêutica porque o risco de contaminação permanece relativamente baixo. Já no sistema contínuo de produção, o acréscimo de nutrientes e a retirada do produto ocorrem simultaneamente ao longo do processo, eliminando-se quase totalmente o tempo improdutivo. Como o risco de contaminação aumenta, o sistema se adapta a processos que não exigem assepsia, como a produção de proteína microbiana e de álcool e, obviamente, o tratamento de água. Entre o sistema em batelada e o sistema contínuo existe um sistema intermediário de batelada alimentada em que, periodicamente, parte do conteúdo (meio de cultivo + produto) é retirada e substituída por meio fresco. A RECUPERAÇÃO DO PRODUTO A recuperação do produto representa uma fração considerável do custo de um processo fermentativo. Se o produto for secretado fora da célula, estará disperso em um volume grande de água e será necessário separá-lo por decantação ou filtração. Mas se o produto permanecer dentro das células, estas terão que ser desintegradas antes de proceder a sua extração. 67

78 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) O produto se concentra por sedimentação, precipitação, filtração, centrifugação, extração por solventes, destilação, evaporação do solvente e secagem. Se a purificação for necessária, esta envolverá outros procedimentos, como a cristalização e os métodos cromatográficos. O acondicionamento final dependerá do tipo de produto. Isto é fundamental no caso das enzimas usadas em cosméticos, onde os problemas técnicos principais são a manutenção da estabilidade do produto e sua ativação pela hidratação da pele. Um problema a considerar é o despejo dos resíduos de uma fermentação, alguns dos quais podem representar um perigo para o meio ambiente como, por exemplo, o vinhoto resultante da produção de etanol ou o soro das indústrias de laticínios. Existem formas de tratamento, como o crescimento de biomassa sobre resíduos industriais, que eliminam o problema e ainda permitem a obtenção de mais um produto. BIOPROCESSOS NA INDÚSTRIA Na produção de bens e serviços, os bioprocessos participam em vários setores produtivos. Os dois exemplos escolhidos referentes à produção de ácido cítrico e de fertilizantes ilustram sua importância em áreas tão diversas como a indústria química e a agricultura. O ÁCIDO CÍTRICO Descoberto no século XVIII no suco de limão, o ácido cítrico é ainda extraído das frutas cítricas em alguns países da África e no México. No entanto, a maior parte da produção atual depende do fungo Aspergillus, do qual tem-se obtido mutantes muito produtivos. Os três procedimentos que garantem atualmente a produção industrial de ácido cítrico são os seguintes: o O processo Koji. A fermentação ocorre na superfície, em meio sólido, com Aspergillus niger como agente biológico. Depois de 80 a 100 horas de fermentação a 28 0 C, o ácido cítrico é extraído com água quente e purificado. Muito desenvolvido nos países asiáticos, este tipo de bioprocesso garante ao Japão uma parte importante da produção anual de ácido cítrico. o Fermentação na superfície do meio líquido. Em meio estéril, incubação a 30 0 C com injeção de ar esterilizado. Inoculação com esporos de Aspergillus niger que germinam e, em 24 horas, cobrem a superfície do líquido, diminuindo o ph a um valor inferior a 2. O processo demora entre 7 e 15 dias e, a seguir, o ácido cítrico é extraído do meio de cultivo. Para recuperar uma quantidade maior de ácido cítrico, o micélio é exprimido e lavado. Este processo responde por 20% da produção anual de ácido cítrico. o Fermentação submersa em meio líquido. Em grandes biorreatores de acero inoxidável com agitação mecânica ou em torres air-lift. É o procedimento preferido porque resulta fácil de automatizar e fornece rendimentos altos (125 g/l). Responde por 80% da produção anual de ácido cítrico. A figura 6.9 mostra o procedimento de separação downstream do ácido cítrico e sua purificação. A produção de ácido cítrico por fermentação é um exemplo clássico de sucesso na utilização de bioprocessos para a produção de insumos que atendam outras indústrias. O ácido cítrico é um composto muito versátil, utilizado nas indústrias farmacêutica, de alimentos, de cosmética e de detergentes. Devido a facilidade com que forma complexos metálicos, também é usado como antioxidante e na limpeza de metais. 68

79 OS BIOPROCESSOS FIGURA 6.9. A obtenção de ácido cítrico por fermentação Uma vez retirado o micélio por filtração, acrescenta-se cal no caldo restante para elevar o ph e precipitar o citrato de cálcio. Este último é retirado por filtração e tratado com ácido sulfúrico concentrado, formando-se sulfato de cálcio. Outra filtração retira o sulfato de cálcio, deixando o ácido cítrico dissolvido no líquido. Eliminam-se as impurezas com carvão ativado, e o cálcio residual e outros cátions por intercâmbio iônico. A evaporação do solvente facilita a cristalização do ácido cítrico, que é recuperado por centrifugação e filtração. Uma vez seco, o ácido cítrico é empacotado e distribuído. BIORREATOR (200 m 3 ) 20 m 3 de cultivo de Aspergillus niger (starter) Injeção de ar esterilizado Filtração Materiais estéreis: açúcar, melaço, nutrientes, algum agente antiespumante Controles de ph, temperatura, CO 2, O 2 Retirada semanal do meio Caldeiras Solução de ácido cítrico impuro Micélio Metano + Ca (OH) 2 Fermentador anaeróbico Precipitado de citrato de cálcio + H 2SO 4 concentrado Restos do meio nutriente Descarte Ácido cítrico + precipitado de sulfato de cálcio Filtração Solução de ácido cítrico puro Gipsita Evaporação, cristalização, centrifugação, secagem e empacotamento Ácido cítrico CO 2H-CH 2-C(OH)(COOH)- CO 2H-CH OS BIOFERTILIZANTES O termo biofertilizante se aplica aos produtos que contém agentes biológicos vivos capazes de favorecer o desenvolvimento vegetal. Um destes agentes é o Rhizobium, uma bactéria simbionte das raízes de leguminosas que fixa o nitrogênio atmosférico, reduzindo a necessidade de aplicar fertilizantes nitrogenados nas lavouras e permitindo assim a substituição de produtos químicos derivados do petróleo por agentes biológicos, menos prejudiciais para o meio ambiente. 69

80 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Na América Latina, a produção de biofertilizantes envolve numerosas empresas, pequenas e médias, que contam com um sólido suporte tecnológico originado em universidades e instituições públicas de pesquisa agronômica. Vários países produzem inoculantes agrícolas; entre eles: Argentina, Brasil, Chile, Colômbia, Cuba, México, Peru e Uruguai. As linhagens bacterianas são estirpes selecionadas por sua eficiência em uma ampla gama de cultivares e amplamente adaptadas às condições locais. O crescimento da população microbiana ocorre em etapas sucessivas, utilizando recipientes cada vez maiores até chegar a biorreatores de litros. Os microrganismos recuperados são veiculados em meio líquido ou em turfa estéril e, uma vez empacotados, vendidos aos agricultores. Segundo a legislação do Mercosul, durante o prazo de validade do produto, a concentração deverá ser de 10 8 microrganismos viáveis por grama de produto. Até o presente, a indústria baseia a produção dos microrganismos na tecnologia clássica, mas com mapeamento do genoma de microrganismos como o Rhizobium etli (México) e o Gluconacetobacter diazotrophicus (Brasil), a biotecnologia moderna começa a se inserir neste campo. Frente as mudanças climáticas e a necessidade de aumentar a produtividade agrícola, os novos métodos de triagem de estirpes são uma ferramenta de incalculável valor para o estudo da relação simbionte entre o microrganismo e a planta hospedeira. 70

81 C A P Í T U L O 7 O CULTIVO DE CÉLULAS E TECIDOS A MANIPULAÇÃO IN VITRO DE CÉLULAS E TECIDOS VEGETAIS AS PRIMEIRAS TENTATIVAS A reprodução assexual das plantas é utilizada para obter um grande número de mudas a partir de um único exemplar. Dependendo do caso, aproveitam-se bulbos (cebola), cormos (gladíolo), rizomas (samambaias), tubérculos (batata-inglesa), caules (banana), raízes (batata-doce, maçã, amora), folhas (begônia, espada-de-são-jorge), estacas (videiras) etc. As plantas obtidas por propagação assexuada ou vegetativa são idênticas à planta-mãe e idênticas entre si. Em outras palavras, são clones. A capacidade de uma célula regenerar réplicas do organismo do qual ela deriva é denominada totipotência. Restringida em animais, esta propriedade característica dos vegetais permite a sobrevivência das plantas superiores após o ataque de herbívoros, pragas e patógenos ou em condições ambientais desfavoráveis FIGURA 7.1. As diversas partes de uma planta angiosperma Gema apical Estípula Ramo ou broto lateral desenvolvido a partir de uma gema axilar Limbo Pecíolo Gema axilar Entrenó Nó Folha Superfície do sol Região da raiz com pelos absorventes Raiz central Raízes laterais BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

82 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) As primeiras tentativas de cultura de tecidos vegetais em laboratório datam de Contudo, a primeira experiência bem-sucedida é a germinação in vitro de sementes de orquídea (Knudson, 1922). Transferidas assepticamente ao meio de cultura e incubadas em condições favoráveis, as sementes e, mais tarde, as plântulas crescem protegidas do ataque de fungos e bactérias. Com algumas variações, o método é usado ainda hoje por numerosos floricultores porque, devido ao tamanho minúsculo das sementes e à ausência de reservas nutritivas, as possibilidades de sobrevivência das plântulas após a germinação in vivo são muito baixas. Distintamente do cultivo in vivo, a micropropagação se inicia com a separação dos explantes, isto é, de pequenos fragmentos de tecido extraídos de diversas partes da planta, tais como folhas, raízes, segmentos nodais e gemas axilares, gemas florais e apicais (Figura 7.1). O cultivo desses explantes em meios de composição adequada e condições assépticas possibilitará a regeneração direta da planta. A cultura in vitro tem a vantagem de ser mais rápida e de ocupar muito menos espaço que a multiplicação in vivo. As principais aplicações estão no cultivo de plantas ornamentais, de hortaliças e na silvicultura. A capacidade de regeneração é maior nas plantas herbáceas que nas lenhosas, e em algumas famílias (solanáceas, crucíferas, gesneriáceas, compostas e liliáceas). Também depende do genótipo e das condições ambientais, diminuindo com a idade da planta TABELA 7.1. Os componentes do meio de cultura para células vegetais COMPONENTES Água destilada Fonte de carbono Substâncias inorgânicas Vitaminas Reguladores de crescimento CARACTERÍSTICAS E EXEMPLOS Representa 95% do meio nutriente. Geralmente se utiliza sacarose. A fonte de carbono é necessária porque os explantes não são totalmente autotróficos e a fotossíntese in vitro não supre as necessidades das células. Macroelementos (N, P, K, Ca, Mg, S) e microelementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I), em uma proporção que depende da planta escolhida. Mioinositol, vitamina B 1 (tiamina), ácido nicotínico (niacina), vitamina B 6 (piridoxina), pantotenato de cálcio, ácido fólico, vitamina B 2 (riboflavina), vitamina C (ácido ascórbico), vitamina H (biotina), ácido para-aminobenzoico e vitamina E (tocoferol). Auxinas: Estas promovem o alongamento celular, a formação de calos e de raízes adventícias; inibem a formação de brotos axilares adventícios e, às vezes, a embriogênese em suspensões celulares. Exemplos: IAA (ácido indolacético), NAA (ácido naftalenoacético), IBA (ácido indolbutírico), 2,4 D (2,4- diclorofenoxiacético). Citocininas: Estas promovem a divisão celular, regulam o crescimento e o desenvolvimento dos tecidos vegetais. Exemplos: cinetina, 2iP (2-isopentiladenina), BAP (benzilaminopurina), zeatina. Outras substâncias. Exemplos: giberelinas, ácido abcíssico, etileno. Misturas de substâncias pouco definidas Materiais inertes Exemplos: extrato de levedura, extratos vegetais, hidrolisados de caseína, peptona e triptona. A tendência atual em pesquisa é de substituí-los por meios de composição definida. Utilizados como suporte. Exemplos: agar, agarose, outros polissacarídeos (Gelrite, Phytagel), lã de vidro, papel de filtro, areia, esponjas de poliestireno. 72

83 O CULTIVO DE CÉLULAS E TECIDOS OS MEIOS DE CULTURA Um meio de cultura inclui água, uma fonte de carbono, substâncias inorgânicas (sais minerais), vitaminas, hormônios e fatores reguladores do crescimento (Tabela 7.1). Alguns desses componentes podem ser substituídos por misturas pouco definidas, mais econômicas ou simples de manipular (água de coco, suco de tomate, suco de laranja). Geralmente, o ph do meio varia entre 5,0 e 6,5. A composição do meio de cultura muda em função das necessidades de cada espécie. O crescimento e a diferenciação celular são controlados mediante as substâncias reguladoras de crescimento (Tabela 7.1). De um modo geral, se a proporção entre citocininas e auxinas for maior que 1, desenvolvem-se brotos, se for menor, raízes e, se for igual, calos. A incubação ocorre a uma temperatura entre 23 e 28 C, com 12 a 14 horas diárias de iluminação. AS ETAPAS DO PROCESSO Cultivam-se assepticamente os explantes em meios de composição adequada, possibilitando a regeneração direta da planta. O processo envolve quatro etapas: A. Estabelecimento de uma cultura asséptica. Uma vez retirados da planta-mãe, os explantes são desinfetados com um agente químico, geralmente hipoclorito de sódio, que é mais tarde retirado mediante sucessivas lavagens com água estéril. A transferência dos explantes para o meio de cultura é realizada em condições assépticas semelhantes às do cultivo de microrganismos (Figura 7.2). A incubação ocorre a uma temperatura entre 23 e 28 C, com 12 a 14 horas diárias de iluminação B. Multiplicação. Dividem-se e transferem-se os propágulos para um meio de multiplicação, de maneira a se obter numerosas subculturas (Figura 7.3). C. Preparação das plântulas para a transferência ao solo. Transferem-se as plântulas das subculturas para um meio de enraizamento onde, além de desenvolver raízes, enrijecem e começam a fotossintetizar. D. Aclimatação. Transferência das plântulas, primeiro para o solo ou para algum outro substrato, mais tarde para uma casa de vegetação. Protegidas da iluminação solar direta, elas aumentarão sua capacidade fotossintética adaptando-se lentamente às condições ambientais. AS DIFERENTES MODALIDADES A CULTURA DE MERISTEMAS A regeneração de uma planta pode ocorrer a partir da gema apical onde se encontra o meristema, um tecido embrionário a partir do qual se formam todos os outros tecidos das plantas (Figura 7.4). Os exemplos citados na bibliografia sobre o cultivo de meristemas são, no mínimo, impressionantes. Se um tubérculo de inhame de 100 g produz 25 kg de tubérculos em dois anos, por micropropagação produzirá kg; a partir de uma única gema apical podem-se obter de cravos em um ano. 73

84 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Associando a cultura de meristemas com a termoterapia (incubação a C, por um tempo determinado), obtêm-se estoques de plantas livres de vírus e de outros patógenos. Com este método são recuperadas algumas plantas que só se reproduzem naturalmente pela via assexuada e se encontram ameaçadas de extinção, devido à contaminação por vírus. Esta modalidade de cultivo permite a multiplicação de espécies que se reproduzem lenta e/ou dificilmente (orquídeas) e o aceleramento da produção de mudas em plantas com ciclo anual ou bianual. Outra variação é a microenxertia, que se aplica às essências florestais (eucalipto) e às árvores frutíferas (citros). A técnica gera uma alta produtividade de mudas sadias, que são cultivadas em pouco espaço (mais de plantas / m 2 ) sem depender dos fatores climáticos e da época do ano. Do ponto de vista econômico, o custo destas mudas é alto porque a cultura em meio sólido necessita um trabalho minucioso e mão de obra especializada. A multiplicação dos propágulos em biorreatores, análogos aos fermentadores microbianos, visa reduzir os custos. Ao modelo tradicional de pás giratórias que danifica os tecidos e as células, preferem-se pequenas cubas de 1 a 5 l onde os propágulos permanecem em sistemas de imersão permanente ou temporária. Apesar dos custos, a tecnologia é interessante quando se planeja introduzir uma espécie em uma região determinada porque elimina qualquer contaminação prévia. Também é interessante para iniciar a propagação vegetativa com mudas certificadas, visando a amplificação posterior dos cultivos FIGURA 7.2. O procedimento a seguir para se obter uma cultura asséptica no laboratório Separação Esterilização Lavados Dissecação Incubação dos explantes e semeadura Água + detergente + hipoclorito de sódio Água estéril Condições assépticas, C, na luz FIGURA 7.3. Obtenção de subculturas a partir de explantes nodais Planta-mãe 74

85 O CULTIVO DE CÉLULAS E TECIDOS A CULTURA DE CALOS Um calo é uma massa de células desdiferenciadas que prolifera de maneira irregular em resposta aos ferimentos em órgãos e tecidos, formando in vivo um tecido tumoral. A semeadura in vitro de um explante em meio adequado gera um calo que pode ser mantido indefinidamente, com a condição de proceder a uma subdivisão e transferência periódica a um meio nutriente com a mesma composição. Se o calo for transferido a outro meio com uma concentração diferente de hormônios, formar-se-ão órgãos ou embriões, a partir dos quais poderão ser regeneradas numerosas plantas (Figura 7.5). A cultura de calo é a modalidade alternativa para plantas que não podem ser propagadas diretamente a partir de meristemas e, por isso, menos conveniente para micropropagação. Contudo, sua utilização é inevitável no caso de algumas espécies economicamente importantes (cereais, leguminosas, forrageiras, espécies florestais e palmeiras tropicais) FIGURA 7.4. A cultura de meristemas Gema apical Meristema Transferência a um meio de diferente composição Planta-mãe Cultura de meristema Formação de órgãos Planta-filha FIGURA 7.5. As diferentes possibilidades dos cultivos de calos Planta-mãe Explante Calo Formação de órgãos Planta-filha Metabólitos secundários Biorreator Células Embrioides Sementes artificiais 75

86 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Diferentemente das outras modalidades de cultura de tecidos, na cultura de calos a proliferação celular está acompanhada por um aumento das variações genéticas e da instabilidade cromossômica (variação somaclonal). Esta permite a seleção de variedades de plantas com propriedades novas, tais como a resistência ao estresse, ao ataque de insetos, a patógenos, a herbicidas, a concentrações salinas elevadas, a moléculas químicas (Al, Mn). A variabilidade pode ser aumentada pela utilização de agentes mutagênicos. A CULTURA DE CÉLULAS E ÓRGÃOS VEGETAIS EM BIORREATORES A desagregação de um calo em meio líquido gera suspensões de células, que são cultivadas em biorreatores industriais para produzir metabólitos secundários ou embrioides. Os primeiros são compostos naturais considerados produtos de Química Fina, de alto valor agregado no mercado. Tratase de alcaloides, de glicosídeos cardíacos, de substâncias antitumorais e antimicrobianas, de hormônios esteroides etc. para a indústria farmacêutica e, também, de corantes, adoçantes e aromas para as indústrias alimentícia e cosmética. As sementes artificiais são embrioides, isto é, embriões formados a partir de células somáticas, encapsulados em um gel com nutrientes e envoltos em plástico biodegradável. Como estas sementes se desenvolvem normalmente quando semeadas na terra, uma das aplicações desta tecnologia é a sua dispersão por aviões, ou por drones, para o reflorestamento de regiões de difícil acesso. No início da década de 1990, gerou-se uma enorme expectativa comercial em relação à possibilidade de substituir os métodos tradicionais de extração ou de síntese pela produção mediante o cultivo de suspensões celulares em biorreatores. Vários estudos estimaram as condições necessárias para que a síntese ou a bioconversão de compostos naturais em produtos de alto valor agregado fosse vantajosa. Os cálculos mostraram que, se o mercado fosse suficientemente amplo e o valor do produto superasse os US$ 500 ou por kg, a produtividade do sistema deveria de ser igual ou superior a um grama por litro de cultura celular. Essa condição é difícil de alcançar. Existem numerosas dificuldades técnicas. As células vegetais são grandes (100 m) e sedimentam com facilidade. A tendência a formar agregados as torna muito sensíveis ao cisalhamento. Como o crescimento é lento, os riscos de contaminação aumentam. Também existem problemas relacionados com a transferência de oxigênio. Vários são os modelos de biorreatores para o cultivo de células vegetais, entre os quais o tradicional de pás giratórias e outros preferíveis de tipo air-lift ou de leito fluidizado. A condução do processo pode ser descontínua, semicontínua ou contínua; neste último caso, com células imobilizadas. A escolha de uma modalidade ou outra de cultivo depende da substância estar, ou não, associada ao crescimento celular e, também, de se tratar de um produto intra ou extracelular. O cultivo de órgãos e especialmente de raízes transformadas (hair roots) tem dado bons resultados, apesar de poucas iniciativas terem alcançado um nível comercial. Entre elas, a produção de shikonina a partir de raízes (Lithospermum erythrorhizon) pela empresa Mitsui Petrochemical Ind. Ltd.; de gingenosídeo (Panax ginseng) e de purpurina (Rubia akane) por Nitto Denko Corp.; e de paclitaxel (Taxos cuspidata), comercializado como Taxol por Phyton Inc., uma empresa associada a Bristol-Myers Squibb. Espera-se o estabelecimento das bases de uma agricultura molecular combinando o desenvolvimento de novos processos industriais com a engenharia metabólica das células. Por enquanto, as aplicações se restringem à produção de alguns fármacos e de aditivos para a indústria de alimentos (flavorizantes, corantes e aromas). 76

87 O CULTIVO DE CÉLULAS E TECIDOS FIGURA 7.6. As possibilidades do cultivo de células vegetais MELHORAMENTO E CONSERVAÇÃO DA BIODIVERSIDADE VEGETAL Várias modalidades de cultura de tecidos contribuem para facilitar a tarefa de melhoramento (Figura 7.6). O método genético tradicional, isto é, a autofecundação das plantas por várias gerações, demora oito ou dez anos para obter linhagens puras (homozigotas), em que se manifestem os caracteres recessivos. Esse tempo pode se reduzir a meses mediante a cultura de anteras, gerando-se plantas haploides (n cromossomos), que, tratadas com colchicina, originam diretamente plantas diploides (2n) homozigotas. Como as plantas resultantes destes cruzamentos geram sementes que dificilmente se desenvolvem, frequentemente é necessário retirar os embriões do resto da semente e proceder a sua recuperação mediante a cultura in vitro. Os protoplastos se formam por digestão enzimática da parede celular, que poderá ser regenerada novamente no meio de cultura. Durante o período em que a célula está sem a parede celular, pode-se introduzir DNA exógeno (transformação) ou fusionar protoplastos de diferentes cultivares ou espécies (hibridização somática). Protoplastos, células, calos, gemas apicais e laterais, meristemas, sementes, embriões somáticos e zigóticos, todos podem ser congelados em nitrogênio líquido a C. A criopreservação facilita a preservação de numerosas plantas ornamentais, frutíferas, oleaginosas, leguminosas, medicinais e aromáticas. Finalmente, deve-se destacar a importância destas técnicas de cultura de células e tecidos vegetais para a conservação em bancos de germoplasma, tanto das espécies cultivadas como das espécies selvagens. A conservação da biodiversidade é importante não só do ponto de vista do melhoramento agronômico como do farmacológico, já que a maioria dos medicamentos de que dispomos contém princípios ativos extraídos de plantas. A DIFUSÃO DA TECNOLOGIA As técnicas de cultura in vitro de vegetais facilitam o melhoramento genético das variedades comerciais e representam uma etapa indispensável na obtenção de uma planta transgênica, sendo 77

88 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) rapidamente assimiladas por empresas e instituições de pesquisa e desenvolvimento. Numerosas empresas as utilizam no mundo todo para garantir a qualidade genética e fitossanitária das mudas e sementes comercializadas. Em Cuba, por exemplo, o IBP (do espanhol, Instituto de Biotecnologia de las Plantas) desenvolveu, junto com outros centros científicos, protocolos para batata, cana-de-açúcar, plátano, banana, goiaba, abacaxi, maracujá etc. O IBP está associado a uma rede de 15 biofábricas com capacidade de produzir 60 milhões de plântulas in vitro e sementes artificiais. Esta tecnologia representa, na América Latina, uma corrente comercial da biotecnologia agrícola, com ampla difusão na olericultura, na hortifruticultura, na floricultura e na propagação de plantas ornamentais, assim como na produção de plantas de interesse industrial (cana, café) e de mudas de essências florestais para as indústrias de papel. A MANIPULAÇÃO IN VITRO DAS CÉLULAS ANIMAIS AS PRIMEIRAS TENTATIVAS O primeiro experimento de cultivo de células animais data de 1885, quando W. Roux manteve uma seção de placa medular de frango em solução salina por alguns dias. Em 1907, R. Harrison conseguiu cultivar células de embrião de rã no sistema conhecido como gota pendente. Pouco depois, o cirurgião A. Carrel conseguiu cultivar células de coração de galinha e manter os cultivos durante 34 anos, apesar das dificuldades causadas pelas contaminações bacterianas. Em 1961, L. Hayflick e PS Moorhead demonstraram que as linhagens normais de células têm um número finito de divisões e reavaliaram o experimento de A. Carrel. Como o crescimento das células era estimulado mediante a adição de extratos embrionários de frango, é possível que, ao longo dessas três décadas, numerosas células de frango foram acrescentadas ao cultivo original. Dois avanços fundamentais permitiram o progresso das técnicas de cultivo de células animais: o uso de enzimas proteolíticas para liberar as células da matriz tecidual (1916) e o desenho de meios definidos (década de 1950). Em 1955, dá-se início à produção da primeira vacina da poliomielite em cultivo de células de rim de macaco, desenvolvida por J. Salk. A partir desse momento, a tecnologia é considerada madura para o lançamento de outros produtos. AS DIFERENTES MODALIDADES Uma das modalidades de importância clínica é a cultura de linfócitos para a análise do cariótipo, visando detectar as alterações cromossômicas estruturais e numéricas que possam ser a causa de distúrbios no funcionamento do organismo. Os linfócitos extraídos do paciente são colocados em um meio líquido que induz a divisão celular. A adição de colchicina inibe a formação das fibras do fuso mitótico, bloqueando as células na metáfase. Um choque hipotônico provoca a lise das células e libera os cromossomos (Figura 7.7 A). Nem todas as células, contudo, se desenvolvem bem em suspensão. Células derivadas de órgãos como o rim ou o fígado devem primeiro ser separadas, mecânica ou enzimaticamente, da matriz tecidual. Além de nutrientes, precisam aderir a um suporte inerte (vidro, plástico etc.) para crescer e o fazem formando uma monocamada de células. Uma vez esgotados o espaço e os nutrientes, uma fração dessa cultura primária será transferida para outro recipiente com meio nutriente, onde crescerá até que seja necessário repetir o procedimento. Assim, por repiques sucessivos, uma cultura primária originará várias culturas secundárias (Figura 7.7 B). 78

89 O CULTIVO DE CÉLULAS E TECIDOS Entretanto, à diferença dos microrganismos, que podem ser repicados indefinidamente, as células animais normais sofrem um tipo de morte programada (apoptose) depois de 20 a 80 divisões. Devese então reiniciar o cultivo com uma nova amostra. Existem algumas exceções que escapam dessa limitação, como as células extraídas de tumores ou as células-tronco; e também os linfócitos B, imortalizados por infecção com o vírus de Epstein-Barr ou por fusão com células de mieloma (hibridomas). Estas células, que podem crescer em suspensão ou em camada, não dependem de um suporte onde aderir nem demostram inibição por contato, dividindo-se a cada horas, em vez de horas como as células normais. OS MEIOS DE CULTIVO O cultivo de células animais só começou a se desenvolver com sucesso na década de 1950, quando H. Eagle conseguiu definir quais os nutrientes indispensáveis para o crescimento celular (Tabela 7.2). Basicamente, um meio para o cultivo de células animais inclui água, sais minerais, aminoácidos, vitaminas, glicose, soro humano, bovino ou de cavalo (fatores de crescimento) e antibióticos (para prevenir as contaminações microbianas) FIGURA 7.7. As culturas de células de origem animal B. Etapas da cultura de leucócitos para a análise do cariótipo Amostra de sangue com anticoagulante Separação dos leucócitos por centrifugação Cultivo dos leucócitos Adição de colchicina e lise celular Fixação e coloração (Bandeamento) Observação e comparação B. Etapas da cultura de células a partir de um fragmento de tecido Meio de cultivo Suspensão celular Cultura Cultura primária secundária Desagregação mecânica ou enzimática (tripsina, colagenase) Repique 79

90 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) O soro bovino fetal é um suplemento de baixo custo, geralmente adicionado na proporção de 2-10%. Além de melhorar as características físico-químicas do meio, o soro facilita a aderência ao suporte e fornece nutrientes, hormônios, fatores de crescimento etc. Em compensação, a qualidade pode variar de um lote a outro, e a riqueza de nutrientes favorece a contaminação. O soro também dificulta os estudos imunológicos e a purificação dos produtos proteicos. Em um meio definido, o soro é substituído por quantidades determinadas de diversas substâncias inorgânicas e orgânicas, algumas destas últimas produzidas por engenharia genética em bactérias ou leveduras. AS LINHAGENS CELULARES Nas Coleções de Culturas encontram-se linhagens celulares de diversos tipos, conservadas por criopreservação (Tabela 7.3). A linhagem de células HeLa, uma das mais utilizadas, continua sendo cultivada desde a década de 1950, quando foi isolada do carcinoma uterino de Henrietta Lacks, uma mulher negra e pobre de 31 anos, no Hospital Johns Hopkins (Maryland, Estados Unidos) TABELA 7.2. Os componentes de um meio de cultura básico para células animais COMPONENTES Água Fonte de carbono CARACTERÍSTICAS E EXEMPLOS Desmineralizada, destilada. Glicose. Substâncias inorgânicas NaCl, KCl, CaCl 2, MgCl 2. 6H 2O, NaH 2PO 4.H 2O, NaHCO 3. L aminoácidos Vitaminas Misturas de substâncias pouco definidas Arginina, cistina, fenilalanina, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, treonina, triptófano, tirosina, valina. Biotina, ácido fólico, colina, nicotinamida, ácido pantotênico, piridoxal, riboflavina, tiamina. Soro animal de diversa origem, inclusive humano. Outros Antibióticos (penicilina, estreptomicina) e vermelho de fenol (ph 7,2-7,4). TABELA 7.3. Origem e utilização de algumas linhagens celulares CÉLULAS ORIGEM APLICAÇÕES HeLa(*) Carcinoma cervical humano Pesquisa MDCK Rim de cachorro Produção de vacinas veterinárias 3T3 Tecido conjuntivo de camundongo Técnicas laboratoriais Nawalwa Linfoma humano -interferon COS-7 Rim de macaco verde africano Estudos sobre multiplicação viral e expressão VERO (**) Rim de macaco verde africano Produção de vacinas humanas CHO Hamster Estudos nutricionais e de expressão gênica (*) Células originadas em 1951, provenientes do carcinoma uterino de Henrietta Lacks. (**) Esta linhagem, oriunda de rim de macaco-verde africano (Cercopithecus aethiops) está aprovada pela OMS para a produção de vacinas humanas. 80

91 O CULTIVO DE CÉLULAS E TECIDOS A história de Henrietta Lacks levanta várias questões de bioética. Sem o seu consentimento ou o de seus parentes, as células foram distribuídas a laboratórios do mundo inteiro com o nome fictício de Helen Lane e, durante anos, foi negada a sua família qualquer forma de compensação que aliviasse sua situação econômica. Por outro lado, experimentos da década de 1960 em que se injetaram células HeLa em presidiários constituem uma das experiências mais antiéticas da história da ciência. Além de ser mais difícil detectar uma contaminação por células que outra por bactérias ou fungos, as células HeLa são uma fonte de contaminação temível, devido à facilidade e velocidade com que se multiplicam. Em 1966, o geneticista S. Gartler descobriu que 18 das culturas de células mais usadas continham o marcador glicose-6-fosfato desidrogenase (G6PD-A), característico da população negra americana. A partir de esse momento, as linhagens celulares são monitoradas com marcadores específicos. CONDIÇOES DE CULTIVO As células devem ser isoladas, inoculadas, e cultivadas assepticamente em um meio com os nutrientes essenciais (aminoácidos, carboidratos, vitaminas, sais minerais) adicionado de hormônios e fatores de crescimento, ambiente físico-químico regulado (ph, pressão osmótica, temperatura entre 35 0 a 37 0 C, umidade, proporção definida de O 2 e CO 2). A viabilidade das células é avaliada microscopicamente no hemocitômetro, após coloração das células mortas com azul tripano. Uma das limitações destas técnicas é que o crescimento sempre ocorre em um plano, o que dificulta a compreensão do que acontece dentro de um organismo, por isso trabalhos recentes desenvolvem outras formas de cultivo que permitam o desenvolvimento em 3D. A riqueza do meio de cultivo e a diferença na velocidade de crescimento entre uma bactéria e uma célula favorecem as contaminações das culturas. O risco de contaminação com algum patógeno se estende ao operador, especialmente se o trabalho envolve uma cultura primária de células humanas ou de primatas. O risco potencial abrange os vírus HIV e HBV em amostras de sangue, bactérias como Mycobacterium tuberculosis em amostras de pulmão, vírus SV40 em células transformadas e células tumorogênicas. DO LABORATÓRIO À INDÚSTRIA A cultura in vitro de células animais é a rota seguida para a manufatura em grande escala de vários produtos, tais como as vacinas e os anticorpos monoclonais. Também é adequada para a produção de citocinas (linfocinas, interferones, eritropoietina) e de outras proteínas de origem recombinante (fator ativador de plasminogênio, p.ex.) que, por exigir modificações pós-traducionais complexas, não podem ser produzidas em bactérias ou leveduras transformadas. Na hora de passar da escala do laboratório à escala industrial, algumas considerações devem ser levadas em conta. A cultura de células animais exige um cuidado extremado, meios de cultivo complexos e caros e condições muito rigorosas. Como as células se dividem lentamente (a cada 20 horas aproximadamente), a assepsia deve ser mantida durante períodos prolongados. A demanda de oxigênio é alta, e as células são muito frágeis e sensíveis ao cisalhamento. Finalmente, as concentrações celulares são baixas, o que diminui a produtividade e a rentabilidade do processo. Embora algumas células possam crescer livremente em suspensão, outras precisam de um suporte ao qual aderir. No biorreator, este problema pode ser resolvido de diversos modos: mediante o confinamento das células dentro de membranas semipermeáveis, imobilização em géis ou cápsulas ou fixação sobre suportes, tal como pequenas partículas de 100 a 400 m em vidro, plástico ou dextrina, em modelos de fermentadores análogos aos representados no capítulo anterior. 81

92 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Biorreatores de tamanho pequeno (até 15 l) e processos descontínuos apresentam menos problemas de contaminação, já os de maior tamanho (até l) exigem a substituição da agitação mecânica por sistemas de tipo air lift ou leito fluidificado. Evita-se a apoptose ou morte celular renovando periodicamente parte do meio para retirar os produtos excretados. Nos últimos anos, as técnicas de cultura in vitro de células animais deram um amplo impulso às pesquisas básicas e aplicadas, aos testes de diagnóstico, às técnicas de fertilização in vitro, à produção de compostos biológicos (proteínas recombinantes), de tecidos para transplante e de vacinas para uso humano e veterinário. Nos estudos toxicológicos, esta tecnologia substitui, ao menos parcialmente, a experimentação com animais, uma atividade que suscita forte resistência na sociedade devido aos questionamentos éticos levantados. 82

93 C A P Í T U L O 8 A TECNOLOGIA DO DNA AS FERRAMENTAS DISPONÍVEIS A tecnologia do DNA compreende uma série de procedimentos para extrair, fragmentar, sintetizar, marcar, identificar, amplificar e sequenciar o DNA. Trata-se de um conjunto de ferramentas de uso rotineiro em laboratórios, geralmente em sistemas automatizados especialmente desenhados para efetuar rapidamente um número altíssimo de operações. O primeiro passo a dar no campo da biologia molecular é a extração dos ácidos nucleicos. Os sistemas tradicionais coexistem com métodos de extração em fase sólida, geralmente oferecidos como kits por numerosas empresas. Estima-se que o mercado de extração e purificação de ácidos nucleicos supere os 3.8 milhões de dólares em AS NUCLEASES OU ENZIMAS DE RESTRIÇÃO Entre as numerosas enzimas utilizadas diariamente nos laboratórios, as nucleases merecem atenção especial porque quebram as ligações entre os nucleotídeos de uma cadeia de DNA. As exonucleases começam pelas extremidades enquanto as endonucleases cortam a molécula por dentro. Pertencem a este último grupo as enzimas de restrição que reconhecem sítios específicos no DNA. As enzimas de restrição são produzidas por bactérias como uma arma de defesa contra o ataque de vírus (bacteriófagos): cortando o DNA viral impedem sua multiplicação. O DNA bacteriano não é atacado por suas próprias enzimas, seja porque faltam as sequências correspondentes, seja porque estas estão camufladas pela adição de um grupo metila. Desde sua descoberta por Werner Arber, na década de 1960, já foram isoladas centenas de enzimas de restrição que agem como tesouras químicas ao reconhecer, como os seus pontos-alvo, determinadas sequências de 4 a 8 bases. Por exemplo, a enzima EcoRI, cujo nome deriva de "Escherichia coli linhagem RY13 (R), primeira endonuclease a ser descoberta" corta o DNA em dois pedaços (Figura 8.1). A sequência é um palíndromo porque pode ser lida do mesmo modo (GAATTC) nos dois sentidos (5-3 ou 3-5 ), de forma análoga a frases como Amor a Roma (Figura 8.1). Assim como há enzimas que cortam o DNA com pontas lascadas, outras fazem um corte reto. Outras enzimas colam os fragmentos, restabelecendo a ligação entre os nucleotídeos (ligases). BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

94 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A ELETROFORESE DO DNA A eletroforese separa os fragmentos de DNA obtidos com uma enzima de restrição. As amostras são colocadas em um gel no qual se aplica um campo elétrico. Os fragmentos de DNA carregados negativamente se movimentam na direção do polo positivo. Ao encontrar uma resistência menor, os fragmentos menores migram mais rapidamente (Figura 8.2) FIGURA 8.1: As enzimas de restrição (EcoRI corta o DNA na sequência palindrômica GAATTC) 5 G A A T T C 3 G A A T T C 3 C T T A A G 5 C T T A A G FIGURA 8.2. A eletroforese do DNA A. Sistemas de eletroforese Fonte de eletricidade Vertical Horizontal Tampão Amostra Cátodo Marco de plástico Fonte de Gel eletricidade Gel Tampão Eletrodo Tampão Ânodo C. Migração de diferentes amostras no gel Eletrodo Fragmentos B. Formação de bandas por migração maiores dos fragmentos de restrição no gel Amostra Fragmentos de DNA Migração Eletrodo Fragmentos menores 84

95 A TECNOLOGIA DO DNA O poder de separação varia com o suporte (gel de agarose ou de poliacrilamida) e com o tamanho do poro, que depende da concentração do meio. Também varia com as características do campo elétrico aplicado. Os fragmentos de restrição formam bandas que podem ser observadas na luz ultravioleta, após coloração com uma substância fluorescente. Fragmentos de tamanho conhecido inseridos no gel, à maneira de uma régua molecular, servem como padrão de comparação para estimar o tamanho das bandas do DNA analisado. Uma das primeiras aplicações da eletroforese dos fragmentos de restrição foi o estudo dos polimorfismos. A modificação do sítio de restrição de uma molécula de DNA (como, por exemplo, de G AATTC para GAACTC) origina fragmentos de tamanhos diferentes, denominados RFLPs ou rifleps (do inglês, restriction fragment length polymorphism). Os RFLPs são marcadores que podem ser estudados do mesmo modo que um gene que determina um caráter visível ou uma modificação bioquímica (Figura 8.3) FIGURA 8.3. Os polimorfismos A. Polimorfismo de restrição (RFLPs) Uma mutação pode gerar dois alelos diferentes, A 1 (nenhum sítio de restrição) e A 2 (um sítio de restrição). Na eletroforese, o DNA dos indivíduos A 1A 1 será visualizado como uma banda, o de A 1A 2 como três bandas e o de A 2A 2 como duas bandas. A seta indica o sítio de restrição Eletroforese Caso I (Homozigoto) Caso II (Heterozigoto) Caso III (Homozigoto) B. Polimorfismo de VNTRs presentes no mesmo fragmento de restrição, em 3 indivíduos diferentes. Caso I (6,2) Caso II (3,3) Caso III (4,5) VNTR Sítio de restrição 85

96 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) HIBRIDIZAÇÃO E SONDAS GÊNICAS Determinadas condições físicas (temperatura, ph ou concentração salina) quebram as pontes de hidrogênio entre as bases complementares, causando a dissociação dos dois filamentos de DNA. Em condições favoráveis, essas ligações se restabelecem e os filamentos se associam novamente. A reação de associação ou hibridização também ocorre entre filamentos de DNA ou de RNA de diferentes origens e tamanhos, sempre que houver algumas sequências complementares. Em função desta propriedade se constroem filamentos simples de DNA ou RNA de sequência conhecida, que são usados como sondas para reconhecer a presença de uma sequência complementar em um cromossomo ou em um fragmento de DNA (Figura 8.4) FIGURA 8.4. Hibridização de uma sequência de DNA com uma sonda complementar marcada Moléculas de DNA Sonda radioativa ou fluorescente Dissociação Reassociação O MÉTODO DE SOUTHERN Em 1975, E.M. Southern descreveu um método para analisar fragmentos de restrição com sondas específicas. As bandas de DNA cromossômico do gel de eletroforese são transferidas a uma membrana de náilon ou de nitrocelulose e o alvo é reconhecido por hibridização com uma sonda radiativa de DNA, registrando-se o resultado em um filme apropriado (Figura 8.5). O método, denominado Southern blotting, é aplicado no diagnóstico de doenças genéticas, algumas das quais causadas por mutações que modificam o padrão de bandas, ao eliminar ou criar um sítio de restrição. Métodos análogos foram desenhados para estudos de RNA (Northern blotting) e de proteínas (Western blotting). No primeiro caso, a sonda pode ser um fragmento de ácido nucleico, mas no segundo a sonda é um anticorpo específico. O FINGERPRINT Descrita por A. Jeffreys em 1985, trata-se de uma variante do método de Southern que focaliza as regiões do genoma que não se expressam e se repetem dispersas ao longo do genoma. Denominadas VNTR ou vinters (do inglês variable-number tandem repeats), o número de repetições pode variar de um cromossomo ao seu homólogo (Figura 8.3). Sendo assim, os fragmentos de restrição correspondentes têm um tamanho diferente, o que pode ser visualizado por eletroforese. Ao aumentar o número de sondas para o reconhecimento de vários tipos de VNTRs, obtém-se um padrão de bandas individual, parecido com o código de barras do comércio. Assim como as impressões 86

97 A TECNOLOGIA DO DNA digitais identificam as pessoas, as sondas revelam a identidade genética de cada um de nós. O procedimento, não por acaso chamado de Fingerprint, encontrou rápida aplicação tanto na investigação de paternidade (ou maternidade), como na identificação policial ou forense. A SÍNTESE E AMPLIFICAÇÃO DE DNA SÍNTESE DE OLIGONUCLEOTÍDEOS A síntese de oligonucleotídeos de DNA e RNA se realiza hoje em máquinas automatizadas (sintetizadores) capazes de construir, em poucos minutos, moléculas com dezenas de pares de bases (Figura 8.6). Estes oligonucleotídeos podem ser utilizados como sondas ou como primers para a PCR (ver um pouco mais adiante) FIGURA 8.5. A técnica de Southern A sonda revela a presença de uma sequência complementar. A desaparição de um sítio de restrição por mutação permite completar o diagnóstico de anemia falciforme em I e II. 1. Preparação dos fragmentos de restrição Três amostras de DNA de diferente procedência + enzima de restrição. 2. Eletroforese Separação dos fragmentos de restrição por eletroforese. Papel absorvente Membrana 3. Transferência Gel Buffer Papel de filtro para garantir a hidratação Suporte Buffer O DNA é desnaturado, e os fragmentos unifilamentares são transferidos a uma membrana de nitrocelulose. 4. Sonda radioativa 5. Autorradiografia Acrescenta-se uma sonda unifilamentar ao gene procurado. Esta hibridiza com o fragmento portador da sequência complementar. Depois de lavar, para eliminar o excesso de reagente, coloca-se sobre o filtro um filme sensível à radioatividade. 87

98 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) SÍNTESE DE cdna A transcrição da informação genética no sentido RNA DNA pela transcriptase reversa garante aos vírus com genoma de RNA (HIV, por exemplo) sua multiplicação no hospedeiro. Como ferramenta de laboratório, a transcriptase reversa possibilita a construção de filamentos de DNA complementares (cdna) a qualquer molécula de RNA (Figura 8.7). Diferente do gene original, não haverá íntrons no cdna reconstruído a partir de RNA FIGURA 8.6. A síntese de oligonucleotídeos Bloqueio Suporte O primeiro nucleotídeo (Base 1) está fixado a um suporte. Acrescentam-se os nucleotídeos seguintes (Base 2), bloqueados no sítio 5 O segundo nucleotídeo (Base 2) se une ao nucleotídeo fixo. O bloqueio em 5 determina a incorporação de um único nucleotídeo Depois de eliminar por meio de lavagem os nucleotídeos que não se incorporaram na cadeia, retira-se o bloqueio. Reinicia-se o processo com a incorporação do nucleotídeo seguinte (Base 3) FIGURA 8.7. A síntese de cdna por transcriptase reversa DNA (com íntrons) mrna Peptídeo Transcriptase reversa Degradação do RNA Síntese do filamento de DNA complementar Dois filamentos de DNA, sem íntrons cdna 88

99 A TECNOLOGIA DO DNA A REAÇÃO EM CADEIA DA POLIMERASE A reação em cadeia da polimerase (Polymerase Chain Reaction ou PCR) permite obter milhões de cópias de DNA em poucas horas (Figura 8.8). Para isso, os elementos necessários são: o DNA contendo a sequência que se deseja amplificar, desoxinucleotídeos dos quatro tipos (datp, dttp, dctp e dgtp), uma polimerase de DNA e os primers correspondentes. Estes últimos são pequenos fragmentos sintéticos de DNA complementares às extremidades da sequência-alvo, indispensáveis para que a polimerase comece a sintetizar DNA. A chave do processo é a DNA-polimerase, uma enzima estável a altas temperaturas que permite à bactéria Thermus aquaticus sobreviver em águas termais. Atualmente, esta enzima se produz por engenharia genética FIGURA 8.8. A reação em cadeia da polimerase A. Os elementos necessários Fragmento de DNA Desoxinucleotídeos Enzima taq-dna polimerase Primers Os primers são pequenos fragmentos de DNA, complementares às extremidades da sequência que se quer amplificar e indispensáveis para que a enzima DNA-polimerase inicie a síntese de DNA. B. A amplificação do DNA PRIMEIRO CICLO 95 0 C 68 0 C 72 0 C Molécula Dissociação dos Associação dos A polimerase inicia 2 cópias original filamentos primers com a a síntese de DNA a complementares sequência partir do primer complementar SEGUNDO CICLO 2 cópias 4 cópias TERCEIRO CICLO 4 cópias 8 cópias 89

100 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Em um ciclo pontuado por mudanças de temperatura, os filamentos de DNA são dissociados e anelados com os primers, possibilitando a síntese do resto da sequência pela polimerase. Repetindo muitas vezes o ciclo, gera-se em pouco tempo um número altíssimo de cópias que podem ser utilizadas em qualquer tipo de análise. Um termociclador pode realizar 25 ciclos em menos de uma hora, amplificando 10 5 vezes o fragmento de DNA. A empresa Cetus comprou de seu inventor, K. Mullis, a patente da PCR por U$S , vendendoa pouco tempo depois a Hoffmann-La Roche por U$S 300 milhões; hoje se trata de uma técnica corriqueira em qualquer laboratório de Biologia Molecular e provavelmente nenhum dos dois fez um bom negócio. Mais tarde, em 1993, Mullis recebeu o Prêmio Nobel pela invenção da PCR. Uma das grandes vantagens da PCR é que não há necessidade de isolar previamente o fragmento a ser amplificado, bastando conhecer as extremidades da sequência e escolher os primers adequados. Desenvolvendo-se de forma totalmente automatizada, o procedimento admite mais de vinte variantes. Como assinalado anteriormente em relação aos sintetizadores de oligonucleotídeos, uma das chaves do êxito da PCR é o fato de ser um procedimento automatizado que se desenvolve em máquinas rápidas e eficientes, resultado da integração da Biologia Molecular com a Informática e a Eletrônica. Sendo uma tecnologia versátil, tem dado origem a mais de 20 variantes do procedimento inicial, todas com aplicações específicas e diferentes níveis de sensibilidade. O sucesso da PCR se deve a sua extraordinária versatilidade, permitindo que seja utilizada, com objetivos diversos, em campos tão diferentes como a agricultura, a medicina veterinária, os estudos ambientais, os testes de diagnóstico e a medicina forense. Aplica-se também nos estudos antropológicos e evolutivos, tais como a extração de DNA de múmias egípcias, de animais extintos como o quagga (um tipo de zebra) ou de insetos presos em âmbar 40 milhões de anos atrás. O SEQUENCIAMENTO DO DNA O sequenciamento de um fragmento de DNA é outro procedimento de tipo iterativo que possibilita a construção de máquinas capazes de realizar rapidamente a tarefa (Figura 8.9). O sequenciamento com didesoxinucleotídeos é um aprimoramento de Sanger (1977) do método inicial de Maxam & Gilbert (1973). O DNA é amplificado e incubado com DNA-polimerase, nucleotídeos normais e didesoxinucleotídeos marcados. A síntese de DNA é interrompida a cada vez que um didesoxinucleotídeo é incorporado, gerando fragmentos de diferente tamanho. Um sistema automatizado permite identificar, na corrida eletroforética, cada um dos quatro didesoxinucleotídeos incorporados, fornecendo diretamente a sequência do fragmento sequenciado. Uma vez determinada a sequência de várias amostras, inicia-se a montagem da informação armazenada nos bancos de dados. Esta etapa se realiza em supercomputadores, exigindo um tratamento matemático para ordenar as sequências, preencher as lacunas e verificar os dados. Existem sequenciadores automatizados em que o gel é colocado nos capilares por um braço-robô que acrescenta o DNA e efetua a limpeza depois da eletroforese. No ano 2000, tais braços permitiam o tratamento de uma centena de amostras em 4 horas, sem exigir mais do que 15 minutos diários de atenção humana. No auge do estudo do genoma humano, uma empresa ligada a Celera (Biosystems Applied) mantinha os computadores funcionando dia e noite, chegando a gastar U$S mensais com eletricidade. Apesar de ter possibilitado o estudo de numerosos genomas, a partir de 2006 o método automatizado de Sanger começou a ser considerado pouco eficiente, surgindo a necessidade de desenvolver uma nova geração de tecnologias, mais rápidas e mais baratas. 90

101 A TECNOLOGIA DO DNA FIGURA 8.9. O sequenciamento de um fragmento de DNA 1. Preparar numerosas cópias do fragmento a sequenciar (tamanho aproximado: 500 pares de bases) 2. Incubar a preparação com as substâncias necessárias para a síntese de filamentos complementares e acrescentar alguns nucleotídeos, na forma didesóxi, marcados com substâncias fluorescentes de diferente cor. Primer DNA-polimerase Desoxinucleotídeos Didesoxinucleotídeos 3. Iniciar a síntese dos filamentos complementares que será bloqueada quando, em vez de um desoxinucleotídeo, se incorporar um didesoxinucleotídeo, porque estes não formam ligações fosfodiéster. Síntese bloqueada devido à incorporação de 4. Depois de vários ciclos teremos fragmentos de todos os tamanhos: 5. Os fragmentos são separados por eletroforese. O sequenciador identifica cada um deles pela fluorescência do nucleotídeo didesóxi incorporado e fornece a sequência. Fragmentos maiores Migração Sequência Fragmentos menores 91

102 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Várias tecnologias de sequenciamento next generation coexistem atualmente no mercado (454 Life Sciences, Ion Torrent s PGM, Pacific Biosciences RS and the Illumina MiSeq). O fator comum é o sequenciamento em paralelo dos fragmentos de DNA sobre um substrato sólido (High throughput sequencing). A leitura das bases incorporadas é simultânea à sua incorporação, não sendo necessário separar os fragmentos, como no método didesóxi. Em 2006, os métodos utilizados eram 500 vezes mais rápidos que os da década anterior. Hoje, além de serem ainda mais velozes, as tecnologias next generation derrubaram os custos do sequenciamento. Se, em outubro de 2004, o custo do sequenciamento de 1 Megabase ( de pares de bases) era de US$ 1598,91, em abril de 2014 o preço era de US $ 0,05. Essas tecnologias revolucionaram as pesquisas genéticas e genômicas. Em consequência, temos uma enorme avalancha de dados possibilitando estudos comparativos e evolutivos de uma dimensão inimaginável alguns anos atrás. Também abre o caminho para estudos sobre as diferenças genéticas que afetam a saúde e a doença. OS ARRAYS Como resultado do conhecimento acumulado sobre o genoma do homem e de outros organismos, já podem ser estudados alguns aspectos relacionados com a expressão e a interação dos genes. Lidar com um número enorme de informações demanda novos avanços tecnológicos, entre os quais a construção de chips de DNA ou microarrays. Estes podem analisar em paralelo grandes quantidades de material biológico (HTS). Em um tipo de microarray, os testes são processados em microplacas de poliestireno com um número variável de pequenas cavidades, cada uma delas cumprindo a função de um tubo de ensaio. Estas placas permitem realizar simultaneamente numerosos testes, utilizando uma quantidade mínima de reagentes e automatizando a leitura dos resultados. Um segundo tipo de dispositivo consta de até sondas de DNA por centímetro quadrado, fixadas mediante diferentes tecnologias (robótica, fotolitografia a uma lâmina de vidro, náilon ou sílica). A hibridização dessas sondas com as moléculas de ácidos nucleicos (cdna) marcados será visualizada por varredura (scanner) como pontos fluorescentes e analisada com um software apropriado para o tratamento da informação (Figura 8.10). Escolhem-se as sondas entre os genes codificadores de proteínas que se expressam na célula. Desse modo, se excluem os genes que correspondem ao rrna, aos trnas, às sequências de controle e ao DNA extragênico. A escolha de sequências transcritas, denominadas ESTs (do inglês, expressed sequence tags), aumenta as chances de detectar os genes que participam de alguma resposta patológica. Os microarrays são utilizados nos estudos de expressão gênica e para o sequenciamento rápido de oligonucleotídeos. O estudo simultâneo de centenas de genes é um caminho para desvendar as interrelações existentes entre eles e vários aspectos do funcionamento do genoma. Numerosas empresas fabricam arrays comercialmente; algumas estimam que em pouco tempo serão construídos arrays do tamanho de uma moeda, contendo todo o genoma humano. A CONSTRUÇÃO DE GENOMAS MÍNIMOS Com o desenvolvimento da genômica e a aparição de novas plataformas tecnológicas e na interface entre a biologia e a engenharia, nasce a biologia sintética. Trata-se de uma nova área de conhecimento com finalidades práticas, estimulada pela chegada dos métodos de sequenciamento next generation e a existência de plataformas tecnológicas accessíveis para a síntese de oligonucleotídeos. 92

103 A TECNOLOGIA DO DNA FIGURA Fundamentos da tecnologia de arrays Se as sondas representarem ESTs, saberíamos que os genes representados por B7, C2, D4, E10, G8 e H5 estão ativados. O tamanho das sondas depende da tecnologia utilizada na construção do array. Observe-se que cada uma das sondas representadas no desenho corresponde a um conjunto de moléculas semelhantes. Microarray com sondas (Oligonucleotídeos de DNA) fixadas a um suporte A partir do mrna extraído, se prepara o DNA, que é marcado com uma substância fluorescente Hibridização Eliminação do cdna marcado que não emparelhar com nenhuma sonda Varredura (scanner) para detectar as sondas que hibridizaram com o cdna Resultado: Houve complementação com as sondas B7, C2, D4, E10, G8 e H Na vanguarda deste movimento estão os pesquisadores do Instituto J. Craig Venter com a bactéria sintética (Synthia, 2010). Na construção, unidades básicas de DNA de Mycoplasma mycoides foram introduzidas em uma bactéria receptora de outra espécie, Mycoplasma capricolum, eliminando-se posteriormente o genoma desta. Synthia se reproduz normalmente e carrega sequências específicas que confirmam sua origem artificial. Bactérias especialmente desenhadas seriam de interesse para a indústria e para projetos de grande envergadura, mesmo que hoje nos pareçam um tanto fantasiosos, como a colonização de Marte. Contudo, alguns aspectos resultam preocupantes. A síntese do vírus da pólio (2002) e a ressurreição do vírus da gripe espanhola levantaram inquietude em relação à disseminação de material que possa ser utilizado para elaborar armas biológicas ou toxinas. Outro aspecto de biossegurança a considerar é o desenho de sistemas de contenção que impeçam a liberação de organismos sintéticos no ambiente, seja utilizando sistemas bioquímicos não naturais, como a introdução de benzopurinas ou benzopirimidinas no DNA, seja construindo ribossomos que 93

104 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) reconheçam códons de 4 bases. No leque de questões levantadas, destacam-se as seguintes: Quais os sistemas de contenção necessários para impedir a liberação no ambiente de novas formas de vida? Como seriam modificadas as leis de propriedade intelectual? Quais as medidas a tomar em caso de acidente? Como impedir o uso dual de equipamentos e organismos? Quais as implicações éticas do desenho de seres vivos diferentes? Esperam-se da biologia sintética avanços substanciais em medicina, indústria, energia e meio ambiente, porém, será essencial o monitoramento dos riscos para a biossegurança, a biosseguridade e a bioética. 94

105 C A P Í T U L O 9 A ENGENHARIA GENÉTICA O NASCIMENTO DA BIOTECNOLOGIA MODERNA Ao término da Segunda Guerra Mundial, a Genética e a Biologia molecular se desenvolveram a uma velocidade tal que bastaram 25 anos para esclarecer os temas fundamentais: a estrutura dos ácidos nucleicos, o código genético, a ação dos agentes mutagênicos, a genética dos microrganismos, a estrutura e a síntese das proteínas, a regulação gênica etc. É nesse contexto de avanços muito rápidos que devemos situar as primeiras experiências de engenharia genética com a tecnologia do DNArecombinante. A utilização da palavra recombinante nos remete à recombinação gênica, um fenômeno que ocorre normalmente durante a meiose, devido à permuta de fragmentos cromossômicos homólogos. Mediante o corte e a união de pequenos pedaços de DNA, a engenharia genética cria novas combinações de genes, pertencentes ou não a indivíduos de uma mesma espécie. A engenharia genética é um instrumento valioso para o estudo dos genomas, a produção de proteínas em organismos modificados geneticamente e a geração de organismos transgênicos com propriedades novas. AS PRIMEIRAS EXPERIÊNCIAS Em 1972, na Universidade de Stanford (Califórnia), P. Berg conseguira associar o DNA de dois microrganismos diferentes e formar uma molécula mista de DNA. Na mesma universidade, Stanley Cohen especializava-se na biologia dos plasmídeos microbianos, pequenas moléculas de DNA circular, portadoras de alguns genes capazes de se replicar de maneira autônoma. E, na Universidade da Califórnia (São Francisco), Herbert Boyer isolava a primeira das enzimas de restrição que corta o DNA em fragmentos com pontas lascadas, uma característica que simplifica a tarefa de associar ( colar ) os pedaços. S. Cohen e H. Boyer se encontraram em uma conferência científica no Havaí. A ideia de uma colaboração entre ambos teria surgido uma noite, diante da praia de Waikiki, ao redor de sanduíches e cervejas. As experiências conjuntas começaram assim que eles regressaram a seus laboratórios em São Francisco. Boyer dispunha da enzima de restrição EcoRI, Cohen, de dois plasmídeos, um deles com um gene de resistência à kanamicina (psc102) e o outro com um gene de resistência à tetraciclina e um sítio de restrição para EcoRI (psc101). BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

106 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA 9.1. Cortar, colar, copiar: a experiência que deu origem à engenharia genética A. Preparação dos plasmídeos recombinantes Bactérias T R CORTAR COLAR Enzimas de restrição psc 101 Bactérias T S psc 102 B. Transferência dos plasmídeos e seleção das bactérias recombinantes Plasmídeos Bactérias T R K R recombinantes Bactérias T S K S COPIAR OU CLONAR Multiplicar Meio de cultivo com tetraciclina e kanamicina Legenda T: tetraciclina, T s : sensível à tetraciclina, T r : resistente à tetraciclina, K= kanamicina, K s : sensível à kanamicina, K r : resistente à kanamicina, psc101: plasmídeo de Stanley Cohen n 0 101; psc102: plasmídeo de Stanley Cohen n FIGURA 9.2. Sapobacter ou Bactosapo? Com a entrada de um plasmídeo recombinante, com DNA codificador de rrna de Xenopus, em uma bactéria, esta passa a sintetizar rrna de Xenopus. Xenopus DNA de Xenopus Bactéria recombinante Moléculas de Xenopus Fragments of amplified Xenopus laevis DNA, coding for 18S and 28S ribosomal RNA and generated by EcoRI restriction endonuclease, have been linked in vitro to the bacterial plasmid pscl01; and the recombinant molecular species have been introduced into E. coli by transformation. These recombinant plasmids, containing both eukaryotic and prokaryotic DNA, replicate stably in E. coli. RNA isolated from E. coli minicells harboring the plasmids hybridizes to amplified X. laevis rdna. Extraído de: Replication and Transcription of Eukaryotic DNA in Escherichia coli (MORROW J.F., COHEN S.N., CHANG A.C. Y., BOYER H.W., GOODMAN H.M.E R.B. HELLING. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 71:5,

107 A ENGENHARIA GENÉTICA No primeiro experimento, os pesquisadores abriram o psc101 e inseriram fragmentos do psc102, utilizando a enzima de restrição EcoRI como tesoura e uma ligase como cola. A seguir, eles introduziram o plasmídeo recombinante na bactéria Escherichia coli. A obtenção de clones resistentes a ambos antibióticos (tetraciclina e kanamicina) mostrou o sucesso do experimento (Figura 9.1). Boyer e Cohen repetiram a experiência, substituindo o DNA bacteriano por um fragmento de DNA do sapo Xenopus laevis. Com esse objetivo, selecionaram um gene codificador de rrna no DNA do sapo e o inseriram no plasmídeo psc101. Introduzido o plasmídeo recombinante na bactéria Escherichia coli, esta começou a sintetizar rrna de Xenopus (Figura 9.2). A extraordinária novidade do experimento está na transferência de genes de uma espécie para outra bem distante na escala evolutiva; um fenômeno limitado na natureza a uma mesma espécie ou a espécies muito próximas. MITOS E REALIDADE As infinitas possibilidades da tecnologia do DNA-recombinante despertaram alguns dos antigos mitos. Por desobedecer a Zeus, entregando o fogo ao homem, Prometeu sofreu o terrível castigo de ser acorrentado a uma montanha e ter o fígado devorado por uma águia. Instrumento da vingança divina, Pandora abrira a caixa da qual saíram todos os males da humanidade. A ambiguidade da nova biotecnologia, com os seus desafios e promessas, costuma ser representada nas duas faces de Jano, um rei com o dom de ver simultaneamente o passado e o presente. Em 1974, P. Berg e mais nove pesquisadores publicaram uma carta nas revistas científicas Science, Nature e Proceedings of the National Academy of Science, alertando os colegas sobre os possíveis riscos da nova tecnologia e pedindo uma moratória sobre os experimentos com DNA, até serem estabelecidos os cuidados e salvaguardas necessárias. Considerando que o uso desta tecnologia apresenta vários riscos possíveis porque novos tipos de organismos, alguns deles potencialmente perigosos, podem ser introduzidos no ambiente, se não existirem os devidos controles, o National Institute of Health (NIH) formou o Recombinant DNA Advisory Committee (RAC). Em 1975, a conferência de Asilomar (Monterrey, Califórnia), reunindo 139 pesquisadores de 17 países, classificou os experimentos em função do risco (baixo, médio ou alto), pedindo a suspensão dos experimentos de alto risco enquanto não se determinassem quais as formas de contenção adequadas, tanto físicas como biológicas. Enfatizava-se também a necessidade de trabalhar com microrganismos enfraquecidos, incapazes de sobreviver fora do laboratório. Em 1976, o RAC publicou um conjunto de normas de trabalho que, além de revisadas periodicamente, devem ser seguidas por todos os pesquisadores e instituições que recebam dinheiro do NIH para pesquisas com DNA-recombinante. Com base nos trabalhos publicados em 1973, a Universidade de Stanford obteve uma patente que lhe rendeu U$S 300 milhões, divididos com a Universidade da Califórnia. A Universidade de Stanford licenciou o uso da tecnologia a mais de 400 empresas, entre as quais Amgen, Eli Lilly, Genentech, Johnson & Johnson e Schering Plough. Qual o invento patenteado? O processo ou ferramenta biotecnológica que consiste em inserir um DNA exógeno em um plasmídeo bacteriano e este em uma bactéria, que, dessa forma, se transforma em uma fábrica capaz de reproduzir esse gene em quantidades ilimitadas. Nesta breve recapitulação do nascimento da Biotecnologia moderna, vale destacar a preocupação com a segurança, mostrada oportunamente pelos pesquisadores e as instituições científicas envolvidas. Não há na história da ciência ou da tecnologia um episódio de responsabilidade coletiva comparável ao da Conferência de Asilomar. Paralelamente a sua exploração comercial, a engenharia genética é utilizada atualmente em centenas de laboratórios de universidades e institutos de pesquisa. E não há registro ou relato de 97

108 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) nenhum acidente relacionado com essa tecnologia. Talvez valha a pena lembrar que Prometeu foi liberado depois de 30 anos, e que bem no fundo da caixa de Pandora estava a esperança. AS BIBLIOTECAS DE GENES O enorme tamanho de um genoma dificulta a localização de um gene e seu mapeamento. Uma forma de facilitar a manipulação é extrair o DNA de um organismo determinado, cortá-lo com enzimas de restrição, inserir os fragmentos em plasmídeos e introduzir os plasmídeos recombinantes em bactérias. Cada bactéria formará um clone e cada clone levará um fragmento do genoma do organismo estudado. O conjunto de clones representa o genoma inteiro de um organismo, constituindo uma biblioteca genômica (Figura 9.3). Boa parte do DNA não leva genes codificadores de proteínas. Por isso, um procedimento alternativo é a montagem de uma biblioteca gênica, incluindo exclusivamente os genes que se expressam, ou seja, os genes responsáveis pela síntese de proteínas. Separa-se o mrna codificador, e, com a enzima transcriptase reversa, constroem-se as moléculas correspondentes de cdna. Inserem-se estas em plasmídeos, e os plasmídeos em bactérias. Com este procedimento, obviamente, o número de clones na biblioteca será menor (Figura 9.3). O número de clones também depende do tamanho do fragmento que o vetor pode carregar. Tanto os plasmídeos bacterianos como o bacteriófago transportam fragmentos pequenos de DNA de 10 a 20 kb, outros vetores genéticos foram especialmente desenhados para carregar fragmentos maiores (cosmídeos, YACs ou yeast artificial cromossomes, BACs ou bacterial artificial chromossomes, transposons etc.). A construção de bibliotecas de genes representa o primeiro passo para o mapeamento de um genoma. Ao sequenciamento dos fragmentos segue a montagem da informação. Trata-se de uma etapa complexa em que se alinham as sequências, se preenchem lacunas e se verificam os dados. O tratamento matemático das informações demanda algoritmos sofisticados e computadores poderosos. Uma vez organizada a sequência, esta é armazenada em bancos de dados. O usuário tem acesso através da Internet, mediante programas especializados que acumulam uma enorme quantidade de informações. A CONSTRUÇÃO DE UM MICRORGANISMO RECOMBINANTE Uma das primeiras proteínas de origem recombinante foi a somatotropina ou hormônio de crescimento. Como a enzima de restrição eliminava do cdna, além da sequência codificadora do peptídeo-guia, os nucleotídeos correspondentes aos primeiros aminoácidos da molécula, estes tiveram que ser acrescentados quimicamente, em um processo extremamente engenhoso (Figura 9.4). A transferência gênica permite obter microrganismos que sintetizem alguma substância diferente, geralmente visando o cultivo em grande escala. O gene de interesse costuma ser selecionado e estudado na bactéria de laboratório Escherichia coli e, posteriormente, transferido à espécie na qual se pretende produzir a proteína correspondente. Além de Escherichia coli e de Saccharomyces cerevisiae, existem vários outros microrganismos que são habitualmente utilizados como hospedeiros: Bacillus subtilis, Picchia pastoris, Pseudomonas, Streptomyces, Aspergillus nidulans, Neurospora crassa etc. Estes microrganismos são utilizados na produção de fármacos (insulina, hormônio de crescimento, vacinas) ou de enzimas (quimosina) e, também, na degradação de poluentes. 98

109 A ENGENHARIA GENÉTICA FIGURA 9.3. A construção de bibliotecas de genes A triagem dos clones pode ser feita reconhecendo a "etiqueta" representada por uma sequência conhecida no DNA (STS, ou sequence tagged site; ESTs, ou expressed sequence tagged); no caso do gene se expressar, a triagem também pode ser feita com anticorpos específicos para a proteína sintetizada. BIBLIOTECA GENÔMICA Contém todas as sequências do genoma BIBLIOTECA GÊNICA Contém as sequências codificadoras de proteínas Extração de DNA Extração de mrna Fragmentação com enzimas de restrição Transcriptase reversa Síntese do cdna Inserção no vetor Inserção no vetor Plasmídeos Plasmídeos Incorporação do vetor na célula hospedeira (Transformação) Incorporação do vetor na célula hospedeira (Transformação) Bactérias Multiplicação e seleção das células transformadas Bactérias Caracterização dos clones Quando o gene não se expressa no hospedeiro Quando o gene se expressa no hospedeiro Mediante sondas gênicas Mediante anticorpos específicos para a proteína recombinante 99

110 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA 9.4. A produção de somatotropina por engenharia genética cdna obtido a partir do mrna da somatotropina Peptídeo guia A remoção do sinal correspondente ao peptídeo-guia, com a enzima de restrição Hae III, remove também 72 bases, codificadoras dos primeiros 24 aminoácidos da molécula Fragmento de DNA sintético com as 72 bases correspondentes aos 24 primeiros aminoácidos Plasmídeo recombinante União dos dois fragmentos de DNA Inserção em um plasmídeo Transformação Transcrição Tradução Somatotropina FIGURA 9.5. Algumas estratégias possíveis de clonagem Biblioteca genômica Biblioteca gênica Identificação do clone com o gene que se procura Síntese in vitro Reação em cadeia da polimerase (PCR) Clonagem e subclonagem em Escherichia coli Transferência a outro organismo, visando a expressão do gene 100

111 A ENGENHARIA GENÉTICA ENCONTRAR O GENE De um modo geral, encontrar um gene equivale a procurar uma agulha num palheiro. O gene pode ser localizado por triagem dos clones de uma livraria gênica ou genômica (Figura 9.3). Se esta não existir, pode ser necessário construí-la, em uma primeira rodada de clonagem, para achar o gene de interesse. A identificação do clone de interesse envolve a identificação de uma proteína com anticorpos marcados ou o reconhecimento de um gene por hibridização com uma sonda marcada. A segunda dificuldade está na obtenção de numerosas cópias desse gene. Uma solução é a multiplicação do clone correspondente e posterior isolamento do gene procurado. Outra é a amplificação do gene mediante a PCR, sempre que se conheçam as sequências iniciais e finais ou, eventualmente, as sequências adjacentes à região onde está inserido. Se a sequência do gene for conhecida e relativamente curta, podem-se construir cadeias curtas de oligonucleotídeos e associálas, formando um gene sintético que será amplificado por PCR. Existem numerosas estratégias, que dependem do caso e, também, das características e possibilidades do laboratório (Figura 9.5). Seja qual for o caminho seguido, uma vez que as cópias do gene de interesse forem obtidas, estas terão que ser transferidas ao hospedeiro definitivo. INSERIR O GENE A transferência de um fragmento estranho de DNA se vê facilitada pela utilização de vetores. Um vetor é uma molécula de DNA que se duplica de maneira autônoma dentro de uma célula, carregando vários genes, entre os quais alguns marcadores que permitam reconhecer sua presença dentro da célula. É no vetor que será inserido o fragmento de DNA estranho, para multiplicação ou integração no genoma. Além dos plasmídeos (bacterianos e de leveduras) e bacteriófagos (, m13), também se utilizam como vetores os transpósons, que são elementos genéticos móveis capazes de pular de um lugar a outro do genoma, espalhando ou não cópias. Construídos em função das necessidades, existem hoje vetores bacterianos, vetores de leveduras e vetores bifuncionais que podem ser utilizados tanto em bactérias como em leveduras. As primeiras experiências de Engenharia Genética foram feitas na bactéria Escherichia coli, um microrganismo muito conhecido e fácil de cultivar em laboratório. Porém, Escherichia coli não é o organismo ideal para a expressão de genes eucarióticos. Células procarióticas e eucarióticas diferem em relação ao processamento do mrna e às modificações das proteínas depois da tradução. Por este motivo, quando se procura expressar genes de mamíferos, Escherichia coli é substituída por outras células eucarióticas, como a levedura Saccharomyces cerevisiae, um fungo utilizado há séculos na produção de alimentos e bebidas. Para que um gene se expresse em uma célula hospedeira, é necessário que esta reconheça seus próprios sinais de expressão. Para poder sintetizar uma proteína exógena, a célula deverá ler a sequência codificadora com seus próprios sinais de transcrição (promotor) e de tradução (sítio de ligação com o ribossomo, término de leitura). O ideal é construir um vetor que já contenha os genes marcadores para seleção ou reconhecimento, os sítios de restrição, uma sequência promotora e os sinais adequados de início e fim da transcrição. Ao colocar a sequência codificadora da proteína, o vetor funciona como um cassette de expressão (Figura 9.6). Outros fatores adicionais intervêm na construção de um vetor de expressão. Um promotor forte, por exemplo, permitirá sintetizar uma quantidade grande de proteína, o que será comercialmente interessante se esta for uma enzima. Entretanto, se a proteína em questão for uma toxina que possa afetar o hospedeiro, será preferível escolher um promotor fraco. Uma possibilidade interessante é a 101

112 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) utilização de um promotor que responda a um fator externo controlável (substrato, temperatura), de maneira tal que o gene possa ser ligado ou desligado no momento que se considere conveniente. Finalmente, também deve ser considerado o destino da proteína dentro da célula; se esta for secretada haverá que acoplar na construção gênica um gene de sinalização que a leve até a membrana celular. Existem diversos métodos para inserir o DNA recombinante dentro da célula. Facilita-se a entrada do DNA com algumas manipulações, tais como a adição de CaCl 2 no meio e/ou a modificação da temperatura. A aplicação de forças elétricas também aumenta as chances do DNA penetrar na célula, ao abrir os poros da membrana (eletroporação). Os plasmídeos atravessam a membrana celular em um processo denominado transformação, que ocorre em determinadas condições fisiológicas da célula hospedeira. Em se tratando de vetores virais, a infecção da célula promove a entrada do DNA exógeno dentro da célula. Fala-se neste caso de transfecção (transformação + infecção) FIGURA 9.6. A estrutura de um vetor de expressão Este deve incluir os elementos genéticos da célula hospedeira para a transcrição e tradução. Origem da replicação mrna Promotor Sinais de término de leitura Sinais de início de leitura Gene exógeno IDENTIFICAR OS MICRORGANISMOS RECOMBINANTES A tecnologia do DNA-recombinante está baseada em fenômenos que ocorrem em frequências muito baixas. A existência de métodos de seleção eficientes possibilita detectar e recuperar aquelas células que incorporaram um gene estranho. Associa-se o gene estranho a um marcador seletivo como, por exemplo, um gene de resistência a algum antibiótico. Em presença deste, só poderão se multiplicar e formar clones ou colônias as células que incorporaram ambos os genes. Entretanto, o uso de genes de resistência a antibióticos é considerado polêmico, porque existe uma possibilidade remota dos genes serem transferidos das bactérias transformadas para as bactérias do ambiente. Também podem ser utilizados como marcadores seletivos os genes que codificam a síntese de um aminoácido. Neste caso, a seleção do microrganismo recombinante ocorre em um meio sem esse aminoácido. 102

113 A ENGENHARIA GENÉTICA Além dos marcadores seletivos, os pesquisadores contam com outro tipo de marcadores que permitem identificar as bactérias transformadas e, também, acompanhar a expressão de um gene no organismo modificado. Destacam-se entre estes marcadores, ou genes repórteres: GAL e GUS, respectivamente o gene da -galactosidase e o gene da glucuronidase, que transformam o substrato correspondente em um composto colorido; GFP, um gene da medusa Aequorea Victoria, que sintetiza uma proteína fluorescente, verde brilhante na luz ultravioleta; LUC, o gene da luciferase, uma enzima dos vaga-lumes, que emite luz em presença do substrato. A CHEGADA DA COMUNIDADE DIY A crise econômica do início de século XXI excluiu dos empregos formais numerosos jovens com boa formação profissional e, paralelamente, o progresso tecnológico causou uma queda acentuada nos preços dos equipamentos básicos de laboratório e de síntese/sequenciamento de ácidos nucleicos. Nos países desenvolvidos, onde a cultura do empreendedorismo é muito forte, algumas iniciativas educativas de várias organizações (Biobricks Foundation, SYNBIO etc.) e universidades (Harvard, MIT etc.) promoveram a criação da comunidade DIYBIO (do inglês, do it yourself). Tomando como referência o nascimento da indústria dos computadores pessoais na Califórnia, esta geração monta laboratórios de fundo de garagem, absorve o conhecimento disponível em open source e aproveita equipamentos de segunda mão, quando não cria os próprios. Trabalha com base na livre difusão de protocolos e sequências biológicas standard que são usadas, com segurança, como blocos fundamentais (biobricks). O objetivo de desenhar e construir sistemas biológicos simplificados que cumpram funções determinadas os integra à Biologia Sintética. Os elementos fundamentais são moléculas de DNA, associadas entre si como os blocos de Lego. Denominados partes, dispositivos e sistemas em função de sua complexidade, os elementos serão colocados em um microrganismo ou chassis (Figura 9.7). Observe-se que os participantes utilizam exclusivamente microrganismos do Grupo de Risco 1, com baixo ou nenhum risco individual e coletivo, e biobricks seguros disponibilizados por organizações responsáveis. Inclusive figura na Internet um kit para bioengenharia (Amino, a US$ 700), equivalente ao Arduino em eletrônica, com tudo o que é preciso para sintetizar microrganismos BS1, geneticamente modificados, e criar fragrâncias, flavorizantes, materiais, medicamentos etc FIGURA 9.7. Semelhanças entre os Legos e os Biobricks ( A. Classificação hierárquica PARTES DISPOSITIVOS SISTEMAS Codificam funções básicas e sua eficiência Exemplos: sequência gênica de uma proteína ou de um promotor da RNA polimerase, número de vezes / momento em que uma polimerase ou um ribossomo passam por determinado ponto. Coleções de partes que implementam uma função Exemplo: produção de uma proteína fluorescente como resposta à presença de uma determinada substância no ambiente. Tarefas complexas Exemplo: oscilar na emissão de duas cores com uma frequência determinada. CHASSIS Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae etc. 103

114 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) B. Construções intercambiando as partes Gene funcional Promotor Sítio de ligação com o ribossomo (rbs) c Sequência codificadora da proteína Sequências finalizadoras da transcrição Vamos mudar o promotor? Enzimas de restrição c Novo promotor + ligase c Novo gene funcional A comunidade DIY compartilha valores e normas de trabalho. O estímulo à inovação científica e econômica, assim como ao empreendedorismo, está presente nas competições internacionais igem (International Genetically Engineered Machine), organizadas pelo Massachussets Institute of Technology (MIT), a partir de No entanto, algumas organizações pedem um controle estrito, temendo a participação de pessoas sem treinamento adequado (biohackers) ou mal-intencionadas (biocrackers). Na comunidade DIY, a biologia sintética se desenvolve em um sistema transparente de código aberto (Open Source), não sendo possível restringir o acesso a informação, materiais e equipamentos. Por outro lado, uma regulação estrita limitaria o acesso ao conhecimento de uma comunidade promissora, explicitamente comprometida com o desenvolvimento de códigos de conduta, protocolos seguros e regulamentações. Este movimento abre um novo canal para o ensino e divulgação da ciência que, além de atingir o público geral e complementar a atividade acadêmica, contribui para a democratização do conhecimento. A CONSTRUÇÃO DE PLANTAS TRANSGÊNICAS As primeiras plantas transgênicas datam de 1983 quando, por caminhos independentes e complementares, M. Van Montagu e J. Schell (Universidade de Gante, Bélgica), M. Dell-Chilton (Universidade de Washington, S t Louis) e R. T. Fraley (Monsanto) conseguiram transferir genes bacterianos para plantas. As plantas transgênicas se originam via cultura in vitro a partir de células vegetais modificadas geneticamente. Portadoras de um gene exógeno ou transgene, sua obtenção visa o melhoramento das propriedades agronômicas e nutritivas dos vegetais e, também, sua utilização para produzir substâncias novas (biofábricas). 104

115 A ENGENHARIA GENÉTICA O TRANSGENE Para garantir a transferência de uma sequência gênica determinada, deve-se construir em redor uma estrutura complexa que inclua também um gene marcador, um promotor e as sequências de leitura adequadas (sequências iniciais e terminais). Denomina-se transgene o conjunto formado pela sequência gênica e a estrutura que o acompanha. O promotor desencadeia a transcrição da sequência codificadora de interesse. Um promotor constitutivo permitirá a expressão gênica na maioria dos tecidos e ao longo da vida da planta, enquanto outro limitará a expressão a um tecido determinado. Também existem promotores que respondem a estímulos ambientais internos ou externos, como a luz. O gene marcador confere resistência a substâncias normalmente tóxicas para as células vegetais, tais como os antibióticos ou os herbicidas, de modo que, em um meio seletivo, só sobrevivam células que integraram o transgene. O uso de marcadores de resistência a antibióticos na construção de plantas desperta vários questionamentos, apesar de se tratar de antibióticos sem uso clínico e que já estão presentes nas bactérias do intestino do homem. Estes marcadores podem ser substituídos, mas como sua utilidade se limita ao processo de transformação, o melhor seria eliminá-los uma vez cumprida sua função. Já foram desenvolvidas várias técnicas genéticas de remoção dos marcadores, esperando-se que nos próximos anos sua retirada se transforme em uma prática corriqueira de laboratório. A TRANSFERÊNCIA DOS GENES A CÉLULAS VEGETAIS Agrobacterium tumefaciens é uma bactéria do solo, que leva um plasmídeo denominado Ti (do inglês, Tumour induced plasmid). Quando infectadas com a bactéria portadora desse plasmídeo, as plantas eudicotiledôneas desenvolvem galhas, isto é, tumores característicos (crown gall). A eliminação de alguns genes na região T do plasmídeo Ti conserva sua capacidade de inserção no cromossomo da célula hospedeira, eliminando a propriedade de induzir tumores. Esta característica transforma o plasmídeo em um vetor adequado para a transferência de genes de outras espécies às células vegetais. Basta colocar o transgene na região T do plasmídeo previamente desarmado para se obter um plasmídeo recombinante que poderá ser transferido novamente a Agrobacterium ou a células hospedeiras, onde o transgene irá se inserir em algum lugar do genoma (Figura 9.8). Com esta tecnologia criou-se a primeira planta transgênica, um tabaco resistente à kanamicina. Continua sendo utilizada até hoje, com as eudicotiledôneas. Porém, as plantas monocotiledôneas (arroz, milho, trigo) e algumas leguminosas não são infetadas por Agrobacterium, de modo que, para conseguir transferir genes, deve-se recorrer a outros métodos. Os métodos físicos têm a vantagem de poder ser aplicados tanto nas plantas monocotiledôneas como nas eudicotiledôneas. A eletroporação e o tratamento com uma substância desestabilizadora da membrana plasmática (polietilenglicol ou PEG) são técnicas muito utilizadas. Porém, o método preferido atualmente é a biolística. Um revólver especial (gene gun) dispara microprojéteis de ouro ou tungstênio, recobertos de DNA, em direção às células. O dispositivo possibilita a entrada do DNA exógeno no núcleo, nas mitocôndrias ou nos cloroplastos. De um modo geral, a transformação se realiza em protoplastos, células em que a parede celular foi eliminada com enzimas. DO LABORATÓRIO AO CAMPO No laboratório, transfere-se a construção genética às células receptoras por algum dos métodos possíveis (geralmente eletroporação, biolística ou uso de vetores, como o plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens); a seguir, se selecionam e recuperam as células transformadas e, 105

116 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) mediante as técnicas de cultura in vitro, se regeneram as plantas correspondentes. Note-se que este trabalho costuma ser realizado em plantas cujo genótipo favorece a transformação e a regeneração da planta transformada, mas que geralmente resultam pouco vantajosas do ponto de vista agronômico. A presença do transgene, assim como o número de cópias e o lugar em que estas se integraram no genoma, é conferida mediante técnicas bioquímicas e/ou marcadores moleculares (polimorfismos na molécula de DNA, repetição de sequências), porque são aspectos que podem influir na expressão gênica. Considera-se alcançado o êxito quando o transgene se expressa no lugar correspondente e com um adequado nível de atividade, restando por verificar a estabilidade da expressão gênica e o seu valor agronômico FIGURA 9.8. A construção de uma planta transgênica no laboratório O plasmídeo Ti "desarmado" portando um gene exógeno é transferido a células de discos foliares. Formam-se calos que poderão regenerar a planta inteira. Plasmídeo Ti Plasmídeo Ti desarmado DNA exógeno Planta que será manipulada geneticamente Plasmídeo recombinante Transformação Discos foliares Cultura de calos Regeneração da planta com o gene exógeno integrado no genoma 106

117 A ENGENHARIA GENÉTICA Acabada a etapa de laboratório, iniciam-se os testes controlados em casa de vegetação, para selecionar as plantas-mãe que darão origem a várias gerações de retrocruzamentos seletivos com alguma das linhagens elite. Os testes visam a obtenção de uma linhagem transgênica de alto rendimento adaptada a um contexto específico. Em outros termos, uma variedade cultivada ou cultivar, com uma produtividade potencial parecida à da linhagem elite e que expresse o traço codificado pelo novo transgene (Figura 9.9). Conceitualmente, estes testes são semelhantes aos efetuados no processo de melhoramento tradicional; no entanto, a utilização de marcadores moleculares e de técnicas de cultura in vitro permite caracterizar a progênie bem mais rapidamente. Só então se dá início à liberação planejada no meio ambiente, que envolve o cultivo de plantas em experimentos protegidos e testes de campo em diferente escala, até que o novo híbrido transgênico esteja pronto para o seu cultivo comercial. A liberação do cultivo dependerá da autorização da legislação local, geralmente bastante restrita a esse respeito FIGURA 9.9. As etapas da construção de uma planta transgênica Transformação por engenharia genética Regeneração mediante técnicas de cultura de tecidos Caracterização molecular e bioquímica Avaliação do valor agronômico Melhoramento mediante cruzamentos com linhagens de elite Obtenção de uma variedade transformada geneticamente Experimentos e testes de campo, em pequena e grande escala Autorização da legislação local Liberação do cultivo para sua exploração comercial CÉLULAS E ANIMAIS TRANSGÊNICOS A TRANSFERÊNCIA GÊNICA A CÉLULAS ANIMAIS Um dos objetivos da engenharia genética é a produção de proteínas recombinantes em culturas celulares. Em relação aos microrganismos, a grande vantagem das células animais é possuir os sistemas de transcrição e de processamento das proteínas indispensáveis para a expressão dos genes de organismos superiores. Observe-se que, em relação às células animais, a palavra transformação designa a conversão de uma célula normal em maligna, sendo substituída por transfecção. O transporte de DNA exógeno 107

118 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) dentro da célula é assegurado por métodos físicos (eletroporação, microinjeção, ingestão de micropartículas, fusão de lipossomos com a membrana plasmática) e por vetores (vírus, plasmídeos e transpósons). A transfecção mediante vetores virais dos quais se eliminaram as sequências patogênicas interessa ao laboratorista porque os vírus animais infectam tecidos específicos e se integram no genoma da célula hospedeira de maneira estável. Em mamíferos, os vírus utilizados mais frequentemente como vetores são o SV40, a vacina, os retrovírus e os adenovírus. Células de inseto também podem ser manipuladas geneticamente com vetores como os elementos P de transposição de Drosophila, ou como o baculovírus, uma vez eliminado o gene que permite sua proliferação na natureza. Assim como visto anteriormente em relação aos microrganismos e às plantas, a sequência codificadora é colocada em uma construção gênica bem definida que inclui um gene marcador para selecionar as células que receberam o transgene. Utilizam-se como marcadores genes de resistência a antibióticos, genes para características metabólicas (Tk ou timidina quinase) etc. O grande problema é sempre a integração do transgene no lugar desejado, sem interromper a expressão de outros genes ou causar a ativação de algum oncogene. M. Capecchi, M. Evans e O. Smithies receberam o Prêmio Nobel de Medicina de 2007 por solucionar esse problema em célulastronco de camundongo. Para integrar a construção gênica em um determinado sítio, colocaram, nas extremidades do transgene, sequências de DNA homólogas às extremidades do segmento a ser substituído. Como distinguir a integração no lugar desejado (recombinação homóloga) da integração ocorrida em qualquer outro lugar (recombinação não homóloga)? Acrescentando na construção gênica, um pouco mais longe, um gene de seleção negativa. Se a célula integrar a construção em qualquer outro lugar do genoma, ela se tornará sensível a um segundo antibiótico. Inversamente, se a célula for resistente a este antibiótico, isto significa que houve integração no lugar desejado. APLICAÇÕES A ovelha Dolly nasceu em 1996, depois de numerosas tentativas de transferir o núcleo de uma célula mamária a um ovócito anucleado (Figura 9.9). Adorada pela mídia, o clone Dolly teve que ser sacrificado em 2003 com um tumor no pulmão, artrite e sinais de envelhecimento precoce. Poucos meses depois do nascimento de Dolly, o mesmo grupo do Instituto Roslin e de PPL Therapeutics anunciou o nascimento de Polly, uma ovelha transgênica para o gene codificador do fator IX, uma proteína que falta nos hemofílicos. Em vez de receber, como Dolly, o núcleo de uma célula diferenciada mantida em cultivo, Polly recebeu um núcleo proveniente de células embrionárias modificadas geneticamente. Mesmo sendo difícil de obter, um animal transgênico pode ser bem mais interessante do ponto de vista econômico que o cultivo de células em biorreatores, um processo complexo e de alto custo. Na construção de animais transgênicos para a produção em grande escala de uma proteína recombinante, escolhe-se habitualmente um promotor que se expresse na glândula mamária, de modo que o produto gênico apareça no leite do animal. Cabras transgênicas produtoras de fator ativador de plasminogênio (tpa), vacas produtoras de lactoferrina, somatotropina ou insulina já são uma realidade. Na Argentina, BioSidus mantém uma dinastia de vacas produtoras de hormônio de crescimento. No Brasil, a Universidade do Ceará conserva um rebanho de cabras transgênicas de raça Canindé que secreta no leite o fator de estimulação de colônias de granulócitos humanos (hg-csf). Chama-se Atryn o primeiro anticoagulante liberado comercialmente, na Europa (2006) e nos Estados Unidos (2009), produzido no leite de cabra transgênica (GTC Biotherapeutics). Outra aplicação interessante da tecnologia de transfecção de células-tronco embrionárias cultivadas in vitro na pesquisa clínica é a construção de modelos animais para o estudo de doenças 108

119 A ENGENHARIA GENÉTICA humanas. Desse modo se obtiveram camundongos transgênicos para genes determinantes de algumas doenças humanas, tais como câncer de mama (BRCA 1), doença de Huntington, anemia falciforme etc. Estes animais são de grande utilidade para as pesquisas farmacológicas FIGURA Construção de animais transgênicos A. Microinjeção. Após a transfecção, implantam-se os ovos em fêmeas receptivas (pseudográvidas). Aqueles que incorporaram o transgene originarão, neste caso, animais de tamanho maior (supermouse). Cruzamento Descendência Ovos fertilizados Injeção de DNA exógeno Implantação em fêmeas pseudográvidas B. Transfecção de células-tronco embrionárias A implantação do blastócito com células modificadas em uma fêmea aguti gera animais quiméricos, com células que levam o caráter para pelagem marrom e células com o caráter para pelagem preta. Do cruzamento entre quimeras, nascem alguns animais com pelagem preta, tendo incorporado o DNA exógeno no genoma. Camundongos de pelo preto Animais quiméricos Descendência Blastocisto Transfecção e seleção das células Blastocisto Camundongo de pelo marrom (aguti) Injeção das células Implantação modificadas 109

120 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Esta estratégia é utilizada não só para construir modelos animais com um gene ativo (knock in), mas também para colocar um gene inativo (knock out). Após a transfecção de células-tronco embrionárias com um gene desativado, realiza-se sua transferência a blastócitos, que, reimplantados, originarão animais quiméricos, isto é, animais com células de dois tipos: umas em que o gene está ativado e outras em que não está ativado porque incorporaram o transgene. Dos cruzamentos entre quimeras com células germinais portadoras do gene desativado nascerão animais homozigotos com duas cópias do gene inativo (Figura 9.10). AS NOVAS TECNOLOGIAS DE EDIÇÃO GÊNICA BASEADAS NO RNA INTERFERENTE A injeção na célula de um RNA artificial (sirna) de sequência parcialmente semelhante à do DNA de um gene determinado possibilita silenciar sua expressão. Trata-se de uma ferramenta poderosa para o estudo da genômica funcional para interferir parcialmente (knockdown) com sua tradução no citoplasma, de maneira temporária e sem danificar a célula. Com a integração no genoma de um DNA codificador de RNA em forma de grampo de cabelo (shrna, do inglês, short hairpin RNA) consegue-se uma resposta permanente. Depois de processado pela maquinaria celular dos mirna, o shrna irá interferir na tradução de uma molécula externa que lhe for complementar. Adicionando à construção gênica um promotor induzível, pode-se regular sua expressão em diferentes tecidos ou em determinados intervalos de tempo. Um dos frutos desta tecnologia é o feijão resistente ao vírus do mosaico dourado da Embrapa. BASEADAS NAS NUCLEASES SÍTIO-DIRIGIDAS: ZFN s e TALEN As técnicas convencionais de engenharia genética inserem o DNA exógeno ao acaso, com o risco de interromper algum gene de interesse. A recombinação homóloga é um procedimento eficiente em células-tronco embrionárias de camundongo, mas não se aplica a outros tipos celulares nem a outras espécies. As primeiras tecnologias de edição gênica agem mediante proteínas sítio-específicas, unidas a uma enzima de restrição que corta o DNA. Como o reconhecimento do alvo depende das proteínas, devemse construir proteínas específicas para cada sequência-alvo. As duas tecnologias mais utilizadas são as nucleases dedos de zinco ou ZFN s (do inglês zinc finger nucleases) e TALEN (do inglês Transcription Activator-Like Effector Nucleases). Quando o DNA é cortado, a célula une novamente os dois extremos, um mecanismo natural de reparação sujeito a erros que causam o knockout do gene em questão. Mas não é esse o único interesse destas técnicas. Uma vez efetuado o corte, tanto se podem induzir mutações de um par de bases como gerar inserções ou deleções e, inclusive, inserir um gene exógeno em um lugar bem definido do genoma. Tanto ZFN s (2003) como TALEN (2010) são complexas, trabalhosas e pouco precisas, mas TALEN é preferida por ser mais fácil de desenhar e, por conseguinte, mais econômica. BASEADAS NA IMUNIDADE BACTERIANA: CRISPR-Cas9 Como sobrevive uma bactéria ao ataque de um fago? Uma possibilidade é que o fago seja metabolicamente inativo; a outra é que entrem em ação mecanismos de defesa bacterianos, como a 110

121 A ENGENHARIA GENÉTICA fragmentação do DNA viral pelas enzimas de restrição bacterianas. Estas reconhecem sequências específicas que no próprio genoma estão protegidas por modificações químicas (metilação). A bactéria sobrevivente poderá, mediante a nuclease Cas, incorporar algumas sequências de DNA do fago em seu genoma, entre os segmentos repetitivos do sistema CRISPR (do inglês, Clustered regularly interspaced short palindromic repeats). Se houver um novo ataque, a transcrição e o processamento desse DNA pode levar à degradação Cas-dependente do DNA do bacteriófago. Estes mecanismos de defesa (CRISPRs) são frequentes e têm sido encontrados em 40% das eubactérias e 90% das arqueas sequenciadas. Baseadas nesse mecanismo de imunidade bacteriana, E. Charpentier (Universidade de UMEA, Suécia; Universidade de Viena, Áustria) e J. Doudna (Universidade de Califórnia, Estados Unidos) mostraram que bastava juntar um RNA de fita única com a enzima Cas9 em um tubo de ensaio para cortar qualquer sequência de DNA no lugar desejado. No ano seguinte, F. Zhang e G. Church (Harvard Medical School) usaram o sistema CRISPR-Cas9 para editar o genoma de células animais e humanas. Assim como as nucleases sítio-dirigidas ZNF s ou TALEN, CRISPR pode ser utilizada para gerar mutações de ponto, deleções ou inserções. Com pequenas alterações, CRISPR-Cas9 se transforma na maquinaria ideal para inibir ou ativar genes, desenvolver estudos epigenéticos e induzir a expressão gênica por substâncias químicas ou estímulos luminousos. Entre outras aplicações, O sucesso de CRISPR-Cas9 se deve tanto a sua versatilidade como à simplicidade, já que as ferramentas básicas são a enzima Cas e o RNA-guia, bem mais fácil e econômico de sintetizar que as proteínas (Figura 9.11). Qual o status de um organismo editado? Em primeira aproximação, seria um organismo geneticamente modificado. Porém, diferentemente dos OGMs que estão no mercado, um organismo editado não carrega necessariamente genes de outras espécies. A edição pode inativar um gene, gerar uma versão mais favorável de um gene existente ou transferir uma variante da mesma espécie, tal como ocorreria na natureza por mutação espontânea ou por melhoramento. Deste ponto de vista, os organismos editados não deveriam ser enquadrados na legislação existente FIGURA A edição gênica com CRISPR-Cas9 Os mecanismos naturais da célula tendem a reparar o corte sítio-dirigido, produzindo-se alguns erros (mutação de ponto, deleção) e possibilitando a inserção de um transgene. Cas9 RNA-guia DNA genômico Corte Transgene + Gene repórter Mutação de ponto Deleção Inserção de um transgene 111

122 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Em mamíferos, a enzima e o RNA-guia podem ser introduzidos por injeção em células embrionárias; em plantas por transfecção de protoplastos ou por agroinfiltração. Posteriormente à edição, as nucleases são degradadas pelas células e desaparecem do organismo. No caso de usar uma construção gênica, esta desaparece por segregação na divisão celular. Legalmente, a edição gênica não entraria nos padrões atuais da regulamentação. Existem repositórios onde são armazenadas centenas de plasmídeos e milhares de linhagens virais, expressando Cas e um guia diferente de RNA. Nas bibliotecas de vírus (lentivírus, vírus adenoassociados) estão armazenadas as sequências de mais de genes. Estes bancos pertencem a instituições como Harvard Plasmid Database, DNASU Plasmid Repository, National Institutes of Health s PlasmID, Mammalian Gene Collection ou a organizações independentes como Addgene e Zinc Finger Consortium. Empresas como Thermofisher oferecem, além dos vetores, sistemas que por transfecção mediada por lipídios podem ser introduzidos diretamente na célula, gerando resultados em 4 dias. A relevância das novas tecnologias de edição é indiscutível, como mostram algumas das primeiras aplicações. Em bactérias, CRISPR permite remover modificações genéticas para se adequar a critérios de biossegurança ou de proteção da propriedade intelectual; na indústria de laticínios, é utilizada para proteger os bacilos lácticos das infecções virais. Também possibilita a obtenção de plantas resistentes a vírus e árvores com menos lignina e menos taninos (Populus). Como ferramenta de pesquisa, CRISPR é utilizada no estudo de ativadores e inibidores epigenéticos e na edição de células-tronco para entender as doenças neurológicas. Desativando simultaneamente vários genes, abre-se a possibilidade de estudar doenças poligênicas como autismo, diabetes ou esquizofrenia. Conseguem-se criar animais knockin ou knockout por injeção de Cas9 e do RNA específico no zigoto fertilizado. Basta que um animal ou as células de uma cultura in vitro tenham incorporado por transfecção o gene codificador de Cas, para que só seja necessário acrescentar o RNAguia específico para as sequências-alvo escolhidas. A patente das técnicas de edição gênica está sendo disputada por Doudna, Charpentier e Zhang. A biotecnologia é hoje um empreendimento milionário construído sobre pesquisadores, universidades, empreendedores, empresas, interesses econômicos de grandes capitais. Pesquisadores chineses criaram macacos com dois genes alterados. Na Inglaterra, foram autorizados experimentos de edição gênica com embriões que não serão implantados. A comunidade científica de vários países começa a vislumbrar a possibilidade de edição genética de embriões para terapias gênicas. A alteração da linhagem germinal representa até o momento uma fronteira técnica e moralmente intransponível, mas qual será o posicionamento da sociedade? BIOSSEGURANÇA E REGULAÇÃO No Brasil, a principal norma reguladora sobre as atividades com organismos geneticamente modificados é a Lei de Biossegurança (Lei n , de 24 de março de 2005) que agrega diferentes áreas do direito: ambiental, sanitário, defesa do consumidor, propriedade intelectual, civil, administrativo e penal. A palavra final sobre as questões técnicas corresponde à Comissão Nacional Técnica de Biotecnologia (CTNBio), uma instância colegiada multidisciplinar cuja finalidade é prestar apoio técnico consultivo e assessoramento ao Governo Federal na formulação, atualização e implementação da Política Nacional de Biossegurança relativa a OGM, bem como no estabelecimento de normas técnicas de segurança e pareceres técnicos referentes à proteção da saúde humana, dos organismos vivos e do meio ambiente, para atividades que envolvam a construção, experimentação, cultivo, 112

123 A ENGENHARIA GENÉTICA manipulação, transporte, comercialização, consumo, armazenamento, liberação e descarte de OGM e derivados ( As normas da legislação brasileira estão de acordo com o Protocolo de Cartagena sobre Biossegurança e as diretrizes do Codex Alimentarius e da Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OCDE). Nem a biologia sintética nem a edição de genes se enquadram totalmente dentro das previsões de um sistema regulatório baseado na engenharia genética. À medida que as novas tecnologias se desenvolvam será necessário adequar a legislação, mantendo os princípios de precaução, contenção e biossegurança. 113

124 C A P Í T U L O 10 BIOTECNOLOGÍA E INDÚSTRIA O PROCESSO WEIZMANN No século XIX, os principais produtores de borracha natural eram o Brasil e a Inglaterra (plantações na Malásia). O processo de vulcanização, que confere ao material sua elasticidade e resistência (C. B. Goodyear, 1839), e a invenção dos pneus (J. Dunlop, 1888) transformaram a borracha em um insumo estratégico para o crescimento da indústria automotora. Quando, em uma tentativa de dumping, os países produtores diminuíram a oferta e provocaram um aumento significativo do preço, desencadeou-se a corrida à borracha sintética. Enquanto a Alemanha tentava sintetizar a borracha a partir de um derivado do petróleo (butadieno), a Inglaterra explorava as possibilidades de síntese de moléculas precursoras por fermentação. Nesse contexto histórico, o químico de origem russa Chaim Weizmann desenvolveu, na Universidade de Manchester (1914), um processo fermentativo que utilizava a bactéria Clostridium acetobutilycum para a produção de butanol (um precursor do butadieno) e acetona. Por ser o primeiro processo fermentativo industrial desenvolvido em condições assépticas, o processo Weizmann é considerado um marco histórico na biotecnologia industrial. No início da Primeira Guerra Mundial, a atenção da Inglaterra desviou-se da borracha para a produção de explosivos e, especialmente, de cordite, uma pólvora à base de nitrocelulose cuja preparação demanda acetona. Por ser sintetizada a partir de carbonato de cálcio, um insumo importado da Alemanha, a via química de produção de acetona tornou-se inviável, tendo a Inglaterra que começar a explorar a via biotecnológica. Recrutado pelo Comitê de Munições e tendo cedido a patente do processo ao governo britânico, Weizmann começou a produzir acetona, por fermentação microbiana de amido de milho, na Nicholson Gin Distillery (Londres), mas, devido à guerra e à falta de alimentos, o suplemento de carboidratos acabou se tornando um fator limitante na produção. Em 1916, os britânicos transferiram a produção para uma destilaria em Toronto (Canadá), ao tempo que era construída outra instalação na Índia. Em 1917 começou a funcionar uma fábrica produtora de acetona por fermentação de milho em Indiana (Estados Unidos). Finalizada a guerra, a acetona e o butanol continuaram a ser utilizados como solventes. Os caminhos da ciência, da tecnologia e da política se cruzaram várias vezes. Químico e jornalista, Weizmann chegou a ser um dos mais importantes líderes comunitários do movimento sionista mundial. Sua contribuição ao esforço bélico da Primeira Guerra Mundial estaria relacionada com a declaração Balfour (1918), que prometera ao povo judeu um lar na Palestina. Finalizado o mandato conferido pela Liga das Nações à Grã-Bretanha (1947), criou-se o Estado de Israel (1948), do qual Weizmann foi o primeiro presidente. Fundado em Rehovot (Israel), o Instituto de Pesquisas Científicas e Tecnológicas leva o seu nome. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

125 BIOTECNOLOGIA E INDÚSTRIA A INDÚSTRIA QUÍMICA A VIA QUÍMICA A indústria química se caracteriza por produzir substâncias que atendem as necessidades de outras indústrias. Enquanto algumas empresas sintetizam os derivados petroquímicos básicos (etileno, propileno, butadieno), outras os transformam nos petroquímicos finais: polietileno (PE), polipropileno (PP), policloreto de vinil (PVC), poliésteres e óxido de etileno. Um terceiro grupo converterá esses materiais em objetos de consumo tais como filmes, recipientes, objetos diversos etc. As empresas devem responder às mudanças do mercado ajustando-se rapidamente a qualquer variação de preço da matéria-prima ou da energia. Para subsistir, uma indústria terá que reagir com versatilidade, mediante o desenvolvimento de processos tecnológicos inovadores e rentáveis. Os processos descartados poderão ser reutilizados, se a condição do mercado tornar-se favorável novamente. Um exemplo típico é a evolução do mercado da acetona. Subproduto da corrida à borracha sintética durante a Primeira Guerra Mundial, a acetona passou a ser um produto indispensável para a indústria de armamentos. Uma vez concluído o conflito, reapareceu como solvente essencial na fabricação de lacas, uma função da qual seria afastada mais tarde por outras substâncias. A indústria química do século XX se baseou, principalmente, no petróleo e seus derivados. A crise dos anos 1970 chamou a atenção da sociedade para os riscos da dependência de um recurso não renovável. A diminuição das reservas conhecidas cria a necessidade de apelar a tecnologias de extração novas e caras, geralmente insustentáveis. A situação poderá mudar quando, respondendo aos apelos da sociedade para diminuir as emissões de carbono, o petróleo seja substituído parcial ou totalmente, por fontes de energia alternativas. A VIA BIOTECNOLÓGICA A via biotecnológica está baseada na transformação da biomassa, um recurso barato e renovável. Para substituir a via química, devem-se desenvolver processos que possibilitem a obtenção de produtos, materiais e energia a um custo competitivo e com menor impacto ambiental. Todas estas condições se encontram satisfeitas na obtenção de numerosas moléculas de interesse industrial, a partir de milho, de óleos vegetais ou de madeira (Tabela 10.1) TABELA Diversidade de produtos derivados de algumas matérias-primas renováveis SETOR MATÉRIA-PRIMA COMPONENTES APLICAÇÕES Açúcar e amido Óleos vegetais Cana-de-açúcar, beterraba açucareira, sorgo sacarino, trigo, milho, batata, arroz, mandioca etc. Canola, soja, coco, girassol, dendê, gorduras animais. Açúcar, amido, melaço. Triglicerídeos, ácidos graxos, glicerol. Madeira Pinho, eucalipto. Celulose, papel e lignina. Solventes, produtos farmacêuticos, adesivos, resinas, polímeros, selantes, limpadores, etanol. Surfactantes para sabões e detergentes, ingredientes inativos de produtos farmacêuticos, tintas, pinturas, resinas, cosméticos, ácidos graxos, lubrificantes, materiais de construção. Materiais de construção, fibras, polímeros, resinas, adesivos, pinturas, revestimentos, tintas, piche. 115

126 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A Biotecnologia Industrial fundamenta-se na microbiologia, nas fermentações e na biocatálise, recebendo o impacto da biotecnologia moderna (genômica, engenharia metabólica, engenharia genética), que abre perspectivas novas no melhoramento das linhagens microbianas e das variedades vegetais. A produção da vitamina B 2 (BASF) e do antibiótico cefalexina (DSM Life Sciences Products) são dois exemplos bem-sucedidos da substituição da síntese química pela ação microbiana. Esta resultará vantajosa sempre que, entre o substrato inicial e o produto final, existam vários metabólitos intermediários, porque um agente biológico será capaz de realizar diretamente a sequência completa de reações. A utilização de organismos geneticamente modificados, permite melhorar os processos produtivos e desenhar produtos novos. Em relação à segurança, cabe lembrar que as características metabólicas das linhagens industriais estão alteradas, de modo a elas crescerem em condições artificiais muito estritas, tornando-as incapazes de sobreviver fora do laboratório ou, eventualmente, de competir com os microrganismos do ambiente. A percepção pública nutre uma atitude neutra, ou favorável, em relação à biotecnologia industrial. Em parte, porque os produtos são utilizados como insumos para outras indústrias, o que lhes confere pouca visibilidade. E também porque, ao utilizar matérias-primas renováveis e desenvolver processos menos poluentes com menor gasto de energia, as biotecnologias ajudam a atenuar a imagem poluidora da indústria química. Não é por acaso que a biotecnologia industrial é denominada biotecnologia branca. OS PRODUTOS BIOTECNOLÓGICOS Alguns processos biotecnológicos geram substâncias em quantidades pequenas (volume baixo) que serão vendidas a um preço elevado (alto valor agregado). Trata-se geralmente de metabólitos secundários cuja produção demanda grandes investimentos, um nível tecnológico avançado e uma mão de obra altamente qualificada. Nesta categoria, denominada química fina, inserem-se os produtos farmacêuticos e agrícolas, alguns aditivos alimentares, os aminoácidos, as vitaminas e as enzimas. A via biotecnológica também se aplica a algumas substâncias fabricadas em grandes quantidades (volume alto), em processos que demandam investimentos menores, e operações mais simples. Entre estes produtos, de valor agregado intermediário, encontramos metabólitos primários, tais como alguns solventes, ácidos orgânicos e polímeros. No caso de substâncias produzidas em grandes quantidades e com baixo valor agregado, como os biocombustíveis líquidos (etanol, biodiesel) ou gasosos (biogás), alguns países contam com sistemas produtivos em pequena escala, funcionando em instalações sépticas e com mão de obra não especializada. Esses sistemas não exigem mais que equipamentos simples e pequenos investimentos, mas sua eficiência é baixa, de modo que vão sendo substituídos, gradual e progressivamente, por outros de nível tecnológico avançado, gerenciados por grandes empresas, em empreendimentos economicamente sustentáveis. Atualmente, a via biotecnológica resulta economicamente viável para alguns metabólitos, as enzimas, os bioplásticos e os biocombustíveis. METABÓLITOS DE INTERESSE COMERCIAL Estima-se que a biotecnologia branca responderá, nos próximos anos, por 20% das vendas do setor químico. Entre as moléculas de interesse comercial, vários metabólitos primários e secundários se destacam por sua versatilidade (Tabela 10.2). 116

127 BIOTECNOLOGIA E INDÚSTRIA ÁLCOOIS E SOLVENTES Vimos previamente alguns aspectos históricos relacionados com a produção de acetona e butanol por fermentação. Estima-se que a imobilização de microrganismos daria um novo impulso à síntese de solventes, aumentando a produtividade em aproximadamente 60%. Também deve-se destacar a importância do etanol, 95% do qual é produzido por via biotecnológica. ÁCIDOS ORGÂNICOS A produção de ácido cítrico (4.0 x 10 5 toneladas/ano) depende quase exclusivamente do cultivo do fungo filamentoso Aspergillus niger, em processos fermentativos de diversos tipos. O ácido cítrico é utilizado na indústria de alimentos como aditivo (acidulante e antioxidante), na cosmética como regulador do ph e, na indústria farmacêutica, como anticoagulante e ingrediente de tabletes efervescentes. Em relação ao ácido acético, os processos industriais modernos também dependem da ação bacteriana (gêneros Acetobacter, Gluconacetobacter e Gluconobacter). Com numerosas aplicações, o ácido acético é um precursor de várias moléculas intermediárias, como o anidrido acético e os acetatos éster, e de produtos como o acetato de celulose, o celofane, o acetato raiom etc. Também participa como solvente na produção de borracha, plásticos, gomas, resinas e óleos voláteis. A indústria farmacêutica o utiliza como acidificante. O ácido láctico é obtido por fermentação bacteriana (Lactobacillus) ou fúngica (Rhizopus oryzae), sendo um importante insumo para as indústrias de alimentos e de fármacos e a cosmética. Também toma parte, como monômero, na síntese de um polímero biodegradável, o ácido poliláctico (PLA). O ácido succínico encontra aplicações em várias indústrias (alimentos, fármacos, cosmética), assim como na produção de plásticos e de materiais para a indústria automotora. Trata-se de outro bloco fundamental para a síntese de polímeros, resinas de ABS (acrilo-nitrilo-butadieno), Nylon 6.6, solventes etc. AMINOÁCIDOS A produção industrial de aminoácidos se destina, principalmente, à nutrição humana (66%) e ao enriquecimento de rações animais (33%) e, em menor grau, às indústrias farmacêuticas e cosméticas (1%). O método produtivo mais antigo é a extração, por hidrólise de proteínas (soja, cabelos); os outros métodos incluem a síntese, a fermentação e a biocatálise. A síntese química apresenta o inconveniente de gerar misturas das duas formas isoméricas (acil-d e acil-l), representadas habitualmente como tipo mão direita" e tipo "mão esquerda". Como os organismos vivos só assimilam L-aminoácidos, estes devem ser separados das misturas racêmicas por biocatálise. A imobilização de enzimas estereoespecíficas nos biorreatores facilita a produção industrial, reduzindo os custos de maneira significativa. Observe-se que a separação é desnecessária no caso da glicina, que não apresenta ambas as formas, e da DL-metionina, já que os seres vivos convertem a forma D em L. A via fermentativa é conveniente para a produção de vários aminoácidos. O agente biológico Corynebacterium glutamicum produz ácido glutâmico (1,1 milhão de toneladas/ano), que é usado na cozinha oriental como flavorizante (glutamato monossódico), para realçar o sabor dos alimentos. A L-fenilalanina e o ácido L-aspártico são obtidos por imobilização conjunta de Escherichia coli e Pseudomonas dacunhae, em uma coluna de fermentação, ou por uma bactéria geneticamente modificada (Escherichia coli). Ambos são os componentes do adoçante não calórico Aspartame ( toneladas/ano). 117

128 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) TABELA Metabólitos primários e secundários obtidos por fermentação e/ou bioconversão enzimática METABÓLITOS PRIMÁRIOS Álcoois e solventes Ácidos orgânicos EXEMPLOS Etanol, butanol, acetona, glicerol, manitol. Ácido láctico, ácido cítrico, ácido acético, ácido glucônico, ácido itacônico, ácido málico, ácido tartárico, ácido pirúvico, ácido succínico. Aminoácidos Ácido L-glutâmico (monoglutamato de sódio), L-lisina, L-fenilalanina, ácido L- aspártico, L-carnitina. Polissacarídeos Nucleotídeos e nucleosídeos Xantana, dextrana, pululana, gelana, agar, alginatos, carrageninas. Ácido guanílico (5 GMP) e ácido inosínico (5 IMP). Vitaminas Vitamina B 2 (riboflavina), vitamina C (ácido L-ascórbico), vitamina B 12 (cianocobalamina). Corantes β-caroteno, astaxantina, ficocianina, monascina. METABÓLITOS SECUNDÁRIOS Moléculas para a saúde humana e/ou animal Moléculas para a agricultura Moléculas para a indústria de alimentos EXEMPLOS Antibacterianos, antivirais, antifúngicos, anti-helmínticos, antitumorais, soros, imunoglobulinas, vacinas, imunossupressores, estatinas etc. Inseticidas e pesticidas, fatores de crescimento vegetal. Condimentantes e aromatizantes para a indústria alimentícia Outros aminoácidos cumprem a função de aditivo em alimentos (L-cisteína, toneladas/ano), ou de complemento nutricional em rações animais (L-treonina, toneladas/ano; L-lisina toneladas/ano). Por outro lado, a indústria farmacêutica absorve toneladas/ano de L-arginina e 500 toneladas/ano de L-triptófano, de L-valina e de L-leucina. NUCLEOTÍDEOS E NUCLEOSÍDEOS No Japão, os ácidos guanílico (5 -GMP) e inosínico (5 -IMP) são obtidos mediante diferentes processos fermentativos, e vendidos comercialmente como potenciadores de sabor. POLISSACARÍDEOS Os espessantes e gelificantes, extraídos das algas marinhas, estão sendo substituídos, parcialmente, por polissacarídeos de origem microbiana. A goma xantana ( toneladas/ano), um produto de fermentação da bactéria Xanthomonas campestris, entra na composição de molhos prontos, pudins, geleias, sorvetes, dentifrícios etc. Suas propriedades espessantes também são utilizadas na recuperação do petróleo. As dextranas (200 toneladas/ano) são obtidas por via fermentativa, a partir de diversos microrganismos. As de alto peso molecular são empregadas como espessantes na indústria de alimentos, na preparação de filmes protetores de sementes (indústria agrícola) e na composição das emulsões fotográficas. As de baixo peso molecular são usadas como plasma sanguíneo artificial, para melhorar o fluxo sanguíneo em casos de traumatismos e cirurgias. VITAMINAS Apesar da maior parte das vitaminas serem obtidas, industrialmente, por via sintética ou extrativa, a via fermentativa é vantajosa nos casos da riboflavina (vitamina B 2) e do ácido ascórbico (vitamina C). Ainda é a única possível para a cianocobalamina (vitamina B 12), uma molécula complexa que não é 118

129 BIOTECNOLOGIA E INDÚSTRIA sintetizada nem por animais nem por vegetais. Um precursor da vitamina A, o -caroteno, é sintetizado pela alga Dunaliella bardawil, que cresce na água salobra, em grandes tanques ao ar livre, em uma região desértica perto da costa do Mar Vermelho (Israel). ENZIMAS Algumas enzimas podem ser extraídas facilmente dos tecidos ou dos órgãos de seres vivos: as amilases do malte da cevada; a papaína da papaia; a ficina do figo, a bromelina do látex do abacaxi. Do estômago de suínos se separa a pepsina e do pâncreas dos mesmos se obtém a pancreatina, que é uma mistura de amilases, proteases e lipases. Já a renina é extraída do quarto estômago de bezerros, e a catalase, do fígado ou do sangue de bovinos. A extração de enzimas de origem vegetal ou animal está sujeita à disponibilidade de terra e às flutuações das colheitas ou do abate. Por isso, a tendência é substituí-las por outras de origem microbiana que, obtidas mediante processos fermentativos em grande escala, garantem uma produção regular de qualidade constante. Mesmo cumprindo uma função idêntica, duas enzimas produzidas por microrganismos diferentes podem apresentar propriedades dessemelhantes. Por exemplo, a lactase ( -galactosidase), uma enzima que hidrolisa a lactose, está presente em bactérias, leveduras e fungos. No entanto, as condições ótimas de funcionamento diferem uma da outra: 40 0 C, 37 0 C e C (temperatura); 3-4, 7,2 e 6,6 (ph). A escolha de uma enzima proveniente de um microrganismo ou de outro dependerá das condições que o bioprocesso demande. Considerando que ainda há muito a desvendar sobre a biodiversidade microbiana e a arte de alterar suas vias metabólicas, existem grandes chances de encontrar enzimas com propriedades diferentes, que possibilitem o desenho de processos industriais inovadores. Por outro lado, a chegada das novas técnicas de biologia molecular aliadas aos sistemas robotizados de HTS (do inglês, High Throughput Selection) dará, certamente, um impulso extraordinário a esta área. A otimização de um processo industrial contempla o custo da matéria-prima, o tipo de fermentação (submersa ou em meio semissólido) e os controles de ph e temperatura, necessários para o bom desenvolvimento do processo. Do ponto de vista econômico, não vale a pena elaborar ou redimensionar esses parâmetros para todo microrganismo produtor de uma enzima interessante. Muito mais proveitosa é a transferência da sequência codificadora dessa enzima a um dos microrganismos industriais já bem conhecidos, tais como as bactérias do gênero Bacillus (Bacillus subtilis) e os fungos do gênero Aspergillus (Aspergillus oryzae). Mais de 60% da produção comercial de enzimas procede da biotecnologia moderna, com linhagens seguras, versáteis, altamente produtivas, sem desvios metabólicos laterais, e adaptáveis aos bioprocessos industriais. Um fator que incide no custo de uma enzima é a dificuldade técnica encontrada na separação e purificação (etapa downstream). Em geral, as enzimas mais baratas são as extracelulares, ou seja, as que são secretadas para fora da célula como, por exemplo, as hidrolases (amilases, proteases e celulases). As mais caras são as enzimas intracelulares, que precisam ter um grau de pureza maior para ser utilizadas como fármacos, ou como reagentes em testes de diagnóstico. As enzimas são insumos para outras indústrias, especialmente as de alimentos e bebidas, rações, detergentes, analíticas e farmacêuticas. Atualmente, o maior produtor é Novozyme (Dinamarca), que responde por 48% do mercado. A empresa mantém em funcionamento vários fermentadores de l, contabiliza mais de patentes e 700 produtos, dedicando a quase totalidade de seu orçamento de pesquisa e desenvolvimento à otimização de microrganismos, produtos enzimáticos e tecnologia. A demanda de enzimas industriais se mantém relativamente estável em economias 119

130 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) maduras (Estados Unidos, União Europeia, Japão e Canadá) e cresce em economias em desenvolvimento. BIOPOLÍMEROS E BIOPLÁSTICOS A denominação de biopolímeros abrange aqueles que são sintetizados pelos seres vivos, como a celulose, o amido e os óleos vegetais; e os que resultam da polimerização de uma molécula básica, como o ácido láctico, proveniente de uma fonte renovável. Um dos bioplásticos mais versáteis é o polilactato (PLA), um poliéster comercializado como Ingeo, obtido por polimerização do ácido láctico, um produto da fermentação de milho. Utiliza-se como revestimento de filmes e de papel (BASF), recheio de almofadas e edredons (NatureWorks) e material de embalagens descartáveis por diversas empresas (Coca-Cola, McDonald s). Também está sendo aproveitado na indústria automotora (Hyundai) e eletrônica (Samsung). Uma das novas aplicações do Ingeo por NatureWorks, está nas impressoras 3D. Polímeros sintetizados diretamente por microrganismos, como os poli-hidroxialcanoatos (PHAs) e o poli-hidroxibutirato (PHB), já entraram no mercado de embalagens das indústrias de alimentos e de cosméticos. Este último, por ser biocompatível, encontrou importantes aplicações nas áreas médica e veterinária (Biopol). No interior de São Paulo, uma usina piloto (Biocycle), relacionada com empresas do setor sucroalcooleiro (Biagi, Balbo), já está produzindo PHB por fermentação bacteriana do açúcar de cana. Está sendo pesquisada a transferência dos genes codificadores de PHA (Ralstonia eutropha) e de PHB (Alcaligenes eutropus), a microrganismos e plantas (canola). A indústria dispõe atualmente de, aproximadamente, trinta moléculas essenciais para a construção de polímeros, tais como os ácidos carboxílicos, o etanol, os aminoácidos, os triglicerídeos, o furfural, o sorbitol, o glicerol etc. Essas biomoléculas possibilitam tanto a obtenção de plásticos inovadores biodegradáveis, como a de plásticos convencionais, não biodegradáveis e semelhantes aos de origem petroquímica. Entre estes: as resinas de poliuretano sintetizadas a partir de óleo de soja, o poliéster de origem bacteriano Sorona 3GT (DuPont, Genencor) de amplo uso na indústria têxtil, do PVC ou polietileno verde (Braskem, Tetrapak), que é um polímero do etileno obtido a partir do etanol de cana utilizado nas embalagens de leite e sucos de fruta, e na confecção de sacos de lixo. Como caracterizar um bioplástico? Pela origem? Pela biodegradabilidade? Existe bastante confusão a esse respeito, porque alguns setores consideram que a proveniência ou a biodegradabilidade bastariam para aplicar-se o rótulo de bioplástico. Contudo, uma substância só deveria ser considerada bioplástico se respondesse, simultaneamente, aos dois critérios: proveniência de uma fonte renovável e biodegradabilidade. OS BIOCOMBUSTÍVEIS A combustão é a forma mais simples de liberar energia; por isso algumas comunidades rurais queimam madeira, resíduos vegetais ou excrementos secos de ruminantes. Contudo, 75% da energia consumida no planeta é retirada dos combustíveis fósseis (carvão, petróleo e gás natural). Considerando que as reservas são limitadas, e que a queima de combustíveis fósseis é a causa de vários problemas ambientais, parece acertado buscar outras formas de extrair energia. Uma fonte alternativa é a biomassa, um recurso que, por ser renovável, pode fornecer energia de modo sustentável. A grande vantagem da biomassa sobre os combustíveis fósseis é que libera uma quantidade de CO 2 igual à que absorveu durante o seu crescimento em um período recente, enquanto a quantidade de CO 2 liberada pelos combustíveis fósseis fora removida do ambiente há milhões de anos

131 BIOTECNOLOGIA E INDÚSTRIA FIGURA As etapas necessárias para a produção de etanol a partir de diferentes matérias-primas BIOMASSA AMILÁCEA BIOMASSA SACARINA BIOMASSA CELULÓSICA Hidrólise enzimática Hidrólise ácida ou enzimática CALDO AÇUCARADO FERMENTESCÍVEL Fermentação Destilação ETANOL A tecnologia fermentativa nos oferece combustíveis eficientes, como o etanol ou o biogás. Existem outras possibilidades, tais como a obtenção de biodiesel por transformação química de óleos vegetais e, futuramente, a produção de hidrogênio a partir de água, utilizando a capacidade fotossintética das microalgas. Os biocombustíveis contribuem para reduzir alguns dos problemas ambientais que tanto nos afligem, tais como a acumulação de CO 2 e outros gases de efeito estufa (óxido nitroso e metano). Nos países que os adotam, os biocombustíveis substituem a gasolina, parcial ou totalmente, modificando a realidade do setor de transportes. Curiosamente, os primeiros automóveis de Henry Ford, com motores de ignição por centelha, funcionavam com etanol de milho, e os primeiros motores de Rudolf Diesel, de ignição por compressão, o faziam com óleo de amendoim. Com o petróleo barato, passou-se a utilizar gasolina e óleo diesel para os automotores, mas o aumento dos preços, ocorrido na década de 1970, mostrou a conveniência de substituir os derivados do petróleo por etanol e biodiesel. Atualmente, o etanol é o principal biocombustível líquido para transporte. A maior parte da produção (90%) está concentrada no Brasil e nos Estados Unidos, como produto da fermentação da cana-de-açúcar e do milho, respectivamente. Os outros países produtores são o Canadá, a China, a União Europeia (França e Alemanha) e a Índia. Embora um litro de etanol forneça bem menos energia que um litro de gasolina (66%), sua maior octanagem melhora o desempenho das misturas etanol-gasolina. Até que ponto o etanol será capaz de substituir a gasolina? A resposta dependerá da tecnologia disponível, do processo produtivo e do preço do petróleo. Estima-se que, no Brasil, o bioetanol de cana-de-açúcar seria competitivo com o barril de petróleo a US$ 30-35; nos Estados Unidos, onde o etanol se produz a partir de milho, isso ocorreria com o barril de petróleo a US$ No entanto, a produção de etanol a partir de biomassa levanta alguns problemas. Como os cultivos do milho e da cana demandam muita água, procura-se encontrar outras fontes menos exigentes: pinhão-manso, sorgo sacarino, capim (Panicum virgatum) e outras gramíneas perenes (Miscanthus). 121

132 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Uma fonte de controvérsia é o desvio de matérias-primas alimentícias, como o milho ou a soja, para a produção de biocombustíveis, porque redunda no aumento do preço dos alimentos e penaliza os setores mais pobres da população. Também preocupa a expansão dos cultivos agroindustriais, favorecendo o desmatamento e afetando a biodiversidade. A solução parece estar na obtenção de etanol a partir de resíduos lignocelulósicos, uma tecnologia complexa, ainda em desenvolvimento (Figura 10.1). O ETANOL A PRODUÇÃO POR VIA FERMENTATIVA A produção de etanol pela via biotecnológica envolve a ação fermentativa de leveduras sobre um substrato adequado: cana-de-açúcar, beterraba açucareira, sorgo sacarino, milho. No Brasil, a matériaprima é a cana-de-açúcar (Figura 10.2). Após a colheita, a cana é transportada até a usina onde é triturada, separando o caldo do bagaço, que é utilizado como combustível, gerando calor e eletricidade para o próprio estabelecimento. Reservase o caldo à produção de açúcar ou de etanol. Um subproduto da produção de açúcar, o melaço, é reincorporado ao processo produtivo de sacarose ou misturado ao caldo de cana para a obtenção de etanol. Antes de dar início à fermentação, são acrescentados no caldo os nutrientes e antissépticos necessários, ajustando-se também outros parâmetros, como a temperatura e o ph. O processo fermentativo ocorre nas dornas (biorreatores) por obra das leveduras, naturais ou selecionadas. A condução do procedimento, contínua ou descontínua, depende do estabelecimento assim como da complexidade e automação dos equipamentos disponíveis. Concluída a fermentação, recuperam-se as leveduras por centrifugação, com vistas a uma posterior reutilização e/ou à produção de ração animal. Da destilação do vinho se obtém a flegma, um líquido com álcool em maior concentração, e um resíduo denominado vinhaça ou vinhoto, que deve ser tratado antes de despejado no ambiente. A retificação, isto é, a eliminação das impurezas da flegma, gera o álcool hidratado, que é convertido em álcool anidro por desidratação. A SUBSTITUIÇÃO DA GASOLINA O CASO DO BRASIL No Brasil, 63% da energia provém de fontes renováveis: grandes hidroelétricas (42%), madeira (10%), cana-de-açúcar (9%), outras (2%). A contribuição da cana-de-açúcar está diretamente relacionada com o uso do etanol como combustível. Calcula-se que 60% da cana-de-açúcar plantada no Brasil destina-se à produção de etanol por fermentação. Em outros países utilizam-se matérias-primas diferentes, tais como a beterraba açucareira (União Europeia) ou o milho (Estados Unidos). A desvantagem das matérias-primas amiláceas é que demandam um tratamento enzimático (sacarificação), antes da fermentação (Figura 10.1). A crise do petróleo, na década de 1970, provocou um aumento significativo do preço, mostrando a necessidade de substituir a gasolina por outras fontes de energia. Em 1975, o Brasil instituiu o Programa Nacional do Álcool (Pró-Álcool), visando a produção de etanol como combustível alternativo para os carros de passeio. Pouco tempo depois, na década de 1980, de carros funcionavam com etanol (94% de etanol, 6% de água), e outros com uma mistura de álcool e gasolina (78% de gasolina, 22% de álcool). Em 1989, a queda do preço do petróleo e os problemas inerentes ao próprio Pró-Álcool (subsídios, baixa produtividade) provocaram uma crise de desabastecimento, abalando seriamente o programa. 122

133 BIOTECNOLOGIA E INDÚSTRIA Reativado na década de 1990, desta vez obedecendo a critérios de produtividade, tanto na lavoura como na indústria, o programa deixou de receber subsídios. Hoje, mais de três milhões de carros são movidos com álcool hidratado, enquanto o álcool anidro é aditivado à gasolina, em uma proporção que varia entre 20 e 24%, dependendo da relação oferta/procura. A introdução, em 2003, da tecnologia flexfuel, que permite abastecer os carros tanto com gasolina como com álcool hidratado, deixa ao consumidor a possibilidade de escolher o combustível, em função de considerações econômicas e ambientais. A produção de etanol no Brasil, estimada em 29,2 bilhões de litros, passa por uma fase de pouco crescimento, devido às políticas energéticas. O setor sucroalcooleiro de hoje é um enorme complexo FIGURA A produção de etanol a partir da cana-de-açúcar Transporte LAVOURA CANA-DE-AÇÚCAR Trituração e extração CALDO, GARAPA OU MOSTO BAGAÇO Combustível Fermentação LEVEDURAS Reaproveitamento MELAÇO AÇÚCAR CO 2 VINHO LEVEDURAS Ração animal Destilação Retificação FLEGMA VINHAÇA Fertilizante ETANOL HIDRATADO Desidratação ETANOL ANIDRO 123

134 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) industrial de mais de 400 indústrias, com participação de várias multinacionais em um mercado consolidado através de ciclos de aquisições e fusões. As pequenas usinas foram suplantadas por outras, tecnologicamente aprimoradas, que desenvolvem sistemas de produção integrados (biorrefinerias). Lentamente, a mecanização da colheita elimina a necessidade das queimadas e modifica as condições de trabalho nos canaviais. Além de etanol, as instalações industriais fabricam aglomerado, ração animal, adubo, celulose etc. O aproveitamento do bagaço é fundamental, porque permite gerar a energia necessária para o funcionamento das usinas e até exportá-la, aumentando a matriz energética renovável do país. A obtenção de variedades de cana-de-açúcar com diferentes períodos de desenvolvimento (rápido, médio e tardio), assim como o plantio sequencial, diminuem as flutuações na oferta de matéria-prima. O projeto Genoma-cana, uma parceria entre a Fapesp (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), várias universidades e o setor sucroalcooleiro, facilitará o melhoramento da planta (teor de açúcar, resistência a pragas, resistência à seca). Encontra-se em andamento o melhoramento das leveduras, procurando desenvolver microrganismos mais produtivos e tolerantes ao etanol, ou com características (floculação) que facilitem sua recuperação uma vez concluída a fermentação. O BIOGÁS A BIODIGESTÃO ANAERÓBIA A digestão microbiana da matéria orgânica, em condições aeróbias produz água (H 2O) e dióxido de carbono (CO 2), e em condições anaeróbias, metano (CH 4), dióxido de carbono (CO 2) e água (Figura 10.3). Nos ambientes confinados de pântanos e sepulcros, o metano liberado gera alguns fenômenos assustadores de combustão espontânea ( luzes dos cemitérios ). Nas condições mais controladas de um aterro sanitário ou de um biorreator (= biodigestor), o gás acumulado poderá ser utilizado como combustível (biogás). O processo fermentativo de biodigestão anaeróbia se desenvolve sobre resíduos rurais (esterco), agroindustriais (vinhaça, efluentes das indústrias de laticínios e dos matadouros), domésticos ou comunitários (lama de esgotos) e, também, sobre plantas (aguapé). Coloca-se a matéria-prima no biodigestor, em condições anaeróbias e ph neutro (6,7-7,7), evitando a presença de substâncias solventes ou de inseticidas, que prejudicariam o desenvolvimento do processo. Dependendo da temperatura do biodigestor, haverá uma multiplicação de bactérias mesófilas (35 0 C) que processarão a matéria-prima em dias, ou termófilas (55 0 C) que o farão em dias. A segunda opção libera mais biogás, mas requer maior consumo de energia e um monitoramento cuidadoso, porque as bactérias termófilas não suportam bem as variações de temperatura. A decomposição anaeróbia envolve a sucessão biológica de várias populações naturais de microrganismos, de modo que as melhoras tecnológicas visam, exclusivamente, a engenharia do processo. Este pode ser conduzido tanto de maneira descontínua como contínua, em biodigestores especialmente construídos para permitir o abastecimento diário de matéria-prima e a retirada de biogás. Existe um número grande de modelos de fermentadores, desde os muito simples (modelo tailandês, chinês, indiano) até os automatizados, que processam um volume grande de matéria-prima. Um dos resíduos da biodigestão é um material sólido fibroso que, uma vez compostado e prensado, vende-se como solo artificial, para o cultivo de plantas ou para melhorar a qualidade do solo. O outro é um efluente líquido, que se aproveita como adubo (Figura 10.4). A UTILIZAÇÃO DO BIOGÁS O biogás está formado por 50-65% de metano e 35-50% de dióxido de carbono, com traços de gás sulfídrico (corrosivo), nitrogênio, oxigênio e hidrogênio; pode ser usado diretamente ou armazenado. 124

135 BIOTECNOLOGIA E INDÚSTRIA Entre as aplicações possíveis está o abastecimento do consumo doméstico (fogões, lampiões ou aquecedores), a geração de energia elétrica e o acionamento de motores de veículos. Seu poder calorífico é menor que o do gás natural, um combustível fóssil cuja composição inclui metano, etano, propano e butano (Tabela 10.3). A primeira fábrica de biogás começou a funcionar em 1859 em Bumbai (Índia). A iniciativa alcançou bastante sucesso e, em 1980, a Índia contava com biodigestores. Talvez seja esta uma das razões pelas quais a digestão anaeróbia seja considerada um processo biotecnológico apropriado para pequenas cidades e comunidades rurais. No entanto, a produção de biogás pode alcançar outra dimensão, se for encarada como uma tecnologia moderna que visa a produção de calor e de eletricidade (Figura 10.5). A Dinamarca é o líder mundial na produção de biogás, estando a tecnologia bem desenvolvida em outros países como os Estados Unidos, a Alemanha, a França, o Japão e a Suécia. Em 1995, quando contabilizava mais de cinco milhões de pequenos biodigestores rurais, a China teve o empenho de construir reatores tecnologicamente avançados para o tratamento de rejeitos urbanos e a geração de eletricidade. Na América Latina, algumas pequenas comunidades contam com geradores de biogás que as abastecem com energia suficiente para cozer os alimentos ou alimentar um motor. Contudo, nos últimos anos surgiram vários projetos ambiciosos de exploração do potencial existente nos aterros sanitários urbanos (Olavarría, Argentina; Bandeirantes, Nova Iguaçu e Petrópolis, Brasil; Santiago, Chile; Monterrey, México; Maldonado, Uruguai). O tratamento dos rejeitos agroindustriais, especialmente da indústria açucareira e da suinocultura, também é uma fonte considerável de biogás. Cuba conta com mais de 100 fábricas produtoras de biogás. A produção de bioplásticos a partir do biogás gerado em estabelecimentos agrícolas representa uma tecnologia recente, patenteada pela empresa norteamericana Newlight. A empresa sueca IKEA, especializada em mobiliário doméstico, planeja substituir 40% do plástico utilizado pelo bioplástico da Newlight FIGURA A biodigestão em condições aeróbias e anaeróbias. RESÍDUOS ORGÂNICOS VEGETAIS E ANIMAIS O 2 MOLÉCULAS ORGÂNICAS SIMPLES ACETATO Aerobiose Anaerobiose H 2O CO 2 H2O CH4 CO2 BIOGÁS 125

136 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA As complexas etapas da produção de biogás dentro do biodigestor MATÉRIA-PRIMA Microrganismos fermentativos MOLÉCULAS COMPLEXAS MOLÉCULAS SIMPLES Bactérias acidogênicas BIODIGESTOR ÁCIDOS E ÁLCOOIS Bactérias acetogênicas ACETATO Bactérias metanogênicas BIOGÁS MATERIAL SÓLIDO FIBROSO + EFLUENTE LÍQUIDO TABELA O poder calorífico de vários combustíveis. GÁS PODER CALORÍFICO (Kcal/m 3 ) GÁS PODER CALORÍFICO (Kcal/m 3 ) Butano Gás natural Propano Biogás Metano Gás de cidade FIGURA As utilizações do biogás BIOGÁS PLANTAS PURIFICADORAS E DE ARMAZENAMENTO ENERGIA TÉRMICA ENERGIA ELÉTRICA COMBUSTÍVEL TRANSPORTE AUTOMOTOR 126

137 BIOTECNOLOGIA E INDÚSTRIA O BIODIESEL A TRANSESTERIFICAÇÃO O biodiesel é um combustível composto por ésteres (etílicos ou metílicos) produzidos na reação química de transesterificação entre óleos vegetais e álcool (etanol ou metanol), em presença de um catalisador inorgânico ou enzimático (lípases) (Figura 10.6). Um dos subprodutos da reação é o glicerol (5 a 10% do produto bruto), geralmente aproveitado pelas indústrias de alimentos, de cosmética e de medicamentos. Diferentemente do bagaço de cana, o glicerol gera uma substância tóxica (acroleína) quando é queimado, de modo que aumentar a produção de biodiesel significa aumentar o leque de aplicações do glicerol. O biodiesel fornece entre 88 e 95% da energia do diesel, mas pode ser misturado com o diesel convencional, em proporção variando de 1% (B1) a 20% (B20), aumentando a qualidade do combustível e diminuindo a emissão de partículas poluentes e de gases tóxicos na atmosfera FIGURA A reação de transesterificação H 2C O CO R CH 2OH HC O CO R + 3R OH HCOH + 3R O CO R H 2C O CO R CH 2OH Triglicerídeos Álcool Glicerol Ésteres A PRODUÇÃO DE BIODIESEL A produção de biodiesel está localizada principalmente na União Europeia (60%) e, em menor parte, nos Estados Unidos, na China, na Indonésia e na Malásia. A matéria-prima é variada: soja nos Estados Unidos, canola na União Europeia e no Canadá, soja e girassol na Argentina, dendê na Ásia. No Brasil, tem-se experimentado soja, mamona, babaçu, dendê, girassol, milho, amendoim, pinhão-manso etc. A implementação do Programa Nacional de Produção e Uso de Biodiesel (PNPB) estimula a produção sustentável, enfatizando a inclusão social e o desenvolvimento regional. Desde 2010, adiciona-se no Brasil 5% de biodiesel ao diesel convencional, estimando-se que a proporção chegue a 20% até Restam alguns pontos a considerar, especialmente em relação à utilização de matérias-primas como a mamona, com o intuito de estimular o pequeno agricultor. Em princípio, o biodiesel é carbononeutro. No entanto, diferente do etanol de cana, o sistema produtivo seria carbono-negativo, quando se leva em conta a energia necessária para adubação e irrigação da terra, a movimentação da maquinaria agrícola, o armazenamento e transporte da matéria-prima e dos produtos etc. 127

138 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Do ponto de vista energético, os sistemas produtivos tradicionais mais eficientes seriam os associados aos complexos agroindustriais (soja, milho, girassol), embora apresentem o grave defeito de desviar para a produção de energia as matérias-primas de alimentos e rações. O PANORAMA ATUAL A primeira geração de biocombustíveis abrange o etanol (açúcar de cana-de-açúcar, sorgo sacarino ou beterraba, amido de milho) e o biodiesel (óleos vegetais). A segunda geração de bioetanol utilizaria biomassa lignocelulósica proveniente dos resíduos agroindustriais, tais como bagaço e folhas de cana, palha e sabugo de milho, serraduras e aparas de madeira etc. A maior dificuldade reside na própria estrutura da matéria-prima lignocelulósica. A celulose (polímero de hexoses) e a hemicelulose (polímero de hexoses e de pentoses) se encontram circundadas por lignina, uma substância de suporte das plantas, sendo necessário um pré-tratamento que as separe, possibilitando a hidrólise enzimática e a liberação de açúcares fermentescíveis (hexoses e pentoses). Equipamentos com o design apropriado e enzimas celulolíticas (celulases e hemicelulases) para uso indústrial já estão a caminho. Algumas indústrias funcionam experimentalmente na Suécia, na Espanha, na Dinamarca, no Canadá e nos Estados Unidos. O Brasil conta, desde 2013, com uma instalação piloto em Alagoas (GranBio). BIORREFINARIAS E NOVAS BIOINDÚSTRIAS O milho dá origem a numerosos produtos: glicose, ácido cítrico, bioplástico, biocorantes, bioetanol, xantano, lisina, vitaminas etc. Por analogia com as refinarias de petróleo, uma biorrefinaria é um complexo industrial com instalações para o processamento biotecnológico, químico, físico e térmico da matéria-prima renovável, que será transformada em numerosos intermediários químicos e bioquímicos, alimentando um conjunto de linhas de produção muito diversificado. Localizadas perto das fontes de matéria-prima, e visando a autossustentabilidade energética, o objetivo final das biorrefinarias é gerar numerosos produtos intermediários e funcionar sem desperdício algum. Distante do consumidor, a Biotecnologia Industrial encontra poucas resistências. O desenvolvimento da biologia molecular e a chegada da biologia sintética abrem novas perspectivas, que vão desde a produção de biocombustíveis (volume alto, baixo valor agregado) para o transporte até a obtenção de metabólitos intermediários (volume baixo, alto valor agregado) para as indústrias de cosmética e de alimentação. Dentre as numerosas empresas existentes, que utilizam a biologia sintética para novas aplicações, Amyris do Brasil e Solazyme Bunge mantêm instalações no Brasil, perto do setor sucroalcooleiro ao qual estão ligadas. Os pareceres da CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança) sobre as construções microbianas respectivas podem ser consultados em O CASO AMYRIS A artemisina (quinghaosu) é um medicamento antimalárico, obtido a partir de um extrato da planta Artemisia annua. Sua descoberta, em plena Revolução Cultural, valeu o Prêmio Nobel de Medicina de 2015 à pesquisadora chinesa Tu YouYou. Em 2000, a equipe de J. Keasling em Berkeley (Califórnia, Estados Unidos) obteve, via engenharia genética, uma levedura produtora de artemisina. Em 2003, Keasling fundou a empresa Amyris 128

139 BIOTECNOLOGIA E INDÚSTRIA Biotechnology e, com o apoio da Fundação Bill e Melinda Gates e de Sanofi-Aventis, conseguiu aumentar significativamente ( X) a produção de artemisina, diminuindo o custo do tratamento a menos de 1 dólar (Figura 10.7 A). Bloqueando uma via metabólica celular da levedura, Amyris obteve uma linhagem que, em vez de artemisina, produz farneseno (Biofene, C 15H 24). Além de ser o precursor químico de numerosos produtos, a hidrogenação o transforma em farnesano ou bioquerosene. Um trunfo, considerando que os custos tornam inviável a produção de farneseno pelas vias convencionais. O caminho metabólico da artemisina consta de nove genes, cada um com aproximadamente bases. Modificações nas vias metabólicas abrem o caminho para a produção de combustíveis, ou de qualquer outra substância (Figura 10.7 B). Procurando as combinações mais interessantes e eficientes, infinitas variantes génicas da levedura foram sintetizadas e testadas, utilizando microarrays de DNA e sistemas robotizados de rastreio de alto rendimento (HTS) FIGURA O caso Amyris A. Do quinghaosu à artemisina. Artemisia annua QINGHAOSU Escherichia coli ARTEMISINA Saccharomyces cerevisiae B. Produtos gerados na plataforma tecnológica baseada na engenharia metabólica da levedura (via dos isoprenoides ou terpenos) MATÉRIA-PRIMA (Açúcar) ARTEMISINA (antimalárico) BIOFENO NEOSSANCE Farneseno (C 15) Esqualeno e COSMÉTICOS Hemiesqualeno Isopreno (C5) Farnesano BIODIESEL E OUTROS PRODUTOS QUÍMICOS POLÍMEROS Isoprenoides (C 10) COMBUSTÍVEL DE AVIAÇÃO 129

140 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A empresa conta hoje com leveduras capazes de transformar a cana de açúcar (Amyris do Brasil) ou o sorgo sacarino (Amyris Fuels, Estados Unidos) em biodiesel ou combustível de avião, este último testado em parceria com a empresa TOTAL. Atualmente, a plataforma tecnológica do farneseno renovável pode sintetizar mais de produtos, entre combustíveis, cosméticos, emolientes, fragrâncias, polímeros, lubrificantes e biofármacos. De particular interesse são o esqualeno e hemiesqualeno, derivados do farneseno, que compõem a linha Biossance, um emoliente com numerosas aplicações em cosmética, inclusive na remoção de maquillage. O CASO SOLAZYME (TerraVia) Assim como as plantas, as microalgas sintetizam e acumulam lipídios. Existem dois métodos clássicos para o cultivo de microalgas autotróficas, ambos com algumas vantagens e desvantagens. Os grandes tanques ao ar livre aproveitam terras não cultiváveis, água salobra e luz solar, mas contaminam com facilidade. Os fotobiorreatores fechados contaminam muito menos, mas são mais caros, porque demandam iluminação artificial e certa complexidade tecnológica. A empresa Solazyme modificou geneticamente a alga heterotrófica Prototheca moriformis, de modo a produzir grande quantidade de óleos vegetais (triglicerídeos) e bioprodutos a partir de uma matéria-prima que pode ser sacarose de cana, dextrose de milho e, inclusive, materiais de origem celulósicos (Figura 10.8). Em relação ao biodiesel, o uso de algas para a produção de hidrocarbonetos e triacilglicerídeos permitiria dedicar terras férteis e água doce à produção de alimentos. Por outro lado, a adição de bioquerosene ao querosene diminuiria os custos do combustível de avião. A plataforma tecnológica permite a produção de biodiesel, surfactantes, lubricantes, polímeros, óleos comestíveis, suplementos nutricionais etc. Recentemente, a empresa Solazyme mudou seu nome para TerraVia anunciando que no futuro sua plataforma estaria dedicada à produção de produtos alimentícios (proteína, lipídios, óleos de cozinha) e cosméticos. Um dos produtos de sucesso é o Algenist um emoliente para a pele, de interesse cosmético, que pode ser encontrado em grandes redes de distribuição dos Estados Unidos, da Europa e do Japão (Sephora) FIGURA O caso Solazyme Luz solar + CO 2 Biomassa Algas Triglicerídeos BIOCOMBUSTÍVEIS (Biodiesel) QUÍMICA VERDE (Surfactantes, lubricantes e polímeros) ALIMENTOS E RAÇÕES (Suplementos nutricionais, óleos comestíveis) COSMÉTICA (emolientes, Algenist para o cuidado da pele) 130

141 C A P Í T U L O 11 BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE O DESENVOLVIMENTO SUSTENTÁVEL Qual o impacto das atividades humanas sobre o meio ambiente? Que legado deixaremos para as próximas gerações? Da resposta emerge o conceito de desenvolvimento sustentável, definido como a capacidade de atender às necessidades do presente, sem comprometer a capacidade das gerações futuras em atender suas próprias necessidades (Informe Brütland, 1987). O desenvolvimento sustentável depende das ações realizadas nas áreas econômica, social e ambiental. Esse é o consenso alcançado ao longo de mais de duas décadas, de várias conferências internacionais (Rio de Janeiro, 1992 e Agenda 21; Kyoto, 1997; Johanesburgo, 2002; Copenhague, 2009; Cancún, 2010; Durban, 2011; Rio de Janeiro, 2012) e dos acordos alcançados, na Agenda 21 e nas Conferências das Partes sobre Biodiversidade e Clima. Os relatórios publicados, em 2007, pelo Painel Intergovernamental sobre Mudanças Climáticas (IPCC) apontaram a responsabilidade do homem no futuro do planeta, indicando que não podem ser proteladas as ações concretas de proteção do meio ambiente. Qual a contribuição das biotecnologias para o desenvolvimento sustentável? Em relação à economia, diminuir os custos não só da matéria-prima como da produção industrial, com processos e produtos novos e/ou de maior valor agregado. Na área social, possibilitar a conservação ou a criação de empregos através do desenvolvimento de novas plataformas tecnológicas. E, na área ambiental, cumprir um importante papel na prevenção, no monitoramento e na remediação da contaminação. Pensar globalmente, agir localmente. Os problemas ambientais são muito pontuais, cada um deles demanda um tratamento particular, e o procedimento deve ter uma relação custo/benefício interessante. Nem sempre existe um produto a patentear; havendo um serviço a prestar, a tecnologia fica a cargo de organizações governamentais ou de firmas que agem localmente. A fim de responder às diversas demandas do mercado, algumas contam com uma plataforma de produção de microrganismos, isolados da natureza, em escala industrial. AS TECNOLOGIAS LIMPAS Pouco a pouco, a sociedade está aceitando que é preferível deixar de contaminar, a desenvolver métodos para limpar o ambiente. No contexto das chamadas "biotecnologias brancas", várias tecnologias limpas podem substituir outras mais poluentes, ajudando também a reduzir o volume de resíduos domésticos, agrícolas e industriais. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

142 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A SUBSTITUIÇÃO DE PROCESSOS INDUSTRIAIS A TECNOLOGIA ENZIMÁTICA Diferentemente dos catalisadores não biológicos, as enzimas são específicas, não tóxicas e biodegradáveis. Essas propriedades permitem, à tecnologia enzimática, a substituição de alguns processos e produtos industriais por outros menos agressivos ao meio ambiente em setores reconhecidamente poluentes, tais como as indústrias de alimentos, rações, detergentes, têxteis, papel e celulose, couros etc. Nos curtumes, o uso de enzimas reduz em 40% o consumo de derivados do enxofre, ao tempo que produz couro de melhor qualidade. A introdução de até oito enzimas nos detergentes evita a fervura das roupas, diminuindo o consumo de energia e facilitando a retirada das manchas. Os plásticos representam uma fração significativa (20% v/v) do lixo dos países industrializados, sendo a maior parte proveniente das embalagens convencionais da indústria de alimentos. Além de permanecerem por longo tempo na natureza, sua fabricação envolve uma matéria-prima não renovável (petróleo) e um processo de síntese muito poluente, que gasta uma quantidade grande de energia. Em curto ou médio prazo, esses plásticos convencionais poderão ser substituídos por polímeros de origem bacteriana ou vegetal, compostáveis em poucos meses. Uma das vantagens das embalagens bioplásticas de alimentos é que degradam junto com os restos de comida, dispensando as etapas de triagem e limpeza. Na maioria dos casos, as linhagens utilizadas na tecnologia enzimática e na produção de bioplásticos são OGMs (Organismos Geneticamente Modificados) que não geram maior oposição na sociedade, talvez devido ao seu uso para a produção de insumos, dentro de fermentadores industriais, em sistemas de contenção. Como agentes biológicos, as enzimas tornam os processos produtivos mais limpos e seguros, diminuindo o consumo de energia e a quantidade de resíduos. O desenvolvimento de enzimas ativas a altas temperaturas, em solventes não aquosos e em meios sólidos, poderá futuramente expandir suas aplicações. A INDÚSTRIA DE PAPEL E CELULOSE A indústria de papel e celulose é uma atividade em expansão que gera, no Brasil, empregos diretos ( na indústria e nas florestas) e indiretos, em 540 municípios. Atualmente, as principais empresas são Klabin, Suzano e Fibria, uma fusão entre a Votorantim e a Aracruz. A atividade industrial exige a expansão das florestas, porque a matéria-prima para a produção de papel e celulose é a madeira. Estima-se que, em 2017, o Brasil contará com 2,5 milhões de hectares de florestas plantadas de eucaliptos (60%) e pinhos (30%). A maior dificuldade reside na própria estrutura da matéria-prima lignocelulósica. Na madeira, a celulose (polímero de hexoses) e a hemicelulose (polímero de hexoses e de pentoses) estão circundadas por lignina, uma substância de suporte das plantas, que deve ser descartada, mediante um tratamento químico, em meio alcalino e a altas temperaturas. A eliminação da maior parte da lignina (90%) libera as fibras de celulose e hemicelulose, possibilitando a hidrólise enzimática da madeira e a formação de açúcares fermentescíveis (hexoses e pentoses). No tratamento químico da lignina, resta uma pequena quantidade (10%) que confere uma cor característica à pasta Kraft, base da fabricação de cartão e papel pardo. O branqueamento do papel requer outro tratamento específico, com oxigênio e cloro, no qual se formam derivados clorados 132

143 BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE tóxicos. Um procedimento alternativo é o biopulping, em que a enzima xilanase degrada o xilano da hemicelulose, facilitando a eliminação da lignina que lhe está associada (Figura 11.1). A inserção da biotecnologia moderna ocorre através de duas linhas de ação: o desenvolvimento da tecnologia enzimática e o melhoramento vegetal. O sequenciamento do genoma do fungo Phanerochaete chrysosporium ("podridão branca") revelou a existência de mais de 240 genes codificadores de enzimas extracelulares, envolvidas na degradação de carboidratos, que poderiam ser utilizadas na degradação da madeira e no branqueamento da polpa de papel e de têxteis. O sequenciamento do genoma do eucalipto trouxe novas perspectivas para o melhoramento da qualidade da madeira, especialmente visando aumentar a proporção celulose/lignina. Em 2015, a CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança) aprovou a liberação no meio ambiente, para uso comercial, do eucalipto geneticamente modificado da FuturaGene, uma empresa controlada pela Suzano Papel e Celulose. A produtividade do eucalipto transgênico de crescimento rápido é 20% maior que a do eucalipto convencional. A invasão da empresa por mulheres do MST (Movimento Sem Terra) e a destruição dos laboratórios e das mudas que demandaram dez anos de trabalho mostram as dificuldades em separar tecnologia de ideologia, em alguns setores da sociedade. Um fenômeno análogo ocorreu na Europa, em 2010, depois da aprovação pela Comissão Europeia da batata Amflora (Basf Plant Science), geneticamente modificada, para uso na fabricação do papel. Essa batata produz amido de alta qualidade com 99% de amilopectina, uma substância que confere rigidez à massa e melhora o acabamento. Destinado exclusivamente ao uso industrial, o tubérculo estaria fisicamente separado da batata destinada ao consumo humano ou animal. Porém, em função da oposição encontrada, em 2012, BASF Plant Science decidiu suspender a comercialização da batata Amflora. Em 2013, um tribunal anulou a decisão de aprovação da Comissão Europeia FIGURA A indústria de papel e de celulose. O branqueamento da pasta Kraft admite tratamentos químicos (cloro) e biológicos (xilanase); estes últimos diminuem a carga poluidora do efluente MADEIRA Lignina + celulose + hemicelulose Extração alcalina a alta temperatura Lignina (90%) PASTA KRAFT Lignina (10%) + celulose + hemicelulose Branqueamento com cloro Branqueamento com xilanase Eliminação da lignina Derivados clorados da lignina EFLUENTE POLPA BRANCA EFLUENTE 133

144 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A SUBSTITUIÇÃO DE INSUMOS AGRÍCOLAS Um segundo conjunto de tecnologias limpas visa a substituição parcial de alguns insumos utilizados na agricultura, tais como os fertilizantes e praguicidas. A intensa aplicação de fertilizantes agrícolas, derivados do petróleo, tem consequências negativas no ambiente, porque uma parte do nitrogênio (N) e do fósforo (P) não é absorvida pelas plantas e acaba sendo arrastada pelas chuvas até os rios e as reservas de água. O excesso de nutrientes estimula a proliferação de algas, consumindo o oxigênio dos cursos de água e produzindo toxinas que afetam os peixes e o gado. MICRORGANISMOS VS FERTILIZANTES QUÍMICOS O nitrogênio é um nutriente indispensável para os cultivos vegetais porque faz parte da composição das proteínas e dos ácidos nucleicos. Encontra-se na atmosfera como N 2 e no solo como nitrato, resultante da decomposição da matéria orgânica, ou proveniente dos fertilizantes agrícolas. Alguns microrganismos livres (Azotobacter, Azospirillum) e outros simbiontes (Rhizobium ou Bradirhizobium), que vivem nos nódulos das raízes das leguminosas (soja, feijão), podem fixar diretamente o nitrogênio atmosférico em uma forma utilizável pelas plantas. Aplica-se o termo biofertilizante aos produtos que contêm agentes biológicos vivos, capazes de favorecer o desenvolvimento vegetal. Um destes agentes é o Rhizobium, uma bactéria simbionte das raízes de leguminosas que fixa o nitrogênio atmosférico, reduzindo a necessidade de aplicar fertilizantes nitrogenados nas lavouras. Para proceder à inoculação, mistura-se o produto com as sementes umedecidas, antes do plantio, em tambores ou betoneiras. A produção industrial de rizóbios selecionados para aplicação antes do plantio permite substituir produtos químicos, derivados do petróleo, por agentes biológicos, menos prejudiciais para o meio ambiente. Na América Latina, a produção de biofertilizantes envolve numerosas empresas, pequenas e médias, que contam com um sólido suporte tecnológico originado em universidades e instituições públicas de pesquisa agronômica. Vários países produzem inoculantes agrícolas, entre eles: Argentina, Brasil, Chile, Colômbia, Cuba, México, Peru e Uruguai. No Brasil, várias empresas nacionais e estrangeiras produzem inoculantes para leguminosas; a maioria está localizada no Paraná e Rio Grande do Sul. As linhagens bacterianas são estirpes selecionadas por sua eficiência, em uma ampla gama de cultivares, e amplamente adaptadas às condições locais. Até o presente, a indústria baseia a produção dos microrganismos na tecnologia clássica, mas com o mapeamento do genoma de microrganismos como o Rhizobium etli (México) e o Gluconacetobacter diazotrophicus (Brasil), a biotecnologia moderna começa a se inserir neste campo. Frente às mudanças climáticas e a necessidade de aumentar a produtividade agrícola, os novos métodos de triagem de estirpes são uma ferramenta de incalculável valor para o estudo da relação simbionte entre o microrganismo e a planta hospedeira. As pesquisas sobre a fixação de nitrogênio nas gramíneas forrageiras, iniciadas por Johanna Döbereiner (Embrapa), na segunda metade do século XX, permitem dispensar parcialmente a aplicação de nutrientes químicos nos cereais e na cana-de-açúcar, com a correspondente economia de recursos. O fósforo se origina a partir das rochas do solo e da decomposição dos seres vivos. Nos solos ácidos, característicos das regiões tropicais, a maior parte dos fosfatos (95-99%) forma compostos minerais ou orgânicos insolúveis, que não são acessíveis diretamente às plantas. Por isso, o fósforo se torna um nutriente limitante para o crescimento das plantas. Os micorrizos são associações simbióticas entre raízes vegetais e fungos, que absorvem os nutrientes minerais e a água do solo, transferindo-os para a planta hospedeira. Muitas espécies de 134

145 BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE fungos micorrízicos são comestíveis, e vários gêneros são comercializados a nível mundial: Tuber, Tricholoma, Boletu, Cantharellus, Morchella, Lactarius e Suillus. A inoculação dos solos ou micorrização é uma tecnologia agrícola, associada ao reflorestamento de pinhos e eucaliptos, que elimina ou diminui a necessidade de se acrescentar fósforo. Além dos fertilizantes agrícolas, outra das causas de liberação excessiva de fósforo no ambiente é a criação intensiva de animais. Os porcos e as aves não metabolizam o fitato, um derivado do fósforo presente nas rações. Complementando-as com fitase, uma enzima produzida industrialmente por um microrganismo geneticamente modificado, o fósforo excretado diminui em mais de 30%, reduzindo a contaminação dos lençóis de água. MANEJO INTEGRADO DE PRAGAS VS AGROTÓXICOS A utilização de variedades selecionadas e a rotação dos cultivos são práticas agrícolas que reduzem, substancialmente, a necessidade de aplicar pesticidas sintéticos. Um passo além é dado pelo controle biológico, que preconiza a substituição dos praguicidas químicos por alternativas biológicas, tais como bactérias, fungos e vírus entomopatogênicos. Observe-se que, em seu clássico livro A primavera silenciosa (1972), a pesquisadora Rachel Carson já alertava para os danos causados pelo uso do DDT, recomendando a procura de soluções de cunho biológico para o controle das populações de insetos. Anos mais tarde, contamos com numerosos exemplos em que os pesticidas são substituídos por agentes biológicos específicos (Tabela 11.1). Um deles é a aplicação, nas lavouras de soja, de partículas de baculovírus, um organismo que, normalmente, infecta e mata as lagartas de Anticarsia gemmatalis, parasitas das plantas. Gemstar, um produto que contém o baculovírus Ihara é usado no combate à Helicoverpa armigera, uma praga que afeta os cultivos de soja. A pulverização de esporos do fungo Metarhizium anisopliae, é uma arma na luta contra a cigarrinha-da-folha-da-cana-de-açúcar ou a broca-dos-citros. A broca-da-cana é controlada pela ação sinérgica de duas microvespas (Cotesia e Trichogramma) que agem em diferentes momentos do ciclo de vida da praga. Contudo, o exemplo mais conhecido dessa tecnologia verde envolve a bactéria do solo Bacillus thuringiensis ou Bt. Citada como promissora por R. Carson, essa bactéria é utilizada como pesticida agrícola há mais de cinquenta anos, sem que suas toxinas tenham causado danos às pessoas, à vida silvestre ou à maioria dos insetos benéficos TABELA Alguns exemplos de utilização de agentes biológicos como pesticidas AGENTE BIOLÓGICO Fungo Metarhizium anisopliae Fungo Beauveria bassiana Bactéria Bacillus thuringiensis var kurstaki Bactéria Bacillus thuringiensis var israelensis Bactéria Bacillus sphaericus Vírus Baculovírus anticarsia Vírus Baculovírus spodoptera Vespa Cotesia flavipes PRAGA COMBATIDA Cigarrinha-da-folha-da-cana-de-açúcar (Mahanarva posticata), cigarrinha-da-raiz-dacana-de-açúcar (Mahanarva fimbriolata), cigarrinha-das-pastagens (Deois flavopicta). Diversas, florestais. Lagartas desfolhadoras de grandes culturas e reflorestamentos. Larvas do mosquito da dengue (Aedes aegypti, transmissor da dengue e da febre amarela) e dos borrachudos (Simulium spp.). Larvas do mosquito prego (Anopheles spp., transmissor da malária) e do mosquito urbano ou pernilongo (Culex spp., transmissor da encefalite e da filaríase). Lagarta-da-soja (Anticarsia gemmatalis). Lagarta-do-cartucho-do-milho (Spodoptera frugiperda). Broca-da-cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis). 135

146 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) No Brasil, existem atualmente numerosos produtos a base de Bacillus thuringiensis para o combate às pragas que afetam a agricultura, comercializados com diferentes nomes (Bac-control, Bactur, Dipel, Ecotech, Thuricide etc.) por várias empresas nacionais e estrangeiras (Vectorcontrol, Milenia, Sumitomo, Bayer, Iharabras etc.). Com o desenvolvimento da engenharia genética, os genes correspondentes foram transferidos a várias plantas (milho, algodão etc.) que agora produzem diretamente a toxina inseticida. Baseado no conhecimento da ecologia dos agroecossistemas, o controle biológico permite o Manejo Integrado de Pragas (MIP). No Brasil, deve-se destacar o trabalho da Embrapa e de várias universidades visando a preservação das plantações e a salvaguarda da produção de alimentos. A formação de nuvens de gafanhotos, uma das pragas mais temidas da humanidade, é atualmente monitorada e companhada por via satélite. A aplicação do feromônio PAN (fenilacetonitrilo) induz a dispersão dos insetos e sua volta a um comportamento solitário. No combate aos gafanhotos também são utilizados reguladores de crescimento e, como biopesticida, o fungo Metarrizhium anisopliae varacridum. O controle biológico envolve, além do uso de feromônios, armadilhas e atrativos alimentares. Alguns procedimentos são econômicos e muito engenhosos, como o desenvolvido em Cuba para combater o tetuán del camote, um gorgulho (Cylas formicarius) que ataca a batata-doce. Pendura-se na plantação uma lata com uma pequena quantidade de feromônio, pulverizando em redor esporos do fungo Beauveria bassian. Atraídos pelo feromônio, os machos se aproximam da lata e são contaminados mortalmente pelo fungo, que é inócuo para os seres humanos, os animais e as plantas. Para Cuba, a experiência de várias décadas de trabalho com controle biológico resultou crucial quando, devido ao embargo propiciado por Estados Unidos, o país teve que substituir o uso de agrotóxicos nas lavouras. Atualmente, o programa cubano de controle biológico de pragas envolve laboratórios regionais, estações de defesa vegetal, postos equipados com laboratórios de diagnósticos e mais de 200 centros de reprodução de entomófagos e entomopatógenos. BIOINSETICIDAS VS. INSETICIDAS QUÍMICOS Em 2016, o Brasil vive uma situação sanitária dramática, devido à proliferação do mosquito Aedes aegypti, cuja fêmea é transmissora de várias doenças de origem viral: dengue, chikungunya, zika. Em fins do século XIX e início do século XX, o Aedes causou epidemias terríveis de febre amarela, sendo erradicado das zonas urbanas graças à ação pioneira de Oswaldo Cruz. Por falta de saneamento básico e de medidas de combate eficientes, hoje, o mosquito está novamente disseminado no Brasil e no restante das Américas. A primeira medida para diminuir o número de focos do mosquito é a eliminação das águas paradas, onde ele deposita os ovos e as larvas proliferam. Se isso não for feito, deverá se apelar para os inseticidas químicos, como o Pyriproxyfen, um produto para uso em campanhas de saúde pública. Inseticidas químicos podem ser substituídos por bioinseticidas. Desenvolvido a partir de estudos da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, a empresa Bthek Biotecnologia comercializa um bioinseticida que tem como ingrediente ativo a bactéria Bacillus thuringiensis israelensis e permite o controle das larvas do mosquito (Aedes aegypti) e do borrachudo (Simulium spp.). Outra das armas para evitar a transmissão de doenças por Aedes aegypti contempla a infecção da população natural do mosquito pela bactéria Wolbacchia pipientes, um parasita intracelular frequente em várias espécies de insetos, sem risco algum para os vertebrados. Os mosquitos infetados com Wolbacchia não transmitem dengue e passam a bactéria a sua descendência. Como o acasalamento de uma fêmea não infetada com um macho infetado é estéril, basta liberar mosquitos infetados com Wolbacchia para que a infecção com Wolbacchia se espalhe, diminuindo o número dos transmissores de dengue. 136

147 BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE FIGURA Controle biológico do Aedes aegypti B. Ciclo de vida do mosquito Aedes aegypti Aedes aegypti (fêmea) Pupa Ovos ( ) 4 a 5 dias 2 a 3 dias Larva Duração total do ciclo: 10 a 14 dias E. Controle por Wolbacchia Ovos infetados Cruzamentos possíveis Linhagem infetada com Wolbacchia F. Controle por irradiação Criação de mosquitos Pupas Irradiação Seleção adultos estéreis G. Controle por engenharia genética Criação de mosquitos transgênicos Larvas Mosquitos Mosquitos transgênicas transgênicos da natureza (com tetraciclina) Seleção Acasalamento Sem tetraciclina, as larvas morrem 137

148 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Os primeiros experimentos, em algumas cidades no nordeste da Austrália, no Vietnã e na Indonésia, foram bem-sucedidos. A Fundação Oswaldo Cruz iniciou os primeiros testes em alguns bairros do Rio de Janeiro. Uma estratégia de controle biológico tradicional consiste na liberação, no ambiente, de mosquitos machos esterilizados por radiação. Embora o comportamento de cópula dos machos estéreis e dos férteis seja o mesmo, o acasalamento das fêmeas com os machos estéreis não deixa descendência. Recentemente aplicada na ilha de Fernando de Noronha (PE), esta metodologia levou à redução do tamanho da população e do número de casos de dengue. Mais elaborada, e na linha da biotecnologia moderna, é a construção de uma linhagem transgênica de mosquito que depende de tetraciclina para seu desenvolvimento, uma condição que só existe no laboratório. Liberados no ambiente, os machos transgênicos copulam com as fêmeas normais, gerando larvas que morrem por falta de tetraciclina. Em 2013, a CTNBio aprovou a liberação comercial da linhagem OX513A de Aedes aegypti. Os testes realizados oportunamente em bairros de Juazeiro (PE) e de Piracicaba (SP) reduziram significativamente a população de mosquitos. Participam no empreendimento do chamado mosquito do bem a USP (Universidade de São Paulo) e as empresas Oxitec (Reinio Unido) e Moscamed (Brasil). Como em ocasiões anteriores, alguns setores se posicionaram contra o mosquito transgênico, invocando o princípio de precaução. Das mais simples às mais sofisticadas, não faltam armas para lutar contra o Aedes aegypti; todas podem contribuir para melhorar o saneamento básico e a saúde da população (Figura 11.2). A REDUÇÃO DOS RESÍDUOS A degradação do lixo (resíduos sólidos) e o tratamento de esgoto (resíduos líquidos) são dois exemplos tradicionais de prestação de serviços da biotecnologia tradicional nem sempre valorizados, apesar do imenso volume de matéria que transformam e de sua relevância para o meio ambiente. A DEGRADAÇÃO DO LIXO Em condições adequadas, todos os compostos naturais podem ser biodegradados. As populações microbianas do ambiente degradam as substâncias orgânicas através de numerosas reações, sem que sejam necessários os cuidados assépticos ou a utilização de culturas puras. Em condições aeróbias, os produtos finais da mineralização da matéria orgânica são dióxido de carbono (CO 2) e água; em condições anaeróbias, forma-se biogás. Na compostagem, uma etapa intermediária da mineralização, os próprios microrganismos do lixo degradam a matéria orgânica, previamente fragmentada e misturada (Figura 11.3). No início da biodigestão, a liberação de energia provoca um aumento de temperatura que elimina a maioria dos microrganismos indesejáveis (sanitização). À medida que a atividade microbiana decresce, o sistema se estabiliza e amadurece, até perder todo o seu potencial de biodegradação. O processo pode ser conduzido em sistemas simples (pilhas ao ar livre), ou complexos (silos, biorreatores), sendo necessário, em ambos os casos, remover o material periodicamente, de maneira manual ou mecânica, para assegurar a aeração. A otimização do processo depende do controle de alguns parâmetros, tais como a relação carbono/nitrogênio, o oxigênio, a umidade e a temperatura. O tratamento dos resíduos sólidos urbanos (RSU) em usinas de compostagem é um procedimento alternativo à incineração e ao depósito em lixões e aterros sanitários. Nesses estabelecimentos, a separação prévia dos componentes permite a reciclagem de alguns materiais (metais, vidro etc.). 138

149 BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE A biodegradação aeróbia dos restos orgânicos os transforma em um "composto", utilizado no melhoramento de solos, em atividades de reflorestamento, para colmatar terrenos e combater a erosão. A decomposição in natura do lixo, nos aterros sanitários, cria uma zona de anaerobiose onde se produz biogás, que é liberado na atmosfera, contribuindo para o efeito estufa e as alterações climáticas FIGURA A compostagem LIXO ORGÂNICO AR ÁGUA FONTE DE NITROGÊNIO Fragmentação e mistura das partículas Aumento da temperatura (sanitização) Diminuição e estabilização da temperatura BIODIGESTÃO AERÓBIA Maturação CALOR CO 2 ÁGUA OUTRAS SUBSTÂNCIAS COMPOSTO O TRATAMENTO DAS ÁGUAS RESIDUAIS O esgoto arrasta excrementos (fezes e urina), águas de uso doméstico (banho, lavagem de roupas etc.) e, eventualmente, alguns dejetos de origem industrial. Liberadas diretamente nos cursos de água, as águas servidas causam a desestabilização das populações microbianas, que se multiplicam rapidamente, consumindo o oxigênio dissolvido e ocasionando a morte de peixes e crustáceos. Várias populações naturais participam na biodegradação das águas do esgoto. Os microrganismos aeróbios (bactérias e protozoários ciliados) mineralizam parte da matéria orgânica do efluente. As bactérias anaeróbicas procedem à biodigestão dos lodos, permitindo a obtenção de biogás e a remoção de alguns nutrientes (N e P principalmente), que poderiam criar desequilíbrios ecológicos. O tratamento das águas residuais envolve métodos físicos, químicos e biológicos (Figura 11.4), aplicados em pelo menos três etapas: o Tratamento primário. O esgoto passa por um processo de filtração, que remove objetos grandes, lixo e areia. No tanque de sedimentação, a gordura sobrenadante é separada do lodo sedimentado, que pode ser transferido a um biodigestor. o Tratamento secundário. - O líquido efluente do tanque de sedimentação pode ser tratado de vários modos: 139

150 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) - Em lagoas de baixa profundidade. - Em filtros de gotejamento (1), colonizados pelos próprios microrganismos do esgoto que se desenvolvem digerindo a matéria orgânica do meio. - Em tanques de lodo ativado (2), onde o meio é agitado e oxigenado, mediante a injeção de ar comprimido. - Em um segundo tanque de sedimentação para separar o efluente do lodo. o Tratamento terciário. Este é realizado para eliminar substâncias inorgânicas e orgânicas, envolvendo procedimentos como a filtração, a volatilização da amônia, a precipitação de fosfato etc. o Tratamento avançado. A degradação microbiana dos resíduos orgânicos diminui consideravelmente a carga de microrganismos patogênicos liberada no ambiente, mas não a elimina totalmente. Os microrganismos patogênicos recalcitrantes só podem ser eliminados mediante alguns métodos adicionais, como a cloração, a irradiação UV e o tratamento com ozônio FIGURA O tratamento das águas residuais ESGOTO Fossas sépticas Gradeamento Lagoas de oxidação EFLUENTE Tanque de areia Filtros de gotejamento (1) Tanque de sedimentação Tanque de sedimentação Lodo ativado (2 ) Lodo Lodo Biodigestor anaeróbico EFLUENTE EFLUENTE RESÍDUO SÓLIDO O TRATAMENTO DOS EFLUENTES INDUSTRIAIS O tratamento dos efluentes industriais é fundamental para a população e o ambiente; também é estratégico para o melhoramento da imagem das indústrias mais poluentes, entre as quais figuram as químicas, as papeleiras, as têxteis, as de couro, as de alimentos, as de extração de metais e minerais e as de produção de energia. A produção de etanol gera um efluente (vinhaça) que, anos atrás, era liberado diretamente nos rios e cursos de água, provocando a eutrofização e a mortandade de peixes e de outros seres vivos. Para avaliar a dimensão do problema, basta lembrar que, para cada litro de álcool, a indústria produz até 12 litros de vinhaça. Hoje, as indústrias mais responsáveis tratam o efluente por biodigestão anaeróbia, gerando fertilizante e biogás. 140

151 BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE Outro caso interessante é o dos efluentes das indústrias de laticínios, utilizados como matéria-prima para o crescimento de microrganismos que, posteriormente, serão adicionados às rações animais. De forma análoga, o licor sulfítico dos efluentes da indústria de papel e celulose pode ser eliminado produzindo biomassa, com o fungo Paecilomyces. Em 2014, a enxurrada de lama provocada pela ruptura de uma barragem, com o refugo de extração de minério da empresa Samarco, causou 17 mortes, além da destruição do vilarejo de Bento Rodrigues e a contaminação do Rio Doce. A tragédia de Mariana, considerada o pior acidente da história da mineração, reflete o descaso de algumas empresas com o meio ambiente. À diferença dos resíduos agrícolas e urbanos, que são biodegradados, os metais procedentes das atividades extrativas e industriais (cádmio, zinco, chumbo, selênio) permanecem no ambiente, em concentrações tóxicas. Sua absorção e concentração (bioacumulação) por plantas tolerantes aos metais reduz a toxicidade do solo e facilita sua remoção em faixas de terreno pouco profundas. Existem já plantas geneticamente modificadas para transformar os compostos organomercuriais formados em diversas atividades (extração de carvão e de ouro etc.) em uma forma volátil muito menos tóxica. Em relação aos resíduos gasosos de processos industriais, o tratamento de compostos orgânicos voláteis (VOCs, da sigla em inglês) é feito mediante filtros biológicos de diferentes tipos e complexidade tecnológica. AS EMISSÕES DE GASES E O EFEITO ESTUFA Existem fontes naturais de gases, como os vulcões e os cupins. Estes, devido à atividade da flora intestinal simbionte que lhes permite digerir celulose, liberam 40 milhões de toneladas de metano por ano. No entanto, o homem é o principal responsável pela emissão dos gases que causam o efeito estufa, através de atividades como o depósito do lixo em aterros sanitários, o cultivo do arroz, a criação de gado, a liberação de efluentes agroindustriais sem tratamento e a queima de combustíveis fósseis (petróleo, gás natural e carvão). Os níveis de metano atmosférico são hoje duas vezes maiores que na era pré-industrial, um dado preocupante, sabendo que a contribuição do metano para o efeito estufa é 20 vezes superior à do dióxido de carbono. Embora sua utilização como combustível elimine uma fonte de contaminação atmosférica, a rentabilidade do processo nem sempre justifica o seu aproveitamento. Várias iniciativas tendem a recuperar o metano dos aterros sanitários e utilizá-lo como combustível alternativo. A América Latina, que emite 6% dos gases contaminantes, já está entrando neste mercado com vários projetos de reaproveitamento do metano (aterros sanitários, resíduos agroindustriais) na Argentina, no Brasil, no Chile, em Cuba, no México, no Uruguai. As iniciativas dependem de empresas privadas e/ou de organismos governamentais; alguns estudos preliminares contaram com financiamento do Banco Mundial. Em relação à gasolina, a combustão dos biocombustíveis (mistura gasolina-etanol ou etanol puro) emite quantidades menores de monóxido de carbono (CO), óxidos de enxofre (SO x), hidrocarbonetos e outros compostos poluentes. Em compensação, liberam-se aldeídos cancerígenos e, dependendo do motor, óxidos de nitrogênio (NO x). Apesar disso, estima-se que, entre 2004 e 2008, o uso de biocombustíveis na frota flexfuel brasileira teria deixado de liberar na atmosfera 35 milhões de toneladas de CO 2. Calcula-se também que, para que essa economia fosse de 530 milhões de toneladas de CO 2, bastaria misturar com álcool apenas 10% da gasolina disponível no planeta. O Protocolo de Kyoto (1997) previa a redução da emissão de gases contaminantes (dióxido de carbono, metano, óxidos nitrosos e clorofluorocarbonetos). Ratificado por numerosos países, mas não por Estados Unidos nem Rússia, responsáveis respectivamente por 36% e 17% das emissões, o protocolo de Kyoto não teve ainda os resultados esperados. 141

152 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Contudo, criou-se um mercado paralelo da descontaminação através da compra e venda do Certificado de Redução de Emissões (CER, do inglês Certificate of Emission s Reduction), que nada mais é que um bônus sobre a quantidade de contaminação deixada de emitir. Deste modo, o Protocolo de Kyoto permite que, tendo superado a cota de gases a emitir, um país continue contaminando a atmosfera, se comprar bônus de um país que não a contamina, ou que reduz sua própria contaminação. A RECUPERAÇÃO DE RECURSOS NATURAIS O PETRÓLEO Na extração de petróleo, técnicas especiais (EOR, do inglês enhanced oil recovery) envolvem o uso de polímeros de origem microbiana (xantana) para aumentar a viscosidade e facilitar o seu bombeamento. A introdução direta dos microrganismos no poço (MEOR, do inglês microrganism enhanced oil recovery) parece menos interessante do ponto de vista econômico, mas isso poderia mudar, se o petróleo começar a se esgotar. A MINERAÇÃO A extração dos metais solubilizados nas águas escuras e ácidas do Rio Tinto (Andaluzia, Espanha) data do domínio romano; abandonadas durante séculos, as minas foram exploradas a partir do século XIX por uma empresa inglesa, hoje australiana. Em 1947, o isolamento de bactérias quimiotróficas do gênero Thiobacillus mostrou que a acidificação das águas e a consequente solubilização dos metais eram o resultado de uma ação combinada entre agentes químicos e biológicos. As bactérias transformam os sulfetos metálicos insolúveis em sulfatos solúveis, mediante uma reação de oxidação que libera a energia necessária para sua reprodução e crescimento. A fixação de dióxido de carbono fornece o carbono necessário para a síntese dos componentes celulares, de modo que os requerimentos bacterianos se limitam ao oxigênio e a pequenas quantidades de nitrogênio e fósforo. A biolixiviação se aplica especialmente à extração de cobre, urânio, ouro, zinco, chumbo, níquel e cobalto. A tecnologia é relativamente simples e requer pouca inversão, sendo adaptada aos países em desenvolvimento. Na América Latina, usa-se a biolixiviação para a extração de cobre (Chile, México e Peru) e de ouro (Brasil, Chile e Peru). A BIOMINERAÇÃO NO CHILE Os Andes chilenos guardam as maiores reservas de cobre do planeta. Na época pré-colombiana, foi utilizado, pelas culturas Tiahuanaco e Inca, na produção de bronze, uma liga de cobre e estanho. Durante o período colonial, a produção de cobre se manteve baixa, mas entre 1820 e 1900 extraíramse dois milhões de toneladas. Ao finalizar o século XIX, as jazidas com alta concentração de cobre começaram a dar indícios de esgotamento. No século XX, os consórcios internacionais, que dominavam a tecnologia necessária para a extração do cobre chileno de baixa concentração, assumiram o controle da indústria (Braden Copper Co., Kenecott Corporation, Chile Exploration Company). Após uma década de chilenização, em 1971 as principais minas de cobre foram nacionalizadas. Atualmente, 31% da produção de cobre do Chile está em mãos da Codelco (do espanhol, Corporación Nacional del Cobre), uma empresa estatal criada em 1976, que emprega pessoas; o resto é produzido pelo setor privado. Em 2014, Codelco foi o maior produtor de cobre de mina do mundo e o segundo de molibdeno de mina. As primeiras experiências de biolixiviação foram realizadas, entre 1950 e 1980, em Rio Tinto (Espanha), Cananea (México) e Toromocho (Peru). A exploração da mina de Pudahuel (Codelco, Chile), com tecnologia nacional de biolixiviação, começou na metade da década de A bio- 142

153 BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE hidrometalurgia se estendeu rapidamente, havendo estabelecimentos que extraem o cobre exclusivamente por biolixiviação. As operações são especialmente apropriadas para as minas de baixa qualidade ou semiesgotadas, assim como para a recuperação do cobre, nos refugos existentes. A tecnologia envolve a produção de biomassa, em biorreatores que geram diferentes soluções de microrganismos específicos, com as quais se regam as pilhas de minério. Os microrganismos dissolvem o ferro e o enxofre, liberando o cobre e deixando-o em forma solúvel. Uma vez recolhido em piscinas, esse líquido rico em cobre passa para as plantas de extração, onde se obtêm os cátodos de cobre de alta pureza. A oxidação biológica dos amontoados ou pilhas permite recuperar 75 a 90% do cobre, a um custo muito baixo, em períodos de 6 a 12 meses. No desenvolvimento tecnológico da biomineração, participaram universidades e institutos de pesquisa, além do setor produtivo, com apoio do governo e do Pnud (Programa das Nações Unidas para o Desenvolvimento). As pesquisas atuais contemplam o uso de microrganismos termofílicos (Sulfobolus) e a otimização do processo de bio-oxidação (Thiobacillus ferroxidans). Fundada em 2002, por Codelco e Nippon Mining & Metals Co. Ltd., a empresa BioSigma desenvolve estudos microbiológicos e genômicos, assim como as tecnologias de produção de biomassa, que permitem a inoculação das pilhas, acelerando a recuperação de minério. A partir de uma primeira patente, descrevendo um método para modificar geneticamente as bactérias extremófilas, do gênero Acidithiobacillus, encontradas no minério de cobre, Biosigma conta com mais de 80 patentes concedidas no Chile e no exterior, além de muitas outras em andamento. Hoje, 5% da produção cuprífera do Chile é obtida por biolixiviação. O DIAGNÓSTICO DE CONTAMINAÇÃO AMBIENTAL O diagnóstico de contaminação ambiental exige o monitoramento da água, do ar e do solo. As biotecnologias desenvolvidas abrangem o uso de indicadores biológicos, de técnicas imunológicas e genéticas e de biossensores. INDICADORES BIOLÓGICOS Plantas e animais, capazes de acumular metais pesados, e poluentes orgânicos persistentes podem ser utilizados como indicadores biológicos. A contaminação ambiental é avaliada, diretamente, pela concentração do contaminante em um organismo específico. Na avaliação indireta, são analisadas outras variáveis, tais como o número de plantas e de espécies microbianas, o número de indivíduos nessas espécies etc. TÉCNICAS GENÉTICAS As técnicas genéticas são aplicadas para identificar as populações microbianas presentes no ambiente. Como ainda não sabemos como cultivar no laboratório a maior parte dos microrganismos ambientais, uma boa parte dessa biodiversidade permanece desconhecida. A tecnologia do DNA facilita a identificação dessas espécies, em função das sequências gênicas correspondentes ao RNA ribossômico (rrna de 16S), e ajuda a monitorar as mudanças nas comunidades microbianas utilizadas na remoção de poluentes, de maneira a detectar qualquer variação ambiental e restaurar rapidamente as condições ótimas do sistema. Microarrays adequados avaliam a expressão dos genes em uma linhagem ou uma comunidade microbiana em relação a um agente ambiental (genossensores). 143

154 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) TÉCNICAS IMUNOLÓGICAS As técnicas imunológicas utilizam anticorpos específicos, marcados ou associados a enzimas. As técnicas imunoenzimáticas, cujos resultados podem ser apreciados, simplesmente, por uma mudança de cor, resultam especialmente apropriadas para os testes de campo. Substituem testes tradicionais e lentos, que exigem um equipamento complexo, como os de presença de coliformes na água. Imunoensaios de diversos tipos permitem o monitoramento contínuo, automatizado e barato de pesticidas como o dieldrin, o parathion e os PCBs. BIOSSENSORES Os biossensores combinam diferentes componentes biológicos e eletrônicos, geralmente sob a forma de um chip; alguns são muito seletivos, outros são sensíveis a um amplo espectro de substâncias. O componente biológico pode ser uma enzima, um anticorpo ou um microrganismo. Respondendo a um estímulo ambiental se verifica uma mudança em suas propriedades, mudança que é detectada óptica ou eletronicamente, fornecendo uma medida quantitativa do contaminante (Figura 11.5). Bactérias ou leveduras imobilizadas revelam a presença de uma determinada substância, seja porque a metabolizam, seja porque esta inibe o próprio metabolismo microbiano. Especialmente interessante é a utilização de organismos geneticamente modificados, associando o promotor do gene de uma enzima, que reage com a substância procurada (arsênico, por exemplo), com genes indicadores (luminescência, fluorescência ou produção de uma substância colorida) FIGURA O funcionamento de um biossensor O sinal aumenta ou diminui em função da concentração do substrato contaminante, que estimula ou inibe a ação do agente biológico. Biodetector imobilizado Membrana Substrato O substrato reage com o biodetector, originando um produto específico Ao detectar um produto específico, o transdutor gera um sinal elétrico Amplificador Circuito Sinal de saída (Output) 144

155 BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE A BIORREMEDIAÇÃO Como resultado das atividades humanas, aproximadamente 2,5 milhões de toneladas de substâncias químicas perigosas são liberadas anualmente no meio ambiente (Tabela 11.2). Em alguns casos, tratase de emissões deliberadas e regulamentadas (resíduos industriais), em outros, de escapamentos acidentais (manchas de óleo ou de petróleo). Muitas das substâncias químicas presentes no ambiente foram geradas pelo homem. Algumas podem ser degradadas, em poucos meses, por algum organismo; outras persistem na natureza durante um longo tempo. Consideradas recalcitrantes, essas moléculas são alheias ao mundo dos seres vivos (xenobióticas). Não são biodegradadas ou, quando o são, o processo é lentíssimo, podendo demorar centenas de anos. Existem várias estratégias para retirar substâncias recalcitrantes do meio ambiente (Figura 11.6). As opções contemplam a construção de barreiras físicas, a lavagem ou ventilação do solo contaminado e sua destruição, por incineração ou por biorremediação. Para que esta última possa ser aplicada, é necessário que o poluente seja transformado metabolicamente por algum agente biológico, que os produtos finais sejam seguros e que as condições ambientais favoreçam a atividade microbiana TABELA Os principais contaminantes do meio ambiente CATEGORIA Inorgânicos Orgânicos EXEMPLO Metais (cádmio, mercúrio, prata, cobalto, chumbo, cobre, cromo, ferro), isótopos radiativos, nitratos, nitritos, fosfatos, cianetos, asbestos. Resíduos petroquímicos: petróleo, gasóleo, compostos aromáticos (benzeno, tolueno, etilbenzeno, xileno). Produtos sintéticos: pesticidas organo-halogenados como os bifeniles policlorados (PCBs) ou os hidrocarbonetos poliaromáticos. Gasosos Gases: dióxido de enxofre (SO 2), dióxido de carbono (CO 2), óxidos nitrosos (NO x), metano (CH 4). Compostos voláteis: clorofluorocarbonetos (CFCs), compostos orgânicos voláteis (VOCs). FIGURA As estratégias de biorremediação Microrganismos Microrganismos Microrganismos geneticamente do ambiente selecionados modificados (em sistema fechado) MEIO CONTAMINADO Otimização dos fatores que estimulam a ação bacteriana (estrutura do solo, ph, aceptores de elétrons). Suplemento de nutrientes MEIO DESCONTAMINADO 145

156 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Uma forma de biorremediação é o tratamento in situ, que envolve a produção de biomassa específica no local contaminado. Bactérias e/ou fungos do ambiente digerem o material tóxico, transformandoo em produtos inofensivos, voltando posteriormente a seu nível populacional normal no ambiente ou morrendo. O crescimento da população microbiana pode ser estimulado pelo acréscimo de nutrientes. Outra forma de biorremediação dos solos contaminados é o tratamento ex situ, em que o solo escavado é transferido a um biodigestor. Como a liberação de microrganismos geneticamente modificados no ambiente é vista com extrema desconfiança, sua utilização costuma estar restringida a esses sistemas fechados. Uma das raízes dessa desconfiança pode ser atribuída à Conferência de Asilomar. Em 1975, a preocupação principal dos pesquisadores era a contenção dos microrganismos geneticamente modificados, recomendando o uso de microrganismos fracos que, eventualmente, não sobrevivessem no ambiente. Essas condições eram fundamentais para a continuidade das pesquisas, apesar de ter estimulado o medo e a hostilidade da sociedade, em relação à liberação de microrganismos geneticamente modificados engenherados no ambiente. Na década de 1980, com o objetivo de evitar o congelamento dos cultivos de morango da Califórnia, a empresa AGS (Advanced Genetic Sciences) desenvolveu a bactéria Pseudomonas syringae, geneticamente modificada para eliminar uma proteína que facilitava a formação de gelo. Boa parte da opinião pública se mostrou totalmente contrária à utilização da P.syringae, variedade ice minus, temendo que alterasse a composição das nuvens e o regime de chuvas. Em 1987, um processo judicial culminou com a autorização para realizar os testes de campo correspondentes. Os experimentos foram bem-sucedidos, mas, em função da resistência encontrada, a empresa abandonou o projeto. Em compensação, AGS comercializou Snowmax, um produto criado para aumentar a eficiência da maquinaria produtora de neve artificial. Um dos principais ingredientes era a variedade convencional de P. syringae, produtora da proteína facilitadora da formação de gelo. Snowmax garantiu a neve dos Jogos Olímpicos de Inverno de 1988, em Calgary (Canada). OS VAZAMENTOS DE PETRÓLEO A formação de carvão e de petróleo nas profundezas da terra é possível porque, em condições anaeróbias, tanto a lignina como os hidrocarbonetos são compostos químicos estáveis. Porém, em condições aeróbias, ambos são degradados pelos microrganismos presentes no ambiente. Um dos mais sérios problemas de contaminação ambiental é o derramamento de petróleo nos mares, devido a acidentes notórios (Prestige, Exxon Valdez, Torrey Canyon, Amoco Cadiz, Braer and Sea Empress, British Petroleum) e a situações bélicas (Guerra do Golfo). As manchas de óleo despejadas no mar contêm compostos tóxicos, que representam uma ameaça para a ecologia marinha e costeira, afetando todas as formas de vida aquática e constituindo um risco para a saúde da população. O petróleo derramado no mar flutua na superfície, onde os componentes voláteis evaporam rapidamente. O que não for recuperado pelo homem será dispersado pelo movimento das ondas, permanecendo em alto-mar, ou sendo levado até a costa. Sua degradação dependerá dos microrganismos naturalmente presentes no ambiente marinho. Em 1971, A. Chakrabarty desenvolveu, a partir de várias linhagens de Pseudomonas spp., uma superbactéria que reunia, em um único plasmídio, os genes necessários para degradar quatro componentes do petróleo: cânfora, xileno, octano e naftaleno. Depois de um longo processo judicial que culminou em 1980, Chakrabarty recebeu a primeira patente de um ser vivo: uma bactéria geneticamente modificada, projetada para degradar componentes do petróleo. Embora tenha 146

157 BIOTECNOLOGIA E MEIO AMBIENTE passado com êxito nos testes laboratoriais, a bactéria de Chakrabarty não chegou a ser utilizada no acidente do Exxon Valdez no Alaska (1989) nem em outros vazamentos posteriores. Hoje, admite-se que um microrganismo geneticamente modificado teria poucas possibilidades de sobrevivência na natureza, onde enfrentaria populações de microrganismos extremamente competitivas. Por isso, a tendência atual é de estudar consórcios microbianos naturais, selecionados de modo a que cada tipo de microrganismo sintetize alguma das enzimas necessárias para a degradação da substância contaminante. Obviamente, existem também pesquisas sobre microrganismos ambientais, como Alcanivorax borkumensis, que é capaz de metabolizar 70% dos componentes do petróleo; sendo de especial interesse toda informação nova sobre suas rotas metabólicas e seus requerimentos de fósforo e de nitrogênio. Também há pesquisas visando a produção de biosurfactantes por algas, para substituir os surfactantes usados atualmente, que são muito tóxicos. A principal estratégia aplicada, atualmente, para remediar os vazamentos de petróleo é a bioestimulação. Como o ambiente marinho é geralmente pobre em nitratos e fosfatos, acrescentamse nutrientes aos dispersantes químicos (detergentes), ou às espumas de limpeza das rocas da costa, de maneira a estimular a ação dos microrganismos presentes no sítio contaminado. Estima-se que, até o momento, o solo de mais de sítios contaminados com petróleo, proveniente de vazamentos de tanques de armazenamento, tenha sido tratado por bioaumentação. A RADIAÇÃO Após o acidente da planta nuclear de Chernobyl (1986), tentou-se remover a contaminação mediante o plantio de girassóis, que absorvem e concentram o césio radiativo. As plantas devem ser cortadas e tratadas como material contaminado, após a floração e antes da frutificação, porque as sementes poderiam ser dispersadas pelos pássaros. Devido à estrutura diferente do solo, esta estratégia não funcionou em Fukushima (Japão), onde uma mistura de algas e fungos parece ser mais eficiente. ARMAS E CONFLITOS BÉLICOS Além de causar enorme sofrimento humano, a indústria bélica cria também problemas ambientais de grandes proporções, como ocorrido na Carolina do Sul (Estados Unidos), na década de 1990, quando o tricloroetileno (TCE) utilizado, como desengordurante, na fabricação de armas, fora despejado no solo, contaminando as águas subterrâneas e o rio Savannah. Na descontaminação, utilizaram-se microrganismos que sobrevivem no ambiente contaminado, por ter sistemas enzimáticos capazes de digerir os poluentes-alvo, ligeiramente diferentes de seus substratos normais. Escolheu-se uma bactéria que metaboliza metano, mas é capaz de degradar o TCE. Ao bombear metano no solo, a bactéria se multiplica; ao suspender o bombeamento, ela passa a degradar o TCE por um tempo, até o bombeamento de metano se tornar novamente necessário. A repetição cíclica do processo reduziu a contaminação a um nível aceitável. A utilização do metabolismo gratuito bacteriano é considerada viável do ponto de vista comercial. Outro composto que causou danos incalculáveis foi o Agente Laranja, lançado como desfolhante nas florestas vietnamitas, pelos Estados Unidos, durante a guerra do Vietnam. Em fins da década de 1960, Chakrabarty conseguira uma mistura de linhagens bacterianas capaz de degradar um de seus principais componentes, o herbicida 2,4,5-T. Não temos encontrado registros de uso dessa bactéria. Porém, recentemente, foram aplicadas com sucesso técnicas de biorremediação no entorno da base de Danang para eliminar a dioxina, outro dos componentes do Agente Laranja. Um problema de difícil solução é a detecção e eliminação das 60 a 70 milhões de minas antipessoais, espalhadas no mundo. Uma possível saída parece ser a utilização de plantas de 147

158 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Arabidopsis transgênicas (Aresa, Dinamarca). Estas plantas, portadoras de genes microbianos, degradam a trinitroglicerina (TNT) liberando NO 2, que é absorvido pela planta, modificando, três semanas mais tarde, a cor das folhas. Os conflitos bélicos atuais no Oriente Médio não se limitam unicamente a uma tragédia humana sem precedentes. Deixarão uma herança ambiental terrível. ORGANISMOS NOVOS NA NATUREZA E BIOSSEGURANÇA A construção de Synthia (Instituto J. Craig Venter, 2010) e a disponibilidade das novas plataformas tecnológicas sugerem que os organismos novos na natureza (NTN, do inglês, New to Nature), originados por Biologia Sintética, podem estar mais próximos do que imaginamos. Poderia ser inseguro um NTN construído com partes seguras? A preocupação com biossegurança é inerente ao desenvolvimento da biotecnologia e, assim como em Asilomar, a questão fundamental continua sendo a contenção. Vários são os questionamentos para os quais ainda não temos respostas: qual seria o comportamento na natureza de um organismo construído juntando partes, dispositivos e sistemas biológicos, dentro de determinado chassis? Qual seria o impacto ambiental desse organismo sintético, se a contenção for insuficiente? O que aconteceria com um NTN liberado em um ambiente sem predadores específicos? Poderia haver intercâmbio genético entre um organismo NTN e um organismo biológico convencional, contaminando o pool genético natural? Poder-se-ia falar de certeza de contenção (CoC, do inglês Certainty of Contention) de um NTN se a probabilidade de escapamento, sua disseminação e a interação não intencionada com o ambiente fossem praticamente zero. Nesse caso, em vez de Organismos Geneticamente Modificados, teríamos Organismos Geneticamente Seguros. Algumas das primeiras hipóteses contempladas, para garantir a contenção de um NTN, esbarraram no fenômeno de transferência horizontal, frequente entre os microrganismos ambientais. Por esse motivo, foram descartados tanto o uso de marcadores de resistência a antibióticos, como a inclusão de genes suicidas, desenhados para provocar a morte do organismo, uma vez cumprida sua função. As discussões atuais estão centradas na utilização de alguns sistemas bioquímicos modificados que garantiriam a certeza de contenção. Entre as possibilidades consideradas, teríamos a expansão do alfabeto genético com outras bases de DNA, a construção de ribossomos que reconheçam um código de 4 bases, a substituição de códons para permitir a inclusão de aminoácidos não naturais etc. Contudo, resta avaliar qual seria a eficiência desses sistemas e, ainda, responder à seguinte pergunta: Solucionariam o problema ou criariam outros? 148

159 C A P Í T U L O 12 BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE O conceito de biodiversidade abrange toda a variação existente nos seres vivos. Há 1,75 milhão de espécies identificadas até o momento, o que representa uma pequena fração dos 13 milhões que existiriam no planeta. Pouco sabemos da biodiversidade existente em regiões remotas, como as calotas glaciares ou as profundezas submarinas. Em outra acepção do termo, a biodiversidade compreende a variabilidade genética intraespecífica. Considerando que apenas estamos começando a entender a estrutura dos genomas correspondentes às diferentes espécies, muito resta a estudar. As mudanças climáticas terão graves consequências para a biodiversidade. A desestabilização dos ecossistemas afetará a extensão de terra cultivável, deixando sequelas na produção de alimentos e favorecendo a aparição de doenças emergentes e reemergentes. O Plano Estratégico para a Conservação da Biodiversidade (Nações Unidas) fixa, para a década de 2011 a 2020, os seguintes objetivos: conservar a biodiversidade e fomentar sua utilização sustentável; distribuir de maneira justa os benefícios do uso dos recursos genéticos. A DESAPARIÇÃO DOS ECOSSISTEMAS NATURAIS O cultivo de plantas e a domesticação de animais acompanharam o homem na passagem de uma vida nômade para uma vida sedentária; uma mudança que ocorreu repetidas vezes, em diversas populações e em lugares diferentes. As primeiras plantas cultivadas foram a cevada e o trigo (vales do Eufrates e do Nilo, entre a.c. e a.c.), o arroz (regiões fluviais da China e da Índia, a.c.), e o milho e a abóbora (América Central, entre e 7000 a.c.). No continente europeu, durante a Antiguidade, os cultivos estiveram restringidos a umas poucas espécies locais. As plantas provenientes de outros lugares chegaram lentamente, através do incipiente intercâmbio comercial, ou como troféus de guerra, de romanos e cruzados. As técnicas agrícolas primitivas limitavam-se à tração animal do arado e ao armazenamento de alimentos. Na Idade Média, a introdução da rotação trienal de culturas possibilitou a conservação do solo e o aumento da produção. As grandes navegações e a descoberta do Novo Mundo mudaram o perfil das plantas cultivadas em cada continente. O milho, a batata, o tomate, o feijão, o girassol e o tabaco foram introduzidos na Europa. Procedentes de diferentes lugares, o trigo, o grão-de-bico, o arroz, os cítricos, a banana, o café e a cana-de-açúcar se aclimataram na América (Figura 12.1). No Novo Mundo e ligado ao tráfico de escravos, o ciclo da agricultura das plantações providenciou o cultivo de plantas produtoras de fibras (algodão, juta) e de borracha (caucho), de açúcar (cana-deaçúcar), de óleo (amendoim, palma), de frutos (banana), de substâncias estimulantes (chá, café, cacau) etc. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

160 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA O transporte de plantas de um continente a outro 1: Trigo, aveia, videira, grão-de-bico. 2: Abóbora, feijão, milho, pimenta, tabaco, batata, tomate. 3: Café, inhame. 4: Abacaxi, amendoim, cacau, caucho, mandioca, milho, tomate, pimenta, cinchona. 5: Cítricos, banana, soja, cana-deaçúcar, arroz. 6: Abacaxi, amendoim, cacau, caucho, mandioca, milho, tomate, algodão, abacate. FIGURA Distribuição da produção agrícola (grãos e cereais, pradarias e pastagens, cultivos diversos) na área habitável do planeta Grãos e cereais (10%) Cultivos diversos (1%) Florestas (31%) Pradarias e pastagens (24%) Outros usos (34%) Nesse marco econômico, ficaram definidas algumas das características da agricultura moderna, que visa satisfazer as necessidades dos consumidores, relativas à produção de alimentos e de insumos industriais. A história da domesticação dos animais segue um curso parecido, começando com o cachorro, na Ásia, no final do Paleolítico. Entre e a.c., foram domesticadas a cabra e a ovelha (Mesopotâmia), o boi e o zebu (Mesopotâmia, Egito), o porco (China, Europa) e o gato (Mediterrâneo). A domesticação do cavalo ocorreria bem mais tarde (Ucrânia, a.c.). Antes da chegada dos europeus ao continente americano, os povos originários sustentavam criações de lhamas, alpacas, vicunhas, perus e preás. Os europeus importaram seus animais domésticos uma vez conquistado o Novo Mundo. Cavalos, vacas, porcos e cachorros se multiplicaram rapidamente, causando grande devastação na flora local e tornando as grandes planícies um lugar ideal para a criação de gado. A expansão dos ecossistemas agrícolas acompanhou a ocupação, pelo homem, da superfície habitável do planeta, que exclui os oceanos, os mares, os desertos, as montanhas e as regiões polares (Figura 12.2). O aumento significativo da produtividade agrícola no século XX esteve diretamente 150

161 BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE ligado às novas práticas agronômicas, à mecanização do trabalho no campo e ao melhoramento genético. Contudo, esse progresso teve um impacto negativo na biodiversidade, ao limitar o número de espécies cultivadas. Para evitar o desaparecimento dos ecossistemas naturais, precisa-se de uma agricultura e pecuária sustentáveis, que possibilitem a conservação e a manutenção dos solos, da água, dos processos ecológicos e dos recursos genéticos. O HOMEM E AS PLANTAS AS PLANTAS ALIMENTÍCIAS Os vegetais ocupam um lugar preponderante na dieta humana. Embora nossa alimentação inclua também produtos animais (carne, leite, ovos, peixes, mariscos), a maioria das proteínas que ingerimos é de origem vegetal. Os carboidratos presentes nos cereais fornecem 75% de nossas necessidades calóricas, sendo as restantes complementadas pela ingestão de tubérculos, raízes, plantas oleaginosas e sacarinas. Embora provendo uma pequena quantidade de calorias, as hortaliças e as frutas são importantes devido a outros valores nutritivos (Tabela 12.1). Apesar de existir uma enorme diversidade de plantas comestíveis, 90% dos alimentos consumidos pelo homem restringem-se a um pequeno grupo de 20 a 25 espécies, sendo os principais a banana, a mandioca, o milho, o amendoim, algumas leguminosas, o milheto, a batata, o arroz, o sorgo, a batatadoce, a soja e o trigo (Figura 12.3). A população humana passará, em meio século, de 6 bilhões de pessoas (2000) a 9 bilhões (2050). Será suficiente a produção de alimentos para satisfazer as necessidades dessa população? Ao longo dos últimos sessenta anos, duplicou-se a colheita de cereais e reduziram-se significativamente os preços. O aumento da produção de alimentos deve-se à seleção de variedades mais produtivas e ao cultivo em condições otimizadas. O progresso tecnológico da Revolução Verde (década de 1960) gerou suficientes alimentos para suprir a humanidade, até hoje. Contudo, ainda hoje, 4,5 bilhões de pessoas vivem na pobreza, pessoas morrem diariamente de fome e outras , principalmente crianças e mulheres, sofrem de desnutrição. A carência de vitamina A afeta 14 milhões de crianças, e a falta de ferro, um bilhão de pessoas. Mesmo havendo suficientes alimentos para todos, eles não chegam aos dois bilhões de pessoas que vivem com menos de dois dólares por dia TABELA Os principais tipos de vegetais que entram em nossa alimentação TIPOS DE VEGETAIS Cereais Plantas proteaginosas Raízes e tubérculos Plantas oleaginosas Plantas produtoras de açúcar Frutas e hortaliças EXEMPLOS Trigo, arroz, milho, centeio, aveia, cevada, sorgo etc. Diversos tipos de feijão, lentilha, grão-de-bico, amendoim, ervilha etc. Batata, cará, batata-doce, mandioca, cenoura, beterraba etc. Soja, algodão, colza, canola, amendoim, girassol etc. Cana-de-açúcar, beterraba sacarina. Banana, tâmara, coco, azeitona, abacate, manga, uva, fruta-pão, couve, couve-flor, tomate, pimenta, quiabo, berinjela, pepino, abóbora etc. 151

162 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA Os vegetais na alimentação humana Espécies outrora consumidas como alimento (5.000) Espécies cultivadas atualmente (2.300) Espécies cultivadas comercialmente (150) Espécies essenciais na dieta humana (20-25) Espécies comestíveis ( ) Segundo a Food and Agriculture Organization (FAO), para responder às necessidades da população, a produção de alimentos deverá aumentar em 60%, nos próximos 30 anos. Considerando que 90% das pessoas viverão na faixa intertropical do planeta, onde está situada a maioria dos países em desenvolvimento, a falta de alimentos poderá se agravar. Em parte, porque, salvo algumas exceções significativas (chá, café, cacau, banana etc.), os alimentos são consumidos no mesmo lugar onde são produzidos. E também porque, em função das mudanças climáticas e da tendência migratória para as grandes cidades, aumentará o número de pessoas que, em vez de produzir alimentos, deverá comprálos. Embora em vários lugares tenham aparecido sinais de erosão e de esgotamento do solo, a expansão da fronteira agrícola parece improvável. Boa parte da terra não utilizada se encontra em regiões pouco férteis, distantes, carentes de infraestrutura ou cobertas por florestas. Sua ocupação aceleraria a degradação de ecossistemas, com perda de biodiversidade e risco de aparição de doenças. Os grandes desafios atuais da humanidade são o aumento da produtividade dos sistemas agrícolas e a redução da desigualdade de acesso aos alimentos. Se, para o primeiro, o desenvolvimento tecnológico é indispensável, a história mostra que, sem mudanças sociais e políticas, não haverá solução para o problema da fome. AS PLANTAS COMERCIAIS A PRODUÇÃO DE INSUMOS Várias plantas são cultivadas e comercializadas, às vezes internacionalmente, como matéria-prima para diversas indústrias (Tabela 12.2). Assim como o ouro, a carne, o petróleo e o gás natural, os grãos são considerados produtos equivalentes (commodities), independentemente do produtor. Os preços são fixados em mercados futuros, que estabelecem a quantidade e a qualidade da commodity a ser comercializada. De todas as plantas industriais, a soja é uma das mais importantes, devido à extraordinária versatilidade de seus produtos. O grão e os brotos podem ser consumidos diretamente ou como farinha na composição de pães, doces, bebidas, massas, biscoitos etc. Os grãos fermentados são utilizados na culinária oriental (misó, tempeh). A fração proteica do grão substitui a proteína de origem animal como carne de soja. Também é usada na elaboração de produtos dietéticos, pastas e cremes, massas, sucrilhos, comida de bebês, bebidas etc. A torta de soja é incluída nas rações animais. Por outro lado, essa fração proteica entra na composição de adesivos, reagentes analíticos, colas de madeira, emulsão asfáltica, produtos de limpeza, cosméticos, substitutos de couro e plásticos. O óleo extraído do grão é usado para cozinhar e como condimento para saladas e, na indústria de alimentos, entra na composição de molhos, maioneses, coberturas de bolo, bebidas, patês e 152

163 BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE margarinas. Outras indústrias o utilizam como anticorrosivo e antiestático, entrando na composição de agentes dispersantes e antiespumantes, selantes, cosméticos, madeirite, corantes e tintas. Atualmente, 80-90% do óleo de soja produzido provém de culturas transgênicas. Assim como a soja, o milho apresenta um espectro de aplicações de amplidão equivalente na alimentação e na indústria. Não é de surpreender que os primeiros cultivos transgênicos comercializados correspondessem a quatro das plantas industriais: a soja, o milho, o algodão e a canola TABELA As plantas e a indústria PRODUTO Biocombustíveis Fibras têxteis Óleos e gorduras Essências e fragrâncias Látex Ceras Resinas Especiarias Taninos Tinturas PLANTAS INDUSTRIAIS Cana-de-açúcar, beterraba sacarina, cereais, soja, mamona etc. Algodão, sisal, linho, cânhamo, juta, coco, rami, piaçava. Soja, algodão, colza, canola, amendoim, girassol, dendezeiro, babaçu, mamona, sésamo, oliveira, linhaça. Sassafrás, menta, citronela, geraniol, eugenol, capim-limão. Borracha, chicle (sapoti). Carnaúba, jojoba. Bálsamos e gomas. Pimenta-do-reino, noz moscada, canela, gengibre, cravo-da-índia. Acácia, quebracho, eucaliptos. Pau-brasil, pau-campeche, urucum A EXPLORAÇÃO DAS FLORESTAS As florestas naturais têm um valor intrínseco fundamental na preservação da biodiversidade. No entanto, a lenha ainda é utilizada como combustível, e as madeiras nobres continuam a ser exploradas. As florestas também são uma fonte de matéria-prima para a indústria de papel e celulose. As biotecnologias facilitam o reflorestamento, através da micropropagação e do plantio clonal de árvores mais produtivas, obtidas por melhoramento genético convencional ou por engenharia genética. Técnicas de engenharia genética visam reduzir a lignina em 45-50%, de modo a diminuir a necessidade de tratamentos poluentes, no processamento da polpa. A maioria dos estudos sobre essências se limita aos gêneros Pinus, Eucalyptus, Picea, Populus, Quercus e Acácia. O mapeamento de genomas (Pinus, Eucalyptus) e a utilização de marcadores genéticos permitem selecionar alelos em genes que controlam a variação fenotípica. Aplicam-se também as duas tecnologias para a obtenção de árvores que possam crescer em solos ácidos ou com salinidade acentuada. A comercialização do eucalipto transgênico de crescimento rápido da FuturaGene (Suzano), aprovado pela CTNBio, redundaria na limitação da expansão das plantações, diminuindo a energia gasta em transporte. Além do Brasil, outros países já realizaram experiências de transformação genética em árvores. Na China, a tecnologia é considerada fundamental para o reflorestamento; plantações de Populus resistente a insetos (portador de um transgene codificador da toxina do Bacillus thuringiensis) estão 153

164 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) sendo monitoradas, desde o ano Outros estudos visam a resistência à salinidade, ao estresse, à seca etc. A FLORICULTURA A floricultura é o cultivo de plantas ornamentais e de flores. Trata-se de um mercado em expansão, de importância comercial para a América do Sul, o Oriente Médio, a Asia e a África. A produção de material de propagação (mudas, sementes e bulbos) para a floricultura tende a se concentrar em grandes empresas internacionais. Cultivam-se poucas espécies nativas para exportação. A maioria das plantas comercializadas é o resultado de cruzamentos tradicionais, técnicas de cultivo de tecidos (micropropagação e embriogênese somática), haploidização e fusão de protoplastos. A produção comercial de orquídeas, por exemplo, depende hoje totalmente das técnicas de cultura in vitro; boa parte do desenvolvimento das plantas ocorre em condições de laboratório bem controladas, que permitem a obtenção de mudas sadias e de variedades novas. O Brasil exporta flores e plantas tradicionais (crisântemos, rosas, gladíolos, cravos, gérberas etc.) e plantas tropicais (helicônias, bromélias, orquídeas, antúrios etc.) em diferentes modalidades (flores de corte, flores em vaso, plantas verdes e plantas para paisagismo). A Argentina exporta rosas, cravos e palmas para cidades como Miami e Milão, de onde são distribuídas internacionalmente. Também exporta bulbos de tulipa e uma variedade de rosa preta sem espinhos. O Instituto Nacional de Tecnologia (INTA) e a Japan International Cooperation Agency (JICA) participam de um programa de cooperação para o desenvolvimento da floricultura, assim como da produção hortifrutícola. Aproximadamente 75% do mercado mundial de flores corresponde a cravos, rosas, crisântemos e gérberas, espécies nas quais faltam os pigmentos responsáveis pela coloração azul (antocianinas). Com a transferência de um gene de petúnia ao cravo, as empresas Florigene (australiana) e Suntori (japonesa) conseguiram colocar no mercado flores inovadoras, tais como os cravos (Dianthus caryophyllus L.) de cor malva (Moondust) ou violeta (Moonshadow). Na Colômbia, os cravos azuis são cultivados, desde 2000, por Flores Colombianas S.A., uma filial da empresa holandesa Floriyin, e comercializados em diversos países, inclusive dentro da União Europeia, onde levam a seguinte ressalva: Este produto é um cravo geneticamente modificado e inapropriado para o consumo por seres humanos e animais. Em 2009, a Colômbia iniciou o cultivo de rosas e crisântemos azuis transgênicos, que não são vendidos na União Europeia; os melhores clientes estão no Japão que, no século VIII, adotara o crisântemo como emblema do selo imperial. Em relação à engenharia genética, não há muito interesse em desenvolver novas variedades, porque os custos dos testes necessários para obter a aprovação de um transgênico são muito altos. No entanto, existem várias linhas de pesquisa visando o desenvolvimento de fragrâncias e a resistência a doenças e ao estresse. Também se estuda a transferência, a várias espécies ornamentais, de genes que prolonguem a conservação das flores nos vasos. A COSMÉTICA As indústrias cosméticas utilizam, em seus produtos, numerosos ativos vegetais extraídos de plantas e de algas. Em conjunto com pequenas comunidades rurais, várias empresas desenvolveram uma forma de produção sustentável de substâncias intermediárias, como óleos (coco, castanha) e outros extratos vegetais (maracujá, açaí, andiroba etc.). A onda verde que se alastra na sociedade levou várias empresas nacionais (Natura, O Boticário, Granado etc.) e estrangeiras (L Oréal-Body Shop, Zhiel s, Yves Rocher etc.) a aderir, com sucesso, a este modelo. 154

165 BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE AS PLANTAS MEDICINAIS Até o momento, foram identificadas aproximadamente espécies de plantas medicinais. Sem acesso aos medicamentos comercializados, 80% da população rural depende delas. A metade das drogas medicamentosas consumidas atualmente é extraída de 250 espécies de plantas silvestres, que representam 0,1% das plantas vasculares. Em alguns casos, o princípio ativo das plantas foi identificado e sintetizado quimicamente. O ácido acetilsalicílico da fórmula da aspirina, por exemplo, tem um efeito comparável ao do ácido salicílico, extraído da casca do salgueiro e administrado como analgésico e antitérmico, em chás e poções, desde a Antiguidade. A procura por novos medicamentos começa pela coleta das plantas, seguida da extração de substâncias químicas que são submetidas a testes de atividade biológica. Encontrar um princípio ativo pode gerar lucros muito altos, embora só um, em cada produtos testados, chegue ao mercado. Entre os fitoquímicos bem-sucedidos estão: a diosinina (produção de anticoncepcionais), a vincristina e a vinblastina (medicamentos anticancerosos), a morfina (anestésico) e o curare (relaxante em cirurgias). A BIODIVERSIDADE AMEAÇADA A EROSÃO GENÉTICA A perda de biodiversidade acarreta a perda de variação genética (erosão genética). Os dados são estarrecedores: 11 milhões de Ha/ano de florestas destruídas; avanço da desertificação em 27 milhões de Ha/ano; desaparição de 30 a 300 espécies por dia. A destruição dos ecossistemas, a diminuição do número de espécies existentes e a perda de variabilidade genética são danos irreparáveis, porque é preciso recorrer aos genes das variedades silvestres para melhorar geneticamente as plantas cultivadas e os rebanhos existentes. A erosão genética é inquietante em relação às plantas alimentícias, cultivadas em número restrito e uniformizadas em função das práticas agrícolas modernas. Se, no início do século XX, existiam na Índia mais de variedades nativas de arroz, hoje provavelmente não restam mais de 50. Por outro lado, o risco de extinção ameaça, aproximadamente, 30% das variedades ou raças dos animais de criação. Também preocupa o futuro das plantas medicinais, muitas delas silvestres, porque as melhores plantas são as primeiras a ser colhidas, enquanto as restantes ficam no terreno, produzindo as sementes que darão origem às próximas gerações. Este tipo de seleção negativa contribui para a erosão genética das espécies. A EXPANSÃO DO AGRONEGÓCIO Embora as novas tecnologias de edição genética possam modificar rapidamente o panorama, as plantas geneticamente modificadas se limitam, por enquanto, a um número reduzido de espécies e a poucos traços, principalmente tolerância a herbicidas e resistência a insetos. A globalização dos cultivos de plantas geneticamente modificadas traz alguns questionamentos relativos ao seu impacto sobre a biodiversidade. Vários cenários são possíveis, com diferentes consequências para os ecossistemas e sua biodiversidade. No primeiro, a expansão do agronegócio afetaria os espaços dedicados a outras culturas, pastagens e florestas. No segundo, ao aumentar a produção agrícola, as variedades transgênicas diminuiriam a pressão sobre as áreas não cultivadas, especialmente as florestas. 155

166 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A materialização de um ou outro, assim como a de qualquer outro cenário intermediário, dependerá das pressões socioeconômicas e das políticas públicas relativas à produção de alimentos, exportações e proteção do meio ambiente. Mas não da transgênese em si, porque os cenários seriam os mesmos se em vez de plantas geneticamente modificadas dispuséssemos de plantas melhoradas por métodos tradicionais. A expansão da monocultura de um pequeno número de espécies representa, sem dúvida, uma perda da biodiversidade existente no ambiente natural. No entanto, o mercado de sementes difere de outros mercados globalizados, como o de bebidas gasosas, o de eletrônica ou o de informática, que geram produtos standard, de modo que a comercialização de um único tipo de semente não significa necessariamente a total uniformização do material genético. Nenhuma semente está presente ou é comercializada em todo o globo, criando-se variedades adaptadas a contextos específicos. Essas variedades ou cultivares distinguem-se entre si por suas características morfológicas, fisiológicas, bioquímicas ou moleculares, herdadas geneticamente. A estratégia é a mesma em relação às plantas transgênicas. Por exemplo, das 668 cultivares de soja (Glycine max (L.) Merrill), registradas no Registro Nacional de Cultivares (RNC/ MAPA), mais de 200 são transgênicas. A TRANSGÊNESE Muitas das plantas consideradas naturais são um invento recente do homem. Um exemplo é o morango, resultante de um cruzamento acidental entre duas variedades que não coexistem na natureza: a norte-americana Fragaria virginiana e a sul-americana Fragaria chiloense, ocorrido no século XIX em um Jardim Botânico da França. Outro exemplo é o tritical, um híbrido de trigo e centeio, obtido em laboratório em fins do mesmo século. Tratado inicialmente como uma curiosidade científica, este cereal teve suas propriedades agronômicas desenvolvidas recentemente, sendo utilizado hoje na composição de pães e biscoitos e de rações animais; também é vendido em algumas lojas de produtos naturais. A valorização do que é natural varia de uma pessoa a outra. Se a natureza for vista como boa e protetora, toda intervenção humana será observada com desconfiança. Ao contrário, frente a uma natureza perigosa e ameaçadora, cabe ao homem se resguardar. Dessas duas visões do mundo natural nascem a tecnofobia e a tecnofilia, duas correntes que se enfrentam frequentemente. A transgênese é especialmente perturbadora para alguns setores de opinião, contrários ao uso dessa tecnologia. Em alguns casos, existiria desconfiança na ligação atual entre a ciência, a tecnologia e o mundo empresarial. Ao associar o progresso científico às vantagens econômicas, a ciência perderia sua histórica imagem de pureza, honestidade e desinteresse. Em outros, o temor consistiria na modificação do padrão das espécies, por transferência de genes, quebrando a ordem estabelecida na Criação e gerando o caos genético. Na mitologia, esse medo se encontra representado na quimera, um misto de leão, cabra e dragão que vomitava fogo e que, na Idade Média, simbolizava o mal. Figuras mistas de homem, animal e planta se encontram magistralmente representadas pelo pintor flamengo Hieronymus Bosch (El jardín de las delicias, 1510). Por ser de cunho religioso e essencialmente subjetiva, esta última visão não corresponde ao nosso conhecimento atual sobre as espécies, que são unidades morfológicas e reprodutivas essencialmente dinâmicas. Sem fundamentação científica, o criacionismo e o fixismo ignoram os inúmeros estudos sobre a evolução dos seres vivos, assim como descobertas recentes sobre os genomas, mostrando o compartilhamento de um número grande de genes entre as diferentes espécies. 156

167 BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE A PROTEÇÃO DA BIODIVERSIDADE OS CENTROS DE DIVERSIFICAÇÃO No início do século XX, o geógrafo e geneticista russo Nikolai I. Vavilov organizou mais de 100 expedições que percorreram 64 países, coletando sementes, grãos, tubérculos etc. Nessas viagens, ele observou que a diversidade das variedades cultivadas era muito maior em algumas áreas que em outras. Essas áreas geográficas seriam os centros de origem dessas variedades. Na Cordilheira dos Andes, existem mais de variedades de batata, cada uma delas identificada com um nome pela população local. Para Vavilov, isso revelaria que a região andina seria seu centro de origem e de diversificação. A partir de observações análogas, ele localizou seis a oito centros geográficos onde, presumivelmente, teria-se originado a agricultura (Tabela 12.3). Vavilov não chegou a completar sua obra. Encarcerado por defender o conceito mendeliano da herança, faleceu na prisão de Saratov, em Como comentado anteriormente, a genética foi considerada uma teoria reacionária e burguesa, na antiga União de Repúblicas Socialistas Soviéticas (URSS), entre 1929 e A teoria de Vavilov foi extremamente fecunda para os estudos evolutivos das plantas cultivadas e, consequentemente, para a conservação da biodiversidade. Admite-se hoje que a diversidade das plantas cultivadas e silvestres, bem maior em alguns pontos geográficos, indica que alguns biomas foram mais propícios que outros para o nascimento de práticas agrícolas. Atualmente, sabe-se que os centros origem nem sempre coincidem com os centros de diversidade, porque as migrações humanas geraram centros de diversidade secundária em que, respondendo às práticas agrícolas e à pressão do ambiente, as espécies se diversificaram, tornando-se tolerantes às condições ambientais e resistentes às doenças locais. A CONSERVAÇÃO DA BIODIVERSIDADE Uma das consequências do processo evolutivo é a extinção de espécies: o número de espécies vivas não chega a 1% das que, alguma vez, povoaram a Terra. Mais que a aparição e desaparição das espécies, o que preocupa é a velocidade com que isso está acontecendo, porque configura uma extinção em massa, causada pelo homem TABELA Os centros de diversificação e os cultivos originários REGIÃO América Central e do Norte América do Sul Índia e Sudeste asiático China África (Etiópia) Ásia menor CULTIVOS Milho, amaranto, feijão, batata-doce, mandioca, algodão, sisal, papaia, abacate, goiaba, pimenta, abóbora, tomate, baunilha, cacau, girassol, morango, noz pecã, tabaco etc. Amaranto, amendoim, feijão, lupino, batata, mandioca, amendoim, algodão, caju, frutade-conde, abacaxi, papaia, abacate, morango, pimentão, abóbora, coca, mate, borracha etc. Limão, pepino, arroz, melão, manga, cana-de-açúcar, algodão, cânhamo, coco, arroz, frutapão, laranja, tangerina, banana, plátano, noz-moscada, berinjela etc. Soja, colza, lichia, pera, pêssego, repolho, chá, gengibre, ginseng, cânfora etc. Café, melão, melancia, inhame, sorgo etc. Alfafa, trigo, aveia, centeio, cevada, rabanete, cenoura, ervilha, grão-de-bico, lentilha, azeitona, figo, amêndoa, vinha, maçã, beterraba, alho, cebola, açafrão, papoula, alcaçuz etc. 157

168 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Consideremos, por exemplo, o caso da Mata Atlântica brasileira, cuja biodiversidade é maior que a da Amazônia. A devastação é tal que só restam pedaços da floresta original, e sua conservação depende da manutenção de corredores entre os diversos fragmentos. Preservar a biodiversidade e os recursos genéticos é muito mais que salvá-los da extinção, significa conservar suficiente diversidade dentro de cada espécie, de forma a garantir que seu potencial genético possa ser usado no futuro. Todas as variedades cultivadas atualmente têm incorporados genes de variedades selvagens, ou dos estoques genéticos, conservados pelos povos que praticam uma agricultura tradicional. A produção comercial do tomate, por exemplo, seria impossível sem a contribuição de genes silvestres de América Latina. Graças aos trigos selvagens, dispomos de variedades resistentes aos fungos, à seca, ao calor ou ao frio. A resistência a quatro doenças do arroz cultivado atualmente deve-se a uma única variedade, encontrada na Índia central. A CONSERVAÇÃO IN SITU A biodiversidade pode ser conservada in situ, mediante a proteção ambiental de uma determinada região. Além de manter a dinâmica evolutiva das espécies, nas Unidades de Conservação Ambiental devem-se contemplar as necessidades da população local, criando reservas de desenvolvimento sustentável (Mamirauá, Brasil; Slan K an, México). Na Costa Rica, uma lei de 1996 compensa aqueles que conservem, ou aumentem, a área de floresta dentro de suas propriedades. Algumas iniciativas interessantes para a proteção da biodiversidade envolvem o rastreamento por satélite (baleias, lontras) e o uso de aplicativos para telefones celulares, que facilitam o monitoramento da fauna silvestre (SISSGEO, Centro de informação em Saúde Silvestre, Fiocruz). Uma nova tendência é o retorno da vida selvagem, mediante a reintrodução de animais como o urso, nos Pirineus, ou o lobo, nas florestas europeias. Projetos mais arrojados contemplam a criação de comunidades de grandes mamíferos. Em Oostvaarderplassen (Países Baixos), o objetivo é reconstituir, sem intervenção humana, a paisagem original da região. Os animais extintos foram substituídos por outros que lhes são aparentados. Em vez do auroque, que desapareceu em 1627, introduziu-se o auroque de Heck, criado em 1920 por cruzamento entre as mais antigas raças de bovinos europeus. O pônei Konik da Polônia ocupa o lugar do tarpan, um cavalo selvagem extinto. A ideia é controvertida porque, inevitavelmente, o ecossistema reconstituído será diferente do padrão antigo e, também, porque os defensores dos direitos dos animais consideram uma crueldade o abandono dos animais a seu destino. Um projeto análogo procura recriar as estepes da tundra, anteriores à última era glacial (Parque Pleistocênico, Rússia). Outra tendência é o uso da biotecnologia moderna para salvar espécies ameaçadas, como os rinocerontes, mortos por caçadores inescrupulosos para extrair e vender os chifres, como troféu ou como medicamento. Uma empresa norte-americana transferiu a uma levedura um gene capaz de sintetizar queratina de rinoceronte que, misturada ao DNA do animal, seria utilizada para fabricar chifres artificiais. Outra empresa, envolvida na conservação dos rinocerontes, injeta no chifre do animal anestesiado um corante azul que pode causar vômitos e diarreias, de modo a impedir seu uso como ornamento ou medicamento. A CONSERVAÇÃO EX SITU Os anfíbios enfrentam sérios riscos de extinção em massa, devido à perda de habitats e a uma doença causada pelo fungo Batrachochytrium dendrobatidis, nativo de África do Sul, onde vive em forma simbiótica com a rã de unhas africana (Xenopus laevis). Na década de 1930, essa rã fora distribuída no mundo inteiro, para a realização de testes de gravidez. Embora a doença possa ser tratada facilmente 158

169 BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE em cativeiro, o mesmo não ocorre na natureza. Até o momento, a conservação dos anuros depende da manutenção e cuidado das espécies em jardins zoológicos. Diferentemente dos tradicionais, os jardins zoológicos modernos recriam os habitats naturais dos animais, sem jaulas (San Diego Zoo, California). Esses jardins cumprem um rol importante na preservação das espécies ameaçadas, mantendo instalações de criopreservação (Frozen Zoo) e coleções de DNA, esperma, ovos, embriões e tecidos vivos. O progresso tecnológico permite o sequenciamento de animais extintos, como os dois mamutes (Mammuthus primigenius) congelados no permafrost da Sibéria, 60 mil e 20 mil anos atrás. Uma vez descartadas as sequências de microrganismos que contaminaram os fósseis, a comparação com o genoma do elefante africano atual permitirá entender as principais mudanças evolutivas e, talvez, a causa de sua extinção. Contudo, a expectativa de clonar um mamute resulta um tanto fantasiosa, lembrando-nos do livro de M. Crichton, Parque dos dinossauros. Para recriar o mamute, seria necessário complementar as partes do genoma faltantes com sequências de elefante africano; substituir, em um zigoto, o genoma do elefante africano pelo do mamute; inseminar artificialmente uma fêmea de elefante africano e aguardar dois anos até a cria nascer. Esta seria, provavelmente, muito parecida ao mamute, mas qual seria o destino desses animais? A conservação ex situ de plantas envolve a coleta de amostras representativas de uma população e sua manutenção em bancos de germoplasma e/ou jardins botânicos, na forma de sementes, estacas, plantas inteiras etc. A criopreservação é aplicada, especialmente, às plantas cultivadas que se reproduzem por sementes. Estas podem ser conservadas, no frio, durante longos períodos de tempo (20 a 30 anos a 5 0 C; um século a C-20 0 C). Periodicamente, algumas sementes serão germinadas para retirar, das plantas que frutifiquem, a geração seguinte de sementes frescas e substituir as antigas nas câmaras frias. A criopreservação tem a vantagem de manter o material em um espaço reduzido e com cuidados extremos. Porém, devido às limitações no tamanho das amostras e aos custos de manutenção, nem sempre o sistema consegue conservar os recursos fitogenéticos. Um exemplo é a coleção da Estação Experimental Vavilov (São Petersburgo, Rússia), que sobreviveu à Segunda Guerra Mundial e atualmente enfrenta grandes dificuldades econômicas. As técnicas de cultura de tecidos permitem conservar muitas das plantas que não resistem à dessecação (coco, cacau, cítricos, café, dendê, borracha e 70% das árvores das florestas tropicais) e, também, as plantas de multiplicação vegetativa (raízes, como a mandioca, tubérculos como a batata, banana, cana-de-açúcar). A incorporação da tecnologia do DNA e dos estudos genômicos facilita os estudos de diversidade genética; a disponibilidade dos dados no domínio público abre perspectivas novas de conservação. Existem hoje mais de bancos de genes e de germoplasma, com mais de de amostras. Os principais se encontram nos Estados Unidos, na China, na Alemanha e no Brasil (Embrapa). Na Noruega, a km do Polo Norte, um lugar considerado a salvo de mudanças climáticas, desastres naturais e guerras, criou-se recentemente o banco de sementes de Svalbard, com capacidade para armazenar 4,5 milhões de amostras, cada uma com 500 sementes. Devido à localização geográfica dos centros de origem e de diversificação, é preocupante a multiplicação recente dos conflitos bélicos (Afeganistão, Iraque, Síria), que afetam a população local e comprometem seu futuro, ao devastar a Ásia Menor, uma região de grande biodiversidade e riqueza genética. Os bancos de germoplasma podem, também, ajudar a restaurar uma agricultura devastada por conflitos bélicos. Em Ruanda, um país em que 90% das pessoas dependiam da agricultura e onde eram conhecidas 600 variedades de feijão, o conflito bélico entre etnias rivais causou, em 1994, a morte de 159

170 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) pessoas e a migração forçada de dois milhões de pessoas. Durante esse período, organizações internacionais conservaram, em bancos de germoplasma, as sementes essenciais para a reconstrução do país. A LEGISLAÇÃO VIGENTE Aprovada por 175 países, a Convenção sobre Diversidade Biológica (1992) reconhece a soberania nacional sobre a biodiversidade, estabelece a repartição de bebefícios decorrentes do uso dos recursos genéticos e reconhece os direitos das comunidades locais e indígenas sobre seus conhecimentos. No Brasil, a proteção da biodiversidade está regida pela Lei nº /2015 que determina as regras para acesso ao patrimônio genético e ao conhecimento tradicional associado, assim como a repartição de benefícios. O CGIAR E O CENTRO INTERNACIONAL DA BATATA Uma das organizações dedicadas à conservação da biodiversidade e ao desenvolvimento agrícola dos países em desenvolvimento é a Future Harvest, uma iniciativa com 16 centros localizados em diversos lugares, porém mantendo uma estrutura descentralizada que favorece a difusão das informações. Os centros são mantidos pelos governos de 165 países, fundações privadas e organizações internacionais e regionais que integram o Consultative Group on International Agricultural Research (CGIAR), apoiado pela Food and Agriculture Organization (FAO). Os centros do CGIAR na América Latina são: o Centro Internacional para el Mejoramiento del Maíz y el Trigo (CIMMYT) no México, o Centro Internacional de la Papa (CIP) no Peru e o Centro Internacional de Agricultura Tropical (CIAT) na Colômbia. A batata é originária da região andina. No século XVI chegou à Europa onde, depois de vencer a resistência da população, transformou-se em um dos poucos alimentos consumidos pela população mais pobre. Quando, em meados do século XIX, o fungo Phytophtora infestans infectou as batatas, desencadeou-se na Irlanda um terrível período de fome, que causou a morte de um milhão de pessoas e a emigração de boa parte da população. Hoje, a batata é o quarto cultivo mais importante do mundo, com uma produção anual de 300 milhões de toneladas. Em muitos países, a população depende de batata e de outros tubérculos (batata-doce) para sua alimentação, por serem relativamente ricos em energia e nutrientes. O Centro Internacional da Papa (CIP) preserva a batata (Solanum tuberosum), a batata-doce (Ipomoea batatas) e nove tubérculos ou raízes andinas (Oca, Ulluco, Mashua, Arracacha, Yacon, Achira, Ahipa, Maca, Mauka). O banco de germoplasma de batata inclui amostras de uma centena de espécies selvagens, coletadas em 8 países de América Latina, além das variedades cultivadas tradicionalmente pela população andina. Entre os objetivos do CIP se encontra o melhoramento da qualidade nutricional, da resistência a doenças e a condições climáticas adversas, como a seca e a geada. O centro utiliza a biotecnologia para criar formas adaptadas às condições locais e distribui as variedades tradicionais e melhoradas sob a forma de sementes, tubérculos ou vitroplantas. Atualmente também estimula as utilizações comerciais das variedades autóctones: distribuição em pacotes (t ikapapa), elaboração de chips ou hojuelas a partir de rodelas com um visual variado. O PROTOCOLO DE CARTAGENA DE BIOSSEGURANÇA Vigorando desde setembro de 2003, o Protocolo de Cartagena de Biossegurança suplementa a Convenção sobre a Diversidade Biológica. O acordo contempla o risco potencial decorrente do transporte e do manuseio de todos os organismos vivos modificados (OVMs) que possam ter um efeito 160

171 BIOTECNOLOGIA E BIODIVERSIDADE adverso na conservação e no uso sustentável da diversidade, levando em consideração os riscos para a saúde humana. Frente à apreensão suscitada pelo trânsito e movimento dos organismos transgênicos através de fronteiras, os países membros determinaram que a expressão pode conter OGMs identifique toda carga proveniente de lavouras transgênicas destinada à alimentação, ração ou processamento. O Protocolo não cobre os produtos derivados dos transgênicos (como, por exemplo, papel produzido a partir de árvores transgênicas) nem os transgênicos produtores de fármacos, que são regulados por outras organizações. Mediante o Protocolo de Cartagena se estabelece a cooperação internacional, a fim de ajudar os países em desenvolvimento a utilizar a biotecnologia com segurança e a regulá-la eficientemente. Os governos membros se propõem a promover o fluxo de informações e a transferência de tecnologia, conhecimentos e recursos, mediante o treinamento científico e técnico correspondente. 161

172 C A P Í T U L O 13 BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA A EVOLUÇÃO DAS PRÁTICAS AGRÍCOLAS Embora as práticas agrícolas e as plantas cultivadas tenham-se desenvolvido em um curto período da história evolutiva dos vegetais, as plantas cultivadas atualmente são o resultado de milhares de anos de seleção artificial pela mão do homem e guardam muito pouca semelhança com suas ancestrais selvagens (Figura 13.1). Na Europa, o uso de ferramentas rudimentares prevaleceu até a Idade Média, quando, em função de várias inovações, as práticas agrícolas se tornaram mais eficientes. Datam desse período o aproveitamento da força de tração animal, a invenção dos moinhos, a prática de descanso dos solos e a construção de sistemas de irrigação. No século XVIII, a integração das atividades agrícolas e a criação de animais originou uma nova agricultura que, além de envolver a utilização de esterco como fertilizante, promoveu a rotação entre os cultivos de gramíneas, leguminosas e plantas forrageiras. A incidência do progresso científico e tecnológico caracteriza a agricultura do século XIX, destacando-se a preocupação com as necessidades nutricionais das plantas e com as doenças que afetavam os cultivos e as criações (antraz das ovelhas, cólera das aves, doenças do bicho-da-seda etc.). Originadas por cruzamentos seletivos, novas variedades e híbridos de trigo foram comercializadas internacionalmente, a partir de Com a invenção da máquina a vapor e as primeiras utilizações da eletricidade, iniciou-se a mecanização do campo. No início do século XX, o uso do trator se espalhou rapidamente. A substituição da tração animal pela maquinaria agrícola diminuiu a necessidade de produzir rações, liberando para outros cultivos a superfície anteriormente dedicada à produção de feno e aveia. Com o redescobrimento das leis de Mendel e a teoria cromossômica da herança, iniciou-se uma nova era no melhoramento de vegetais e animais. O cruzamento entre duas linhagens puras de milho origina um híbrido semelhante às linhagens parentais, mas com qualidades superiores. Esta propriedade, denominada heterose ou vigor híbrido, permite a geração de plantas mais produtivas, suficientemente homogêneas para facilitar a colheita mecânica (Figura 13.2). As primeiras empresas comerciais a explorar a heterose do milho surgiram, a partir de 1920, nos Estados Unidos e no Canadá (Hi-Bred Corn Company, mais tarde Pioneer Hi-Bred). Essas empresas selecionavam as linhagens parentais de milho, procediam aos cruzamentos correspondentes e vendiam as sementes híbridas ao agricultor. A perda do efeito da heterose diminui a produtividade da descendência das plantas híbridas, de modo que o agricultor passou a comprar as sementes BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

173 BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA Em 1960, o milho híbrido era cultivado, com raras exceções, em todas as plantações dos Estados Unidos e do Canadá. O melhoramento das plantas já não dependia daqueles que estavam diretamente envolvidos em seu cultivo, mas daqueles que produziam as sementes. Na década de 1960, o desenvolvimento de uma variedade de trigo de alto rendimento e resistente a doenças permitiu aumentar a quantidade de alimentos disponíveis, salvando da fome mais de 1 bilhão de pessoas. Por ser o artífice da revolução verde, uma contribuição fundamental para a paz mundial, o engenheiro agrônomo Norman Borlaug recebeu o Prêmio Nobel da Paz (1970). A revolução verde duplicou a produtividade dos cereais mediante o desenvolvimento e cultivo de variedades melhoradas geneticamente, complementados por práticas agrícolas complexas (irrigação, mecanização, aplicação de fertilizantes e pesticidas). Porém, trouxe problemas ambientais, sociais e de saúde, devido à necessidade de grandes investimentos de capital para a mecanização e à aplicação de produtos químicos, que foram usados em quantidades excessivas FIGURA O milho O milho de a anos atrás era bem menor do que o que conhecemos atualmente. O cruzamento acidental com o teosinto, uma erva que ainda existe na natureza, teria dado origem ao milho moderno, que passou por várias modificações até se estender pela América précolombiana. Diversas variedades de milho persistem até hoje no continente. FIGURA A produção de milho híbrido A hibridização permite obter híbridos simples, a partir de duas linhagens, e híbridos duplos, a partir de quatro linhagens. Existem híbridos múltiplos construídos a partir de pelo menos cinco linhagens. Linhagem A Linhagem B Linhagem (AxB) Linhagem (AxB)x(CXD) (Planta de milho híbrido) Colheita Linhagem C Linhagem D Linhagem (CxD) 163

174 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Em alguns países, os pequenos agricultores não chegaram a usufruir a revolução verde. Se, desde 1960, a produção de cereais aumentou em mais de 40% na Ásia e na América do Sul, na África diminuiu 13%. Com a crise do petróleo da década de 1980, o setor de sementes agrícolas foi invadido por grandes empresas transnacionais, produtoras de agrotóxicos e fertilizantes que, mediante um investimento extraordinário de recursos em pesquisa e desenvolvimento, conseguiram introduzir as técnicas de engenharia genética no melhoramento das sementes. Traspassando as barreiras interespecíficas, obtiveram plantas mais produtivas ou com propriedades novas. Comercializadas a partir de 1996, as principais plantas geneticamente modificadas (PGMs) cultivadas atualmente são a soja, o milho, o algodão e uma variedade de colza denominada canola. Os traços mais frequentes são a tolerância a herbicidas e/ou a resistência a pragas. Em relação aos métodos tradicionais, as biotecnologias modernas inserem a tecnologia na semente. Em 2015, dos 28 países que semearam cultivos biotecnológicos, 20 deles foram países em desenvolvimento. Produtores de América Latina, Ásia e África cultivaram 54% da área global plantada com PGM. A OBTENÇÃO DE NOVAS VARIEDADES MUTAÇÃO GÊNICA E SELEÇÃO O melhoramento clássico está baseado na reprodução seletiva entre indivíduos de uma mesma espécie. A variação intraespecífica é limitada, mas alguns agentes físicos e químicos podem induzir mutações aleatórias. No caso de aparecer algum mutante interessante, será cruzado por várias gerações com um dos tipos parentais, até que este incorpore, por introgressão gênica, as características desejadas. Esse processo de mutação e seleção demora de cinco a quinze anos e, quando finalizado, o gene selecionado pode estar acompanhado por outros não desejáveis. Duas variedades comerciais de batata (Lenape, 1960; Magnum bonum, 1990), obtidas por este método, tiveram que ser retiradas do mercado devido ao alto conteúdo de alcaloides, característico das plantas selvagens. O progresso alcançado na indução de mutações (TILLING, do inglês Targeting induced local lesions in genomes) e na seleção assistida por marcadores moleculares facilita a obtenção de novas variedades (batata Amflora, BASF). A genômica também trouxe avanços notáveis, como a identificação de 40 genes de resistência a patógenos no tomate, que foram reunidos em um genótipo único. Contudo, em ambos os casos, a variação se deve a genes pertencentes à mesma espécie. ALTERAÇÃO DO NÚMERO DE CROMOSSOMOS A multiplicação do número de cromossomos (poliploidia) é um fenômeno que acontece espontaneamente nos vegetais, seja por não disjunção dos cromossomos ou por uma falha da citocinese durante a divisão celular. Ao longo do processo evolutivo, duplicações dos lotes cromossômicos originais (autopoliploidia) ocorreram em várias das espécies cultivadas atualmente, tais como a batata ou a cana-de-açúcar. A multiplicação dos lotes cromossômicos pode ocorrer em híbridos interespecíficos, pouco férteis ou estéreis, restaurando a fertilidade e gerando uma nova espécie, diferente de ambas as linhagens parentais. Este mecanismo (alopoliploidia) deu origem a plantas como o trigo, a colza, a aveia, o tabaco, o algodão, o café etc. A descoberta da colchicina (1935), uma substância que interfere com a formação dos fusos mitóticos, permitiu a criação de novas espécies poliploides. A hibridização do trigo e do centeio, 164

175 BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA seguida de uma duplicação cromossômica, originou o triticale, uma planta que reúne a qualidade do grão do primeiro e a rusticidade do segundo. Outra forma de alteração do número de cromossomos é a cultura de anteras, para a obtenção de plantas haploides. Essa tecnologia permite identificar mutantes recessivos e obter rapidamente variedades diferentes por hibridização ou duplicação cromossômica. ENGENHARIA GENÉTICA À medida que a distância entre as espécies aumenta, os cruzamentos se tornam cada vez mais difíceis e a transferência dos genes pode exigir o uso de técnicas complexas, como a fusão de protoplastos e o cultivo de embriões. Quando os recursos genéticos provêm de outros organismos distantes na escala evolutiva (plantas, microrganismos ou animais), sua transferência só é possível por engenharia genética. Qual a diferença entre uma planta obtida por cruzamento seletivo e outra por engenharia genética? Na primeira, genes da mesma espécie ou de uma espécie muito próxima são introduzidos aleatoriamente. Na segunda, incorpora-se diretamente uma construção gênica, proveniente da mesma espécie (construção cisgênica) ou de uma espécie distante (construção transgênica). Trata-se de uma tecnologia poderosa demais para ser negligenciada. NO LABORATÓRIO A construção de uma planta geneticamente modificada (PGM) começa com o isolamento e caracterização do gene de interesse (transgene) e a construção de uma estrutura genética complexa, que inclui um gene promotor e um gene marcador. O primeiro possibilita a transcrição do transgene, determinando se este irá se expressar em todas as células ou somente em alguns tecidos. O segundo permite selecionar as células transformadas. A construção genética é transferida às células receptoras por algum dos métodos disponíveis (eletroporação, biolística ou uso de vetores, como o plasmídeo Ti de Agrobacterium tumefaciens). As células transformadas são recuperadas, procedendo-se à regeneração das plantas mediante técnicas de cultura in vitro. Mediante técnicas bioquímicas e/ou acompanhamento de marcadores moleculares (polimorfismos na molécula de DNA, repetição de sequências), constata-se a transferência gênica e outros aspectos que podem influir na expressão gênica, como o número de cópias e o lugar em que estas se integraram ao genoma. O trabalho laboratorial é realizado com plantas cujo genótipo favoreça a transformação e a regeneração da planta transformada, geralmente pouco vantajosas do ponto de vista agronômico. Considera-se alcançado o sucesso quando o transgene se expressa no lugar correspondente e com um adequado nível de atividade, restando por verificar a estabilidade da expressão gênica e o seu valor agronômico. AS ETAPAS POSTERIORES Acabada a etapa de laboratório, iniciam-se os testes controlados em casa de vegetação, para selecionar as plantas-mãe das quais procederão várias gerações de retrocruzamentos seletivos com alguma das linhagens elite, visando a obtenção de uma linhagem transgênica de alto rendimento, adaptada a um contexto específico. O resultado é uma variedade ou cultivar que expressa o traço codificado pelo transgene e apresenta um potencial de produtividade parecido ao da linhagem elite. Conceitualmente, a metodologia seguida depois da transformação mantém semelhança com à do melhoramento tradicional, mas o processo é acelerado pela utilização de técnicas de cultura in vitro e de marcadores moleculares na caracterização da progênie. 165

176 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Uma vez obtida a nova variedade de PGM, dá-se início à liberação planejada no meio ambiente, que abrange o cultivo em experimentos protegidos e testes de campo realizados em diferente escala, até a nova variedade estar pronta para o seu cultivo comercial. A liberação do cultivo dependerá da autorização da legislação local, geralmente bastante restrita a esse respeito (Figura 13.3). No Brasil, esta autorização é dada pela Comissão Técnica Nacional de Biossegurança (CTNBio), definida pela Lei de Biossegurança como o órgão multidisciplinar responsável pelo controle dessa tecnologia no país (Lei /2005, Política de desenvolvimento da Biotecnologia; Decreto 6.041/2007). A BIOSSEGURANÇA E O PRINCÍPIO DE PRECAUÇÃO Poucas tecnologias suscitaram tanta polêmica como a introdução das PGMs na agricultura, uma questão que não pode ser tratada levianamente. Além de conhecimentos e tempo, a construção de uma planta transgênica exige o consenso das numerosas pessoas que participam no processo e a aprovação da autoridade correspondente FIGURA As etapas da construção de uma planta transgênica Duração do processo: 10 a 15 anos. Transformação Regeneração das plantas transformadas Caracterização molecular e bioquímica Avaliação do valor agronômico (Casa de vegetação, campo) Introgressão em uma linhagem comercial de elite Linhagem-mãe Linhagem comercial de elite Retrocruzamentos Obtenção da variedade geneticamente modificada Experimentos protegidos e testes de campo, em pequena e grande escala Autorização das autoridades locais, de acordo com a legislação vigente Liberação do cultivo para sua exploração comercial 166

177 BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA Ainda hoje, parte da opinião pública considera que as PGMs não deveriam ter sido introduzidas no ambiente, nem utilizadas para o consumo humano, até não ser demonstrada a ausência de qualquer risco. A exigência apoia-se no princípio de precaução, um princípio que pode ser entendido de diversas maneiras. Podemos dizer, de maneira simplista, que havendo a possibilidade de algo ruim me acontecer na rua, melhor ficar em casa, ou que havendo a possibilidade de algo ruim me acontecer na rua, ao sair de casa é bom ter cuidado e prestar atenção no sinal, nos carros, nas bicicletas que circulam na contramão e, também, no bandido. Note-se que a decisão de não sair de casa também envolve riscos, tais como escorregar e levar um tombo no banheiro, queimar-se ao acender o fogão ou receber um vírus via Internet. Não existe risco zero, toda ação apresenta riscos que devem ser analisados para ser posteriormente gerenciados. No Brasil, o cultivo de plantas transgênicas é regido pela Lei de Biossegurança, que estabelece a observância do princípio da precaução para a proteção do meio ambiente. O Princípio 15 da Declaração do Rio de Janeiro sobre Meio Ambiente e Desenvolvimento Sustentável (1992) diz o seguinte: De modo a proteger o meio ambiente, o princípio da precaução deve ser amplamente observado pelos Estados, de acordo com as suas capacidades. Quando houver ameaça de danos sérios ou irreversíveis, a ausência de absoluta certeza científica não deve ser utilizada como razão para postergar medidas eficazes e economicamente viáveis para prevenir a degradação ambiental. Diferente da prevenção, que trata de riscos conhecidos, a precaução contempla riscos potenciais que demandam uma avaliação detalhada. Mesmo havendo incertezas ou falta de unanimidade entre os expertos, o princípio de precaução não justifica a falta de ações concretas para a proteção do meio ambiente. Por outro lado, o Princípio 10 da mesma declaração nos diz que: A melhor maneira de tratar questões ambientais é assegurar a participação, no nível apropriado, de todos os cidadãos interessados. No nível nacional, cada indivíduo deve ter acesso adequado a informações relativas ao meio ambiente de que disponham autoridades públicas, inclusive informações sobre materiais e atividades perigosas em suas comunidades, bem como a oportunidade de participar em processos de tomada de decisões. Os Estados devem facilitar e estimular a conscientização e a participação pública, colocando a informação à disposição de todos. Deve ser propiciado acesso efetivo a mecanismos judiciais e administrativos, inclusive no que diz respeito à compensação e reparação de danos. Vários pontos merecem ser destacados: admite-se a incerteza e a falta de unanimidade entre os expertos, afirma-se o direito de todos à informação e pede-se a participação, no nível apropriado, de todos os cidadãos interessados. A responsabilidade pela tomada de decisões não será exclusivamente de um grupo de indivíduos, sejam estes cientistas, administradores, empresários, políticos ou comunicadores. Terá que ser democraticamente assumida por um grupo heterogêneo que represente os interesses da sociedade, mesmo tendo que abrir as portas ao marketing, aos lobbies e à pressão dos grupos políticos, ambientalistas ou não. Considerado por alguns grupos de opinião como um dos alicerces do desenvolvimento sustentável e uma proteção contra o controle da tecnologia pelas grandes empresas, o princípio de precaução também é visto por outros como um obstáculo ao progresso e uma tentativa de protecionismo. A formalização do princípio mediante uma estrutura jurídica, como a Lei de Biossegurança, assim como o estabelecimento de normas, regras e procedimentos claros, é a melhor maneira de gerenciar o desenvolvimento tecnológico, minimizando os riscos correspondentes. 167

178 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) AS PGMs DE INTERESSE AGRONÔMICO As PGMs atuais apresentam traços, inseridos como transgenes, que visam modificar suas propriedades agronômicas e/ou melhorar suas qualidades nutricionais, industriais ou ambientais. Poderiam escapar dos limites do plantio e suplantar as plantas silvestres, tornando-se invasoras? Existe o precedente de plantas ornamentais se transformarem em pragas quando introduzidas, inadvertidamente, em um ambiente novo: a lantana prolifera descontroladamente na Austrália; o kudzu, procedente do Japão, se espalha no sul dos Estados Unidos; e o rododendro, originário da Península Ibérica, se multiplica na Inglaterra. Além da degradação ambiental devida ao desmatamento, à jardinagem ou à agricultura, para que o cenário se repetisse seriam necessárias várias características hereditárias, que são sistematicamente eliminadas como fatores indesejáveis nas plantas cultivadas: dormência da semente, plasticidade fenotípica, crescimento indeterminado, florescimento e produção contínua de sementes etc. Com o objetivo de reduzir o risco futuro de introduzir um gene que transforme uma planta normal em praga, a FAO (Food and Agriculture Organization) estabeleceu uma série de diretrizes, cumpridas em 130 países, que se aplicam também a insetos, bactérias e fungos. Nenhum dos cultivos biotecnológicos disponíveis no mercado mostrou-se persistente ou invasor nos testes prévios a sua comercialização ou no monitoramento posterior. Diante da necessidade de mitigar os efeitos das mudanças climáticas, espera-se que em um futuro próximo sejam desenvolvidas plantas mais eficientes no uso do nitrogênio e tolerantes à salinidade. A maior produtividade dos cultivos também é necessária para conseguir mais alimentos sem aumentar a área plantada e, também, porque plantas de uso industrial podem ser exportadas, gerando divisas. Os principais cultivos comercializados atualmente, conforme já dito, são a soja, o milho, o algodão e uma variedade de colza denominada canola. As propriedades agronômicas modificadas são a tolerância a herbicidas, a resistência a insetos, a resistência a vírus, o conteúdo e a qualidade do óleo, a tolerância à seca etc. A TOLERÂNCIA A HERBICIDAS A LUTA CONTRA AS ERVAS DANINHAS O crescimento das ervas daninhas no campo é prejudicial por dois motivos: competem pelos mesmos nutrientes e contaminam a colheita. Para eliminá-las, o agricultor pode aplicar herbicida antes do plantio, uma prática que demanda o revolvimento prévio do solo, acelerando a erosão. Contudo, se uma planta for tolerante a um herbicida de amplo espectro, bastará semeá-la diretamente e aplicar o herbicida depois da germinação, para eliminar as ervas daninhas. Os cultivos tolerantes a herbicidas facilitam o plantio direto, um sistema no qual as sementes e os fertilizantes são depositados em sulcos, reduzindo a erosão e a demanda de combustível. Em vários países, comercializam-se sementes transgênicas de soja, de milho, de algodão e de canola tolerantes a herbicidas. O herbicida não seletivo mais utilizado é o glifosato, presente em vários produtos comerciais, tais como Roundup, Buccaneer, Rodeo, Accord etc. Sua ação inibitória se aplica a sistemas enzimáticos dos vegetais, ausentes em animais e seres humanos. Considerado pouco tóxico em caso de exposição oral ou de inalação, o glifosato é degradado rapidamente no ambiente. As sementes de plantas tolerantes ao glifosato são comercializadas com o nome de RoundupReady (RR, Monsanto). As vendas geminadas de sementes e herbicida encerraram-se no ano 2000, com o vencimento da patente do Roundup e o aparecimento no mercado de outras variações do produto, mais econômicas para o agricultor. 168

179 BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA Outro herbicida utilizado é o glufosinato, presente em outro grupo de produtos (Basta, Liberty, Ignite etc.). As sementes tolerantes ao glufosinato são comercializadas com o nome LibertyLink por BayerCropScience. Glifosato e glufosinato não são os únicos herbicidas no mercado. Existem outras substâncias, do grupo das imidazolinonas, cuja tolerância tem sido transferida à soja Cultivance, um empreendimento conjunto da Embrapa e da Basf. O GLIFOSATO No Brasil, o glifosato não está limitado exclusivamente à agricultura, sendo utilizado, desde 1978, em áreas urbanas e na manutenção de estradas e ferrovias, sem evidências de impactos no meio ambiente. Em 2015, o IARC (do inglês, International Agency on Research on Cancer), uma extensão semiautônoma da Organização Mundial da Saúde, reclassificou o glifosato como provável agente carcinogênico, no grupo 2 A. Esta categoria inclui, além do malation e da acrilamida, o chimarrão quente, a malária, a carne vermelha, a disrupção dos ritmos circadianos e as emissões de frituras em alta temperatura. Das quatro agências encarregadas de avaliar o glifosato, o IARC foi a única a encontrar essa associação. Outras agências manifestaram seu desacordo e questionaram a reclassificação. Nos Estados Unidos, a EPA (do inglês, Environmental Protection Agency) continua classificando o glifosato na categoria E, que reúne substâncias que apresentam evidências de ausência de carcinogenicidade em seres humanos. Na União Europeia, a EFSA (do inglês, European Food Safety Agency) considera improvável que o glifosato represente um risco para os seres humanos e não justifica sua classificação como agente carcinogênico potencial. A APARIÇÃO DE PLANTAS SILVESTRES RESISTENTES AO GLIFOSATO Ao diminuir a aplicação dos agroquímicos tradicionais, os cultivos biotecnológicos favorecem a conservação dos recursos ambientais. Sua vantagem sobre as plantas silvestres depende da presença de um agente seletivo como, por exemplo, um herbicida ao qual elas sejam tolerantes. Sem o herbicida, ou fora de seu alcance, as PGMs não têm nenhuma vantagem sobre as plantas silvestres nem conseguem competir com elas em ambientes naturais. Contudo, o fluxo gênico em sentido contrário é preocupante, porque, tornando-se tolerantes a herbicidas, as plantas silvestres podem competir no terreno com as plantas cultivadas e comportar-se como ervas daninhas. Admite-se que a aparição de resistência em pelo menos 34 espécies poderia ter sido causada pela transferência do gene correspondente, das plantas cultivadas às plantas silvestres. No Brasil, há relatos sobre resistência ao glifosato no azevém (Lolium multiflorum) e na buva (Conyza bonariensis e C. canadiensis). Por outro lado, algumas plantas são naturalmente resistentes ao glifosato como, por exemplo, a trapoeraba (Commelina benghalensis). A aparição de plantas resistentes ao glifosato, que é o herbicida mais utilizado no mundo, está sendo acompanhada com atenção. Estima-se que, depois de 10 a 20 anos de uso intenso, seja inevitável o aparecimento de plantas silvestres tolerantes. Contudo, o agricultor pode retardar a aparição dessa tolerância, mediante algumas ações preventivas: rotar as culturas, evitar o uso repetido do mesmo herbicida, aplicar as doses adequadas em condições meteorológicas propícias, acrescentar outras modalidades de controle etc. 169

180 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A RESISTÊNCIA A INSETOS A TRANSFERÊNCIA DA TOXINA Bt ÀS PLANTAS Os insetos causam quebras de safra, estimadas em 20 a 40% da produção agrícola. Contudo, o combate mediante o uso de agrotóxicos tem causado problemas no ambiente e na saúde humana, sendo, portanto, necessário encontrar métodos alternativos de luta. Há mais de 50 anos que os agricultores convencionais e orgânicos utilizam um inseticida biológico para proteger suas colheitas. Trata-se da toxina produzida por um microrganismo do solo, o Bacillus thuringiensis, inócua para o ser humano e fatal para os insetos. Uma vez ingerida pelas lagartas, a toxina age no sistema digestório, matando-as em poucos dias. O produto comercial é vendido com os nomes de Dipel, Thuricida ou Vectobac. Uma vez transferido o gene codificador da toxina do Bacillus thuringiensis às plantas, estas passam a produzi-la diretamente. Existem diversas versões do gene Cry que codificam toxinas muito específicas, efetivas em diferentes ordens de insetos. Algumas variedades (YieldGard, Agrisure ) diferem pela posição do transgene, o que caracteriza eventos diferentes e permite a comercialização com nomes diferentes, como algodão Bollgard e milho Yieldgard, da Monsanto, ou milho Agrisure, da Syngenta. As plantas Bt demandam menos pesticidas e reduzem as emissões de carbono, ao diminuir o uso de combustível. Outra das vantagens das variedades Bt sobre as variedades convencionais está na menor quantidade de micotoxinas (aflatoxina e fumonisina) perigosas para a saúde humana, em função da menor contaminação por fungos dos ferimentos causados pelos insetos. AS PRÁTICAS AGRONÔMICAS Todo inseticida age como agente seletivo, sendo inevitável a aparição de insetos resistentes. A fim de evitar ou retardar a aparição de larvas resistentes à toxina do Bacillus thuringiensis, uma possibilidade é utilizar variedades Bt que produzam uma quantidade de toxina maior que a dose aplicada habitualmente como inseticida. Outra possibilidade mais sutil é o plantio de variedades convencionais (não Bt) em espaços predeterminados onde os insetos não entram em contato com a toxina. Em vez de tentar eliminar o inseto, diminui-se a infestação mediante uma pressão seletiva mais frouxa, que mantém a sensibilidade ao inseticida em uma proporção considerável da população. Hoje, a manutenção de refúgios nas lavouras de plantas Bt (algodão, milho) é uma prática bem estabelecida para o controle de insetos. O gerenciamento dos riscos envolve algumas medidas complementares que visam amortecer o impacto eventual do fluxo gênico a outros cultivos. Um gene que confere tolerância a um herbicida não será vantajoso em ausência do mesmo. Mas o que ocorreria se esse gene conferisse algum valor adaptativo, tal como a produção de um inseticida? O risco de polinização cruzada depende da espécie, sendo mais fácil de acontecer no milho, em que o pólen se dispersa levado pelo vento, do que na soja ou no trigo, plantas com autofecundação. A presença de espaços ou corredores de isolamento evita a disseminação de pólen transgênico para as variedades silvestres e, também, para as convencionais semeadas nos campos vizinhos, evitando prejuízos significativos para o agricultor que as comercializa. O tamanho dos espaços ou corredores de isolamento depende das características reprodutivas da espécie em questão e de fatores ambientais, como o vento. No caso do milho, por exemplo, estima-se que o risco de polinização cruzada entre os cultivos diminui, de 1% a zero, quando a distância entre ambos aumenta de 100 a pés. 170

181 BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA A VIDA SILVESTRE A probabilidade de ocorrer fluxo gênico aumenta se houver, na proximidade, espécies silvestres compatíveis. Por isso, devem-se extremar os cuidados em relação ao cultivo de plantas geneticamente modificadas nos lugares onde existam variedades silvestres aparentadas, tais como a batata no Peru, o milho no México, o arroz na Índia, a soja na Coreia e na China. No Brasil, onde existem variedades silvestres do algodão, a CTNBio delimitou preventivamente zonas de exclusão para o cultivo de algodão biotecnológico. Em relação à vida silvestre, apesar do estardalhaço causado oportunamente pela notícia de que as borboletas monarcas seriam afetadas pelo contato com pólen de plantas de milho Bt, os próprios autores do estudo declararam que era uma experiência laboratorial, desenvolvida em condições diferentes das de um ambiente natural. A RESISTÊNCIA A VÍRUS Assim como a vacinação, a resistência a vírus está baseada na transferência ao hospedeiro de uma parte do genoma viral. A produção em excesso da proteína de revestimento viral, por exemplo, inibe a síntese de seu material genético. Esta tecnologia foi utilizada para erradicar viroses da batata, da beterraba, do pepino, do tomate, da couve-flor e do melão. Os produtos hortícolas têm recebido menos atenção que os cereais e as leguminosas, em parte devido à resistência do consumidor e, também, porque o custo da construção de uma planta transgênica para cultivos com pequena produção não é interessante economicamente. Contudo, as variedades de papaia resistente a vírus (UH Rainbow, UH SunUp), comercializadas nos Estados Unidos, salvaram o estado do Havaí de um desastre econômico. No Brasil, a CTNBio autorizou em 2011 o cultivo do feijão tolerante ao vírus do mosaico dourado, desenvolvido pela Embrapa, por tecnologia do irna. O vírus é transmitido pela mosca branca Bemisia tabaci e causa a perda de 40 a 85% da safra, uma quantidade de feijão que poderia alimentar entre 9 milhões a 18 milhões de pessoas adultas. Esse feijão deve ser comercializado a partir de A COEXISTÊNCIA ENTRE PLANTAS CONVENCIONAIS E PGMs Todos os sistemas agrícolas exercem algum impacto sobre o meio ambiente. No entanto, uma agricultura sustentável pode minimizar os efeitos negativos da produção agrícola, restaurando a fertilidade e limitando a erosão da terra. Algumas práticas agrícolas já são compartilhadas pelas diversas modalidades agrícolas (orgânica, industrial ou de precisão), incluindo a rotação de culturas, a adubação verde, o manejo de pragas e de nutrientes, o plantio direto com uma cobertura na superfície do solo etc. Outras são específicas, como, por exemplo, a proibição para os produtores orgânicos de utilizar sementes geneticamente modificadas ou de cultivar terrenos onde previamente tenham sido plantadas PGMs. Cultivos convencionais e biotecnológicos ocupam diferentes faixas de mercado e crescem em função das oportunidades econômicas. A proporção de variedades convencionais e biotecnológicas varia nos principais cultivos industriais, que são a soja, o algodão, o milho e a canola. No Brasil a CTNBio exige um isolamento mínimo de 400 metros, ou de 40 dias, entre os plantios de milho GM e milho convencional. A contaminação de um cultivo convencional por um cultivo biotecnológico acarreta perdas consideráveis para o produtor rural. Nos Estados Unidos, a contaminação de cultivos convencionais de arroz e milho por cultivos geneticamente modificados custou 1 bilhão de dólares às empresas produtoras de sementes. 171

182 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Medidas de proteção são tomadas, envolvendo o distanciamento dos cultivos e a manutenção de faixas de exclusão de diferente tamanho, segundo as características da fecundação, autopolinização ou polinização cruzada. Testes genéticos e imunológicos permitem identificar a presença de organismos geneticamente modificados em uma carga de cultivos convencionais. O objetivo dessas medidas é reduzir a presença de sementes adventícias a um limite comercialmente aceitável (0,9%). Os modelos de regulação dos cultivos tradicionais, orgânicos e biotecnológicos são considerados de índole econômica, porque dão ao agricultor a possibilidade de escolher a modalidade que melhor lhe convier. Não envolvem biossegurança, porque esta é analisada no momento da aprovação da variedade biotecnológica, uma vez satisfeitas as normas legais. Nos países onde o cultivo de OGMs está permitido, os agricultores têm a opção de semear cultivos orgânicos, convencionais e biotecnológicos sempre que sejam respeitadas as medidas de coexistência. Um modelo de regulação, baseado em normas de coexistência, vem sendo desenvolvido na Espanha desde O CULTIVO DE OUTROS TIPOS DE PGMs PGMs DE INTERESSE NUTRICIONAL Uma segunda leva de plantas transgênicas contempla a modificação das qualidades das plantas, isto é, das propriedades que interessam ao consumidor como, por exemplo, o melhoramento da qualidade nutricional, a redução de alérgenos, modificações do tempo de conservação e das características organolépticas, a adequação ao processamento industrial dos óleos e amidos etc. Em 1974, a variedade Tower de Brassica napus recebeu o nome de canola (do inglês canadian oil, low acid ). Trata-se da colza, uma planta oleaginosa que a modificação genética tornou comestível, ao diminuir o teor de ácidos graxos saturados e a quantidade de glucosinolato. Modificações posteriores originaram numerosas variedades que diferem na composição dos ácidos graxos, sendo algumas delas também tolerantes a herbicidas. Entretanto, o principal marco no desenvolvimento deste tipo de transgênicos é o arroz com vitamina A (Golden Rice). A carência de vitamina A decorrente de uma dieta baseada exclusivamente no arroz causa a cegueira irreversível e a morte de milhões de crianças na Ásia. A inserção de dois genes de narciso e um gene bacteriano em uma variedade de arroz indica deu origem a um grão amarelado contendo -caroteno, que é um dos precursores da vitamina A. Considerado um empreendimento humanitário, várias empresas cederam, nos países em desenvolvimento, os seus direitos sobre suas patentes relacionadas com a construção do arroz dourado. Espera-se que sejam produzidas plantas com outras alterações no teor de nutrientes: arroz contendo ferro, milho enriquecido com os aminoácidos lisina e triptófano e batata com alto teor de proteínas com metionina e lisina. A soja Vistive apresenta baixo teor de ácido linolênico, o que torna o óleo mais estável e dispensa a hidrogenação, uma fonte de gordura trans. Este óleo de soja é utilizado como ingrediente de biscoitos (Cargill e Kellogg s). A China desenvolveu e liberou recentemente o milho com fitase para integrar as rações animais. Este milho permitirá a assimilação de fosfatos pelos suínos, melhorando a produtividade do rebanho e diminuindo a poluição ambiental. PGMs PRODUTORAS DE MEDICAMENTOS Existe uma terceira leva de plantas biotecnológicas desenvolvidas especialmente para desempenhar o papel de fábricas biológicas, produzindo fármacos, vacinas e plásticos. Estão em andamento os testes 172

183 BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA de campo com alfafa, milho, arroz, tabaco, banana e batata. Para evitar a contaminação acidental dos alimentos, essas plantas terão que ser cultivadas em confinamento e processadas separadamente das plantas comuns. Formas alternativas de evitar a disseminação do transgene no pólen estão sendo desenvolvidas, tais como sua inserção no DNA dos cloroplastos. As proteínas extraídas e purificadas serão utilizadas pela indústria farmacêutica. Uma regulação estrita deverá controlar o cultivo, o transporte e a distribuição destas plantas. Os sistemas que poderiam tornar estéreis as plantas de interesse agronômico ou nutricional despertaram uma forte reação contrária na opinião pública (sistemas de proteção tecnológicos ou TPSs, do inglês technology protection systems; tecnologias de uso genético restrito ou GURTs, do inglês, genetic use restriction technologies). No entanto, é bem possível que voltem a ser considerados em relação às plantas produtoras de medicamentos. O AGRONEGÓCIO AS PRIMEIRAS EMPRESAS PRODUTORAS DE SEMENTES Nos países do continente africano e de parte da Ásia, em que a agricultura é a principal fonte de alimentos, os pequenos agricultores dependem das sementes. Na época da colheita, eles separam uma parte e a conservam para o plantio do próximo ano. Devido à mecanização do campo, nos países desenvolvidos, a proporção da população dedicada às tarefas agrícolas é bem menor. A agricultura de subsistência cede lugar a um enorme complexo agroindustrial, que integra outras atividades, como a venda de insumos (maquinarias, produtos químicos, sementes etc.) e a transformação e distribuição de produtos. A produção de sementes como atividade lucrativa remonta ao ano 1774 e à pequena loja da família Vilmorin, na França. Em 1874, Henry de Vilmorin obtém o primeiro trigo híbrido (Dattel), comercializado em 1883 e cultivado até hoje. Nos Estados Unidos e no Canadá, as primeiras empresas a comercializarem os milhos híbridos surgem a partir de As construções genéticas conferem vigor (heterose) às plantas híbridas, mas forçam o agricultor a comprar novas sementes, ano após ano. A transgênese não inviabiliza a utilização de sementes para o ano seguinte. No entanto, as novas tecnologias inseridas no grão devem ser pagas mediante complexos sistemas de royalties às empresas detentoras das patentes correspondentes. OS GIGANTES GÊNICOS Logo depois da crise do petróleo da década de 1980, as grandes empresas transnacionais produtoras de agrotóxicos e fertilizantes químicos entraram na área agrícola. Uma das razões é que o mercado de sementes tem uma margem de lucro maior; a outra é que leva menos tempo desenvolver uma planta geneticamente modificada que um produto químico novo. Vários ciclos de fusões caracterizaram um processo de concentração e consolidação em que centenas de pequenas empresas foram absorvidas por enormes conglomerados, produtores de agroquímicos e de sementes, com ramificações na indústria farmacêutica. Na linha de frente das novas tecnologias, estas empresas concentram um enorme poder que é malvisto pelo público. Denominadas Gigantes Gênicos (do inglês, Gene Giants), as principais empresas produtoras de sementes são Monsanto, Dupont (Pioneer), Dow AgroSciences nos Estados Unidos, Syngenta na Suiça, Limagrain (Vilmorin) na França, Bayer CropScience na Alemanha e Sakata no Japão. Estima-se que, em 2020, o mercado de sementes biotecnológicas será de 42 bilhões de dólares comerciais, em um mercado global de sementes comerciais de 73 bilhões de dólares. 173

184 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A CADEIA PRODUTIVA DA SEMENTE Cada país desenvolve variedades adaptadas a seus solos e condições climáticas. Uma vez aprovadas e registradas, esses cultivares poderão ser disponibilizados para os agricultores. O processo de amplificação do número de sementes, estritamente regulamentado, contempla várias etapas de que participam diferentes entidades do setor público ou privado (Figura 13.4). No caso da característica transgênica, esta precisa da aprovação das instâncias legais competentes, antes de ser transferida para os cultivares locais e passar por todo o processo de multiplicação, certificação e registro, até chegar ao agricultor e este dar início ao plantio. A cadeia produtiva da semente envolve inventores e obtentores, multiplicadores, produtores e comerciantes de sementes e agricultores. A qualidade das sementes é estabelecida pela legislação e pelas agências de certificação de sementes, que garantem ao comprador sementes dentro dos padrões. PATENTES E INOVAÇÃO TECNOLÓGICA No Brasil, a produção de mudas e sementes oriundas do melhoramento clássico está regulada pela Lei de Proteção de Cultivares (n.º 9.456/97); o produtor rural que compra uma semente paga pelo germoplasma desse cultivar. A inserção de um transgene é considerada um evento e demanda a aprovação das autoridades correspondentes. Em 2010, estimava-se que o processo de inserção de um evento demorava 13 anos, a um custo de 136 milhões de dólares. A patente é uma forma de proteção da inovação tecnológica, regulada pela Lei da Propriedade Industrial (n.º 9.279/96) que, além de lucro, permite à empresa o ressarcimento do investimento e o financiamento de novas pesquisas. O produtor rural que compra uma semente geneticamente modificada paga pelo germoplasma e pela propriedade intelectual do produto. Organismos vivos não podem ser patenteados FIGURA Os elos que integram a cadeia produtiva da semente Estado (Institutos de pesquisa, universidades) Inventores / Obtentores Empresas nacionais (sociedades, cooperativas e empresas familiares) Empresas internacionais Multiplicadores Diversa estrutura empresarial Produtores e comerciantes Diversa estrutura empresarial Agricultores. 174

185 BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA O produtor rural pode pagar os royalties ou taxa tecnológica (TT) na compra da semente. Quando as sementes biotecnológicas não têm as limitações dos híbridos, ele pode optar por guardar legalmente parte do produto da safra para o próximo plantio, pagando um percentual antes da entrega na moega. Se ele não salvar as sementes de acordo com a lei, será cobrado na entrega do grão. As patentes têm uma duração limitada; entre as que já expiraram estão a do herbicida Roundup (2000) e a da primeira variedade RR1 de soja RoundupReady (2015). Algumas organizações se manifestaram a favor de uma versão pública sem royalties, algo assim como um genérico (Open Source Seed Iniciative), mas a inovação está nas mãos das empresas produtoras de sementes, que logo lançam no mercado produtos cada vez mais eficientes, para substituir os que perderam a proteção. A novidade no mercado são as plantas piramidadas, que combinam vários eventos, tais como a tolerância a dois herbicidas, a tolerância à herbicida e a resistência a insetos, ou a resistência a dois tipos de insetos, um que ataca a raiz e outro a parte superior da planta. Seu número aumenta a cada dia. A soja RR2 Bt, que reúne a tolerância à herbicida e a resistência a insetos, substituiu a soja RR1. O milho Genuity SmartStax TM (Monsanto, DowAgroSciences), por exemplo, reúne oito genes para o controle de pragas acima e abaixo do solo, e a tolerância a herbicidas para o controle de plantas daninhas. Na África, o projeto WEMA (do inglês, Water Efficiency for Africa) espera dispor, em 2017, de um milho Bt com eventos piramidados de resistência a insetos e tolerância à sequia. A ADOÇÃO DOS CULTIVOS BIOTECNOLÓGICOS NO MUNDO Em 1996, Estados Unidos, China, Argentina, Canadá e Austrália iniciaram o cultivo de PGMs em 1,7 milhão de hectares. O International Service for the Aquisition of Agri-Biotech Applications (ISAAA) é uma organização internacional que divulga anualmente os dados correspondentes à adoção dos cultivos biotecnológicos no mundo. Segundo o ISAAA, em 2015, 28 países semearam com PGMs uma superfície de 179,7 milhões de hectares, liderados por Estados Unidos, Brasil, Argentina, Índia e Canadá. Dos 28 países que semearam PGMs, 8 são industrializados e 20 em vias de desenvolvimento. Dentre os países que não permitem o cultivo de PGMs, 39 os importam (Tabela 16.1). O traço dominante foi a tolerância à herbicida e os principais cultivos soja, milho, algodão e canola, seguidos por beterraba sacarina, alfafa e papaia. Mais de 90% dos 18 milhões de agricultores que plantaram sementes biotecnológicas são pequenos produtores rurais, especialmente na China, na Índia, nas Filipinas e na África do Sul. Os cultivos biotecnológicos possibilitaram o aumento da produção agrícola e melhoraram as condições econômicas desses agricultores. Nos países onde a mão de obra agrícola está constituída principalmente por mulheres, os cultivos biotecnológicos melhoraram suas condições de vida, ao permitir que elas dedicassem mais tempo ao cuidado das crianças ou a outras atividades. Os problemas de saúde causados pela contaminação ambiental com agrotóxicos diminuíram em função de uma redução de 14% na aplicação de inseticidas, sendo que em alguns casos essa diminuição teria chegado a 50% (China, Argentina). Com a liberação da comercialização do arroz Bt na China e do feijão resistente a vírus no Brasil, inicia-se uma nova etapa que contempla as principais fontes de alimento locais. Encontram-se em andamento vários estudos, sobre o grão de bico na África, a berinjela na Índia, o milho resistente à seca nos Estados Unidos e na África subsaariana. OS ESTADOS UNIDOS E A UNIÃO EUROPEIA Nos Estados Unidos, três agências controlam e regulamentam o uso das novas tecnologias genéticas: USDA (United States Department of Agriculture), EPA (Environmental Protection Agency) e FDA (Food 175

186 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) and Drug Administration). Embora a resistência aos cultivos transgênicos seja muito baixa, sendo plenamente adotados desde 1996, cresce em alguns estados um movimento de oposição que pede a rotulagem. Na União Europeia, a resistência às PGMs é muito alta. Em 1999, uma moratória suspendeu o cultivo de novas variedades transgênicas, assim como a comercialização de seus produtos. Não atingiu algumas variedades autorizadas anteriormente para cultivo, importação ou utilização na produção de alimentos ou de rações. Em 2003 foram estabelecidas normas de rotulagem e de rastreamento de traços transgênicos e com a implantação de diretrizes para o cultivo de plantas transgênicas, de maneira a minimizar a contaminação dos campos de cultivos orgânicos e convencionais. Recentemente o Conselho da União Europeia estabeleceu que cada Estado poderá interditar um cultivo geneticamente modificado com base em considerações éticas ou socioeconômicas, sem invocar argumentos científicos. Apesar da hostilidade das autoridades do Conselho Europeu, há um bom número de organizações favoráveis ao cultivo de plantas geneticamente modificadas: 33 no Reino Unido, 23 na Itália, 16 na Espanha e 11 na Alemanha. ISRAEL Israel não assinou o Protocolo de Cartagena e não restringe a importação de PGMs nem de seus derivados. Desenvolve pesquisas biotecnológicas sobre tomate, batata, eucalipto, soja, algodão, milho, morango, banana e flores. Os testes de campo devem ser autorizados pelo PPIS (do inglês, Plant Protection and Inspection Services of Israel). Encontra-se em preparação uma regulamentação que exige a rotulagem dos produtos com mais de 0,9% de ingredientes derivados de PGMs. Os produtos sem DNA ou proteína derivada de uma OGNM não serão rotulados. OS PAÍSES DE AMÉRICA LATINA Na América Latina (Brasil, Argentina, Paraguai, Uruguai, Bolívia, Colômbia, Chile, Costa Rica, Cuba e Honduras), os principais cultivos biotecnológicos são a soja, o milho e o algodão (Tabela 16.1). Embora o desenvolvimento das sementes dependa geralmente do setor privado, em vários países (Argentina, Brasil, México, Colômbia) o setor público começou a gerar suas próprias variedades, respondendo à demanda local. Na Argentina, os primeiros exemplos são a soja tolerante à sequia da empresa Indear e a batata resistente à vírus, desenvolvida pela Tecnoplant, uma empresa do grupo Sidus. No Brasil, o feijão resistente a vírus desenvolvido pela Embrapa, e a soja tolerante ao glufosinato, fruto de uma colaboração entre a Embrapa e a Basf. Os países da América Latina contam com uma comunidade acadêmica de alto nível científico e tecnológico, ativa nas universidades e nos centros de pesquisa, com empresas de tradição histórica na difusão da tecnologia agropecuária e, em vários casos, com condições econômicas limitadas pelas sucessivas crises políticas. Em ambos os países, numerosas empresas privadas ocupam lugares de destaque em diferentes setores do mercado biotecnológico. A existência de convênios e programas de intercâmbio científico tende a elevar o nível das atividades científicas e tecnológicas. Ao longo dos primeiros quinze anos de implantação das novas tecnologias agrícolas, cada país seguiu sua própria trajetória até estabelecer as normas legais que garantem o progresso em condições seguras. ÁFRICA SUBSAARIANA O desenvolvimento da agricultura africana permitiria reduzir a pobreza e aumentar a segurança dos alimentos. Até o momento, África do Sul, Burkina Faso e Sudão comercializam o algodão resistente a insetos e a soja e o milho tolerantes ao glifosato. Em Burkina Faso, Quênia, Moçambique, Nigéria, 176

187 BIOTECNOLOGIA E AGRICULTURA África do Sul, Tanzânia e Uganda a comunidade científica conta com o apoio de organizações internacionais para desenvolver cultivos de interesse local: milho, batata-doce, mandioca, arroz, sorgo e banana. Os traços principais são a resistência a pragas, a tolerância à sequia e à salinidade e outras condições, como a biofortificação em vitamina A, zinco e ferro. Contudo, existem dificuldades devido à pressão cultural da União Europeia e, também, à falta de regulamentações locais que possibilitem avançar nos testes de campo. CHINA Com uma população de mais de 1,3 bilhão de habitantes e graves problemas ambientais, a China estará investindo 4 bilhões de dólares em biotecnologia, até A China é o maior importador de alimentos do mundo, de modo que parte das pesquisas está relacionada com o arroz, o milho, o trigo e a soja. Em relação ao meio ambiente, a adoção do algodão BT por 70% dos agricultores permitiu em 5 a 8 anos a redução do uso de pesticidas em 50 a 60 %. AS NOVAS TECNOLOGIAS Nos últimos 20 anos, diferentes países tiveram uma atitude que variou entre a rejeição absoluta e a aceitação dos cultivos geneticamente modificados. Atualmente, 271 organizações e instituições científicas reconhecem a segurança dos cultivos geneticamente modificados e seus benefícios potenciais. Tanto o setor público como o setor privado de vários países têm capacidade para utilizar a tecnologia em benefício da sociedade, colocando no mercado cultivos adaptados às condições locais, uma vez satisfeitos os requerimentos e as regulamentações determinados pelas autoridades competentes. As novas tecnologias de edição gênica já estão sendo usadas: na China, para obter um trigo resistente a fungo e um arroz mais produtivo; no Reino Unido, para produzir uma variedade de cevada resistente à seca. O primeiro produto comercializado é a SU Canola, resistente ao herbicida sulfoniltiouréia. Contudo, ainda é cedo para prever qual será o destino das novas variedades, porque sua implantação depende do processo regulatório a ser adotado TABELA As plantas geneticamente modificadas no mundo (Dados do ISAAA, março de 2016) A. Os cultivos de plantas geneticamente modificadas Abóbora (Cucurbita pepo), Alfafa (Medicago sativa), Algodão (Gossypium hirsutum L.), Ameixa (Prunus domestica), Arroz (Oryza sativa L.), Batata (Solanum tuberosum L.), Berinjela (Solanum melongena), Beterraba sacarina (Beta vulgaris), Canade-açúcar (Saccharum sp), Canola argentina (Brassica napus), Canola polonesa (Brassica rapa), Chicória (Cichorium intybus), Choupo (Populus sp.), Cravo (Dianthus caryophyllus), Eucalipto (Eucalyptus sp.), Feijão (Phaseolus vulgaris), Grama Creeping Bentgrass (Agrostis stolonifera), Linho (Linum usitatissumum L.), Maçã (Malus x Domestica), Melão (Cucumis melo), Milho (Zea mays L.), Papaia (Carica papaya), Petúnia (Petunia hybrida), Pimentão doce (Capsicum annuum), Rosa (Rosa hybrida), Soja (Glycine max L.), Tabaco (Nicotiana tabacum L.), Tomate (Lycopersicon esculentum), Trigo (Triticum aestivum). B. Países que pararam de plantar cultivos geneticamente modificados Países (N 0 de eventos aprovados) Egito (1) Indonésia (15) Irã (1) União Europeia*** (86) Cultivos geneticamente modificados Milho. Cana de açúcar, milho, soja. Arroz. Algodão, batata, beterraba sacarina, canola argentina, cravo, milho, soja. (***) Bulgária, França, Alemanha, Polônia, Suécia 177

188 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) C. Países que plantam cultivos geneticamente modificados. Países (N 0 de eventos aprovados) África do Sul (67) Argentina (40) Austrália (107) Bangladesh (1) Bolívia (1) Brasil (50) Burkina Faso (1) Canadá (165) Chile (3) China (60) Colômbia (73) Costa Rica (15) Cuba (1) Estados Unidos de América (190) Filipinas (88) Honduras (8) Índia (11) México (158) Myanmar (1) Paquistão (2) Paraguai (20) Sudão (1) União Europeia*(86) Uruguai (17) Vietnã (6) Cultivos geneticamente modificados Algodão, arroz, canola argentina, milho, soja. Algodão, milho, soja. Alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, cravo, milho, rosa, soja, trigo. Berinjela. Soja. Algodão, eucalipto, feijão, milho, soja. Algodão. Abóbora, alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, canola polonesa, linho, maçã, milho, papaia, soja, tomate. Canola argentina, milho, soja. Algodão, arroz, beterraba sacarina, canola argentina, choupo, milho, papaia, petúnia, pimentão doce, soja, tomate. Algodão, arroz, beterraba sacarina, cravo, linho, milho, rosa, soja, trigo. Algodão, soja. Milho. Abóbora, alfafa, algodão, ameixa, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, chicória, grama, linho, maçã, melão, milho, papaia, rosa, soja, tabaco, tomate, trigo. Alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja. Arroz, milho. Algodão, soja. Alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja, trigo. Algodão. Algodão. Algodão, milho, soja. Algodão. Algodão, batata, beterraba sacarina, canola argentina, cravo, milho, soja. Milho, soja. Milho. (*) Espanha, Portugal, República Tcheca, Romênia, Eslováquia D. Países que importam cultivos geneticamente modificados Países (N 0 de eventos aprovados) Coreia do Sul (138) Federação Russa (23) Japão (214) Malásia (22) Noruega (11) Nova Zelândia (92) Panamá (1) Singapura (24) Suiça (4) Tailândia (15) Taiwan (117) Turquia (32) União Europeia**(86) Cultivos geneticamente modificados Alfafa, algodão, batata, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja. Arroz, batata, beterraba sacarina, milho, soja. Alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, cravo, milho, papaia, rosa, soja. Cravo, milho, soja. Cravo. Alfafa, algodão, arroz, batata, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja, trigo. Milho. Alfafa, algodão, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja. Milho, soja. Milho, soja. Algodão, beterraba sacarina, canola argentina, milho, soja. Milho, soja. Algodão, batata, beterraba sacarina, canola argentina, cravo, milho, soja. (**) Áustria, Bélgica, Croácia, Chipre, Dinamarca, Estônia, Finlândia, Grécia, Hungria, Irlanda, Itália, Letônia, Lituânia, Luxemburgo, Malta, Países Baixos, Eslovênia, Reino Unido. 178

189 C A P Í T U L O 14 BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS Das 148 espécies conhecidas de mamíferos terrestres, onívoros ou herbívoros, que alcançam um peso de 45 kg, somente 14 foram domesticadas. Em relação às restantes, o fracasso costuma ser atribuído a seis razões: uma dieta que o homem não pode ministrar; crescimento lento e espaçado (elefantes e gorilas); tendências agressivas (ursos e rinocerontes); relutância a se reproduzir em cativeiro (pandas, guepardos); falta de estruturas de liderança (antílope); tendência ao pânico em lugares fechados ou em presença de um predador (gazelas). Seja como for, a criação de animais para a alimentação está limitada a um pequeno número de espécies de mamíferos, ruminantes (bovinos, ovinos, caprinos) e monogástricos (suínos, coelhos e aves), de peixes, de crustáceos e de mariscos. Também se criam animais para a prática de esportes (cavalos) e como companhia (gatos, cachorros, pássaros, peixes). Os grandes estabelecimentos agrícolas praticam a cultura extensiva de gado (bovino, ovino, caprino) em pradarias e pastagens, enquanto os menores tendem a investir em culturas intensivas de altos rendimentos (gado leiteiro, aves, suínos e peixes), que degradam o ambiente. A produção agrícola depende também de fatores econômicos e sociais. À medida que melhora o nível de vida da população, mudam os padrões de consumo e, consequentemente, a atividade agropecuária. Estima-se que, entre 1993 e 2020, os países em desenvolvimento duplicarão o consumo de carne. Pequenas empresas familiares serão substituídas por outras de produção intensiva, orientadas a satisfazer o mercado urbano; a criação de aves e suínos aumentará em detrimento da criação de ruminantes. Essas mudanças exigirão maior eficiência na seleção, no gerenciamento das empresas e nos cuidados com a alimentação e a saúde dos animais. Nos países desenvolvidos, o objetivo primordial é aumentar, ou manter, a quantidade de produtos (leite, ovos, carne e lã) e, simultaneamente, diminuir os custos. Em relação aos métodos produtivos, isso significa reduzir o número de animais, o trabalho humano e o impacto causado pelas doenças. As biotecnologias inserem-se tanto na alimentação, como na conservação da saúde dos animais, possibilitando também o controle da reprodução e a aceleração da seleção genética. Perspectivas novas surgem com a utilização dos animais como biorreatores, para a produção de fármacos. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

190 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A NUTRIÇÃO DOS ANIMAIS A NECESSIDADE DE RAÇÕES A criação e engorda de gado de corte nas pastagens é possível em países com grandes extensões territoriais, tais como a Argentina, a Austrália, o Brasil e a Nova Zelândia. O alimento básico do gado é o capim, que cresce de maneira desigual ao longo das quatro estações do ano. Nos períodos em que falta capim deve-se suplementar a dieta do rebanho com feno (forragem dessecada), silagem (forragem e grãos fermentados), grãos, concentrados e/ou resíduos agroindustriais. À medida que a agricultura invade as áreas de pastagem, a pecuária adota os regimes de semiconfinamento ou confinamento, estabelecendo como objetivo primordial o aumento da produtividade (gado leiteiro, aves e suínos). Parte dos cultivos de cereais (milho) e de leguminosas (tortas de soja, algodão, colza e girassol) é utilizada como ração, para suprir as necessidades proteicas e energéticas dos animais, sendo necessários de 3 a 10 kg de grãos para obter 1 kg de carne. Como o valor nutricional dos grãos é variável, acrescentam-se às rações alguns complementos nutritivos. Vários produtos industrializados fornecem um conteúdo de nutrientes equilibrado para as necessidades dos animais, em função de sua espécie, sua idade etc. DE LIEBIG À VACA LOUCA Os suplementos nutritivos proteicos foram introduzidos em fins do século XIX. Em 1865, Liebig inventou um procedimento industrial para transformar os restos dos animais em extrato e farinha de carne. O primeiro era vendido como complemento para a alimentação humana; a segunda era utilizada para fortificar as rações animais. Bem antes da Segunda Guerra Mundial, as rações dos ruminantes dos países desenvolvidos incluíam farinha de carne, em uma proporção de 2 a 5%. Até 1973, a Europa importava grãos para as rações animais. Quando condições climáticas adversas causaram uma grande quebra da safra de soja, os Estados Unidos embargaram o grão disponível, para garantir suas necessidades internas. Sem grãos como fonte proteica das rações, a única opção que restou aos europeus foi a farinha de carne. Na tentativa de baratear ao máximo os custos das rações, deixou-se de extrair a gordura com solvente e modificaram-se as condições de esterilização. A inclusão de restos de animais doentes, inicialmente ovelhas com scrapie, uma doença esporádica, conhecida no Reino Unido desde 1732, pode ter contaminado as vacas e provocado o surto da doença da vaca louca, uma variante da doença de Creutzfeldt-Jakob que afeta o homem, causando-lhe danos neurológicos graves. Esta variante ataca as pessoas jovens e se manifesta mais rapidamente. Em 1988, a farinha de carne foi proibida na alimentação do gado bovino e ovino. A epidemia exigiu o sacrifício de boa parte dos rebanhos, no Reino Unido e outros países da Europa, colocando em discussão a composição das rações animais e mostrando a necessidade de aumentar a quantidade e a qualidade dos suprimentos de grãos e de plantas forrageiras. VARIAÇÕES SOBRE A COMPOSIÇÃO DAS RAÇÕES Além da farinha de carne, outros produtos já foram utilizados como suplemento proteico, entre eles o leite desnatado em pó e a farinha de pescado, que hoje está sendo abandonada devido ao aumento do preço, resultante da pesca excessiva e da diminuição dos cardumes. Como fonte alternativa de proteínas, a biomassa microbiana seca tem dado bons resultados. Denominada SCP (do inglês, single cell protein), a proteína unicelular pode ser obtida de diversas fontes. As leveduras, como Saccharomyces cerevisiae, são um subproduto nas destilarias de álcool; outras, como Candida utilis ou Torula, se multiplicam sobre os efluentes das indústrias de papel ou de 180

191 BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS laticínios. A bactéria Methylophilus methylotropus cresce sobre metanol, obtido a partir do gás do Mar do Norte, originando uma SCP que é comercializada, no Reino Unido, sob o nome de Pruteen. O acréscimo de enzimas (proteases, celulases, amilases etc.) tende a aumentar a digestibilidade das rações. Uma dieta baseada em grãos tem o inconveniente de introduzir fósforo e outros nutrientes, complexados ao ácido fítico. No caso dos ruminantes, a flora microbiana do sistema digestório consegue disponibilizar parte do fósforo, mas isso não ocorre nos animais monogástricos como os suínos, as aves e, inclusive, o homem. Os fitatos impedem a assimilação do fósforo, porém, a adição da enzima fitase na ração melhora a assimilação dos nutrientes e diminui a quantidade de fósforo excretado no ambiente, que é uma das causas da eutrofização dos cursos de água. A adição de antibióticos visa proteger as rações da ação bacteriana. Já a adição de probióticos procura modificar o ambiente gastrintestinal, estimulando a multiplicação de certos tipos bacterianos em detrimento de outros. A fitase é produzida por fermentação microbiana e, na Europa, é obrigatório adicioná-la às rações. O mercado global de fitase é de, aproximadamente, 500 milhões de dólares, 40% do qual situado na China. AS RAÇÕES TRANSGÊNICAS A União Europeia exige o etiquetado de toda ração contendo mais de 0,9% de um Organismo Geneticamente Modificado aprovado previamente, mas não considera necessário rotular os alimentos provenientes de animais alimentados com rações geneticamente modificadas (carne, ovos, leite). O escândalo da vaca louca, seguido pelo caso dos frangos contaminados com dioxina, mostrou o descaso dos produtores europeus em relação às rações animais. Isso explica a repercussão de alguns trabalhos (A. Pusztai, 1998; G-E. Séralini, 2012), declarando ter encontrado alterações do sistema imune ou formação de tumores em ratos alimentados com batatas ou milho transgênico. Esses trabalhos foram totalmente desqualificados pela comunidade científica, mas ainda são citados como prova do perigo das rações e dos alimentos transgênicos. As rações representam até 70% dos custos da criação de animais. Por ser um dos gargalos da produção agrícola, toda tentativa de baratear as rações costuma ser assimilada rapidamente. Contudo, devido aos escândalos precedentes e à desconfiança da população, a introdução de plantas geneticamente modificadas teve que ser analisada cuidadosamente, em diversos tipos de animais. Não foram encontrados sinais de toxicidade da soja, da ervilha, do lupino, do algodão e da batata em ratos nem da colza em coelhos. As características das carcaças, dos tecidos e das carnes não mudaram em animais que receberam alimentos transgênicos. Numerosos estudos, desenvolvidos em instituições de pesquisa e universidades, mostraram que, tanto em relação à composição química, como à digestibilidade e ao valor nutritivo, as plantas biotecnológicas disponíveis são substancialmente equivalentes às convencionais (não transgênicas). Organizações internacionais como FAO/WHO (Food and Agriculture Organization e World Health Organization) consideram, desde 1991, que a ingestão de DNA é segura, independentemente de ser sua fonte transgênica ou não. As organizações norte-americanas FDA (Food and Drug Agency), em 1992, e EPA (Environmental Protection Agency), em 2000, manifestaram-se no mesmo sentido. Segundo a FASS (Federation of Animal Science Societies), as rações são digeridas normalmente pelos animais estudados, sem que sejam detectados ácidos nucleicos ou proteínas de origem transgênica na carne, no leite ou nos ovos. Este era um resultado esperado, porque, em função dos conhecimentos sobre digestão e absorção, tanto as proteínas como o DNA são degradados durante o processo digestivo. Em alguns casos, em que as plantas têm as propriedades agronômicas modificadas, como, por exemplo, o milho resistente a insetos (milho-bt), verifica-se uma redução substancial de micotoxinas. 181

192 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Estas são muito perigosas, para os animais que ingerem os grãos contaminados, porque causam hemorragias, danos no fígado e nos rins, diarreias e câncer. Ao diminuir os ataques de insetos, há menos lesões que possibilitem a infecção e o crescimento dos fungos. Em consequência, o milho transgênico melhora a qualidade do alimento e a saúde animal, especialmente dos monogástricos, mais sensíveis as micotoxinas que os ruminantes. A aprovação do milho com fitase (Academia de Ciências Agrícolas da China, Origin Agritech Ltda.) representa um marco importantíssimo para a China. Estão sendo estudadas plantas com maior digestibilidade, como uma alfafa transgênica com menos lignina. Por outro lado, o melhoramento das plantas forrageiras também abre perspectivas interessantes. Observou-se, por exemplo, aumento de peso e bom crescimento da lã em ovelhas alimentadas com lupino transformado geneticamente, para sintetizar uma proteína de girassol com alto conteúdo de metionina. O MELHORAMENTO GENÉTICO DO GADO Existem hoje mais de raças de gado, resultantes de muitos anos de adaptação a diferentes condições ambientais. O melhoramento genético visa três objetivos fundamentais: aumentar a eficiência da conversão do alimento para incrementar a taxa de crescimento corporal; acrescer a produtividade (leite, ovos); modificar a composição da carcaça, aumentando a quantidade de proteína (carne e leite), em detrimento da gordura. Diferentemente da área de melhoramento vegetal em que, através da venda anual de sementes, as grandes empresas conseguem recuperar rapidamente seus investimentos; a área de melhoramento animal tem um retorno mais lento porque existem períodos maiores entre uma geração e outra. Muitas das características selecionadas em animais mostram uma variação contínua, que, em vez de responder a um gene único, resulta da contribuição de vários genes (herança poligênica ou quantitativa). Se estiverem situados em cromossomos diferentes, a seleção dos genes de interesse acarretará genes vizinhos, que podem ser desfavoráveis. Os frangos do tipo broiler, por exemplo, têm-se transformado em um alimento comum e barato, em contraste com anos atrás. Selecionados por 50 gerações, esses frangos crescem quatro ou cinco vezes mais rápido que seus antepassados. Mas, no caminho, apareceram alguns efeitos deletérios, tais como o aumento do teor de gorduras, a fertilidade baixa e a presença de anormalidades esqueléticas. Por outro lado, galinhas selecionadas como poedeiras desenvolveram osteoporose, ao desviar o cálcio do esqueleto para a construção da casca dos ovos. E os perus desenvolveram um tamanho tal que não conseguem acasalar sem riscos, sendo necessário proceder à inseminação artificial. A seleção assistida por marcadores moleculares obteve um grande sucesso na área, justamente por amenizar a dificuldade de se lidar com traços multigênicos. Ciclos de vida mais longos tornam mais lenta a recuperação dos investimentos de modo que, a exceção da produção de frangos, o setor resulta menos atrativo para as grandes empresas privadas. A distribuição do material genético se encontra nas mãos dos pecuaristas e de pequenos empreendimentos privados, responsáveis por mais de 80% da pesquisa e desenvolvimento na área agropecuária dos países desenvolvidos. O CONTROLE DA REPRODUÇÃO O controle da reprodução dos animais permite a expansão rápida dos estoques, reduzindo os custos de transporte de animais. O processo começa com a seleção dos pais (reprodutores e matrizes), escolhidos pelas suas características genéticas, relativas à produtividade e à saúde (Figura 15.1). 182

193 BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS Desde meados do século XX, pratica-se a inseminação artificial no gado bovino, ovino, caprino, porcino e em aves (perus, frangos). A técnica é mais utilizada com o gado de leite que com o de corte, porque o preço por cabeça é mais alto. Complementa-se a inseminação artificial com a sexagem prévia do sêmen, a fim de escolher os espermatozoides que poderão dar origem a fêmeas. O sêmen colhido de um reprodutor é introduzido no útero das matrizes. Considerando que uma única ejaculação de um touro produz aproximadamente 100 doses de sêmen, que um animal chega a produzir doses por ano e que a eficiência da inseminação chega a 50%, o método permite obter aproximadamente crias por reprodutor ao ano. O desenvolvimento das técnicas de criopreservação permite utilizar tanto o sêmen fresco como o congelado, possibilitando, também, a conservação da biodiversidade de raças em perigo de extinção. Uma dose de sêmen custa a partir de 15 reais e, se for de qualidade comprovada, 20 reais. O touro Bandido, que teve uma exitosa participação em uma novela de televisão e morreu prematuramente, deixou sêmen congelado. Dele descendem os touros Zangão, Matador e Carrancudo, que participam em festas de rodeio por todo o Brasil. Normalmente, uma vaca produz uma cria por ano. Tratada com hormônios para induzir uma superovulação e inseminada artificialmente, essa vaca poderá gerar simultaneamente cinco embriões, que serão colhidos mediante a lavagem do útero e transferidos a uma vaca receptora. A criopreservação garante que 25 a 50% dos embriões congelados possam originar animais vivos. Como o processo todo (superovulação + inseminação + transferência dos embriões) pode ser repetido quatro vezes por ano, apesar de algumas limitações técnicas, uma vaca parirá 10 crias por ano FIGURA O Controle da reprodução em bovinos O controle da reprodução dos animais domésticos depende de diversas técnicas (superovulação, inseminação artificial, coleta de ovócitos ou de embriões, criopreservação, transplante de embriões). Vaca doadora Touro reprodutor Vaca doadora Ovários obtidos nos matadouros Superovulação Sêmen Superovulação Congelamento Coleta dos Coleta dos ovócitos ovócitos Inseminação artificial Fecundação in vitro Coleta dos embriões Transplante Testes genéticos Congelamento Desenvolvimento in vitro dos embriões Transplante Vacas receptoras Vacas receptoras 183

194 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Outra variante consiste em extrair os ovócitos das vacas superovuladas, ou dos ovários de animais sacrificados, procedendo a uma fecundação artificial, antes de reimplantar os embriões nas vacas receptoras. O número de embriões também pode ser aumentado por bipartição, por micromanipulação do blastócito com 64 a 128 células. A aplicação de testes genéticos nos pais e nos embriões, antes de ser reimplantados, permite uma seleção apurada da descendência. Sendo a produção de alimentos um dos objetivos fundamentais da atividade agropecuária, os modificadores metabólicos são utilizados tanto para incrementar a produção, como para modificar a relação entre carne e gordura, e, assim, diminuir o desperdício. AS NOVAS TECNOLOGIAS MARCADORES MOLECULARES E SELEÇÃO GENÔMICA O estudo do genoma dos animais domésticos fornece informações para a seleção de alguns caracteres. Em relação aos monogênicos, o processo seletivo oferece poucas dificuldades, especialmente se o gene responsável por uma característica de interesse estiver estreitamente associado a um determinado marcador, que possa ser detectado facilmente por técnicas moleculares. O processo se complica com os caracteres poligênicos, porque devem correlacionar-se os principais genes que participam na variação do traço escolhido, e as sequências não funcionais que, distribuídas ao longo do genoma, irão cumprir o rol de marcadores moleculares. Centenas de marcadores foram identificados em diferentes espécies. Trata-se de SNPs e de sequências curtas de DNA repetidas um número variável de vezes (mini ou microssatélites), que são transmitidas de uma geração a outra e podem ser identificadas por eletroforese. Além de facilitar a seleção, os marcadores permitem a determinação do parentesco (pedigree) e a identificação dos animais, tanto no campo como nos produtos derivados. Já foram sequenciados vários genomas de animais domésticos: frango (Gallus gallus), porco (Sus scrofa), cachorro (Canus familiaris), vaca (Bos taurus), cavalo (Equus caballus), gato (Felis catus), coelho (Oryctolagus cuniculus), peru-selvagem (Meleagris gallopavo), dromedário (Camelus dromedarius), abelha (Apis melífera), ovelha (Ovis aries), peixe-zebra (Danius raris) etc. À medida que um genoma é completado, as técnicas eletroforéticas são substituídas por chips de DNA (microarrays). O sequenciamento do genoma cria uma quantidade extraordinária de dados, correlacionando marcadores e características fenotípicas. Com essa informação, estabelecem-se equações preditivas para os cruzamentos seletivos, substituindo a seleção por marcadores pela seleção genômica. A CLONAGEM Em 1975, J. Gurdon (Prêmio Nobel de Medicina 2012) mostrou que, transferindo um núcleo de girino a um ovócito anucleado de rã, gerava-se um girino normal e, após a metamorfose, uma rã adulta. O sucesso do experimento diminuía notavelmente quando o núcleo era extraído de células diferenciadas. No Instituto Roslin (Escócia), Ian Wilmut tentou transferir o núcleo de uma célula de glândula mamária de ovelha Finn Dorset a um ovócito receptor anucleado de uma ovelha Scottish Blackface. O embrião resultante seria implantado em uma ovelha Scottish Blackface. Depois de 277 tentativas frustradas, nasceu uma ovelha Finn Dorset, Dolly ( ), o primeiro animal obtido por transferência nuclear (Figura 14.2). Fenômeno midiático, Dolly desenvolveu um tumor no pulmão, sendo sacrificada depois de desenvolver artrite em uma pata e de mostrar sinais de envelhecimento precoce. 184

195 BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS As dificuldades técnicas estão, principalmente, na estimulação do citoplasma receptor e na coordenação entre a atividade citoplasmática e a nuclear. Quando a reprogramação celular é incompleta, observam-se fenômenos epigenéticos que abrangem o DNA, a cromatina e a inativação do cromossomo X. Como resultante de efeitos aleatórios e de influências ambientais, os animais clonados não são totalmente idênticos. Por outro lado, os problemas de saúde são mais frequentes em clones, porque a gestação é mais demorada e o tamanho do recém-nascido é maior. As taxas de mortandade perinatal aumentam, assim como o número de malformações congênitas. A clonagem é utilizada com os animais fundadores, principalmente bovinos e suínos, porque são os únicos em que os benefícios justificam o custo do procedimento. Alguns exemplos são ilustrativos: Bull 86 Squared, um clone de um animal resistente à brucelose, salmonelose e tuberculose; Annabell Zeta, uma vaca da raça Holstein recordista da produção de manteiga, clonada com sucesso por apresentar problemas de fertilidade; Second Chance, nascido depois de 189 tentativas de clonagem de Chance, um touro que participou de rodeios e filmes. A tecnologia está sendo desenvolvida também na Argentina e no Brasil. Ciruelito é um clone de Ciruelo, grande campeão da raça Brangus. Lenda e Glória da Embrapa descendem de Vitória, uma vaca da raça Simental, nascida por transferência nuclear; Porã e Potira descendem, via bipartição embrionária, de uma vaca da raça bovina Junqueira, em alto risco de extinção; também zebuínos foram clonados. Em ambos os países existem empresas privadas especializadas na clonagem comercial de bovinos (BioSidus, ARG Natural Beef; Vitrogen, Geneal) em empreendimentos ligados a universidades ou institutos de pesquisa agronômica. De um modo geral, a clonagem é utilizada para animais de elite, doentes ou acidentados, estimando-se o preço de um bezerro clonado, nos Estados Unidos, em redor de dólares. Ainda pode demorar vários anos até que o preço se torne interessante para o melhoramento direto na pecuária FIGURA Dolly, um clone obtido por transferência nuclear Ovelha Finn Dorset Ovelha Scottish Blackface Cultivo de células de glândula mamária Transferência nuclear Extração do glóbulo polar e dos cromossomos do ovócito Ativação elétrica e fusão Implantação do embrião em uma ovelha Scottish Blackface Nasce Dolly (Finn Dorset) 185

196 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Diferente dos bovinos, os equinos nasceriam mais saudáveis. Em 2003, a mula Joy of Idaho foi o primeiro clone de um híbrido de uma égua e um jumento. No mesmo ano e depois de 847 tentativas, nasceu na Itália a égua Prometea, gerada a partir de uma célula somática materna, o que a torna ao mesmo tempo filha e irmã gêmea de sua mãe. Em 2005 obtiveram-se os primeiros clones de um cavalo de corrida (Pieraz Cryozootech) e de um cavalo de salto (Paris-Texas). Recentemente, nasceu na Argentina BS Ñandubay, clone de Ñandubay, um cavalo crioulo (Halitus, BioSidus). No Brasil, as potras Branca e Neve foram obtidas por bipartição embrionária. Observe-se que a inseminação artificial e os tratamentos de fertilidade estão proibidos em cavalos de corrida, puros-sangues. Contudo, as possibilidades da clonagem vão além do aumento da taxa de fertilidade de animais elite e da conservação de animais com características interessantes. A clonagem pode ser utilizada para a conservação de espécies raras e em risco de extinção, para a criação de rebanhos homogêneos que facilitem trabalhos de pesquisa e para a propagação rápida de alguns organismos transgênicos. A TRANSGÊNESE Na década de 1980, a transferência de um gene codificador de hormônio de crescimento humano originou ratos duas vezes maiores. Quando repetida a experiência com porcos, obteve-se o Beltsville pig, um animal que apresentou problemas variados: dificuldades respiratórias, artrite, letargia etc. O experimento suscitou vários questionamentos éticos em relação ao tratamento infligido aos animais. De um modo geral, salvo em peixes, a transgênese do hormônio de crescimento (GH, do inglês growth hormone e GHFR, do inglês growth hormone factor releasing) nos animais domésticos revelou-se problemática. Um caso interessante pelos benefícios que poderia trazer para o meio ambiente é o do Enviropig (Universidade de Guelph, Canada), um porco portador de um gene bacteriano codificador de fitase. Secretada na saliva, a enzima reduz em 40% a concentração de fósforo no esterco. Por falta de apoio financeiro e sem a aprovação das autoridades pertinentes, em 2012, o projeto teve que ser descontinuado, e os porcos, sacrificados. A partir de 1988 começaram a ser produzidos vacas, cabras, coelhos, ovelhas, frangos, porcos e peixes transgênicos. As novas tecnologias de edição gênica poderão modificar a velocidade do processo. No entanto, a comercialização de animais transgênicos ou seus produtos seguirá avançando lentamente, não só pelos altos custos, como pelo tempo demandado para responder ao processo regulatório e pela resistência eventual dos consumidores. Experiências de transgênese visam melhorar a qualidade do leite de vaca, modificando as proteínas (leite humanizado para lactantes) ou reduzindo a lactose (para as pessoas com intolerância). Na Nova Zelândia e nos Estados Unidos vêm sendo obtidas vacas que produzem mais caseína no leite, uma propriedade interessante para a indústria de queijos. Algumas tentativas também foram feitas em relação à produção de fibras animais: ovelhas transgênicas que não precisassem de determinados suplementos de aminoácidos na dieta; modificação da estrutura das fibras de lã e de caxemira para facilitar o tingimento e diminuir o encolhimento; alteração das propriedades da seda. A partir de uma proteína de aranha, sintetizada por uma cabra transgênica, se desenvolveu e patenteou o Biosteel TM, um produto muito resistente que pode ter diversos usos, inclusive militares. Uma das maiores preocupações existentes é o risco de escapamento de um animal transgênico, e a consequente possibilidade de difundir o transgene nas populações naturais. O risco depende de algumas características do animal, especialmente a mobilidade, a capacidade de escapar do cativeiro e a de voltar ao estado selvagem (Tabela 14.1). Outros fatores adicionais que devem ser considerados em uma simulação de risco são a viabilidade juvenil, a idade de amadurecimento sexual, a fertilidade do macho, a fecundidade da fêmea, a viabilidade do adulto etc. 186

197 BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS TABELA O risco de escapamento de um animal transgênico ESPÉCIE MOBILIDADE CAPACIDADE DE VOLTAR AO ESTADO SELVAGEM CAPACIDADE DE ESCAPAR DO CONFINAMENTO Camundongos Alta Alta Alta Peixes Alta Alta Alta Insetos Alta Alta Alta Porcos Baixa Alta Moderada Aves Baixa Baixa Baixa Vacas Baixa Baixa Baixa AS NOVAS TECNOLOGIAS DE EDIÇÃO GÊNICA A ablação dos chifres de animais criados em confinamento é um procedimento cruento que visa evitar ferimentos do própio animal e do pessoal que os cuida. Algumas raças de gado estão desprovistas de chifres, mas as etapas necessárias para introduzir esse carácter por cruzamento e seleção reduz a qualidade da cria. Uma das primeiras aplicações da tecnologia CRISPR (do inglês, Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) visa a obtenção de touros sem chifres. Outras aplicações previstas abrangem o melhoramento genético de mascotes (peixes, cachorros) e a marcação de ovos de galinha, possibilitando a sexagem dos embriões e sua inclusão na cadeia alimentícia ou na produção de vacinas. A AQUICULTURA Os principais países produtores de peixes, mariscos e crustáceos por aquicultura são a Noruega, o Chile, o Canadá, os Estados Unidos, o Reino Unido, a Nova Zelândia e os países asiáticos. O desenvolvimento da aquicultura parece uma alternativa razoável para a produção de alimentos porque, em função da pesca desmedida, os estoques de peixes nos mares e oceanos têm diminuído assustadoramente. No entanto, do ponto de vista ecológico, ainda subsistem dúvidas em relação à aquicultura. Alguns peixes não exigem nenhuma complementação da ração, como as carpas e tilápias. Já o camarão e o salmão são criados com rações que incluem farinha de peixe. Quais seriam as vantagens da aquicultura se for necessário extrair peixe para a preparação das rações? A criação de peixes e mariscos é uma atividade empresarial que cria empregos, demanda poucos insumos e gera um produto de alto valor agregado. Contudo, alguns problemas subsistem, como a distância dos mercados de destino e a contaminação das águas costeiras, que dificulta a criação de mariscos filtradores de plâncton, favorecendo o florescimento das algas. O gerenciamento destas variáveis, nas fazendas de salmão, dá um retorno econômico importante para a Noruega, o Chile o Canadá e os Estados Unidos. No entanto, como as águas e os invernos canadenses são muito mais frios que os chilenos, onde o salmão pode ser criado o ano inteiro, os produtores canadenses e norte-americanos se interessaram por um salmão resistente ao frio e de crescimento rápido. Dentro desse contexto, a empresa AquaBounty transferiu para o salmão do Atlântico um cassete de expressão, denominado AquAdvantage TM, com dois genes codificadores de uma proteína anticongelamento e um hormônio de crescimento do salmão do Pacífico (Figura 14.3). O peixe cresce rapidamente em condições comerciais, 187

198 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) alcançando o tamanho equivalente ao de um salmão convencional em menos tempo (18 meses em vez de 24 ou 30). Para alguns especialistas, existiria o risco de invasão e substituição dos salmões naturais pelos transgênicos, ou a introdução de genes de valor adaptativo, inicialmente maior que os das populações selvagens, mas cujo valor diminuiria a médio prazo, levando a espécie à extinção (genes troianos). A empresa AquaBounty considera esses riscos sob controle, em função da condição triploide dos salmões GM AquAdvantage, que garante a esterilidade de 98,9% dos peixes e das condições ambientais desfavoráveis em Prince Edwards Island (Canadá), onde serão produzidos os ovos. Segundo o Protocolo de Cartagena, os peixes transgênicos devem ser criados exclusivamente em contenção. Por isso, a exploração comercial de salmões transgênicos não poderá ser feita como até agora, em jaulas marinhas; eles terão que crescer confinados em fazendas dentro do território, de maneira a diminuir os riscos de escapamento. AquaBounty planeja desenvolver o processo no Panamá, em regiões de altitude, com temperatura adequada e rios desfavoráveis para a sobrevivência do salmão. A aprovação, em 2015, do FDA (Food and Drug Administration), da liberação comercial do salmão AquAdvantage o torna o primeiro animal transgênico a entrar no mercado. Estima-se que atualmente existam umas 30 variedades de peixes transgênicos em laboratórios de diferentes lugares. Tilápias e carpas transgênicas se encontram em vias de aprovação em Cuba e na China, respectivamente. Também estão sendo desenvolvidos camarões e mariscos desprovidos da proteína responsável por 80% das alergias e uma truta com mais ácidos graxos Ômega FIGURA O salmão transgênico AquAdvantage (Aquabounty Technologies) Salmão do Pacífico (Chinook) Oncorhynchus tshawytscha Enguia do nordeste do Atlântico Zoarces americanos Gene codificador de hormônio de crescimento Gene codificador de proteínas anticongelamento Salmão do Atlântico (Salmo salar) Alcança o tamanho definitivo em 18 meses, em vez de 24 a 30. Salmão AquAdvantage Criado em contenção (AquaBounty Technologies) (Protocolo de Cartagena). Triploidia (esterilidade de 98,9%) 188

199 BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS A SAÚDE DOS ANIMAIS OS MODIFICADORES METABÓLICOS Os hormônios são modificadores metabólicos que estimulam o crescimento, em bezerros e porcos, e a produção de leite, em vacas. Os mais usados são os hormônios bst (somatropina bovina) e pst (somatropina porcina), produzidos a partir de microrganismos transformados por engenharia genética. Sua utilização gerou polêmicas, sendo proibidos em alguns países da Europa, mas permitidos em 19 países, entre os quais a Argentina, o México e o Brasil. RESISTÊNCIA A DOENÇAS A seleção genética de animais resistentes às doenças é uma forma de reduzir o prejuízo que elas causam, estimado em 10 a 20% da produção. No Reino Unido, a resistência ao scrapie, por exemplo, se tornou uma condição indispensável para a entrada de qualquer ovino em um programa de melhoramento. Outra possibilidade interessante é a obtenção de bovinos resistentes à vaca louca, à mastite e à brucelose. O mapeamento do genoma dos animais domésticos facilita a tarefa de selecionar animais resistentes a doenças, tais como frangos resistentes à doença de Marek e à salmonelose. Várias pesquisas estão direcionadas à introdução de genes que confiram resistência a doenças que afetam o gado, como a tripanossomíase ou a aftosa. O porco africano é resistente ao vírus da febre suína, enquanto o porco europeu é sensível ao vírus. Como eles não cruzam, os métodos clássicos de melhoramento tiveram que ser descartados. O Instituto Roslin (Reino Unido) obteve porcos europeus resistentes ao vírus da febre suína africana, alterando uma única base do genoma, mediante as novas ferramentas de edição gênica (ZFNs, TALENs). A modificação esteve baseada na comparação entre os genomas de ambos os porcos. PREVENÇÃO E TRATAMENTO Na área agropecuária, a defesa sanitária envolve o controle de vacinas e o diagnóstico de doenças, víricas (febre aftosa, peste suína) e bacterianas (tuberculose, brucelose, botulismo). Devido a sua importância econômica, essas atividades exigem condições de trabalho estritas em laboratórios com elevado nível de biossegurança (NB3, NB4). Os principais produtos desenvolvidos para a saúde animal são vacinas, kits de diagnóstico, tratamentos (antibióticos, antiparasitários) e suplementos (hormônios). Estes produtos são necessários porque as práticas intensivas ou semi-intensivas favorecem a transmissão de doenças entre os animais. Existem numerosas vacinas contra as doenças dos animais; muitas pesquisas se direcionam atualmente para a elaboração de vacinas de subunidades de antígeno em plantas modificadas geneticamente, que possam ser administradas na ração. Também está sendo desenvolvida uma vacina para imunizar os animais contra um hormônio reprodutivo (GnRH ou gonadotrophin-release hormone), sendo esta uma alternativa para a castração de touros e porcos. As análises de DNA possibilitam a tipificação dos agentes patogênicos e os estudos epidemiológicos. Os ensaios imunoenzimáticos são utilizados para o diagnóstico de várias patologias e também para o reconhecimento de diversos tipos de contaminação nos produtos (Salmonella, Escherichia coli, Listeria). A produção de medicamentos visa umas 200 doenças animais diferentes. As indústrias de saúde investem aproximadamente US$ 400 milhões por ano em pesquisa e desenvolvimento, mas, de um 189

200 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) modo geral, a saúde animal movimenta muito menos dinheiro que a saúde humana. Salvo em relação aos animais de estimação, o mercado de saúde animal cresce lentamente. Algumas experiências em andamento são a produção de anticorpos monoclonais para a artrite reumatoide no leite de ruminantes, ou a síntese de um antibiótico de amplo espectro por vacas leiteiras, a fim de diminuir a incidência de mastite por Staphylococus aureus. Na América Latina, numerosas empresas do setor privado elaboram medicamentos, vacinas e testes diagnósticos dirigidos à saúde animal. Entre as principais: Biogénesis e Bagó (Argentina), Vallée (Brasil), BiosChile (Chile), Laverlam (Colômbia), IASA (México), Laboratórios Santa Elena (Uruguai). Cuba se destaca pela vacina contra o carrapato, que é vendida em vários países da América Latina. A aquicultura abre um espaço para as empresas que desenvolvem testes de diagnóstico e vacinas para os patógenos que afetam as fazendas, como a argentina Tecnovax S.A. e as chilenas Recalcine e AquaGestión, que desenvolveram uma vacina contra o vírus da anemia infecciosa do salmão. Em relação à febre aftosa, uma endemia que afeta a produção de carne e de leite, novas vacinas mais eficientes e fáceis de aplicar são indispensáveis nas regiões em que a doença não foi totalmente erradicada e em que aparecem surtos eventuais: Argentina, Brasil, Colômbia, México, Paraguai e Uruguai. Do ponto de vista comercial, as vacinas DIVA (do inglês, differentiating infected from vaccinated animals) são especialmente interessantes porque permitem distinguir animais infectados de animais vacinados. Estuda-se também a substituição da vacina atual de vírus inativado, por alfafa transgênica que expresse algumas proteínas do vírus da aftosa (plant-pharming). Tecnologias avançadas são habitualmente aplicadas na produção de vacinas veterinárias. Até o início de 2016, 20 vacinas geneticamente modificadas foram liberadas no Brasil pela CTNBio (Comissão Técnica Nacional de Biossegurança). NOVAS UTILIZAÇÕES DOS ANIMAIS DOMÉSTICOS MODELOS DE ESTUDO PARA DOENÇAS HUMANAS A transgênese é utilizada em vários animais (ratos, camundongos, coelhos e macacos), para transferir características que permitem sua utilização como modelo de doenças humanas. O primeiro modelo foi obtido em 1988, ao se transplantar tecidos do sistema imune extraídos de um feto humano a camundongos geneticamente imunodeficientes; os animais adquiriram um sistema imune humano. No mesmo ano, obtivera-se o oncomouse, um camundongo com um gene para câncer de mama que permite testar tanto o efeito carcinogênico de algumas substâncias como a ação terapêutica de outras. Com este camundongo, a Universidade de Harvard recebeu a primeira patente para um animal transgênico. A partir desse momento vários animais foram redesenhados para servir como modelo; coelhos com diferentes genes para lipoproteínas humanas constituem linhagens sensíveis ou resistentes a regimes ricos em colesterol; camundongos modificados geneticamente possibilitam os estudos sobre epilepsia, obesidade; mapeamento genético de doenças neuropsiquiátricas em cachorros etc. Mediante as novas técnicas de edição gênica (TALENs), o Instituto Roslin obteve, recentemente, um modelo animal (porco) para o estudo da arterioesclerose. Foram alterados os genes codificadores dos receptores da lipoproteína de baixa densidade (LDL), sem os quais essa fração do colesterol se acumula no sangue, causando a doença. Alguns animais domésticos constituem um reservatório de doenças e as transmitem ao homem. Preservar a saúde dos animais diminui o risco de contágio. Deste modo, uma vacina contra a leishmaniose canina desenvolvida recentemente no Brasil visa a cortar a corrente de transmissão da doença do cachorro ao homem. 190

201 BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS XENOTRANSPLANTES O porco é considerado o fornecedor ideal de órgãos para transplante, porque o tamanho e a função destes são equivalentes aos dos humanos. Válvulas de porco substituem já as válvulas cardíacas humanas, depois de eliminar todas as células de porco. A rejeição a um órgão transplantado poderia ser evitada por knock out ou pelas novas técnicas de edição gênica, do gene da α 1,3- galactosiltransferase (α1,3 GalT). Contudo, restaria um dos maiores riscos dos xenotransplantes, que é a transmissão de vírus de uma espécie a outra. OS ANIMAIS COMO BIORREATORES As proteínas terapêuticas incluem hormônios, anticorpos, fatores de crescimento e fatores de coagulação. Os genes codificadores de várias delas já foram transferidos a microrganismos. Porém, devido à necessidade de modificações pós-traducionais, algumas proteínas só podem ser sintetizadas em células animais, cultivadas em biorreatores. Contudo, a quantidade de proteína produzida é muito pequena e os custos operacionais muito altos. Uma alternativa é a transformação genética de um animal para convertê-lo em um biorreator que expresse a proteína de interesse no leite, no sangue, na urina ou nos ovos. De fato, precisa-se de 2 a 3 vezes menos capital inicial, e o custo da proteína recombinante cai entre cinco e dez vezes. Obviamente, a eleição de uma ou outra tecnologia dependerá da demanda do mercado e da dosagem requerida. A aprovação de um produto demanda os testes clínicos correspondentes e normas regulatórias são estritas e demoradas. Poucos meses depois do nascimento de Dolly, o mesmo grupo do Instituto Roslin e PPL Therapeutics anunciou o nascimento de Polly, uma ovelha transgênica para o gene codificador do fator IX, uma proteína fundamental para a coagulação sanguínea e que falta nos hemofílicos. Muitos produtos estão sendo desenvolvidos atualmente no leite (vacas, cabras, ovelhas, porcos) e nos ovos (aves). Em relação ao fator IX humano, por exemplo, porcos transgênicos excretam a proteína no leite em quantidade 250 a vezes maior do que se consegue em biorreatores microbianos. Bastariam algumas centenas de animais para suprir as necessidades de toda a população. Testes clínicos de vários medicamentos encontram-se em andamento. Na Escócia, PPL Therapeutics Ltd. cria 200 ovelhas produtoras de AAT ( -1-antitripsina), uma substância que se encontra em testes clínicos para o tratamento de enfisema hereditário e fibrose cística. Nos Paises Baixos, Pharming BV obteve vacas produtoras de lactoferrina humana, uma proteína com propriedades antimicrobianas. Na Argentina, BioSidus mantém um tambo farmacéutico com duas dinastias de vacas: Pampa, produtora de hormônio de crescimento, e Patagonia, produtora de insulina. No Brasil, a Universidade do Ceará mantém um rebanho de cabras transgênicas de raça Canindé que secreta no leite o fator de estimulação de colônias de granulócitos humanos (hg-csf). Hematech Inc. mantém um rebanho em que os genes bovinos foram removidos (knock out) e substituídos (knock in) por genes humanos. Uma vez imunizados, os animais produzem anticorpos policlonais humanos que podem ser utilizados para combater infecções, assistir a pessoas com o sistema imune comprometido ou tratar doenças autoimunes (artrite reumatoide). Anticorpos humanos (Origen Therapeutics) e interferon (AviGenics) também são produzidos em ovos de aves transgênicas. A empresa GTC Biotherapeutics produz mais de 60 proteínas terapêuticas diferentes no leite de cabras e vacas.com a liberação de ATryn, uma antitrombina com propriedades anti-inflamatórias e anticoagulantes, na Europa (2006) e nos Estados Unidos (2009), esperava-se uma modificação no mercado de fatores de coagulação recombinantes. Porém, as promessas não se confirmaram. Só em dezembro de 2015, o FDA aprovou a liberação comercial do medicamento Kanuma (sebepilase alfa), 191

202 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) de Alexion Pharmaceuticals, para o tratamento de uma doença lisossômica. A enzima é produzida nos ovos de galinhas geneticamente modificadas. Outros produtos estão sendo preparados para fazer frente a um eventual surto de bioterrorismo como, por exemplo, anticorpos humanos contra antraz, varíola e botulismo em vacas transgênicas (TransOva), ou antídotos contra as armas químicas como o gás Sarin em cabras (Nexia). Todas estas aplicações exigem o respeito a normas de segurança estritas. Parece fundamental extremar os cuidados com a eliminação das carcaças e evitar o escapamento de animais transgênicos para produtos medicinais, assim como a entrada acidental de seus produtos na cadeia dos alimentos. O MARCO CONCEITUAL DOS TRÊS Rs O uso de animais em experimentos tem suscitado numerosos debates, em função do sofrimento que se lhes infringe e da dificuldade em se transpor ao ser humano a informação obtida nessas pesquisas. Estima-se em 115 milhões o número de animais utilizados por ano em pesquisas científicas entre roedores (83,5%), primatas (0,15%), gatos (0,06%) e cães (0,24%). Em 1959, Russell e Burch estabeleceram um marco conceitual conhecido hoje como os três Rs (do inglês replacement, reduction and refinement). No momento atual, a ciência não tem como prescindir dos testes em animais em algum momento do desenvolvimento de novos medicamentos e de outras pesquisas. Contudo, os Rs deram início a uma reflexão ética em relação aos animais (Tabela 14.2). Admite-se hoje que nem tudo o que é tecnicamente possível deve ser permitido, cabendo aos Comitês de Ética das instituições de pesquisa discutir este aspecto em relação aos projetos que envolvem seres vivos, a fim de evitar o conflito entre o bem dos seres humanos e o dos animais. Nos últimos anos tem-se desenvolvido numerosas iniciativas para substituir ou reduzir o número de animais no ensino, especialmente na formação de pesquisadores e técnicos. Em bancos de dados como NORINA (A Norwegian Inventory of Alternatives) encontram-se numerosas alternativas para substituir as dissecções e outras práticas que envolvam procedimentos com animais. Contudo, nem sempre os maus-tratos decorrem dos procedimentos experimentais, também podem ser genéticos. Um exemplo significativo é o da raça bovina Belgian Blue, que apresenta um crescimento muscular extraordinário devido a uma mutação no gene codificador da miosina. A carne é macia e com muito pouca gordura, mas devido à largura reduzida do canal pélvico e ao grande tamanho dos bezerros, o nascimento só é possível por cesárea. Alguns países, como a Dinamarca, pedem a extinção desta raça TABELA Significado e alcance dos três Rs (do inglês replacement, reduction, refinement) R SIGNIFICADO EXEMPLOS 1 Substituir Substituição de animais vertebrados conscientes por seres inscientes ou por métodos in vitro. 2 Reduzir Redução do número de animais necessário para a pesquisa mediante desenhos experimentais mais apurados estatisticamente. 3 Refinar Minimizar ao máximo o desconforto ou o sofrimento dos animais. 192

203 BIOTECNOLOGIA E CRIAÇÃO DE ANIMAIS OS ANIMAIS DE ESTIMAÇÃO O bem-estar dos animais domésticos é uma responsabilidade do homem, que deve lhes dar qualidade de vida e minimizar o sofrimento e a dor. Entre estes, os bichinhos de estimação constituem um grupo à parte. Submetidos a processos seletivos diversos, eles experimentam algumas consequências negativas como a surdez, que atinge quase 10% dos dálmatas. Os cachorros, aliás, carregam 300 condições genéticas recessivas das quais 250 foram descritas também no homem. Em 2015, estimaram-se em mais de 14 bilhões de dólares os gastos em produtos de saúde para os pets norte-americanos. Trata-se de vacinas (raiva, hepatite, leucemia felina etc.) e medicamentos (artrite, parasitas, alergias, problemas dentários, doenças cardíacas, falência renal, ansiedade de separação, síndrome de disfunção cognitiva etc.). O mercado também é propício para a clonagem dos animais de estimação. Algumas empresas já estão envolvidas com a tecnologia, que até agora parece ser mais fácil em relação aos gatos que aos cachorros. O desenvolvimento de Night Pearls, um peixe transgênico que brilha no escuro, custou US$ 2,9 milhões. Inicialmente desenhado para monitorar a qualidade da água, este peixe se transformou em mascote. Existem variedades com fluorescência verde, vermelha e com uma combinação das duas cores, a um preço de US$ 17,40, no lançamento em Taiwan (2003). 193

204 C A P Í T U L O 15 BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS OS ALIMENTOS FERMENTADOS As fermentações foram descobertas empiricamente por diversos povos, em diferentes momentos históricos. Assimiladas rapidamente pelo homem, suas duas vantages fundamentais eram a preservação dos alimentos e a eliminação das substâncias tóxicas de alguns grãos. Os processos fermentativos desenvolveram-se de modo artesanal até a segunda metade do século XIX, quando as descobertas científicas sobre os microrganismos e as enzimas possibilitaram o desenvolvimento da indústria de alimentos, que soube se apropriar de todas as ciências afins (microbiologia, bioquímica, engenharia química, automação etc.). Os alimentos fermentados constituem hoje a terceira parte da dieta humana. Seja por facilitar a assimilação dos nutrientes, seja por apresentar menos substâncias tóxicas, esses alimentos entram na categoria dos denominados alimentos funcionais, isto é, alimentos que provêm benefícios extras, além dos que seriam esperados em função de sua composição. Afora os produtos de panificação, as bebidas alcoólicas e os laticínios, existem muitos outros tipos de alimentos fermentados. Alguns são de origem animal (pescado, embutidos e presuntos), mas a maioria é de origem vegetal, tanto no Ocidente (chucrute, picles, azeitonas, café, cacau, chá) como no Oriente (shoyu, misó, tempeh, kimchi etc.) e na África (gari, kokonte ou lafun, agbelima, togwa, kenkey etc.). O PÃO A arte da panificação surgiu em diferentes lugares, entre 7000 e 5000 a.c. Os primeiros pães eram umas bolachas planas, de cereais moídos e água, cozidas sobre pedras quentes. Logo deve ter sido observado que, deixando a massa em repouso por um tempo, melhorava-se a textura e a digestibilidade dos pães. O passo seguinte ocorreu, provavelmente, ao observar o crescimento do pão quando se juntava, à massa recém-preparada, uma pequena parte da massa crua da preparação anterior ( massa ácida ou pé de massa ). Este procedimento já era conhecido por egípcios e hebreus, 5 mil anos atrás. Os estudos microbiológicos atuais indicam a coexistência, no pé de massa, de bactérias lácticas e leveduras. As enzimas presentes no grão catalisam a transformação do amido em açúcares, que são transformados em ácido láctico, pelas bactérias, e em etanol pelas leveduras. Devido à liberação de CO 2, formam-se bolhas que conferem porosidade e leveza à massa. Além de acelerar o crescimento, a preparação de um pé de massa permite a seleção e o enriquecimento dos microrganismos dos cereais. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

205 BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS FIGURA A panificação A massa também pode levar outros ingredientes, tais como gordura, açúcar, leite em pó, ovos, mel, xaropes, frutas, especiarias etc. Farinhas Água Leveduras Enzimas Outros Aditivos Mistura dos ingredientes Fermentação principal Divisão da massa Fermentação secundária Fermentação final Boleamento Moldagem Cozimento Resfriamento Corte em fatias Embalagem e distribuição Durante muitos séculos, a preparação do pão envolvia, necessariamente, o processo natural de fermentação, de modo que cada padeiro tinha que preparar seu pé de massa. A passagem do procedimento artesanal à panificação industrial ocorreu em 1876, nos Estados Unidos, com a produção e venda de cubos de levedura prensada, mediante um processo patenteado pelos imigrantes austrohúngaros Charles e Max Fleischmann. Atualmente, comercializam-se três tipos de fermento biológico (levedura Saccharomyces cerevisiae) para a panificação: o fermento prensado ativo, com 68-72% de umidade, que requer refrigeração durante o armazenamento e dura entre três e cinco semanas; o fermento seco não ativo, que se conserva mais tempo e não exige refrigeração, mas deve ser hidratado antes de usar; e o fermento ativo instantâneo, que não requer hidratação e pode ser adicionado diretamente aos ingredientes secos. Neste campo, as inovações não são bem aceitas. Na década de 1990, comercializaram-se no Reino Unido linhagens obtidas por engenharia genética. Apesar de fermentar o pão rapidamente, facilitando a vida e o sono dos padeiros, o seu uso foi logo descontinuado, principalmente devido à pouca aceitação dos consumidores. Apesar de alguns padeiros conservarem a prática da fermentação natural, os processos artesanais estão desaparecendo, substituídos pela tecnologia da panificação industrial. Prepara-se a massa misturando farinhas de um ou mais tipos, água, leveduras e diversos aditivos: emulsificadores, agentes oxidantes e redutores, enzimas (e -amilases, hemicelulases, lipases etc.) e aceleradores da fermentação. 195

206 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) O processo fermentativo envolve várias etapas, durante as quais o CO 2 liberado forma bolhas que, retidas na massa, aumentam seu volume. Entre uma e outra etapa, a massa é dividida e boleada, facilitando a redistribuição dos ingredientes e o desenvolvimento das características organolépticas. A moldagem visa o alinhamento das fibras proteicas do glúten. Durante a cocção, a mistura etanol-água se transforma em vapor, e a crosta adquire uma cor dourada. A seguir, os pães são cortados e embalados (Figura 15.1). O VINHO A VINIFICAÇÃO O vinho é uma bebida proveniente da fermentação alcoólica da uva, originada no norte da África e na Europa, por volta de 3000 a.c. Durante o amadurecimento da uva, várias espécies microbianas se sucedem, primeiro transformando os açúcares em etanol e, posteriormente, o etanol em ácido acético. Considerando que o destino natural da uva é o vinagre, a arte da vinificação representa um ganho tecnológico indiscutível. A uva é composta por água (86%), açúcares fermentescíveis (12%) e moléculas diversas (2%). Retirase o sumo espremendo ou prensando a polpa, sendo frequente o agregado de enzimas de maceração (pectinases, celulases e hemicelulases) para melhorar o rendimento. O agente biológico da fermentação alcoólica é a levedura Saccharomyces ellipsoidea, que se encontra na pele da uva. Salvo na produção artesanal, a fermentação não depende das leveduras naturais da uva; a indústria vitivinícola conta com um leque amplo de linhagens, selecionadas para favorecer o processo fermentativo. Na vinificação, monitora-se cuidadosamente a fermentação alcoólica, até a conclusão do processo. Procede-se então a duas trafegas, entre as quais ocorre uma segunda fermentação, denominada fermentação malolática. Esta etapa, que é uma das mais complexas na elaboração dos tintos, se deve à ação de bactérias lácticas, como Oenococcus oeni, que transformam o ácido málico (diácido) em ácido láctico (monoácido). Em consequência da fermentação malolática, a acidez do vinho diminui e aparecem as primeiras modificações aromáticas. Posteriormente, o vinho é clarificado e colocado para envelhecer em tonéis ou garrafas, até o total desenvolvimento do buquê. A obtenção de um vinho tinto ou branco depende basicamente do tipo de uva e do procedimento seguido (Figura 15.2). Se quisermos obter vinho branco, utilizaremos uvas brancas ou tintas sem a pele ou casca que as recobre. As uvas tintas com pele originam vinhos tintos, porque esta libera compostos fenólicos (antocianinas, flavonas, taninos). O CULTIVO DA VIDEIRA Existem diferentes espécies de videiras. A Vitis vinifera fornece os vinhos mais finos, enquanto a Vitis labrusca, a Vitis ripari e outras variedades mais rústicas da própria Vitis vinifera são utilizadas para a elaboração de vinhos comuns. Para cada cultivo, existe uma combinação de solo e clima ideais, denominada terroir, sem a qual dificilmente se obterão os melhores resultados. Alguns vinhos resultam da mistura de uvas diferentes, sendo chamados vinhos genéricos ou de corte. Os que são elaborados a partir de uma única variedade denominam-se varietais. Esta categoria inclui nomes como Pinot Noir, Chardonnay e Pinot Blanc (vinhos de Borgonha), Cabernet-Sauvignon (vinhos de Bordeaux), Alvarinho (vinhos de Portugal e Galícia), Tempranillo (vinho da ribeira do Douro), Sangiovese (vinhos de Chianti) e Zinfendel (vinhos da Califórnia). Observe-se que, dependendo do processo utilizado para a elaboração do vinho, a partir de uma variedade de uva como a Pinot Noir poderão ser obtidos vinhos tão diferentes como um Borgonha ou um Champanhe. Em 2007, um grupo franco-italiano completou o mapa do genoma da Vitis vinifera, variedade Pinot 196

207 BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS Noir. A informação abrange mais de genes, muitos dos quais respondem pelos aromas e sabores dos vinhos, e outros regulam a quantidade de resveratrol, uma molécula que diminui os níveis de colesterol. Os estudos genômicos abrem numerosas perspectivas para os viticultores. Uma aplicação importante é o monitoramento da maduração da fruta, mediante arrays de marcadores moleculares, possibilitando a escolha do momento adequado para a vindima FIGURA A vinificação Vinificação em tinto O mosto obtido por esmagamento da uva tinta passa para a cuba de fermentação, uma vez corrigidas a acidez e a quantidade de açúcar. Depois da primeira fermentação (fermentação alcoólica), separa-se, por trasfega, o mosto da borra. Inicia-se a segunda fermentação (fermentação malolática). Depois de clarificado, o vinho deve aguardar dois anos até estabilizar e ser engarrafado. Os vinhos rosados ou rosés são obtidos seguindo um procedimento semelhante, mas deixando macerar durante menos tempo o mosto com as cascas de uva. Também é possível consegui-los misturando vinhos brancos e tintos. Vinificação em branco O mosto é obtido por esmagamento de uva branca ou de uva tinta sem casca, sem permitir a maceração. Salvo em alguns vinhos brancos de Borgonha, evita-se a fermentação malolática. Os vinhos espumantes (Champagne, Cava, Prosecco) passam por uma segunda fermentação alcoólica na garrafa. Uva tinta Uva branca Desengaçamento e esmagamento Desengaçamento e esmagamento Maceração Inoculação Inoculação Fermentação alcoólica Fermentação alcoólica Fermentação malolática Clarificação Clarificação Envelhecimento Engarrafamento Engarrafamento Vinho tinto Vinho branco 197

208 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) O cultivo da videira é uma tarefa complexa que exige tratamentos, enxertos e podas. Os viticultores praticam a multiplicação vegetativa das videiras, o que garante uma qualidade constante, porém aumenta a susceptibilidade da plantação aos patógenos. Espera-se que os estudos genômicos permitam identificar e selecionar genes de resistência a algumas das enfermidades que afetam as videiras. A transferência de genes de resistência de uma variedade a outra é vista com muita desconfiança pelos produtores, porque o rótulo de varietal é parte da estratégia de vendas dos vinhos de qualidade. Contudo, alguns produtores consideram aceitável a transferência de genes de videiras rústicas para plantas de elite, com o objetivo de melhorar a produção. Com a entrada no mercado internacional de países menos apegados às tradições (Estados Unidos, Chile, Argentina, Brasil, África do Sul, Austrália etc.), pode ser que as novas tecnologias genômicas se apliquem na produção de plantas resistentes a doenças e pragas. O ROL DA LEVEDURA NA VINIFICAÇÃO Embora as propriedades organolépticas dos vinhos dependam basicamente do cultivar escolhido, as enzimas da uva e as atividades metabólicas microbianas cumprem, também, um papel importante. A transformação do mosto em vinho envolve inúmeras reações químicas, desenvolvidas por leveduras e bactérias lácticas. Com o mapeamento do genoma de ambos os microrganismos, e a construção de microarrays adequados, estas reações poderão vir a ser bem conhecidas e controladas. Existe a tendência, na indústria moderna, de substituir as leveduras selvagens por leveduras enológicas selecionadas. Contudo, alguns produtores consideram que estas últimas massificam a qualidade do vinho, preferindo utilizar as leveduras nativas e obter assim um produto original qualitativamente diferente dos outros. Bancos de leveduras nativas facilitam a preservação da biodiversidade. Recentemente, duas linhagens de leveduras geneticamente modificadas fizeram sua entrada na indústria de vinhos dos Estados Unidos e Canadá. Trata-se da levedura ML01, que realiza ambas as fermentações (alcoólica e malolática), evitando a produção de histaminas e da levedura ECMo01 que degrada a ureia, impedindo a formação de uma substância carcinogênica. A CERVEJA As bebidas fermentadas representam uma opção saudável, na falta de água ou no caso de ela estar contaminada. Todos os povos elaboraram alguma bebida fermentada a partir dos elementos de seu entorno, fossem grãos, frutas, raízes, caules ou folhas. Em 4000 a.c, os habitantes das margens dos rios Tigre e Eufrates (Mesopotâmia) preparavam 20 variedades de cerveja a partir de um procedimento bem simples. Esmigalhava-se o pão de cevada em um recipiente com água açucarada e, uma vez concluída a fermentação, a bebida era filtrada e transvasada a outro recipiente. Os procedimentos melhoraram a partir do século VII, quando os frades introduziram algumas inovações, como incluir diferentes tipos de ervas, uma prática que culminou com a adição de lúpulo, no século XI. A descoberta da técnica de fermentação baixa, no século XIV, deu maior estabilidade à bebida. Os trabalhos de Pasteur e o progresso da Microbiologia permitiram, no século XIX, o desenvolvimento de uma poderosa indústria, cuja produção mundial supera os milhões de hectolitros por ano. A fabricação da cerveja começa com a maltagem, um processo em que os grãos de cevada germinados são secados e moídos. O malte assim obtido contém as enzimas desenvolvidas durante a germinação, capazes de catalisar a transformação do amido em açúcares fermentescíveis (Figura 15.3). Este processo é indispensável porque, não tendo amilases, as leveduras não fermentam o amido. 198

209 BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS Na brasagem o malte é misturado com água, possibilitando a digestão do amido por ação enzimática. Mais tarde o mosto é filtrado e fervido, sendo então acrescentadas as flores de lúpulo (Humulus lupulus, da família das Canabináceas) que, além de ter uma ação antisséptica, conferem à bebida seu sabor amargo característico. A maltagem e a brasagem são atividades prévias à fermentação alcoólica, que será conduzida por leveduras (Saccharomyces cerevisiae e Sacharomyces carlbergiensis). Os processos mais tradicionais utilizam leveduras que se acumulam no topo da cuba, originando as cervejas do tipo ale, com menos de 4% de álcool. Contudo, existem outras leveduras que sedimentam no fundo, gerando as cervejas de tipo lager, com mais de 6% de álcool. Uma vez concluída a fermentação do mosto, este recebe os tratamentos finais que consistem em maturação, clarificação, carbonatação, pasteurização e engarrafamento. No momento, a tecnologia do DNA-recombinante se limita a transformações com genes do mesmo gênero (Saccharomyces), visando conseguir linhagens mais eficientes em relação ao processo fermentativo, adequadas à cevada e ao lúpulo de diferentes regiões do mundo. Até o momento, essas linhagens não são utilizadas comercialmente FIGURA As etapas da produção de cerveja. Maltagem (Maceração, germinação secagem e moagem do malte) Brasagem (Mistura, filtração e fervura do mosto) Cevada Malte Mosto Fermentação alcoólica Acabamento (Amadurecimento, pasteurização e engarrafamento) Cerveja Comercialização OS QUEIJOS E IOGURTES A PRODUÇÃO DE LATICÍNIOS As raízes da produção de laticínios remontam ao ano 3000 a.c. (Oriente Médio), quando o homem comprovara que o leite mudava de consistência e de sabor ao azedar. O soro podia ser consumido fresco, e a adição de sal ao coágulo o conservava por mais tempo. Em torno de a.c., a utilização de estômagos de cabras e de ovelhas, como recipientes para o leite, permitiu obter queijos mais 199

210 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) sólidos e robustos. Mais tarde, os romanos introduziram extratos de plantas, como o figo, para coagular o leite. A explicação destes fenômenos é simples. As bactérias que normalmente se encontram no úbere dos animais contaminam o leite, proliferando e formando ácido láctico. Nesse meio ácido, as proteínas precipitam, separando-se do soro. A coagulação também ocorre em presença das enzimas renina e pepsina, da mucosa estomacal, e da ficina, do figo. Hoje, a produção mundial de leite fermentado (iogurte, coalhada, quefir etc.) é de três milhões de toneladas por ano, enquanto a de queijos chega a 15 milhões de toneladas por ano (Figura 15.4 A). Várias espécies bacterianas podem fermentar o leite: Streptococcus thermofilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Streptococcus lactis, Bifidobacterium bifidum etc. A maioria dos produtos vendidos como leite fermentado contém um número alto de microrganismos vivos; sendo consumidos como probióticos, para prevenir o desenvolvimento de outros microrganismos indesejáveis ou patogênicos no tubo digestivo. Todos os queijos passam por três etapas: a coagulação, o dessoramento e a maturação (Figura 15.4 B). No entanto, a tecnologia de produção de queijos permite uma série de variações, que se traduz em mais de 400 tipos diferentes. Algumas dessas variações são a origem do leite (vaca, cabra, ovelha, búfalo), o agente da coagulação (calor, enzimas, bactérias lácticas ou ambas), a umidade e consistência (mole, semiduro, duro e muito duro) e a maturação. Muitos países aceitam 35 variedades, definidas por regras internacionais. O ROL DE MICRORGANISMOS E ENZIMAS A produção de queijos envolve a acidificação do meio pelas bactérias lácticas, geralmente Lactococcus lactis e Streptococcus thermophilus. O coalho, uma substância extraída do estômago de bezerros, foi utilizado, durante séculos, como agente da coagulação enzimática, mas sua obtenção ficou cada vez mais cara e difícil. Para estabilizar a produção, e satisfazer a maior demanda pelos produtos lácteos, transferiu-se o gene da renina a uma bactéria (Escherichia coli) e, mais tarde, a uma levedura (Kluyveromyces) e um mofo (Aspergillus). Além da enzima produzida (quimosina) ser mais pura que a renina, os suplementos são constantes, aumentando a eficiência da produção de laticínios e diminuindo os custos. O desenvolvimento de bactérias e fungos durante a maturação confere suas características típicas a alguns queijos como, por exemplo, a presença de olhaduras produzidas por Propionabacterium no Gruyère, ou de um manto branco de Penicillium no Camembert e no Brie ou, ainda, as estrias azuis de Penicillium no Gorgonzola ou no Roquefort. O melhoramento de bactérias lácticas visa a obtenção de linhagens mais estáveis, resistentes aos vírus bacteriófagos, e produtoras de bacteriocinas, que são substâncias com atividade antimicrobiana. Linhagens capazes de liberar mais rapidamente suas enzimas poderiam acelerar o processo de formação de aromas. Com o mapeamento do genoma, espera-se uma intensificação das pesquisas nessa direção. O sequenciamento de várias linhagens de Streptococcus thermophilus, na década de 2000, revelou a presença de sequências CRISPR, relacionadas com a infecção por bacteriófagos, sugerindo a existência de um mecanismo de defesa bacteriano. Exposta a um vírus, a bactéria integra algumas de suas sequências gênicas; em um contato posterior essas sequências servirão como guia para a destruição de qualquer DNA semelhante. O trabalho fora iniciado na empresa Danisco, posteriormente adquirida por DuPont, que acumula várias patentes. A edição gênica é a técnica mais recente disponível para conseguir a resistência das bactérias da indústria de laticínios aos bacteriófagos, uma ameaça que causa grandes perdas. 200

211 BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS FIGURA A produção de laticínios A. Iogurte tradicional e iogurte batido. As variações dependem de acréscimos (açúcar, frutas etc.) e de modificações de consistência (cremoso, firme, batido). Leite + leite em pó (+ açúcar) Pasteurização Inoculação com lactobacilos Preenchimento das embalagens Fermentação láctica Fermentação láctica Resfriamento Agitação (+ adição de frutas) Preenchimento das embalagens Iogurte tradicional Iogurte batido Comercialização Comercialização B. Queijo. Os agentes biológicos intervêm nas etapas de coagulação e na maturação de alguns produtos. Leite Pasteurização Inoculação com lactobacilos, coalho ou enzimas e adição de CaCl 2 Fermentação láctica Coagulação Dessoramento Enformagem, prensagem, viragem e salga Inoculação com fungos e/ou bactérias Maturação Embalagem e comercialização 201

212 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A PROTEÍNA DE CÉLULA ÚNICA Em um sentido amplo, o termo SCP (do inglês single cell protein) se refere à proteína bruta ou refinada, originada pelo crescimento de bactérias, algas, fungos ou mofos. De fato, os microrganismos são muito mais produtivos que os animais de criação. Enquanto uma vaca produz 200 g de proteína por dia, os microrganismos, teoricamente, podem produzir 25 toneladas, no mesmo tempo e em condições ideais. Nas décadas de 1960 e 1970, especulava-se com a utilização de derivados do petróleo como matéria-prima para o crescimento microbiano, mas, com a crise dos anos 1980, a ideia de um bife de petróleo foi abandonada. Atualmente utilizam-se como substrato os excedentes e os restos agrícolas ou industriais, e a maioria dos processos visa o enriquecimento de rações animais. A introdução de proteína microbiana na alimentação humana demanda um processo extra de purificação, por ter um conteúdo de ácido úrico muito alto. Contudo, a empresa Ranks Hovis McDougall (RHM) conseguiu um produto, denominado Quorn, adaptado para a nutrição humana, utilizando o fungo Fusarium graminearum. Comercializado no Reino Unido, o alimento apresenta um alto teor proteico (45%), uma composição em aminoácidos parecida com a da carne de vaca, um alto conteúdo de fibras e uma quantidade aceitável de ácidos nucleicos (1%). Por não ter cheiro ou sabor, o produto pode ser utilizado como substituto de peixe, frango ou carne. A semelhança dependeria do comprimento das fibras. OS ADITIVOS OS DIVERSOS TIPOS A adição de algumas substâncias nos alimentos tem diversos objetivos como, por exemplo, conserválos por mais tempo (antibióticos, ácido acético, ácido láctico, etanol), complementar seu valor nutritivo (vitaminas, aminoácidos) ou mudar a consistência (gomas e enzimas). Os aditivos também são usados para melhorar a cor e o flavor, um termo que abarca o aroma, o sabor e a textura. Apesar da má fama que os acompanha, só uma em pessoas apresenta alergia e intolerância aos aditivos, um número baixo, considerando que uma pessoa em 50 é alérgica ou intolerante a algum alimento. Os principais aditivos utilizados pela indústria de alimentos são os ácidos cítrico e láctico, alguns corantes naturais ( -caroteno, riboflavina), flavorizantes (monoglutamato de sódio, extrato de levedura, aromas), gomas espessantes (xantana, gelana, dextrana), antioxidantes ( -caroteno), vitaminas (B 2, B 12, Biotina), enzimas e antibióticos. Alguns desses aditivos são obtidos em culturas de células vegetais. Outros têm uma origem microbiana, sendo utilizadas linhagens de microrganismos geneticamente modificados para sua produção industrial. Vimos, anteriormente, o importante rol desempenhado por algumas enzimas na produção de alimentos e bebidas por fermentação. Falta destacar o uso da lactase na elaboração do leite deslactosado, um produto dirigido às pessoas com intolerância à lactose. E da pectinase, que, junto com celulases e amilases, facilita a extração do suco de frutas retido na pectina, sendo também utilizada na clarificação do suco. Finalmente, entre os antibióticos usados para conservar alimentos, citaremos a Nisina (INS234), que inibe o crescimento de bactérias Gram-positivas em queijos, salsichas e produtos cozidos de origem avícola, e também a Natamicina ou Pimaricina (INS235), utilizada como conservante na superfície de produtos cárneos embutidos. 202

213 BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS FIGURA A produção de xarope de frutose A hidrólise e a sacarificação do amido produzem glicose; esta é transformada em frutose pela enzima glicose-isomerase, imobilizada em um biorreator. Amido de milho, batata ou trigo Amilases e glicoamilases Hidrólise e sacarificação Glicose Isomerização (Invertase imobilizada) Frutose OS ADOÇANTES Outro caso interessante é o dos adoçantes. O aspartame (ácido aspártico e fenilalanina) é consumido para limitar a ingestão de calorias, e o xilitol, para diminuir a incidência de cáries dentárias. Outros, como o xarope de glicose ou de frutose, substituem o açúcar na indústria de alimentos. A hidrólise ácida ou enzimática ( -amilase e glicoamilase) do amido do milho produz xaropes de maltose e de glicose. Já a ação enzimática da lactase sobre o soro das indústrias de laticínios origina um xarope de dextrose (glicose, galactose). Uma vez refinados e concentrados, esses xaropes podem ser usados como ingredientes na elaboração de produtos alimentícios (biscoitos, sorvetes etc.). O poder adoçante da glicose é menor que o da frutose, mas a transformação enzimática (invertase ou glicose isomerase) transforma uma em outra (Figura 15.5). O resultado é um xarope (42% de frutose, 52% de glicose), que pode ser concentrado por métodos cromatográficos, até alcançar um teor de 90% de frutose. A indústria de refrigerantes substitui a sacarose pelo xarope de frutose, com uma concentração de 55%, obtido mediante a mistura dos dois tipos. O processo começou a ser estudado na década de 1960, sendo o custo da glicose-isomerase o principal fator limitante da tecnologia. Com o desenvolvimento das técnicas de imobilização enzimática, o processo tornou-se econômico, possibilitando o uso do amido proveniente de cereais excedentes, mas, por outro lado, prejudicou os países produtores de açúcar, que viram diminuir a demanda por este produto. O descobrimento de um gene microbiano capaz de transformar a sacarose em cadeias curtas de frutose (fructanos), com o mesmo gosto e desprovidas de calorias, indica que novos produtos poderão entrar em breve no mercado de adoçantes. OS ALIMENTOS BIOFORTIFICADOS Combate-se a fome de uma população dando-lhe acesso aos alimentos. Contudo, a falta total de alimentos é, hoje, um fenômeno menos frequente que a desnutrição, por carência de determinados nutrientes na dieta. Descrita magistralmente por Josué de Castro, na década de 1950, essa fome 203

214 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) parcial, ou fome oculta, ainda afeta mais da metade da população mundial, fundamentalmente mulheres e crianças, sendo a causa de diversas doenças. Segundo a Organização Mundial da Saúde, o ferro, o zinco e a vitamina A são as principais deficiências nutricionais dos países em desenvolvimento. A estratégia tradicional consiste em suplementar os alimentos industrializados com os nutrientes correspondentes. Existem outras possibilidades, tais como a fertilização dos solos e, consequentemente, o enriquecimento das culturas de base. Contudo, o melhoramento genético parece ser a estratégia mais promissora para aumentar as concentrações de nutrientes nas culturas de base (arroz, milho, trigo, feijão, mandioca e batata-doce). A engenharia genética pareceria, a priori, a via mais rápida para fortificar os alimentos. Porém, os empecilhos legais encontrados pelo arroz com provitamina A (Golden Rice), que conta com mais de 10 anos pronto sem ter sido comercializado, desestimulam a escolha dessa tecnologia. Na biofortificação dos cultivos são utilizadas outras tecnologias com base biológica. Nos Bancos de Germoplasma do CGIAR já foram encontradas variedades de feijão com maior conteúdo de ferro, de arroz e trigo com altos níveis de zinco, de mandioca, milho e batata-doce ricos em vitamina A etc. As novas técnicas de análise genética de traços quantitativos e, especialmente, a seleção assistida por marcadores moleculares facilitam o melhoramento genético das culturas de base. As novas variedades deverão ser altamente produtivas e contar com os nutrientes desejados. Espera-se que contem com a aceitação das populações necessitadas e, também, que os nutrientes sejam assimilados de maneira a melhorar sua condição nutricional. A biofortificação de alimentos é um programa internacional desenvolvido por HarvestPlus (CGIAR), um consórcio de instituições de pesquisa e agências de desenvolvimento que age especialmente na América Latina e na África. No Brasil, a Embrapa Agroindústria de Alimentos participa com o projeto BioFORT, tendo já desenvolvido variedades biofortificadas de feijão e milho. Os primeiros testes estão sendo realizados em Sergipe. SEGURANÇA ALIMENTAR A noção de segurança alimentar está baseada na tradição, de modo que é inevitável que, com o desenvolvimento de uma moderna indústria de alimentos, surjam alguns questionamentos. Atualmente, utilizam-se linhagens microbianas selecionadas (starters) para iniciar as fermentações; ao acabar o processo fermentativo, essas linhagens permanecem no meio, como os lactobacilos dos iogurtes, ou são eliminadas por calor ou filtração, como as leveduras do pão e da cerveja. Apesar de ter passado por uma série de processos seletivos, que as torna muito diferentes geneticamente das linhagens selvagens, as linhagens starters são bem conhecidas e não representam risco algum para a saúde. Classificadas pelas agências internacionais como GRAS (do inglês, generally recognized as safe), essas linhagens são as únicas permitidas na produção de alimentos. Não existem normas explícitas sobre o que seria um OGM food-grade, isto é, um microrganismo transgênico que possa ser utilizado na indústria de alimentos. Alguns aspetos de biossegurança teriam que ser considerados. Um deles seria evitar ou eliminar qualquer gene de resistência a antibióticos que tivesse sido introduzido como marcador seletivo na transferência gênica. O outro diz respeito aos organismos doadores de genes, esboçando-se diferentes critérios. Segundo um critério estrito, para poder ser considerado food grade, um OGM deveria conter exclusivamente DNA da mesma espécie (cisgênico), aceitando-se a presença de pequenos fragmentos sintéticos de DNA, sempre que não codifiquem DNA ou RNA, na construção gênica. Em outros termos, a tecnologia do DNA-recombinante utilizaria microrganismos de diferentes linhagens da mesma espécie. 204

215 BIOTECNOLOGIA E ALIMENTOS Atualmente, tem obtido aceitação um critério mais amplo, permitindo a inclusão de DNA de outros microrganismos alimentares, sob a condição de estes pertencerem ao mesmo grupo de microrganismos que participam no processo como, por exemplo, a transferência de genes das bactérias maloláticas para as leveduras da vinificação. A aceitação de OGMs nos alimentos depende das regulamentações de cada país, bem menos flexíveis na Europa que nos Estados Unidos e no Canadá, onde recentemente fora colocada no mercado uma linhagem de Lactococcus, geneticamente modificada e considerada GRAS. As enzimas cumprem um importante papel em várias das indústrias de alimentos (produção de pães, biscoitos, laticínios, sucos de frutas, bebidas alcoólicas, derivados do amido e de proteínas). Atualmente, mais de 30 enzimas diferentes são utilizadas no processamento de alimentos. A primeira enzima sintetizada por um microrganismo transgênico foi a quimosina, utilizada há anos na produção de queijos, como substituto da renina de origem animal. Hoje, aproximadamente 80% dos queijos são elaborados com quimosina, sendo aceitos pelos consumidores lactovegetarianos. Os microrganismos utilizados para a síntese de enzimas food-grade são organismos pertencentes à categoria GRAS, bem conhecidos e altamente produtivos, aos quais foram transferidos os genes de interesse, mediante engenharia genética. Esses OGMs não estão presentes na preparação final que, depois de purificada, contém exclusivamente a enzima. Essa modalidade produtiva garante à indústria de alimentos várias enzimas seguras e de baixo custo, entre proteases, amilases, lipases, lactases, pectinases, glicose-oxidase, invertases etc. A esse respeito, pareceria haver um consenso amplo, incluindo a Comissão Europeia, que considera que os aditivos (corantes, aromas e flavorizantes), só devem ser rotulados como sendo de origem transgênica se o produto final tiver DNA ou proteína de origem recombinante. A mais alta autoridade internacional sobre os alimentos é o Codex Alimentarius, uma comissão de FAO/WHO, reconhecida por 169 países. Esta Comissão se encarrega de estabelecer uma metodologia que permite analisar a segurança alimentar em relação aos produtos derivados de microrganismos geneticamente modificados 205

216 C A P Í T U L O 16 BIOTECNOLOGIA E NOVOS ALIMENTOS Será transgênico? Quantas vezes temos escutado essa pergunta, imbuída de desconfiança? A resposta nem sempre é fácil porque o termo transgênico é aplicado, no dia a dia, com distinto sentido e em contextos diferentes, aos alimentos geneticamente modificados (AGMs). Mesmo aprovados pelas autoridades correspondentes, poucos AGMs são consumidos diretamente: o milho, a batata inglesa e a berinjela resistentes a insetos, o feijão e a papaia resistentes a vírus e o salmão de crescimento rápido. Os cultivos transgênicos biofortificados, como o arroz com vitamina A (arroz dourado), ainda não foram aprovados FIGURA O que é um transgênico? (1) Feijão resistente a vírus, milho resistente a insetos, salmão de crescimento rápido; (2) Frango; (3) Queijos, Aspartame; (4) Arroz dourado; (5) Óleo de soja; (6) Biscoitos e mistura para bolos. 1. Plantas e/ou animais transgênicos, consumidos como alimento 2. Animais alimentados com rações preparadas com cultivos transgênicos 3. Aditivos (conservantes, adoçantes, modificadores de consistência, complementos, enzimas etc.) produzidos por microrganismos transgênicos. 5. Produtos industrializados, derivados de um cultivo transgênico 6. Produtos industrializados, contendo ingredientes provenientes de cultivos transgênicos 4. Cultivos biofortificados (transgênicos) BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

217 BIOTECNOLOGIA E NOVOS ALIMENTOS A maioria das rações dos animais de criação contém soja e milho transgênicos, isto é, tolerantes a herbicidas e/ou resistentes a insetos. Sua aceitação é cada vez mais ampla, simplesmente porque a quantidade de milho e soja convencional não é suficiente para alimentar os animais de criação. O óleo de soja, utilizado na culinária, é extraído do grão de soja geneticamente modificado, sendo considerado transgênico apesar de não conter DNA. Os alimentos industrializados podem conter alguns componentes de origem transgênica (soja, milho), assim como substâncias produzidas por microrganismos geneticamente modificados (enzimas, aditivos etc.). Contudo, para a maioria das pessoas, as diferenças entre esses alimentos permanecem confusas e o termo transgênico muitas vezes é utilizado em forma pejorativa (Figura 16.1). A ENTRADA DOS TRANSGÊNICOS NA CADEIA ALIMENTAR Basta olhar com atenção as naturezas-mortas dos quadros de pintores de séculos passados para comprovar que os produtos expostos nas prateleiras dos supermercados pouco têm a ver com os vegetais e animais de outrora. Sem conhecimento nenhum das leis da hereditariedade, o homem selecionou as variedades que lhe pareceram mais interessantes, por serem plantas mais produtivas, ter frutos mais saborosos etc. Em princípios do século XX, a Genética deu embasamento científico ao melhoramento vegetal e animal e, a partir da década de 1940, utilizaram-se a radiação e as substâncias mutagênicas para obter novas variedades vegetais, com mais apelo para produtores e consumidores. A seguinte revolução genética ocorreu na década de 1990, com a primeira onda de plantas geneticamente modificadas: milho, soja, algodão e canola. Com traços de tolerância a herbicidas e/ou de resistência a insetos e infecções virais, essas plantas mais produtivas geram mais lucros, sendo aceitas rapidamente pelos produtores agrícolas de vários países. Embora em alguns casos, como o milho, as novas tecnologias diminuíram as contaminações por fungos e melhoraram a qualidade da matéria-prima, a percepção dos consumidores não identificou vantagens diretas. Isso poderia explicar, em parte, a adoção de uma atitude negativa em relação aos organismos geneticamente modificados. MELHORANDO A CONSERVAÇÃO Para despertar o interesse do consumidor seria necessário fornecer-lhe produto com qualidades que o beneficiem diretamente, tais como uma melhor conservação dos frutos. Uma dessas tentativas foi a produção de um tomate com maior durabilidade na prateleira. O tomate amolece com o tempo, tendo que ser colhido ainda verde e transportado rapidamente até o lugar de comercialização, onde a maturação é induzida com etileno. Inativando a enzima responsável pelo amolecimento do fruto, o fruto permanece mais tempo na planta, ganhando cor e sabor. Gerado por tecnologia anti-sense, o primeiro AGM foi o tomate FlavSavr (Calgene Inc.), liberado nos Estados Unidos em 1994 e descontinuado pouco tempo depois, devido a seu custo. Mais tarde, outro tomate de maturação lenta ocupou esse nicho de mercado. Diferentemente do FlavSavr, este tomate, que não é transgênico, teve uma expansão muito rápida, sendo comercializado em vários países com diferentes nomes. Dos AGMs que são consumidos diretamente, poucos foram comercializados: o milho resistente a insetos (em numerosos países), a batata e a berinjela resistentes a insetos (esta última em Bangladesh) e a papaia resistente a vírus, que, na década de 1980, salvara da falência os produtores do Havaí. Nos Estados Unidos, já entraram no mercado as maçãs Arctic Granny e Arctic Golden (Okanagan Specialty Fruits Inc.). Nas duas variedades foi silenciado o gene codificador da enzima polifenol oxidase, que 207

218 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) causa o escurecimento das maçãs. Outro produto aprovado é a batata Innate (J.R.Simplot), uma marca que se aplica a cinco variedades, geneticamente modificadas, para resistir ao míldio e formar menos acrilamida na fritura. MELHORANDO AS PROPRIEDADES INDUSTRIAIS Outra forma de interessar o consumidor é melhorando algumas das propriedades dos alimentos industriais: óleo de canola de composição adequada às frituras; trigo com características especiais para a panificação; ou batata com mais amido para absorver menos gordura ao fritar. Contudo, nem sempre a tentativa esteve acompanhada de sucesso. Um tomate com mais pectina, desenvolvido por Zeneca Plant Science, a partir de variações genéticas detectadas em cultura de tecidos, chegou a ser comercializado no Reino Unido, na década de Esse tomate era utilizado na preparação de massa ou purê de tomate, com menos consumo de energia e menor necessidade de aditivos (espessantes) que o fruto tradicional. O produto resultava mais econômico, para a indústria e o consumidor, sendo vendido pela rede Sainsbury com bastante aceitação. No auge da campanha contra os ALMs (Frankenfoods), o produto teve que ser retirado do mercado. Recentemente aprovado nos Estados Unidos, o salmão AquAdvantage de crescimento rápido poderia encontrar menos aceitação entre os consumidores que entre os aquicultores de outros países, potenciais compradores de alevinos. MELHORANDO AS CARACTERÍSTICAS NUTRICIONAIS Uma terceira forma de chegar ao consumidor seria mediante produtos com melhores características nutricionais: carne e leite com menos gordura, soja e batata com mais proteína, canola com vitamina A, milho com metionina, mandioca e batata sem toxinas, camarão e amendoim sem substâncias alergênicas etc. Também seriam bem-vindos alimentos com melhores propriedades organolépticas, tais como pimentões e melões com mais aroma, ou cebolas que não façam chorar. O consumidor também poderia ser atraído por alimentos com componentes biologicamente ativos, como os antioxidantes do chá verde ou as substâncias capazes de diminuir o colesterol do alho e da cebola. Contudo, os casos analisados a seguir indicam que o problema pode ser muito mais complexo. O arroz é uma planta que não produz vitamina A. Na Ásia, onde este constitui a base da alimentação, a deficiência vitamínica mata 1 milhão de pessoas por ano e causa cegueira irreversível em outras Um grupo de pesquisadores, liderado por I. Potrykus, obteve, na Suíça, mediante a transferência de genes do narciso, um arroz (Golden Rice) com a capacidade de sintetizar o ß- caroteno, que é um precursor da vitamina A. O projeto, que interessa mais os pobres que os ricos, contou com subvenções privadas, e várias das grandes corporações cederam as suas patentes. Apesar de estar pronto desde 1999, o Golden Rice ainda não chegou ao mercado, tais os empecilhos legais encontrados pelos grupos contrários aos transgênicos, que adiam sua distribuição. Se o arroz dourado tivesse sido obtido por vias convencionais, estaria no mercado desde Bem diferente é o caso da soja Vistive (Monsanto), que reúne um traço transferido por técnicas de melhoramento convencionais (baixo teor de ácido linolênico) e um traço de origem transgênica (tolerância ao herbicida Roundup). Com 60% menos de gordura saturada, o produto representa um passo adiante na prevenção de doenças cardiovasculares e de altos níveis de colesterol. Lançado no mercado norte-americano em 2005, empresas como Kellog e Cargill o utilizaram logo na preparação de alimentos com melhor qualidade nutricional. Por se tratar de um nicho promissor, outras variedades com alterações no tipo de ácidos graxos estão a caminho (Soymega, com mais Ômega 3). 208

219 BIOTECNOLOGIA E NOVOS ALIMENTOS A FAVOR OU CONTRA? O homem não se alimenta exclusivamente por motivos fisiológicos. Escolhem-se os alimentos em função da satisfação sensorial, emocional e afetiva que se espera obter, sendo determinante o peso das considerações econômicas. A seleção dos alimentos ocorre dentro de uma tradição sociocultural, que inclui a noção do que é saudável, um conceito mal definido e cambiante. Por essas razões, a pergunta do título banaliza uma questão complexa e reflete a falta de consenso sobre o tema. Seja qual for a resposta, ela estará atrelada ao momento histórico que vivemos e às nossas concepções políticas, econômicas e sociais. Nossa atitude depende da confiança depositada no conhecimento científico e no progresso tecnológico, em função da qual os novos alimentos serão vistos como produtos interessantes ou como uma ameaça. Apesar da subjetividade que rodeia a questão, alguns dados precisos ajudam a compreender melhor a origem e os alcances da polêmica. Em 1996, culmina na Europa a crise da vaca louca. Em 1997, a União Europeia aprova o milho resistente à broca de Novartis, portador de um gene marcador de resistência a ampicilina. Em 1999, estoura na Bélgica o escândalo dos frangos contaminados por dioxinas. No mesmo ano, A. Pusztai faz uma comunicação mediática sobre a toxicidade de batatas transgênicas (não comerciais) em ratos, que nunca foram confirmadas. Seja como for, a percepção pública é de insegurança alimentar, possibilitando a formação de uma oposição feroz. De um lado, estavam as empresas de biotecnologia, ligadas a poderosos conglomerados multinacionais e com interesses econômicos muito bem definidos. Do outro, as redes de distribuição de alimentos (Carrefour, Mark & Spencer), associadas aos ambientalistas (Greenpeace, Friends of Earth) e aos produtores agrícolas (Confédération Paysanne). Com uma bem-sucedida campanha de marketing ( não queremos frankenfood ), essas redes aproveitaram a oportunidade para impulsionar seus próprios produtos e lançar suas próprias marcas. Sem argumentações baseadas em princípios científicos, a discussão acirrou o enfrentamento entre partidários e oponentes dos AGMs. Os termos progressista e reacionário foram usados indiscriminadamente por ambos os grupos, esquecendo que o dissenso e a discussão fazem parte das sociedades democráticas. Infelizmente, nessa campanha, queimaram-se comércios, laboratórios de pesquisa e campos com cultivos experimentais. Os fatos continuam sendo preocupantes porque, se nos países ricos da União Europeia não faltam alimentos, e a escolha de uma tecnologia pode depender de considerações econômicas ou ideológicas, nos países mais pobres, a adoção ou rejeição de uma tecnologia é uma decisão que pode ter gravíssimas consequências para sua população, condenando-a inclusive à fome. Na Zâmbia (2002) e em Angola (2004), os governos rejeitaram o milho, enviado como ajuda humanitária para alimentar a população, argumentando que era transgênico. Outros países africanos também chegaram a proibir a importação de AGM (Malaui, Moçambique e Zimbábue). O QUE O CONSUMIDOR PRECISA SABER A NOÇÃO DE SEGURANÇA A noção de segurança alimentar costuma ser bastante flexível. Quando introduzida na Europa, a batata foi vista como um alimento perigoso. A pasteurização do leite teve opositores ferrenhos, argumentando que alteraria a qualidade de um alimento saudável. O amendoim é considerado seguro, mas pode não sê-lo se estiver contaminado com fungos. Muitas pessoas são alérgicas ao kiwi, introduzido recentemente no Ocidente. Algumas pessoas continuam ingerindo gorduras em quantidade, mesmo sabendo que são perigosas. 209

220 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Todos os AGMs comercializados atualmente foram devidamente analisados, e aprovados, no país de origem. Milhões de consumidores os consomem há duas décadas, entre norte-americanos, canadenses, sul-africanos, brasileiros, argentinos e chineses. E vários Comitês Científicos, Prêmios Nobel, Academias de Ciências e organizações internacionais concluíram que os AGMs disponíveis são tão seguros quanto os alimentos tradicionais. Porém, frente a uma intensa propaganda e recebendo opiniões contraditórias, o consumidor consciente acaba sentindo-se inseguro sobre várias questões. A INGESTÃO DE DNA A ingestão de DNA, per se, não é perigosa. Este é um componente de nossos alimentos: um tomate tem 7mg de DNA, uma banana, 50 mg, e um sanduíche, 60 mg. Esse DNA é digerido normalmente, junto com os outros componentes dos alimentos. Em relação ao AGM, calcula-se que uma vaca de 600 kg consumindo uma ração composta por milho geneticamente modificado, ingeriria 600 mg de DNA por dia, dos quais 1,5 mg seria DNA recombinante, o que corresponde a 0,00024% do DNA ingerido diariamente na ração, uma proporção muito baixa. Até o momento, não há evidência alguma de transferência do DNA ingerido ao homem. Alguns fragmentos muito pequenos e degradados de DNA podem ser encontrados no plasma sanguíneo e no espaço intercelular. Denominado cfdna (do inglês, cell-free DNA), sua origem são as células dos alimentos digeridos no intestino e as células mortas dos tecidos em redor. Esses pequenos fragmentos do cfdna não entram nas células; se isso acontecesse, ter-se-iam encontrado sequências de nossos alimentos integradas no genoma. OS MARCADORES DE RESISTÊNCIA A ANTIBIÓTICOS Tampouco temos evidências de transferência in vivo do DNA ingerido aos microrganismos do intestino. Porém, os estudos in vitro indicam que, mesmo em uma frequência extremamente baixa, essa transferência poderia ocorrer. Apesar de sabermos que, se uma bactéria tivesse se tornado resistente, sua implantação no trato digestório só poderia ocorrer na presença do antibiótico como agente seletivo, a utilização de marcadores de resistência a antibióticos no transgene é uma crítica razoável (Figura 16.2) FIGURA A estrutura de um transgene Para garantir a seleção e a expressão da sequência codificadora que será transferida, deve-se construir em redor uma estrutura complexa que, além de um promotor e uma sequência terminal, inclui um gene marcador. Gene marcador Promotor Transgene Sequência terminal 210

221 BIOTECNOLOGIA E NOVOS ALIMENTOS Geralmente, os marcadores utilizados são antibióticos sem uso clínico, e para os quais já se encontrou resistência nas bactérias intestinais, de maneira que a transferência do marcador não mudaria a situação. Considerando que já existe a tecnologia apropriada, a recomendação das agências internacionais é de substituir ou eliminar esse tipo de marcadores. Alguns produtos, como o milho MON810 (YieldGard, Monsanto) e o milho LY038 (Renessen LLC), já não levam marcadores seletivos. A COMPOSIÇÃO QUÍMICA Em relação aos produtos comercializados, o AGM tem a mesma composição química e o mesmo valor nutritivo que o alimento convencional equivalente. No caso de um AGM que sintetize uma vitamina extra, por exemplo, a situação é diferente e não pode ser considerado igual ao alimento convencional, sendo necessários estudos adicionais. A PRODUÇÃO DE TOXINAS Outra preocupação diz respeito à produção eventual de toxinas. Sabe-se que, para sua defesa, as plantas sintetizam substâncias químicas que podem ser tóxicas para o homem ou os animais. Uma delas é a toxina do Bacillus thuringiensis que, por ser prejudicial para os insetos e inócua para o homem, é utilizada sem problemas nas lavouras orgânicas, há mais de 50 anos. Normalmente, a presença de uma toxina é investigada mediante ensaios biológicos em diversas espécies de animais, alimentados durante um tempo com o produto transgênico. Os ensaios são complementados com estudos de anatomia patológica. A avaliação toxicológica dos AGMs comercializados não detectou efeitos adversos. A PRODUÇÃO DE ALÉRGENOS As alergias alimentares caracterizam-se pela hipersensibilidade a uma ou mais proteínas, que desencadeiam reações diversas, tais como urticária, vômito ou diarreia. Sua incidência é de 1-2% em adultos e 5% em crianças, sendo provocadas principalmente por trigo, leite de vaca, ovos, peixe, amendoim e soja. A transgênese ou a edição de genes poderão vir a melhorar a qualidade dos alimentos, se forem utilizadas como ferramentas para eliminar substâncias sabidamente alergênicas dos alimentos. Mas não é essa a preocupação do consumidor; seu o temor é que o transgene sintetize alguma proteína capaz de desencadear alergias. Uma mesma proteína pode ser inócua para uma pessoa e alergênica para outra, sendo impossível prever o efeito que ela terá em uma terceira. Entretanto, sabendo que alguns alimentos são mais alergênicos que outros, deve-se ter cuidado em relação à origem do transgene. Um projeto citado frequentemente é o da transferência à soja de um gene da castanha-do-pará, com o objetivo de melhorar suas qualidades nutritivas. Porém, frente à possibilidade de induzir reações alérgicas, em pessoas sensíveis à castanha-do-pará, o projeto foi descontinuado sem que essa soja saísse do laboratório. É sabido que o risco de uma proteína ser alergênica aumenta se esta apresentar determinadas sequências de aminoácidos, se ela se degradar lentamente no tubo digestivo ou se permanecer estável durante o processamento industrial. Estas características são passíveis de estudos, havendo diretrizes internacionalmente aceitas para a avaliação de alergenicidade. Complementa-se a informação mediante análises laboratoriais com os anticorpos de pessoas sensibilizadas e, também, mediante testes em animais, capazes de desenvolver alergias aos mesmos tipos de alimentos que os seres humanos. 211

222 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Em 2000, o milho Star Link (2000), liberado nos Estados Unidos para compor rações animais, contaminou tortillas e tacos destinados ao consumo humano. Nenhuma das denúncias de alergia à proteína correspondente fora confirmada, mas restou uma lição bem clara em relação à biossegurança: não se pode liberar um cultivo para ração se este for inadequado para seres humanos. O risco de alergenicidade dos AGMs comercializados até agora não é maior que o dos alimentos convencionais. Observe-se que esses alimentos passaram por testes que nunca foram aplicados no arroz, no milho, na batata ou no kiwi, uma fruta introduzida recentemente no Ocidente e que provou ser altamente alergênica. O RISCO DE CÂNCER Recentemente, o pesquisador francês G-E. Séralini (2012) noticiou ter detectado tumores em ratos alimentados com milho geneticamente modificado. Devido a erros no desenho experimental e ao uso de uma linhagem de ratos, especialmente selecionada para o desenvolvimento de tumores, o artigo de Séralini teve que ser retirado, em 2013, da revista Food and Chemical Toxicology. Em 2014, o trabalho de Séralini foi publicado novamente em outra revista (Environmental Sciences Europe). O posicionamento prévio de Séralini em relação aos transgênicos, assim como sua relação com organizações interessadas economicamente no banimento dos ALMs, são públicos. É lamentável que, mesmo totalmente desqualificados pela comunidade científica, esses trabalhos sejam citados como prova do perigo das rações e dos alimentos transgênicos. A UTILIZAÇÃO DE UM PROMOTOR VIRAL (CaMV) Na construção de um transgene, colocam-se sequências promotoras para determinar quando, onde e como irá se expressar a proteína codificada. Alguns pesquisadores manifestaram sua preocupação com a utilização do promotor do vírus do mosaico da couve-flor (CaMV), considerando que sua transferência horizontal de uma planta transgênica às células do aparelho digestório poderia ativar outros genes não virais (oncogenes). Essa preocupação não tem maiores fundamentos, dado que o promotor CaMV é detectado em 14 a 25% da produção de canola, de couve-flor e de repolho convencionais, sendo ingerido pelo homem em quantidades consideráveis, faz décadas, e sem nenhum efeito reconhecido. OUTROS EFEITOS A inserção de várias cópias gênicas em diferentes lugares do genoma poderia gerar a ativação ou desativação de outros genes, gerando no organismo geneticamente modificado algum tipo de alteração que não fora previsto. Até agora, não fora registrado nenhum efeito deste tipo nos produtos comercializados, e os avanços tecnológicos (sequenciamento, microarrays) permitem excluir essa possibilidade. PERSPECTIVA HISTÓRICA Nem os alimentos convencionais, incluídos os orgânicos, nem os que foram obtidos por por radiação ou técnicas genéticas clássicas passam por uma avaliação de risco antes de ser oferecidos ao consumidor. Só os AGMs que chegaram a nossa mesa foram devidamente analisados pelas autoridades correspondentes e trilhões de refeições consumidas por milhões de pessoas em diferentes países, durante duas décadas, incluíram algum componente transgênico, sem que fosse registrado um único incidente. 212

223 BIOTECNOLOGIA E NOVOS ALIMENTOS COMO GARANTIR A SEGURANÇA ALIMENTAR? O PRINCÍPIO DE EQUIVALÊNCIA SUBSTANCIAL Antes de comercializar um alimento transgênico, avaliam-se os riscos que este apresenta para os seres humanos, os animais e o ambiente. Assim como não há cidade segura, há cidades mais seguras que outras. O conceito de segurança se estabelece sempre em relação a algum marco de referência. Quando se trata de segurança alimentar, o referencial é o alimento já conhecido e consumido habitualmente. Por isso, antes de chegar ao mercado, os aditivos, os conservantes e os corantes convencionais novos estão sujeitos à aprovação. Assim como qualquer novo ingrediente de origem biotecnológica. Um alimento originado por biotecnologia moderna é tão seguro para o consumo quanto um alimento que tenha a mesma composição, as mesmas características nutritivas e um histórico de uso seguro. Esse é o denominado princípio de equivalência substancial, admitido por numerosas organizações internacionais como FAO (Food and Agriculture Organization), WHO (World Health Organization), OECD (Organization for Economic Cooperation and Development), ILSI (International Life Science Institute). O princípio dá toda a importância ao produto final e não à tecnologia aplicada para sua obtenção. A AVALIAÇÃO DE RISCOS Não é possível dizer que todos os alimentos transgênicos são seguros, nem se este alimento transgênico é seguro. Só podemos afirmar que os alimentos transgênicos podem ser seguros ou não, e que determinado alimento transgênico é tão seguro quanto o seu equivalente. A análise terá que ser feita caso a caso. Por exemplo, o amido de uma batata resistente a vírus é idêntico ao amido de uma batata qualquer. Porque o amido é um carboidrato purificado, sem DNA nem proteína da planta da qual foi extraído. O mesmo raciocínio pode ser feito em relação ao óleo de canola ou de soja. Já no caso da torta de soja ou da espiga de milho, os genes inseridos sintetizam proteínas, e ambos se encontram no produto final, por conseguinte, deve-se analisar se estes podem ter algum efeito no organismo que os ingere. Todos os parâmetros anteriormente citados terão que ser avaliados: a construção do transgene, os efeitos devidos à presença do transgene (eventualmente, substâncias tóxicas ou alergênicas), o valor nutritivo e, também, os efeitos não previstos devidos à presença do transgene. E como em dois organismos, o mesmo gene pode ser inserido em diferentes lugares e de diferentes modos, cada evento deverá ser analisado separadamente. Essa metodologia, denominada análise de risco de alimentos geneticamente modificados para a saúde humana, garante que o alimento, e quaisquer substâncias que resultem da modificação genética, seja tão seguro quanto seu análogo convencional. A ROTULAGEM DOS ALIMENTOS Não há no momento um consenso em relação aos rótulos: em alguns países não há nenhuma regulamentação, em outros se adota o rotulado voluntário ou se estabelecem normas rígidas. Nos Estados Unidos, o sistema está baseado na responsabilidade da indústria e na avaliação de várias agências federais, cabendo à FDA (US Food and Drug Administration) a avaliação da segurança alimentar das novas variedades (vegetais, laticínios, peixes, frutos de mar e aditivos) e à USDA (US Department of Agriculture) a regulação dos produtos cárneos e avícolas, além dos testes de campo de todas as plantas geneticamente modificadas. Tendo a responsabilidade pelo uso de pesticidas 213

224 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) químicos, corresponde à EPA (Environmental Protection Agency) a aprovação das plantas geneticamente resistentes a pragas. Aproximadamente 20 das variedades transgênicas cultivadas estão autorizadas para o consumo humano, nos Estados Unidos. Não são rotuladas, a menos que o valor nutricional do alimento tenha sido alterado, como no caso do óleo Vistive, ou se tiver sido incorporada alguma substância capaz de produzir alergias. A experiência de mais de uma década de consumo de alimentos transgênicos confirma que estes são equivalentes aos alimentos convencionais. Apesar de alguns grupos ativistas terem manifestado sua oposição aos alimentos transgênicos, isto não tem afetado a estabilidade do sistema de avaliação. Assim como nos Estados Unidos, na Argentina e no Canadá a rotulagem não é obrigatória. Na União Europeia, rege o princípio de precaução. Como o que importa é o processo seguido na produção do alimento, a legislação de 2004 manda rotular todos os produtos de origem transgênica, destinados à alimentação humana ou animal. A regulamentação é extensiva a cantinas e restaurantes. Também é obrigatório o rótulo nos alimentos que contenham mais de 0,9% de material geneticamente modificado, incluindo rações, óleos vegetais, sementes etc. Por outro lado, a legislação europeia considera que, sendo auxiliares de transformação, não há necessidade de rotular alimentos e bebidas preparados com substâncias produzidas por OGM, se estes ou seus resíduos não estiverem presentes no produto final. Tampouco são rotulados os produtos provenientes de animais alimentados com rações transgênicas (carne, leite, ovos) nem o mel de abelhas alimentadas com néctar de flores de plantas transgênicas. Japão, Coreia do Sul e Rússia rotulam os alimentos a partir de um limite percentual de 5%. O objetivo destas medidas é garantir a escolha do consumidor e a rastreabilidade dos transgenes ao longo da cadeia alimentar. O rótulo indica "este alimento contém organismos geneticamente modificados" ou "produzido a partir de (nome do organismo) geneticamente modificado". No Brasil, o Decreto (24/4/2003) determina que, a partir de abril 2004, todos os produtos com mais de 1% de ingredientes transgênicos sejam rotulados, com um símbolo específico de tamanho maior a 1 cm 2, um triângulo com uma letra T inserida dentro (Figura 16.3). RÓTULO E INFORMAÇÃO Quando se trata de escolher entre dois alimentos, basta recorrer à nossa percepção sensorial ou, ainda, à nossa experiência pessoal. Nenhuma das duas permite reconhecer a presença de ingredientes transgênicos, ou de origem transgênica, nos alimentos. Em função da resistência de alguns grupos de consumidores, a rotulagem pareceria a saída mais lógica para informar de maneira honesta, exata e completa sobre os produtos das prateleiras FIGURA O símbolo de transgênico adotado no Brasil. 214

225 BIOTECNOLOGIA E NOVOS ALIMENTOS Vimos no Capítulo 13 que os produtores de sementes comerciais admitem como aceitável uma contaminação de 1% entre as variedades convencionais. Essa contaminação também é inevitável, quando coexistem plantações transgênicas e convencionais. Por conseguinte, o limite de 1% redefine o nível de pureza de um ingrediente de origem vegetal, admitindo-se que todo valor inferior a esse limite pode ser o resultado de uma contaminação acidental. Sendo assim, o consumidor pode comprar um produto com mais de 1% de ingredientes transgênicos ou um produto convencional cuja composição conta mais de 99% de ingredientes não transgênicos. Em outras palavras, o rótulo não garante ao consumidor a ausência de transgênicos. Finalmente, cabe refletir sobre o significado de um rótulo para a maioria dos consumidores, e se a escolha entre um produto e outro não dependerá essencialmente do preço e do marketing. Somente o processo educativo pode dar à população os elementos básicos para formar uma opinião informada e responsável e fazer suas escolhas. O RASTREAMENTO DE UM TRANSGENE Em um mundo globalizado, a variedade de regulamentos e de modalidades de rotulagem é um fator de complicação das transações comerciais, em que a qualidade de um produto pode ter que ser definida em relação à presença ou ausência de um transgene. A aceitação dos transgênicos varia de um país para outro e, também, entre diversos grupos de consumidores. Por isso é importante contar com formas de rastreamento como a técnica da PCR (reação em cadeia da polimerase), que pode ser aplicada em diferentes modalidades: o Testes qualitativos, para reconhecer a presença ou ausência do transgene. o Testes semiquantitativos, em que a presença ou ausência do transgene é determinada em função de um limite como 1%, por exemplo. o Testes quantitativos, que fornecem informação sobre a quantidade do transgene por comparação com amostras de referência com concentrações conhecidas. A técnica permite identificar DNA exógeno em uma quantidade de 0,1% (1 grama em 1 quilograma), mas algumas variantes extremamente sensíveis reconhecem a presença de 0,001% do transgene. Observe-se que, para aplicar estes testes, se precisa de informação sobre as sequências do transgene. Uma forma de simplificá-los seria a inclusão, em todas as construções genéticas, de uma sequência conhecida. Esta funcionaria como uma etiqueta molecular, facilitando a identificação de qualquer transgene. Por outro lado, nem sempre a PCR é informativa. Em amostras de grãos ou alimentos processados, o DNA pode estar quase totalmente degradado. Nesse caso, é necessário saber quais as transformações que o produto sofreu e estabelecer protocolos adequados. Existem métodos imunológicos (Western Blot, ELISA) que permitem detectar a proteína sintetizada pelo transgene e, eventualmente, estimar a quantidade presente. Contudo, o custo de todos esses testes será pago pelo consumidor. 215

226 C A P Í T U L O 17 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS AS DOENÇAS INFECCIOSAS O desenvolvimento da agricultura aumentou a disponibilidade de alimentos, sustentando populações mais densas e sedentárias. O contato com os animais domesticados, por favorecer a evolução e a passagem dos germes ao homem, estaria na origem de doenças como a varíola, o sarampo, a coqueluche, a tuberculose e a gripe. Uma vacina é um produto destinado a estimular o sistema imune, de maneira a prevenir ou controlar uma infecção. No século XIX, mais de 80% das crianças morriam de doença antes dos 10 anos de idade. Hoje, programas de vacinação sistemática as imunizam contra tuberculose, hepatite B, poliomielite, difteria, tétano, coqueluche, meningite, sarampo, rubéola, caxumba e infecções por rotavírus e pneumococos. Nos dois séculos que nos separam de Jenner, o descobridor da primeira vacina antivariólica, temos alcançado o sucesso na prevenção de um bom número de doenças infecciosas. A vacinação chega às crianças e aos grupos de pessoas sujeitos a maiores riscos, como as mulheres (sarampo e rubéola), os maiores de 60 anos (gripe, pneumonias) e os profissionais de saúde (hepatite B, antraz). Também resguarda os residentes em determinadas áreas e os viajantes (febre amarela). A vacinação dos animais os protege das doenças e quebra o elo de transmissão ao homem. A melhora das condições econômicas de uma população repercute na saúde da mesma e, inversamente, a diminuição da incidência de doenças com suas sequelas de invalidez ou morte prematura dá às pessoas a possibilidade de melhorar suas condições de vida. O custo de implantação de um sistema de vacinações é baixo, porque a proteção atinge não só a pessoa que as recebe como as que entram em contato com ela. Em uma variante do velho ditado prevenir é melhor que curar, a WHO (Organização Mundial da Saúde; do inglês, World Health Organization) ressalta que o maior impacto na área de saúde é conseguido com água limpa e vacinas. Lamentavelmente, ainda morrem anualmente dois milhões de crianças de doenças porque as vacinas existentes não chegam até elas, devido aos conflitos armados e à dificuldade de acesso aos centros de saúde. E ainda não temos vacinas para doenças como a tuberculose, a malária ou o HIV/AIDS. A AQUISIÇÃO DE IMUNIDADE Um antígeno é uma substância que estimula a produção de proteínas específicas (anticorpos) capazes de se ligar a ele. Microrganismos infecciosos, suas moléculas e substâncias químicas são antígenos, assim como as células de um organismo transplantadas a outro, o pólen, pelos de animais e certos alimentos nas pessoas sensibilizadas. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

227 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS No primeiro contato com um antígeno, o organismo reage com uma resposta imunológica primária de intensidade baixa e curta duração, acompanhada de alguns sintomas como febre, dor de cabeça, erupção cutânea. Essa primeira resposta facilita a eliminação do antígeno estranho e a produção de células de memória. Em um segundo contato, a resposta imunológica envolverá numerosas células e moléculas e será rápida, intensa e duradoura (Figura 17.1). Todo patógeno é um antígeno estranho e, como tal, será detectado pelo sistema imune quando penetrar no organismo. A resposta envolverá uma ação humoral e uma ação mediada por células, coordenadas por diversos componentes do sistema imunológico. As duas formas de ação dependem das características do ataque do patógeno: o pneumococo se multiplica nos pulmões, o bacilo do tétano produz uma toxina letal, o bacilo de Koch e todos os vírus parasitam as células. No caso de uma bactéria ou de uma toxina, os anticorpos específicos produzidos pelos linfócitos B reconhecem os microrganismos ou as toxinas circulantes, dando início a sua destruição. Os vírus e algumas bactérias demandam outro tipo de combate, porque, ao invadir as células, ficam protegidos dos anticorpos. A célula infectada será destruída pelos linfócitos T matadores (também chamados Tc, do inglês T citotoxic), que reconhecem uma combinação das proteínas celulares com algumas proteínas do invasor, expostas na superfície celular. Tanto a ação humoral como a ação mediada por células dependem da participação dos linfócitos auxiliadores Ta, também chamados Th (do inglês, T helpers), que reconhecem o antígeno e produzem moléculas que estimulam a proliferação das células B e T. Finalizada a resposta primária, algumas células de memória (B, T) permanecerão no sistema, possibilitando a aceleração dos mecanismos de defesa em ocasião de um segundo contato com o antígeno (Figura 17.2) FIGURA As respostas primária e secundária do organismo Intensidade da resposta imune Semanas Primeiro contato com o patógeno (antígeno) Segundo contato com o patógeno (antígeno) 217

228 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Uma vacina é um produto destinado a ensinar o sistema imune a reconhecer determinado patógeno e impedi-lo de desencadear uma infecção ou uma doença. A vacina prepara os mecanismos de defesa, em previsão de um segundo contato, desta vez com o patógeno original. A vacinação estabelece o primeiro contato do organismo com um patógeno que, estando incapacitado para causar a doença, conserva sua identidade molecular e a capacidade de induzir uma resposta imune. As vacinas estimulam a imunidade humoral, a imunidade mediada por células ou, preferentemente, ambas ao mesmo tempo FIGURA A memória imunológica Antígeno Detectado por células que ativam os diferentes tipos de linfócitos Linfócitos T citotóxicos Linfócitos T auxiliadores Linfócitos B Células de memória Síntese de anticorpos Eliminam as células infectadas Neutralizam ou marcam o antígeno dando início a sua eliminação OS DIFERENTES TIPOS DE VACINAS AS VACINAS TRADICIONAIS OU DE PRIMEIRA GERAÇÃO AS VACINAS DE PATÓGENOS VIVOS ATENUADOS Nestas vacinas, os patógenos vivos são cultivados em diferentes meios e/ou passam por vários tratamentos físicos (temperatura, pressão e ph), de modo a selecionar mutantes que, apesar de ter perdido a patogenicidade, conservem a capacidade de induzir uma resposta imune intensa e duradoura, que envolva ambas as vias, a humoral e a celular. Estas vacinas são muito eficientes já que, salvo em caso de imunização por via oral, basta uma única dose para obter a imunidade desejada. Contudo, elas apresentam alguns inconvenientes. Além de serem inadequadas para as pessoas imunodeprimidas, existe o risco de uma forma atenuada reverter para uma forma ativa. Outra desvantagem é a necessidade de conservá-las refrigeradas, mantendo uma cadeia de frio. Utilizam-se na prevenção de doenças de origem viral, como a febre amarela, o sarampo, a rubéola, a caxumba e a poliomielite (Sabin ou OPV, do inglês oral polio vaccine). A vacina contra a tuberculose é a única preparada com uma bactéria viva, o bacilo de Calmette-Guérin ou BCG. 218

229 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS AS VACINAS DE PATÓGENOS MORTOS E DE TOXOIDES Estas vacinas incluem microrganismos mortos ou toxinas inativadas (toxoides) por procedimentos físicos ou químicos. Conferem uma resposta imune de tipo humoral pouco intensa ou duradoura, pelo que se devem administrar várias doses e, mais tarde, manter a imunidade com doses de reforço. Requerem, também, a introdução de substâncias coadjuvantes para estimular a resposta imune. Apesar de ser estáveis e não depender da cadeia do frio, estas vacinas devem ser modificadas frequentemente para se adaptar aos sorotipos bacterianos patogênicos, que são muito variáveis. Além de vacinas de toxoides contra a difteria e o tétano, existem vacinas de microrganismos mortos contra a cólera, a gripe, a hepatite A, a peste, a poliomielite (vacina Salk) e a raiva. AS NOVAS VACINAS OU DE SEGUNDA GERAÇÃO A chegada da engenharia genética revolucionou o campo das vacinas ao permitir a produção de antígenos de tipo proteico em microrganismos transformados, que podem ser cultivados sem riscos em um fermentador (Escherichia coli, Saccharomyces cerevisiae, Picchia pastoris). Devem-se à tecnologia do DNA recombinante (Figura 17.3), as vacinas contra a hepatite B (HBV) e contra o papiloma humano (HPV). Outro benefício é o desenvolvimento de vacinas veterinárias DIVA (do inglês, Differentiate Infected from Vaccinates Animals), que permitem distinguir um animal vacinado de outro doente. AS VACINAS DE SUBUNIDADES DE ANTÍGENOS Nestas vacinas se colocam, em vez do microrganismo todo, só um a 20 antígenos da superfície celular, capazes de induzir a resposta imune. Demandam um longo trabalho de pesquisa prévia para determinar quais os melhores antígenos (subunidades) que deverão ser incluídos na vacina e precisam de substâncias coadjuvantes para estimular a imunidade. Por não levar mais que fragmentos do microrganismo, estas vacinas não apresentam os riscos das vacinas de microrganismos vivos e independem da cadeia do frio. Existem vacinas de subunidades contra a influenza ou gripe, a doença de Lyme, a hepatite B, a coqueluche e a pneumonia FIGURA A utilização da tecnologia do DNA-recombinante na vacina contra a hepatite B Vírus HBV Gene codificador do antígeno de superfície HBsAg Síntese do antígeno Vacina Levedura Levedura transformada 219

230 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) AS VACINAS CONJUGADAS Alguns microrganismos (pneumococos, meningococos) protegem-se com uma cápsula de polissacarídeos, que dificulta sua identificação pelo sistema imune, ainda imaturo, de uma criança. As novas tecnologias possibilitam a associação de um toxoide às subunidades de polissacarídeo, de maneira a estimular a resposta imune e o reconhecimento dos antígenos capsulares. Estas vacinas de antígenos conjugados são utilizadas na imunização contra o Haemophilus influenzae B (meningite) e o Streptococcus pneumoniae ou pneumococo. As vacinas contra este último devem ser modificadas frequentemente, adicionando outros antígenos capsulares das mais de 80 linhagens que causam pneumonia em seres humanos. AS VACINAS VETORIZADAS Outro tipo interessante de vacinas são as vetorizadas, em que o gene codificador do antígeno é transferido a um microrganismo inócuo (bactéria ou vírus) que age como vetor. Ao infetar o hospedeiro, ele se multiplica e começa a produzir o antígeno, induzindo uma resposta imune contra o patógeno. Com uma vacina deste tipo imunizam-se as raposas, atualmente um dos principais elos na transmissão de raiva na Europa. Em um segundo tipo de vacinas vetorizadas, o vetor não se multiplica no hospedeiro. Agindo como uma seringa molecular, ele introduz, na célula, o gene codificador do antígeno. Um vetor deste tipo, o canarypox, que se multiplica em aves, exclusivamente, é utilizado na vacinação contra as doenças de Marek e Gumboro. Existem 12 vacinas vetorizadas para uso veterinário, mas nenhuma aprovada para uso humano. A ÚLTIMA GERAÇÃO A tecnologia mais promissora parece ser a das vacinas genéticas, também denominadas vacinas de DNA nu. Estas consistem de um plasmídeo com uma construção gênica que inclui o gene codificador do antígeno. Injetado diretamente no músculo, o DNA irá penetrar nas células dendríticas, apresentadoras de antígeno. Estas migrarão até os órgãos linfoides, onde sintetizarão o antígeno, estimulando uma resposta imune de tipo celular que permitirá imunizar o hospedeiro. Esta tecnologia teria uma vantagem fundamental, por ser um método genérico que facilita o desenvolvimento e produção de novas vacinas (Figura 17.4). Estas poderão ser elaboradas substituindo um gene por outro no cassete de expressão gênica, o que diminuiria os custos e o tempo necessário para responder a uma emergência sanitária. Também se poderia conseguir uma supervacina com vários genes codificadores de antígenos, capaz de imunizar o organismo contra várias doenças simultaneamente. Por outro lado, as vacinas de DNA estimulam ambas as respostas, humoral e mediada por células. Na área veterinária, já foram aprovadas nos Estados Unidos vacinas de DNA contra o vírus IHNV, causante da necrose hematopoiética em trutas e salmões; contra o vírus da doença do oeste do Nilo, que ataca os equinos; contra o melanoma canino e para terapia gênica relacionada à liberação hormonal do fator de crescimento em suínos. Na área humana, ainda em fase experimental ou em testes clínicos, se encontram em andamento várias vacinas deste tipo contra HIV/AIDS, malária, herpes, tuberculose, hepatite B, influenza, rotavírus etc. 220

231 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS FIGURA Os diferentes tipos de vacinas Tipos de vacinas V. patogênico V. relacionado V. atenuado V. morto Subunidades Recombinante Transfecção Linfócitos B e T Doença e recuperação Imunidade adquirida (espontânea) Imunidade adquirida (artificial) A PRODUÇÃO DE VACINAS PESQUISA E DESENVOLVIMENTO Para chegar a ser comercializada, uma vacina deve cumprir etapas sucessivas de pesquisa, desenvolvimento e operações industriais, que podem demandar em média 12 anos de trabalho e investimento. A etapa exploratória tem uma duração de 2 a 4 anos e se inicia nas bancadas de um laboratório de pesquisa, onde serão identificados os antígenos naturais ou sintéticos que podem prevenir ou tratar uma doença. Segue uma etapa pré-clínica de 1 a 2 anos de duração, que pode envolver pesquisadores de uma indústria privada. Os experimentos são realizados em cultivos de células ou de tecidos e, a seguir, com animais de laboratório (camundongos, cobaias e/ou macacos). Depois de comprovar sua capacidade de imunizar um ser vivo, seleciona-se o melhor candidato vacinal. Os estudos também permitem obter uma estimativa sobre a dose a ser aplicada em etapas posteriores e a forma de administrar a vacina. A primeira fase dos estudos clínicos em seres humanos inicia-se em um grupo de 20 a 80 voluntários adultos e deve ser realizada no pais de produção da vacina, mesmo quando o produto não se destine a essa população. Os participantes são monitorados bem de perto, a fim de verificar a segurança 221

232 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) (toxicidade e farmacocinética) do candidato vacinal. Se a vacina for desenhada para crianças, os testes devem ser iniciados com adultos e jovens. A segunda fase envolve 80 a 300 pessoas e inclui alguns indivíduos da população alvo, isto é, pertencentes aos grupos de risco de contrair a doença. Nesta fase os testes incluem um grupo placebo e visam estudar a imunogenicidade e o efeito protetor da vacina (fase 2 a), isto é, sua eficácia por exposição com inóculos padronizados do agente infeccioso. Também se avalia a relação dose-resposta e sua eficácia por exposição natural à infecção em áreas de transmissão (fase 2b), assim como o melhor calendário de vacinações e a forma de aplicação. A terceira fase, que envolve milhares de pessoas, testa a eficácia do candidato vacinal em proteger os indivíduos vacinados contra a doença e a ausência de fatores adversos que possam ter sido inadvertidos em ensaios com uma amostra menor de pessoas. Testes randomizados, aplicados em duplo-cego, permitem comparar o efeito da vacina experimental e o de um placebo, seja este uma solução salina, outra vacina ou qualquer outra substância. A duração total das três fases correspondentes aos estudos clínicos é de 6 a 8 anos para as vacinas humanas. Se os resultados dos estudos clínicos não forem satisfatórios, será necessária a realização de estudos adicionais, chegando, eventualmente, a interromper os estudos clínicos e proceder à escolha de outro candidato vacinal. Contudo, uma vez comprovado que a vacina é segura e eficiente, a indústria farmacêutica poderá solicitar aos órgãos competentes a licença para comercializar o produto. Esta etapa dura de 12 a 18 meses. A liberação da vacina marca o início do processo de manufatura e da fase de vigilância farmacológica, um monitoramento amplo e rigoroso que coleta toda informação sobre algum efeito adverso que possa ocorrer. Em 1999, por exemplo, uma primeira vacina contra o rotavírus teve que ser retirada do mercado em consequência de alguns casos de intussuscepção relacionados com sua aplicação. As vacinas veterinárias passam pelas mesmas etapas, mas as exigências são menores. É possível simplificar os testes com animais de laboratório e testar o candidato vacinal no animal para o qual é destinado o produto. O número de indivíduos necessários para os testes clínicos também é menor. O MARCO ÉTICO As pesquisas com seres humanos e, por conseguinte, todos os testes clínicos, devem ser desenvolvidos dentro do marco ético elaborado pelo tribunal de Nuremberg, por ocasião do julgamento de 20 médicos condenados como criminosos de guerra, devido aos brutais experimentos realizados com prisioneiros durante a Segunda Guerra Mundial. Segundo o Código de Nuremberg (1949), os experimentos em seres humanos devem visar o bem da sociedade e ser levados a cabo por pessoas cientificamente qualificadas. Os participantes receberão todas as explicações necessárias, antes de dar livremente o seu consentimento. As experiências serão a continuação de outras que, realizadas em modelos animais, permitam prever um resultado tal que justifique a inclusão de testes em seres humanos. O sofrimento mental e físico será evitado, e as pessoas receberão proteção em caso de ocorrer algum efeito adverso. Nos testes clínicos de avaliação de uma nova vacina, as pessoas participam voluntariamente e são informadas sobre os riscos e benefícios de sua participação. Contudo, discute-se a validação do consentimento informado quando os testes são realizados em populações de escassos recursos, com baixos níveis de instrução. 222

233 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS OPERAÇÕES INDUSTRIAIS Na produção de vacinas, cada lote da vacina deve passar por controles estritos, a fim de garantir a qualidade e manter a credibilidade não só da indústria, mas da própria vacinação. Aplicada correntemente em vários países, a vacina Salk de vírus inativados é considerada hoje uma das vacinas mais seguras. Porém, um problema na fabricação da vacina no Laboratório Cutter (Estados Unidos) causou a inativação incompleta de algumas partículas virais e, duas semanas depois de liberada, em 1954, induziu 260 casos de pólio e 10 mortes. Uma vacina deve reunir várias qualidades, principalmente eficiência, pureza, segurança e baixo custo. O processo industrial varia em função do microrganismo utilizado e responde a critérios estritos de qualidade (BPL ou Boas Práticas de Laboratório; BPF ou Boas Práticas de Fabricação). Atualmente, o controle de qualidade ocupa 70% do tempo dedicado à produção de uma vacina. As bactérias multiplicam-se em biorreatores, em condições que dependem da produtividade do próprio processo fermentativo e do tratamento posterior, para a extração de antígenos ou de toxoides. Vacinas antibacterianas podem ser preparadas em grandes quantidades, com equipamento relativamente simples. As proteínas recombinantes de vírus ou bactérias são produzidas em biorreatores, por leveduras, ou em cultivos celulares. Ao processo de extração seguem-se várias operações de purificação por técnicas complexas (ultrafiltração, cromatografia em coluna etc.). Os vírus, parasitas obrigatórios, precisam de células para se multiplicar. Tradicionalmente, utilizamse pele de bezerro e ovos de galinha, mas a tendência atual é substituí-los por culturas celulares que possibilitem o desenvolvimento de vacinas virais para uso humano (poliomielite, sarampo, rubéola, influenza, caxumba, raiva) e veterinário (febre aftosa, raiva, encefalite equina, doença de Mareck e de Newcastle etc.). Além do antígeno, na formulação de uma vacina incluem-se outras substâncias: os adjuvantes, que permitem dosagens menores por serem capazes de estimular a resposta imune; os estabilizantes, que impedem as alterações devidas ao calor, à luz ou à umidade; os conservantes, nos frascos com doses múltiplas. Uma das tendências atuais na administração de vacinas é a redução do número de doses por imunização simultânea, em uma mesma injeção, para várias doenças (tríplice viral ou tríplice bacteriana). Também se dá preferência a sistemas que diminuam a necessidade de refrigeração, que representa 15% dos custos dos programas de vacinação. Outras novidades virão da procura de novas formas de aplicação para substituir o uso de seringas, tais como pistolas, géis, adesivos cutâneos, cápsulas, tabletes, inaladores e sprays nasais. Estes últimos começaram a ser utilizados na aplicação de vacinas contra a gripe (FluMist, nos Estados Unidos; NasVax, em Israel). As vacinas orais têm importantes aplicações na área veterinária. Plantas e animais transgênicos produtores de antígenos poderão revolucionar alguns aspectos da produção de vacinas. A ideia de ter vacinas comestíveis e de poder vacinar as crianças com uma banana em vez de uma injeção é muito sedutora. Contudo, alguns problemas de segurança exigem atenção, como, por exemplo, o risco de se misturar bananas-vacina e bananas-alimento, contaminando os alimentos ou dificultando o reconhecimento de um medicamento como tal. Provavelmente, os antígenos serão extraídos e administrados em tabletes ou cápsulas. Em 2005, Dow AgroSciences registrou nos Estados Unidos uma vacina para a doença de Newcastle em aves, produzida na planta aquática Lemna. Encontra-se em andamento uma nova vacina contra a febre amarela em plantas de tabaco, em um centro a ser implantado no Ceará, pela Fundação Oswaldo Cruz (Fiocruz) em parceria com instituições dos Estados Unidos. 223

234 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) O MERCADO DAS VACINAS A produção de vacinas é uma atividade menos rentável que a produção de medicamentos. Contudo, a chegada das novas tecnologias com base biológica despertou novamente o interesse do setor farmacêutico. Atualmente, cinco grandes empresas (Merck, Pfizer, Sanofi-Pasteur, GlaxoSmithKline e Novartis) concentram de 80% a 90% do mercado global de vacinas humanas, estimado em US$ 61 bilhões em O resto está ocupado por 200 a 250 empresas que desenvolvem mais de 600 produtos. O processo de desenvolvimento de uma nova vacina leva em média 12 anos, a um custo que pode variar entre US$ 300 milhões e US$ 1 bilhão. Alguns produtos, como a vacina antimeningococo Prevnar (Pfizer), atingiram níveis de vendas que superam o bilhão de dólares anuais. Estima-se que o mercado aumentará significativamente nos próximos anos, em função do crescimento do setor adulto e, fundamentalmente, das vacinas terapêuticas, que serão analisadas no Capítulo 20. Também aquecerão o mercado produtos novos, tais como as vacinas para a gripe (influenza) e as vacinas que protejam o turista (febre amarela, dengue) ou diminuam o abuso de drogas (nicotina). Em meio a numerosas crises econômicas, vários países latino-americanos descuidaram de suas estruturas científicas e tecnológicas e passaram a importar as vacinas necessárias para a população. No entanto, e por diferentes motivos, depois de várias décadas de retração na área de produção de vacinas, esta começa a ser considerada novamente uma área estratégica. Para os países em desenvolvimento, o estímulo à produção nacional de vacinas é parte das obrigações frente a sua população. Em termos de saúde pública, trata-se de um setor que não pode ser negligenciado e no qual é preciso manter independência. Alguns países, como Brasil, China e Índia, contam com instituições de pesquisa e desenvolvimento para a produção de imunobiológicos, sendo frequentes as parcerias com as grandes empresas farmacêuticas. Fundações privadas, como a Bill & Melinda Gates Foundation, fornecem fundos em prol de melhores e novas vacinas, que protejam as crianças das doenças. Para organizações internacionais como a WHO, a vacina é a mais simples das medidas preventivas possíveis na área de saúde. Nos próximos anos, haverá progressos na preparação das vacinas preventivas e no desenvolvimento de produtos novos, como as vacinas terapêuticas. Entretanto, esperam-se vacinas novas ou melhores contra as doenças que afetam um número altíssimo de pessoas, tais como HIV/AIDS, malária, dengue e tuberculose. UM SETOR ESTRATÉGICO PARA A SOCIEDADE No Brasil, onde existe uma tradição de mais de um século na produção de imunobiológicos (vacinas, soros, hemoderivados e reativos para diagnóstico), as vendas chegam a US$ 600 milhões por ano, o que representa 3% do mercado da indústria farmacêutica. Até a década de 1960, muitas vacinas humanas e veterinárias eram fabricadas no país. A perda da autossuficiência criou uma situação crítica quando, em inícios da década de 1980, uma multinacional retirou-se do mercado, deixando a população em risco de ficar sem vacina tríplice, soros antitóxicos e antiofídicos. Evidenciou-se nessa ocasião que a sociedade deve ter o acesso garantido às vacinas. O Programa de Autossuficiência Nacional de Imunobiológicos (PASNI) de 1985 reverteu essa situação, mediante uma estratégia de substituição das importações que estimulou a modernização das instalações e a incorporação de novas tecnologias em cinco dos laboratórios oficiais: Instituto Butantan (SP), Instituto de Tecnologia em Imunobiológicos (Biomanguinhos, Fiocruz, RJ), Instituto Vital Brazil (IVB,RJ), Instituto de Tecnologia do Paraná (Tecpar, PR), Fundação Ezequiel Dias (Funed, MG). 224

235 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS Atualmente, o Brasil produz 75% das vacinas que são distribuídas pelo serviço público, a metade delas produzida pelo Butantan (Tabela 17.1). Várias vacinas estão sendo desenvolvidas em parcerias entre as instituições citadas ou com laboratórios estrangeiros (Sanofi-Pasteur, GlaxoSmithKline, Instituto Finlay etc.). Algumas das vacinas resultantes desses convênios protegem a população de sarampo, caxumba e rubéola (tríplice viral), influenza, rotavírus, raiva (cultivo do vírus em células Vero) etc. Os diferentes acordos de cooperação internacional entre os países latino-americanos também terão uma importância fundamental para o desenvolvimento de políticas de saúde pública que garantam à população o acesso às vacinas TABELA A produção de vacinas no Brasil INSTITUIÇÃO Instituto Butantan Laboratório BioManguinhos Tecpar Fundação Ataulfo de Paiva Fundação Ezequiel Dias VACINAS Dupla, Infantil DT (difteria e tétano) Dupla, Adulto dt (difteria e tétano) Tríplice DTP (difteria, tétano e coqueluche ou pertussis) Hepatite B recombinante Influenza sazonal trivalente Raiva (VR/VERO) HPV, em parceria com a MSD (Merck) Hepatite A, em parceria com a MSD (Merck) dtpa (difteria, tétano e coqueluche ou pertussis), para gestantes, em parceria com GSK (GlaxoSmithKline) Poliomielite inativada (VIP) e oral (VOP) Tríplice viral (sarampo, caxumba e rubéola) Tetravalente viral (catapora, sarampo, caxumba e rubéola) HIB (meningite e pneumonia) Tetravalente viral HIB, DTP (Difteria, tétano, coqueluche ou pertussis e HIB) Pneumocócica -10 valente Febre amarela Rotavírus humano, em parceria com GSK (GlaxoSmithKline) Antirrábica de uso veterinário e humano (PV-BHK) Antituberculose (BCG) Vacina meningocócica C AS VACINAS E A ERRADICAÇÃO DA DOENÇA Dispomos hoje de vacinas para numerosas doenças que afetaram a humanidade durante séculos. De um modo geral, elas protegem 80% a 95% das pessoas imunizadas, com baixíssimas frequências de efeitos adversos. O calendário de imunizações depende das autoridades nacionais e, em vários países, a vacinação não é obrigatória. 225

236 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) O impacto das vacinas na morbidade infantil relega ao passado algumas das temíveis doenças que assolaram o século XX: difteria, coqueluche, tétano, poliomielite, meningite, caxumba, sarampo, rubéola, varicela). Lamentavelmente, alguns setores da sociedade se recusam a aceitar o óbvio. Um dos ataques mais desonesto às vacinas foi a publicação em uma revista científica de um artigo relacionando-as com o autismo. A revista teve que se retratar e o trabalho foi declarado fraudulento pelo Conselho Geral de Medicina do Reino Unido (2011). Organizações como o CDC (do inglês, Centers for Disease Control and Prevention), o Instituto de Medicina da Academia Nacional de Ciências (Estados Unidos) e o Serviço Nacional de Saúde (Reino Unido) não encontraram relação entre as vacinas e o autismo. Em algumas comunidades, a resistência às vacinas subsiste por motivos culturais, religiosos ou políticos. Algumas das razões invocadas são: intromissão na liberdade individual, desafio à vontade divina, degradação dos costumes ou interferência no desenvolvimento nacional. Algumas comunidades descuidam da prevenção quando a doença passa um tempo sem se manifestar, favorecendo, assim, a reaparição epidêmica da doença. O impacto das vacinas pode relegar ao passado algumas das temíveis doenças que assolaram a humanidade, porém, isso não significa que tenham sido totalmente erradicadas. As vacinas mostraram-se eficazes para erradicar mundialmente a varíola e reduzir enormemente o número de casos de poliomielite, na maioria dos países. Em relação à gripe, ainda não há uma vacina capaz de estimular a imunidade a todas as linhagens do patógeno. A VARÍOLA A varíola é uma doença eruptiva contagiosa, transmitida por um poxvírus. A incubação dura de 7 a 17 dias; os sintomas principais são febre alta, fadiga e uma erupção de vesículas em todo o corpo. A mortandade é de 30%, e os sobreviventes conservam lesões características. A varíola teria sido levada até a Índia por mercadores do Egito, onde vitimara o faraó Ramsés V. A doença se alastrou até a China (século I) e o Japão (século VI), retornando mais tarde ao Oriente Médio e alcançando a Europa com os Cruzados (século XI-XII). A varíola não fazia distinção entre camponeses, burgueses ou nobres, cobrando vidas de humildes e poderosos, como o rei da França Luís XV. Quem adoece uma vez e se recupera, não adoece uma segunda vez; essa observação deu lugar à primeira estratégia de combate à varíola. No Oriente (Índia e China, século XI), inoculavam-se as pessoas sadias com o pus das vesículas de doentes com uma forma benigna da varíola. A maioria das pessoas inoculadas manifestava uma doença leve e ficava protegida pelo resto de sua vida. A varíola regrediu entre os povos que praticavam a variolização, embora 1% a 2% das pessoas inoculadas morresse ao desenvolver a doença em sua forma mais grave. Em 1520, com a chegada ao México de um escravo contaminado, a varíola entrou no continente americano. O convívio de vários séculos com a doença desenvolveu nos europeus alguma forma de resistência, mas, para as populações ameríndias, o contato com um germe novo significou o extermínio de 95% de seus integrantes, em menos de 200 anos. No século XVIII, a prática da variolização foi introduzida na Inglaterra. Um inoculador, o médico Edward Jenner, observou que as ordenhadeiras nunca desenvolviam a varíola. Segundo uma crença popular, essa resistência era consequência da contaminação com a varíola das vacas (variola vacum ou vacina), uma doença inofensiva que se manifesta por pústulas no úbere das vacas. Em 1796, Jenner inoculou a variola vacum em uma criança e, poucos dias mais tarde, a varíola humana; a criança não adoeceu. A partir dessa experiência, a vacinação se estendeu rapidamente por toda Europa. No Brasil, a vacinação foi introduzida em 1840 pelo Barão de Barbacena. Porém, quando, em 1904, sendo Oswaldo Cruz o Diretor Geral de Saúde Pública, o governo decretou a vacinação obrigatória, a resistência se manifestou no Rio de Janeiro sob a forma de motins, estourando uma revolta que 226

237 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS obrigou o governo a rever a medida. Contudo, a população terminou aceitando a vacinação depois da violenta epidemia de varíola de 1908, que teve 10 mil casos diagnosticados. Apesar dos surtos terem-se espaçado, 300 milhões de pessoas morreram de varíola no século XX. Na década de 1970, a WHO substituiu a vacinação em massa por uma campanha de erradicação em anel. A estratégia consiste em isolar os pacientes cada vez que um caso novo é detectado, e vacinar rapidamente todas as pessoas que tiveram algum contato com o doente. Como a vacina tem um efeito muito rápido, os resultados foram extraordinários. Contudo, por ocasião de um surto havido na Iugoslávia (1972), foi necessário complementar as medidas com uma vacinação em massa. O último caso de varíola registrado ocorreu na Somália em Uma vez confirmada a erradicação da varíola em 1979, o vírus da varíola começou a ser eliminado dos laboratórios para evitar acidentes como o ocorrido um ano antes, quando o escapamento do vírus de um laboratório da Universidade de Birmingham (Reino Unido) causou a morte de duas pessoas. Preventivamente, dois estoques virais foram conservados, um deles no CDC (Center for Disease Control and Prevention, Atlanta, Estados Unidos), o outro no VECTRO (Instituto para Preparações Virais, Moscou, Rússia). Apesar de estar prevista sua destruição no ano 2000, esta não ocorreu. Ninguém pode afirmar que não existe algum estoque de vírus em algum lugar, e a mera possibilidade de um ato de terrorismo é assustadora. Em caso de um surto de varíola, os médicos teriam dificuldades em diagnosticar uma doença que hoje está restrita aos livros. A população deixou de ser vacinada em fins da década de 1970, de modo que boa parte da população nunca foi imunizada; sem doses de reforço, o restante pode ter perdido a imunidade. Por outro lado, a validade de um pequeno estoque de vacinas que sobrou de décadas atrás está comprometida, e a aplicação da vacina contraindicada em pessoas com eczemas ou imunodeprimidas, muito mais frequentes que no início do século XX. Mesmo tendo erradicado a varíola, precisaríamos de vacinas antivariólicas eficientes e seguras, formuladas com tecnologia recente. Algumas já se encontrariam na etapa dos estudos clínicos. A POLIOMIELITE A poliomielite ou paralisia infantil é uma doença causada por um picornavírus (poliovírus), transmitido pela água. O período de incubação é de 4 a 35 dias, e 10% das pessoas infectadas desenvolvem os seguintes sintomas: febre, fadiga, dor de cabeça, vômitos, constipação ou diarreia, rigidez na nuca e dor nas extremidades. Em 1% dos casos, o vírus da poliomielite passa do intestino para a corrente sanguínea e invade o sistema nervoso central, onde se multiplica, destruindo os neurônios motores. As pessoas afetadas desenvolvem a forma paralítica da doença, e, se o vírus se alojar no bulbo, os pacientes precisarão de ajuda mecânica para respirar. A doença pode deixar sequelas motoras permanentes (SPP ou síndrome post-pólio). Apesar de haver evidências da doença no Antigo Egito, os primeiros surtos epidêmicos ocorreram em fins do século XIX. Em 1908, confirmou-se que a poliomielite é uma doença infecciosa. Na primeira metade do século XX, as epidemias deixaram numerosas vítimas, principalmente entre as crianças, mas também entre os adultos como, por exemplo, Franklin Delano Roosevelt, presidente dos Estados Unidos. As melhores condições higiênicas do século XX diminuíram o contato prematuro da população com o vírus, suspeitando-se que a exposição de um grupo vulnerável ao vírus, em idade escolar, foi um dos fatores desencadeante dos surtos. Na década de 1950, a doença era aterradora. Quando aparecia a pólio, as escolas fechavam e as crianças eram privadas do contato entre elas, permanecendo isoladas e trancadas em casa, até o perigo passar. 227

238 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A descoberta de uma vacina teve uma repercussão extraordinária. Em 1954, começou a ser aplicada a vacina de vírus inativados de Jonas Salk (IPV, do inglês, injetable polio vaccine), elaborada com três tipos de poliovírus, cultivados em rim de macaco, e inativada com formalina. Em 1963, houve uma segunda opção, a vacina de vírus atenuados de Albert Sabin (OPV, do inglês oral polio vaccine). Modificações nos processos produtivos aumentaram significativamente a eficiência de ambas as vacinas. Ambas têm vantagens e desvantagens. Para ser aplicada, a IPV demanda agulhas e seringas estéreis, um procedimento mais caro e complicado que a ingestão das gotas da OPV. Em contrapartida, por ser uma vacina de vírus atenuados, a OPV exige a manutenção da rede de frio, o que a IPV dispensa. Do ponto de vista da eficiência, a OPV confere uma imunidade mais ampla porque abrange a mucosa digestiva, impedindo a entrada do vírus selvagem no organismo e a infecção das células nervosas. Contudo, como o vírus atenuado da vacina, eliminado nas fezes, permanece no ambiente, a OPV acaba por atingir outras pessoas, afetando os não vacinados e os imunodeprimidos presentes no entorno. Por isso, alguns países preferem a IPV e outros a OPV. Novas vacinas estão sendo pesquisadas como, por exemplo, uma que leva o gene codificador de uma proteína do capsídeo viral, inserido em Escherichia coli. A síntese dessa proteína por uma bactéria, que coloniza normalmente o intestino, possibilitaria a imunização do hospedeiro. Quando em , nos Países Baixos, um surto da doença atingiu um grupo que se opõe à vacinação por motivos religiosos, verificou-se que o vírus selvagem continua presente no ambiente. Em 2000, a pólio reapareceu no Haiti e na República Dominicana. Na ocasião, revelou-se que o vírus atenuado pode reverter a sua forma patogênica, de modo que, mesmo tendo desaparecido a doença, a vacinação terá que ser mantida. Em 2004, com a aparição de um novo surto de pólio em países do oeste africano, confirmou-se que o objetivo ainda se encontra distante. Apesar do sucesso alcançado pela vacinação, a erradicação da doença parece ser bem mais difícil do que o esperado. Em 2015, a pólio ainda era endêmica no Paquistão e no Afeganistão, e alguns surtos ocorreram em Madagascar, Guiné e Ucrânia. Alguns países são vulneráveis, por estar situados em regiões onde as campanhas de vacinação são complexas e muitas vezes interrompidas por conflitos bélicos, corrupção e/ou superstição (Camarões, Guiné Equatorial, Etiópia, Iraque, Nigéria, Somália, Sudão do Sul e a República Árabe Síria). A INFLUENZA A influenza ou gripe é uma doença transmitida por um ortomixovírus (influenzavírus) e apresenta os seguintes sintomas: febre, dores musculares, garganta inflamada, fadiga e dor de cabeça. O material genético é RNA que está rodeado por um capsídeo proteico e um envelope, derivado da membrana celular do hospedeiro. O RNA confere a seu portador uma enorme variabilidade porque, diferente do DNA, os erros de replicação não são reparados por nenhum mecanismo celular. Em função das proteínas do capsídeo, classificam-se os influenzavírus em três grupos: A, B, e C. Os vírus dos grupos B e C infetam exclusivamente seres humanos e não causam epidemias. Os vírus da influenza da categoria A são os mais perigosos, porque se multiplicam tanto no homem como em outras espécies (aves, suínos, cachorros, cavalos, focas, baleias). As variantes de duas proteínas do envelope, a hemaglutinina (HÁ) e a neuraminidase (NA), são utilizadas para identificar os diferentes subtipos da categoria A: H1N1, H5N1 etc. Ao pular de uma espécie a outra, a recombinação do material genético de diferente origem origina vírus com características novas. Basta que esse vírus infecte o homem e sofra uma mutação que possibilite a transmissão pessoa a pessoa para desencadear uma pandemia. Ao longo do século XX, várias pandemias de gripe assolaram a terra. Em 1918, um surto de gripe sobreveio na Espanha, espalhando-se pelo mundo e causando a morte de 40 a 70 milhões de pessoas. 228

239 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS O vírus H1N1 da gripe espanhola circulou durante várias décadas, embora tenha perdido parte de sua patogenicidade a partir de Em 1957, uma segunda pandemia originou-se na China. A gripe asiática (H2N2) causou a morte de 2 milhões de pessoas. Poucos anos mais tarde, em 1968, o subtipo H3N2 apareceu em Hong Kong e alastrou-se pelo mundo, deixando 47 mil mortos. A gripe aviária (H5N1) surgiu na Ásia, em Embora a transmissão tenha sempre ocorrido no sentido ave-ave e ave-homem, milhares de aves foram sacrificadas durante os surtos de 2003 e 2004, devido ao temor de uma mutação que possibilitasse a transmissão do homem ao homem. A aparição do subtipo H5N1 demandou a modificação dos métodos tradicionais de produção de vacinas em embriões de galinha. Transferindo a informação genética relevante do vírus para um vírus de laboratório, obteve-se um protótipo viral, codificador dos antígenos correspondentes ao H5N1 que pode crescer em embriões de galinha. A gripe A (H1N1) ou gripe suína apareceu no México em Diferentemente das variantes anteriores, esta causou mais vítimas entre os jovens e as mulheres grávidas. A resistência dos mais velhos poderia ser explicada por um contato prévio com vírus de tipo H1N1, que circularam por um tempo na população. A existência de medicamentos antivirais contribuiu para o controle da pandemia. A rápida mobilização das autoridades nacionais e internacionais, assim como das empresas farmacêuticas, foi decisiva para a obtenção de uma vacina adequada. Contudo, algumas fraquezas foram expostas. Uma delas é a dificuldade de produzir rapidamente uma vacina, dado que, para obter 300 milhões de doses de vacina, são necessários 900 milhões de ovos embrionados. Em caso de urgência, a produção em cultivos celulares resultaria mais rápida. Mutação do RNA e recombinação de RNAs de diferente origem são as duas estratégias que explicam a enorme variabilidade do vírus da influenza e justificam a necessidade de mudar continuamente os antígenos da vacina. O candidato vacinal de hoje pode ser inócuo amanhã, sendo difícil prever contra quais antígenos do vírus dirigir a vacina. Por isso, as vacinas contra a gripe são preparadas anualmente, escolhendo as linhagens que se supõe que causarão a próxima epidemia. TUBERCULOSE, MALÁRIA E HIV/AIDS Ainda não temos vacinas para a tuberculose, a malária ou o HIV/AIDS, três doenças que causam um elevado número de mortes. A malária é uma doença causada por um protozoário (Gênero Plasmodium), transmitido através da picada de um mosquito (Gênero Anopheles). O decréscimo da incidência global da doença em 37%, e da mortalidade em 60%, observado a partir do ano 2000, deve ser atribuído à prevenção e ao tratamento dos doentes. No entanto, em 2015 registraram-se no mundo inteiro 214 milhões de casos. A maior dificuldade no desenho de uma vacina contra a malária reside no complexo ciclo do parasita, que se reproduz na glândula salivar do mosquito, se desloca na corrente sanguínea do hospedeiro, se replica no fígado e infecta as hemácias para multiplicar-se novamente. As vacinas em andamento, dirigidas a uma única etapa da vida do parasita, só conseguem imunizar parte das crianças vacinadas. Para ser eficiente, a vacina teria que combater o parasita em cada etapa do ciclo. Uma possibilidade engenhosa, em fase laboratorial, propõe induzir, no homem, anticorpos contra a forma do parasita que reside nas glândulas salivares do mosquito. Na picada, o Anopheles ingeriria os anticorpos, e estes bloqueariam a reprodução do parasita. A tuberculose é uma doença causada pelo bacilo de Koch (Mycobacterium tuberculosis), transmitido pelo ar. O declínio de 47% de casos, observado entre 1990 e 2015, deve ser atribuído aos melhores métodos de diagnóstico e tratamento. No entanto, em 2014, registraram-se 9,6 milhões de casos. 229

240 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Nos alvéolos pulmonares, as bactérias são fagocitadas pelos macrófagos, dentro dos quais elas se multiplicam lentamente, sem ser destruídas. Em algumas pessoas, a infecção permanece latente, em outras se manifesta com diferentes graus de gravidade. A vacina existente utiliza o bacilo atenuado BCG (Bacilo de Calmette-Guérin) para induzir imunidade ao bacilo de Koch. A vacina é eficiente em crianças pequenas, mas não imuniza crianças mais velhas ou adultos. Por outro lado, a eficácia da vacina diminui nas regiões perto do Equador, onde há numerosas infecções por micobactérias aparentadas. As pesquisas atuais visam entender melhor a imunidade no adulto e as características hereditárias que tornam as pessoas mais susceptíveis. Por enquanto, a mais insidiosa das três doenças é a HIV/AIDS, porque destrói a capacidade do sistema imune de responder a infecções oportunistas. Os primeiros casos apareceram em 1981 e se estenderam rapidamente pela população. Em 2013, 35 milhões de pessoas viviam com HIV/AIDS e 1,5 milhão de pessoas morreram de doenças ligadas a AIDS. A maior parte das novas contaminações ocorre nos países em desenvolvimento, especialmente o sul da África e a Ásia. No rasto da HIV/AIDS (e da adição a drogas injetáveis), a tuberculose reaparece com germes resistentes aos medicamentos. Apesar das medidas preventivas e dos grandes progressos alcançados no tratamento da HIV/AIDS, o ideal seria encontrar uma vacina. As dificuldades são enormes porque, para ativar a resposta imune, devem-se ativar as células T auxiliadoras que a coordenam, e são justamente estas as que o vírus destrói. Como geralmente o vírus penetra no organismo por via anal ou vaginal, permanecendo um tempo na corrente sanguínea antes de invadir as células, a vacina deveria estimular ambas as vias, a humoral e a celular, e se estender às mucosas. Na luta contra o HIV/AIDS, diversas estratégias são possíveis; uma delas seria impedir a invasão do organismo pelo vírus, a outra, ajudar o organismo a impedir a progressão e/ou a transmissão da doença. A falta de um modelo animal adequado e as frequentes mutações do vírus complicam a tarefa. Embora os resultados obtidos até agora tenham sido decepcionantes, estão sendo realizados os estudos clínicos correspondentes a vacinas de subunidades, de vetores virais recombinantes e de DNA. A AMEAÇA DAS DOENÇAS EMERGENTES À medida que eliminamos ou controlamos doenças, outras novas emergem e algumas das antigas reaparecem. Os microrganismos adquirem resistência aos medicamentos, e a destruição de habitats naturais deixa o homem a mercê de agentes infecciosos com os quais não teve contato prévio. O crescimento da população e sua concentração em zonas urbanas, as mudanças climáticas, o incremento das viagens internacionais e do comércio, assim como as mudanças comportamentais, são outros fatores determinantes para a dispersão de agentes infecciosos. Alguns exemplos de doenças emergentes são a gripe espanhola, a hepatite B, as febres hemorrágicas (Junín, Lassa, Marburg, Ebola etc.), a doença de Lyme, a BSE (encefalopatia espongiforme bovina), a doença dos Legionários, o HIV/AIDS, a Escherichia coli 0157:H7, a doença do vírus do Nilo ocidental, o SARS (do inglês, severe acute respiratory), o MERS (do inglês, middle east respiratory sindrome) e a dengue. Várias dessas doenças contam com testes diagnósticos, e, para algumas, já temos vacinas (hepatite B, doença de Lyme). Testes clínicos em seres humanos estão sendo realizados com vacinas contra HIV/AIDS, malária, dengue, cólera etc. Entre 2013 e 2016, uma epidemia de Ebola devastou a África ocidental, afetando Guiné, Libéria e Serra Leoa, e alastrando-se até o Senegal, a Nigéria e o Mali. O vírus de Ebola é comum na região, e embora sua forma de transmissão ao homem ainda não tenha sido totalmente esclarecida, sabe-se que envolve vários animais da região (chimpanzés, gorilas e morcegos). As mudanças evolutivas do vírus parecem ter influído menos na gravidade da epidemia que as condições sociais e culturais existentes: infraestrutura destruída por décadas de guerras civis; 230

241 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / VACINAS dificuldade das equipes médicas em distinguir entre diversas infecções com sintomas parecidos; práticas religiosas de sepultamento dos doentes facilitando o contágio. Mais de 28 mil casos e 11 mil mortes abalaram a já comprometida estrutura social e econômica dos países afetados. Os surtos que ocorreram nos Estados Unidos e na Europa, originados por pessoal das equipes médicas transferido para tratamento em seus países de origem, foram rapidamente controlados. Também a Nigéria conseguiu controlar um surto incipiente, utilizando a estrutura sanitária criada, com o apoio de organizações internacionais, para a erradicação da pólio. Nenhum país está preparado para a emergência de uma doença desconhecida. No entanto, a epidemia de Ebola deixa duas lições: a necessidade de contar com testes de diagnóstico rápidos e a obrigação moral de manter em alerta uma infraestrutura sanitária sólida; as vacinas serão de utilidade mais adiante, em ocasião do próximo surto. Atualmente, vários países de América Latina (Brasil, Colômbia) enfrentam uma epidemia de dengue, chikungunya e zika, três doenças de origem viral transmitidas por mosquitos do gênero Aedes (A. aegypti e A. albopictus), transmissores, também, da febre amarela. Existe uma vacina para a febre amarela e encontram-se adiantadas duas vacinas contra a dengue (Sanofi-Pasteur e Butantan). Os fatores determinantes da emergência dessas doenças são as mudanças climáticas, a abertura de rotas comerciais, as viagens internacionais e, fundamentalmente, a falta de saneamento básico, porque facilitam a dispersão e a proliferação do mosquito nas áreas urbanas. Sistemas de atendimento médico precários e falta de testes de diagnóstico agravam a situação da região. A aparição de numerosos casos de microcefalia, atribuídos ao vírus zika, exige uma resposta rápida, mas qual? Uma vacina demora em chegar, e por muito que se queira apressar, não há como diminuir o tempo necessário para fazer os testes clínicos pertinentes e produzir o número de doses necessárias. O caminho parece ser impedir a multiplicação do mosquito, e várias formas foram descritas no Capítulo 11. BIOTERRORISMO E BIOSSEGURIDADE Esporos disseminados pelos correios causaram um surto de antraz, logo depois do atentado às torres do World Trade Center (Estados Unidos, setembro de 2001), alertando o mundo sobre a ameaça de bioterrorismo. Não foi a primeira vez que foram utilizadas armas biológicas. Os romanos usavam animais mortos para infectar os poços de seus inimigos. Antes de levantar o sítio à cidadela de Kaffa (Crimeia, 1346), o exército tártaro de Janibeg catapultou para dentro das muralhas os mortos de peste, iniciando uma terrível epidemia que se difundiu na Europa e dizimou a população. Na América (do Sul e do Norte), os colonizadores exterminaram tribos indígenas com cobertores contaminados com varíola, deixados como presente. Em 1941, durante o conflito sino-japonês, o exército do Japão disseminou a peste bubônica no norte da China, em cinco ocasiões. Estima-se que uma dúzia de países teria armas biológicas de destruição em massa, envolvendo aproximadamente 70 agentes infecciosos. Atualmente, ou em curto prazo, existem vacinas para alguns deles (Bacillus anthracis, Clostridium botulinicum, Yersinia pestis, Francisella tulariensis, varíola e hantavírus). Entretanto, de um ponto de vista científico, sanitário ou financeiro, a vacinação poderia não ser o método de combate mais eficiente. Por isso, boa parte do esforço antiterrorista está sendo orientado atualmente para o melhoramento de diagnósticos e a procura de novos medicamentos antivirais e antibacterianos. Outro motivo de preocupação está na quantidade de informação referente ao genoma de patógenos disponível nos bancos de dados públicos, porque existe o temor que esse conhecimento possa ser utilizado para elaborar armas biológicas. 231

242 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Em 2002, um grupo de pesquisadores americanos mostrou que partículas infecciosas sintéticas de poliovírus podem ser obtidas a partir da sequência genômica disponível na Internet. Esses pesquisadores sintetizaram alguns fragmentos de DNA e encomendaram outros a empresas especializadas. Juntando os pedaços, eles construíram uma molécula de DNA de pares de bases. Depois de transcrever a informação e colocar o RNA em um meio com componentes celulares, eles obtiveram partículas virais. Recentemente, outro grupo de pesquisadores utilizou o mesmo método para sintetizar o vírus da gripe espanhola. No fim do ano 2011, pesquisadores holandeses e norte-americanos noticiaram ter conseguido manipular o vírus H5N1 em laboratório, tornando-o facilmente transmissível em seres humanos. O trabalho, que poderia servir tanto para elaborar uma vacina como para criar uma arma letal, levanta o problema da liberação dos dados da pesquisa que, normalmente, são compartilhados por pesquisadores de todos os países. O perigo do bioterrorismo não deve ser subestimado. Biosseguridade é uma nova disciplina que lida com a utilização inadequada do conhecimento biológico e, particularmente, com as pesquisas consideradas de uso duplo, que podem ser utilizadas para o bem ou para o mal. 232

243 C A P Í T U L O 18 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE OS TESTES DIAGNÓSTICOS O conhecimento e a experiência do médico são determinantes no reconhecimento dos sintomas de uma doença. O diagnóstico será estabelecido a partir de vários elementos, tais como a história clínica do paciente, a anamnese, os exames físicos e uma bateria de análises e/ou testes laboratoriais. Solicitados pelo médico, para monitorar o estado de saúde do paciente, os testes de rastreio identificam fatores químicos, microbianos ou genéticos que possam causar uma doença ou estar associados a ela. Constituem uma rotina que varia dependendo do sexo e da idade do paciente. Os resultados serão avaliados em relação a um conjunto de valores considerados normais e remetidos ao médico como uma fonte objetiva de informação. Geralmente realizados em amostras de sangue e de urina, o objetivo desses testes é detectar qualquer disfunção, seja para induzir mudanças no estilo de vida do paciente e/ou para iniciar um tratamento. Como exemplos, o hemograma, a análise de urina, o lipidograma, a identificação do antígeno prostático para diagnóstico de câncer etc. Qualquer negligência relativa à adoção dos testes adequados pode ter consequências graves para a saúde pública. Em 1985, embora a empresa Abbott já tivesse no mercado um teste de rastreio do vírus HIV nas doações de sangue, a França preferiu aguardar o lançamento de um teste francês. Em poucos meses, 297 dos pacientes transfundidos foram contaminados e três ministros de Estado tiveram que comparecer na Justiça e responder pelo incidente. Inserida nas áreas veterinárias e médicas, a indústria de diagnósticos in vitro cresce rapidamente no setor de diagnósticos moleculares (doenças infecciosas e cardiovasculares, oncologia e farmacogenética), acompanhando as demandas dos mercados da América Latina, do Leste Europeu, do Oriente Médio e do Leste Asiático. AS TENDÊNCIAS ATUAIS A maior parte dos testes diagnósticos é realizada hoje com alta tecnologia, reunindo em ambientes automatizados diversos reagentes, instrumentos analíticos e produtos acessórios de controle de qualidade. Em consequência, as análises clínicas estão se concentrando em umas poucas empresas, com suficiente poder econômico para tratar um volume grande de amostras que justifique a utilização de sistemas robotizados. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

244 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Em outra vertente mercadológica, kits relativamente simples permitem o diagnóstico de gravidez e o monitoramento de algumas condições crônicas, como a diabete, sendo vendidos nas farmácias ou via Internet. Comercializado recentemente, outro tipo de kit informa os clientes interessados sobre sua ancestralidade e predisposição a várias doenças. DISPOSITIVOS MINIATURIZADOS A construção de biochips, dispositivos miniaturizados de arrays moleculares de proteínas, anticorpos ou ácidos nucleicos, estimulou o desenvolvimento de várias plataformas comerciais que revolucionaram o setor de testes de diagnóstico. Essa tendência se vê acentuada com a chegada de materiais e dispositivos em escala nanométrica. O desenvolvimento da tecnologia microfluídica permitiu miniaturizar os ensaios em dispositivos que realizam automaticamente todas as etapas do protocolo. Um biochip microfluídico típico pode reunir, em um único dispositivo, um procedimento complexo: extração da amostra, separação eletroforética, coloração/descoloração e identificação. Os biochips microfluídicos ou lab-on-a-chip (LOC) permitem obter resultados rapidamente, no consultório médico, no hospital (emergência, unidade de terapia intensiva), em algum lugar isolado ou em uma emergência de biosseguridade, sem precisar recorrer ao laboratório (Figura 18.1). O lab-ona-chip demanda uma intervenção humana mínima, dando um resultado preciso que pode ser arquivado facilmente FIGURA Imagens comerciais de alguns dispositivos miniaturizados utilizados em testes diagnósticos A. Lab-on-a-chip de Agilent (lab-on-a-chip-loc jpg ( B. Chip de DNA para diagnóstico de Toshiba ( C. Gene chip de Affymetrix ( A B C 234

245 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE/ TESTES DIAGNÓSTICOS O QUE É UM BOM TESTE As técnicas bioquímicas, imunológicas e genéticas ocupam um lugar preponderante no setor de diagnósticos, porque reúnem várias qualidades que são indispensáveis: sensibilidade, especificidade, exatidão e reprodutibilidade (Tabela 18.1). Apesar ser aplicadas também na área ambiental (análise de solos, qualidade da água) e na indústria de alimentos (detecção de contaminantes nos alimentos ou nas matérias-primas), neste capítulo nos limitaremos a analisar sua utilização na área de saúde TABELA As qualidades de um bom teste de diagnóstico. QUALIDADE Sensibilidade Especificidade Exatidão Reprodutibilidade DEFINIÇÃO Probabilidade de dar um resultado positivo quando a condição está presente. Probabilidade de dar um resultado negativo quando a condição não está presente. Dar o mesmo valor que o obtido com outro método. Em se tratando de um teste quantitativo, dar sempre o mesmo valor na mesma amostra AS TÉCNICAS COM BASE BIOQUÍMICA As técnicas clássicas de identificação microbiana estão sendo substituídas, desde a década de 1970, por sistemas miniaturizados. Nos sistemas API da empresa Biomérieux, por exemplo, uma suspensão de microrganismos é adicionada a uma galeria de minitubos contendo os reagentes necessários para desenvolver diferentes reações químicas. Após a incubação, a análise dos resultados possibilita a identificação do microrganismo (Figura 18.2). Diversos tipos de galerias conseguem identificar quase todas as bactérias e leveduras de interesse clínico. Além de ser mais seguros, o sucesso desses dispositivos se deve à redução da quantidade de reagentes e do trabalho laboratorial, dois fatores que incidem nos custos. Na clínica médica, o combate à infecção depende da seleção de um antibiótico adequado. Os métodos tradicionais de elaboração de um antibiograma, para identificar os antibióticos aos quais o patógeno é sensível, demandam um lapso de 24 a 48 horas que pode ser fatal para o paciente. Os primeiros ensaios, com biochips microfluídicos portáveis, permitiriam obter o antibiograma de um patógeno com menor gasto de reagentes e em menos tempo (2 a 4 horas). Espera-se que esses dispositivos estejam disponíveis em curto prazo FIGURA Imagem comercial dos sistemas API de Biomérieux ( 235

246 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) AS TÉCNICAS COM BASE IMUNOLÓGICA Baseadas nas reações de aglutinação e precipitação entre um antígeno e o anticorpo específico, as técnicas imunológicas receberam grande impulso com a descoberta e o desenvolvimento da tecnologia de hibridomas. Apesar de ser complexa, demorada e cara, a tecnologia de hibridomas abastece os laboratórios com reagentes standard, específicos e sensíveis. Associados a moléculas radiativas ou fluorescentes, os anticorpos monoclonais detectam os antígenos específicos em células, tecidos, soros e corridas eletroforéticas (imunofluorescência, radioimunoensaio, Western Blot etc.). Utilizam-se também para separar diferentes populações celulares (CellSorter) e localizar tumores. Em outro tipo de testes, os anticorpos estão acoplados a enzimas que formam um produto colorido em presença do substrato (ELISA, do inglês Enzyme Linked Immunosorbent Assay). Esses testes detectam e quantificam tanto a concentração de anticorpos em infecções ou doenças autoimunes, como a de antígenos, sejam hormônios, marcadores cancerosos, alérgenos em alimentos e na poeira caseira, toxinas alimentares, esteroides usados ilicitamente por atletas, drogas como a cocaína e os opiáceos etc. (Figura 18.3) FIGURA O método direto e indireto de um teste positivo de ELISA. MÉTODO DIRETO O anticorpo é fixado na placa de microtitulação. MÉTODO INDIRETO O antígeno é fixado na placa de microtitulação. Coloca-se uma amostra de sangue como fonte de antígeno. Este se fixa nos anticorpos. Retira-se o excesso por lavado. Coloca-se uma amostra de soro como fonte de anticorpos. Estes se fixam no antígeno. Retira-se o excesso por lavado. Acrescentam-se anticorpos ligados a uma enzima E, que se fixam no antígeno. Retira-se o excesso por lavado. Acrescentam-se anticorpos específicos para a imunoglobulina humana, ligados a uma enzima E, que se fixam nos anticorpos do soro, fixados previamente no antígeno. Retira-se o excesso por lavado. Adiciona-se o substrato da enzima, formando-se um produto colorido P. Adiciona-se o substrato da enzima, formando-se um produto colorido P. A cor é proporcional à quantidade de antígeno no sangue. A cor é proporcional à quantidade de anticorpos no soro. 236

247 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE/ TESTES DIAGNÓSTICOS AS TÉCNICAS COM BASE GENÉTICA O acúmulo de conhecimento sobre o genoma humano favorece a utilização das tecnologias genéticas para o diagnóstico clínico. Os estudos cromossômicos evoluíram notavelmente com a utilização de sondas de DNA acopladas a moléculas fluorescentes (SKY, do inglês spectral karyotyping). O computador transforma a imagem microscópica em outra de cores brilhantes bem definidas, facilitando a identificação dos pares cromossômicos e de pequenas translocações (Figura 18.4 A). Sondas específicas também possibilitam a localização de sequências gênicas nas células (FISH, do inglês fluorescence in situ hibridization, ASO, do inglês Allele-specific oligonucleotide) e nos fragmentos de ácidos nucleicos, previamente separados por eletroforese em gel (Southern Blot, Fingerprint). Contudo, a grande estrela continua sendo a reação em cadeia da polimerase ou PCR (do inglês, polymerase chain reaction), uma tecnologia que amplifica quantidades ínfimas de DNA, facilitando as análises posteriores (Figura 18.4 B). Na área clínica, a PCR é aplicada na identificação de patógenos e na pesquisa de variações genéticas nos pacientes. A versatilidade da técnica tem dado origem a procedimentos bem diversificados, alguns dos quais integrados em microdispositivos do tipo Lab-on-a-chip. Pode-se monitorar a reação de amplificação com anticorpos fluorescentes, eliminando os estudos complementares de eletroforese posteriores e obtendo os resultados em tempo real. Os biochips de DNA encontraram aplicações em áreas tão diversas como meio ambiente, epidemiologia, controle de qualidade de alimentos etc. Na área de saúde, a tecnologia é utilizada com diferentes objetivos: identificar um patógeno, descobrir quais os genes ativados em um tecido; comparar as sequências de dois alelos; encontrar o medicamento adequado para um paciente; prever o risco de uma pessoa se for exposta a uma substância X. Os dispositivos miniaturizados facilitam, também, a escolha de tratamentos farmacológicos adequados ao perfil do paciente, o diagnóstico do câncer e das doenças cardíacas e neuropsiquiátricas. Por ser portáveis, robustos e relativamente baratos, os dispositivos miniaturizados com diferentes painéis de genes têm um espaço garantido no setor de testes diagnósticos. No entanto, a chegada das novas tecnologias de sequenciamento de DNA, que permitem analisar o genoma todo, abre um novo espaço para o diagnóstico genético FIGURA 18.4: As técnicas com base genética A. Imagem mostrando a identificação dos 46 pares de cromossomos humanos mediante a técnica de SKY, segundo o National Human Genome Research Institute ( B. Imagem comercial de um termociclador para a reação em cadeia da polimerase, de Applied Biosystems ( 237

248 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) O DIAGNÓSTICO DAS DOENÇAS INFECCIOSAS A evolução de uma doença é detida com o diagnóstico, seguido de tratamento. Nos países desenvolvidos, e em alguns setores dos países em desenvolvimento, os novos testes de diagnóstico se encontram disponíveis para a população. Contudo, essa não é a realidade dos países mais pobres, sem acesso a uma tecnologia que exige conhecimentos, material e equipamentos especializados. Nesses países, uma das principais causas de mortalidade continuam sendo as doenças infecciosas, como HIV/AIDS, tuberculose e malária. O diagnóstico de HIV está baseado no reconhecimento da proteína p24 do vírus e na presença de anticorpos detectados mediante os testes ELISA ou Western Blot, que atualmente podem ser combinados em um só. Uma vez diagnosticada a infecção por HIV, acompanha-se a evolução mediante a medição da carga viral, por PCR quantitativa, e a contagem de células CD4. Dependendo dos resultados, dá-se início ao tratamento. Em alguns países, encontram-se à venda kits para diagnóstico de HIV/AIDS, mas sua utilização individual está muito limitada pela dificuldade de enfrentar o diagnóstico sem um apoio psicológico adequado. Também é difícil, para o leigo, lidar com os conceitos de falso positivo ou falso negativo. No entanto, os testes de diagnóstico rápido são uma ferramenta preciosa em mãos de pessoal treinado. O diagnóstico da tuberculose envolve várias etapas, lentas e trabalhosas. Descoberta a infecção latente pela reação à tuberculina, os estudos posteriores exigem radiografias, observações microscópicas e cultivos microbianos. Testes mais recentes identificam rapidamente os anticorpos no sangue, pelo teste ELISA, e o Mycobacterium tuberculosis na amostra de esputo, com sondas genéticas, mas sua difusão é limitada pelo custo. O diagnóstico de malária depende de observações clínicas confirmadas por microscopia, uma técnica relativamente econômica, mas que exige pessoal treinado. Apesar da existência de testes genéticos, os testes imunológicos rápidos resultam mais convenientes nas regiões remotas, sem laboratórios ou equipamentos apropriados. Além de mais econômicos, facilitam a escolha do tratamento, porque diferenciam o Plasmodium falciparum, resistente à cloroquina, de outras espécies que podem causar a doença e são sensíveis ao medicamento. Os países emergentes precisam de testes de diagnóstico rápidos e baratos, adaptados às tantas outras doenças que os afligem (leischmaniose, leptospirose, dengue, chikungunya, zika, infecções por rotavírus, doença de Chagas etc.). Para acompanhar a evolução das doenças emergentes, a grande inovação seria complementar os testes de diagnóstico laboratoriais com outros, mais simples e rápidos, realizados com microdispositivos portáveis. A TIPIFICAÇÃO DE TECIDOS SANGUE A tipificação das hemácias classifica as pessoas em quatro grupos para os marcadores ABO (A, B, AB e O) e dois para o sistema Rh (Rh + e Rh - ). A caracterização rotineira deste último durante a gravidez permite tomar medidas em caso de incompatibilidade sanguínea mãe-feto. Também se tipificam os sistemas ABO e Rh antes de uma transfusão sanguínea, uma intervenção salva-vidas em pacientes que sofreram uma hemorragia (acidente, cirurgia, doenças digestivas etc.), ou que apresentam um quadro de anemia séria (quimioterapia, câncer, doenças hematológicas). A tipificação dos antígenos ABO e Rh da superfície das hemácias nem sempre é suficiente, porque existem vários outros sistemas de grupos sanguíneos capazes de desencadear uma reação de 238

249 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE/ TESTES DIAGNÓSTICOS incompatibilidade. Em pacientes com um passado de gravidez ou de transfusão prévia, os anticorpos a esses sistemas são pesquisados no soro com kits de hemácias específicas FIGURA O sistema HLA C. A herança dos haplótipos. O CROMOSSOMO 6 CRUZAMENTO D. Reação mista ou cross-matching. Colocam-se em contato as células do doador com o soro do receptor, em presença de complemento. Se as células do doador ficam intactas, há compatibilidade. TRANSPLANTE INCOMPATÍVEL Células Soro Complemento Lise do doador do receptor TRANSPLANTE COMPATÍVEL Células Soro Complemento Células intactas do doador do receptor 239

250 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A palavra final corresponde aos testes de compatibilidade, em que se coloca o soro do receptor em presença das hemácias do doador. Indispensáveis na rotina de um banco de sangue, esses testes personalizados são realizados por pessoal médico ou técnico. Nos centros hospitalares que processam um número alto de amostras de sangue, os testes sorológicos clássicos em tubos de vidro estão sendo substituídos por novas tecnologias, em estações de trabalho automatizadas. Os Gel Tests para tipificação de hemácias estão baseados na centrifugação controlada das hemácias em um gel de dextrana-acrilamida. Entre suas vantagens está a possibilidade de trabalhar com numerosas amostras de pequeno volume, a eliminação da etapa de lavados e a obtenção de resultados estáveis. Se for necessário, os dados poderão ser analisados posteriormente e reavaliados por um supervisor. Também se utilizam técnicas cromatográficas como a ACT (do inglês affinity column technology), para identificar subclasses de imunoglobulinas em hemácias sensibilizadas, e placas de microtitulação, para pesquisa de anticorpos. OUTROS TECIDOS E ÓRGÃOS A rejeição de um órgão transplantado deve-se à incompatibilidade entre os tecidos do doador e do receptor. Além dos antígenos do grupo sanguíneo (ABO), existem outros marcadores de identidade que também se expressam nas células de um organismo, como os antígenos leucocitários do sistema HLA (do inglês, human leucocyte antigen). O sistema imune os utiliza para diferenciar as células que fazem parte do organismo ( eu ) das que não pertencem a ele ( não eu ). Os antígenos do sistema HLA são codificados por um conjunto de genes estreitamente ligados, localizados no cromossomo 6. Os genes A, B e C determinam os antígenos de classe I, presentes em todas as células, salvo as hemácias. Já o locus D determina outros três antígenos (DR, DQ e DP), denominados de Classe II, que são encontrados em algumas células (macrófagos, monócitos, células dendríticas e células endoteliais). Os de maior importância clínica são os antígenos de classe I, codificados pelos alelos de A e B, e os de classe II, relativos a DR. A herança do sistema HLA segue um padrão de codominância, ou seja, ambos os alelos se expressam nas células. Quando uma pessoa é caracterizada como HLA - A1 A3 B8 B14 DR2 DR10, isto significa que, em um cromossomo, leva os alelos A1 B8 DR2 herdados de um dos genitores, e, no outro, A3 B14 DR10, herdados do outro. Por estarem estreitamente ligados, esses genes são transmitidos em blocos, denominados haplótipos (Figura 18.5 A). Como esses genes contam com mais de 450 alelos, seria possível ter milhões de combinações que dariam a cada indivíduo uma identidade única. Contudo, alguns haplótipos são mais frequentes que outros, especialmente em diferentes grupos raciais. Os testes de histocompatibilidade são prévios a um transplante de rim ou de células-tronco hematopoiéticas. Para selecionar os pares doador-receptor histocompatíveis, identificam-se os antígenos celulares de ambos mediante painéis de anticorpos e instrumentação laboratorial. Utilizase também a PCR para caracterizar os genes HLA-DP do doador e do receptor. Como gravidezes, transplantes anteriores ou transfusões podem originar, no receptor, anticorpos contra o órgão a transplantar, a verificação da compatibilidade é fundamental. O teste para prevenir a rejeição é a reação mista ou cross-matching, em que se coloca o soro do receptor em contato com as células do doador, em presença de complemento. Se houver compatibilidade, as células do doador ficarão intactas; em caso de incompatibilidade, haverá lise celular (Figura 18.5 B). Os testes de histocompatibilidade também são utilizados no diagnóstico de doenças autoimunes. 240

251 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE/ TESTES DIAGNÓSTICOS O DIAGNÓSTICO DE DOENÇAS GENÉTICAS AS LIMITAÇÕES DOS TESTES As doenças de origem genética representam um grupo heterogêneo de patologias que obedecem a causas diversas: alterações no número e na estrutura dos cromossomos, ação de um gene determinando a síntese de uma proteína ou sua ausência, ação de vários genes interagindo com fatores ambientais, tais como o fumo, a dieta, o estresse etc. (Tabela 18.2). O diagnóstico das doenças monogênicas está baseado em observações clínicas e testes laboratoriais (metabolismo, cromossomos, DNA). A localização e o sequenciamento dos genes responsáveis pelas principais doenças monogênicas possibilitaram o desenvolvimento de testes genéticos. Contudo, esses testes apresentam algumas limitações, devidas à própria heterogeneidade do determinismo genético: o Algumas mutações são inócuas para a saúde do portador (polimorfismos). o Mutações em genes diferentes podem causar a mesma doença. o Mutações diferentes dentro de um mesmo gene podem causar a mesma doença. o Mutações diferentes dentro do mesmo gene podem causar doenças parecidas, com prognóstico diferente (benigno ou grave). Um teste genético pode não detectar todas as mutações capazes de causar uma doença. Por outro lado, sua sensibilidade depende da inclusão da informação mais recente, resultante da pesquisa genética. Também existem doenças genéticas que aparecem em uma família devido a mutações em algum gene ainda desconhecido, de modo que não é possível sua identificação. O caso não será resolvido, a menos que se encontre uma ligação com outro gene próximo e bem conhecido, que funcionará como um marcador. A transmissão do gene marcador permitirá inferir o modo de transmissão do gene desconhecido. Nessa linha de investigação, um estudo desenvolvido por 50 grupos de pesquisa (Wellcome Trust Case Control Consortium) identificou recentemente 24 regiões do genoma humano fortemente relacionadas com 7 doenças diferentes (Doença de Crohn, diabete tipo 1 e 2, doença cardiovascular, hipertensão, artrite reumatoide e doença bipolar). Outro problema de difícil solução é a análise do determinismo genético de doenças que apresentam um padrão de herança complexo, em que diversos fatores ambientais interagem com vários genes. A no ser que se encontre um gene que tenha um efeito muito maior dos restantes, os testes genéticos serão de difícil elaboração. A presença de determinados alelos, como BRCA1 e BRCA2, está associada a uma predisposição familiar ao câncer de mama (Figura 18.6). Porém, esses alelos não são detectados na maioria dos outros casos da mesma doença. Em outros termos, nem todas as doenças de origem genética são familiares, podendo aparecer devido a mutações ou alterações cromossômicas ocorridas ao longo da vida. AS ESTRATÉGIAS SEGUIDAS Apesar de suas limitações, os testes genéticos representam um avanço significativo do ponto de vista médico e individual. Aplicados em qualquer momento da vida de uma pessoa, respondem a diferentes objetivos. 241

252 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) OS TESTES GENÉTICOS NO ADULTO No adulto, os testes genéticos são feitos a partir de alguma evidência clínica, para confirmar ou descartar um diagnóstico. Realizam-se também para prever se uma pessoa que não apresenta sintomas irá desenvolver uma doença da qual já existem casos na família (doença de Huntington, doença de Alzheimer), ou para detectar a presença de algumas mutações gênicas associadas à predisposição a alguma doença. O RASTREIO DE PORTADORES O rastreio de portadores é realizado quando um casal planeja ter filhos e deseja saber se tem ou não um determinado alelo. Geralmente, é solicitado quando há casos de doença na família ou quando o casal pertence a uma população em que a frequência da doença é alta. Nas famílias afetadas, os testes genéticos identificam os indivíduos portadores de um gene ou de uma alteração cromossômica que possa trazer problemas para eles ou para sua descendência. Rastreio de portadores e aconselhamento genético são duas medidas que conseguiram diminuir a incidência de várias doenças em algumas comunidades norte-americanas: a anemia falciforme entre os afro-americanos, a doença de Tay-Sachs entre os judeus askenazim, a fibrose cística entre os irlandeses. O DIAGNÓSTICO PRÉ-NATAL O diagnóstico pré-natal é realizado quando há algum risco ou indício de doença genética no feto. Por exemplo, uma concentração elevada de -fetoproteína no sangue materno, entre a 15 a e a 20 a semana de gravidez, indica a possibilidade de o feto apresentar anomalias, como a síndrome de Down. Nesse caso, a mãe poderá ser aconselhada a fazer uma amniocentese, extraindo-se uma pequena quantidade de líquido amniótico e estudando as células do feto para confirmar ou excluir vários diagnósticos. Também poderá optar por uma biópsia de vilosidades coriônicas, em que se retiram algumas células da placenta (córion) para análise. Em uma fecundação in vitro, o diagnóstico pré-natal pode preceder a implantação do embrião. Após três divisões celulares, quando o embrião se encontra num estado de oito células, uma delas é removida para a determinação do sexo e das características genéticas. O procedimento não causa dano ao embrião. O RASTREIO NO RECÉM-NASCIDO O rastreio de erros inatos do metabolismo no recém-nascido possibilita o tratamento de algumas condições hereditárias, evitando danos e lesões irreparáveis. Aproximadamente 5% das crianças nascem com problemas congênitos ou hereditários, alguns dos quais podem ser previstos mediante testes genéticos de rastreio. A partir da década de 1960, diminuíram as deficiências mentais causadas pela fenilcetonúria, graças à implantação do Teste de Guthrie ou do pezinho, que mede a quantidade de fenilalanina no sangue. Uma técnica nova, derivada da espectrometria de massa, é capaz de detectar 20 transtornos metabólicos em um único teste. 242

253 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE/ TESTES DIAGNÓSTICOS TABELA Algumas das mais de doenças genéticas descritas Nas doenças monogênicas, a transmissão mostra um padrão claro de herança nem sempre fácil de evidenciar nas doenças esporádicas ou multifatoriais. Nestas, a genética tem um rol importante, mas nem sempre suficiente para, por exemplo, determinar a manifestação dos sintomas. TIPO DE DOENÇAS HERANÇA EXEMPLO Cromossômicas Esporádica Síndrome de Down, síndrome de Turner, síndrome de Klinefelter. Mitocondriais Materna Síndrome MERRF, síndrome MELAS, doença de Leigh (NARP), doença de Leber. Monogênicas Autossômica recessiva Autossômica dominante Recessiva ligada ao X Dominante ligada ao X Fibrose cística, fenilcetonúria, anemia falciforme, doença de Tay-Sachs, talassemias. Hipercolesterolemia familiar, doença de Huntington, rim policístico, neurofibromatose, acondroplasia. Hemofilias, distrofia muscular de Duchenne, síndrome de Lesch-Nyan, síndrome do X frágil. Síndrome de Rett. Multifatoriais Contribuição genética variável; influência de fatores ambientais Malformações congênitas (palato fendido, defeitos do tubo neural). Câncer (intestino, mama, ovário, próstata e melanoma). Doenças cardiovasculares (hipertensão arterial, pressão alta, alguns casos de doença cardíaca, hipercolesterolemia). Doenças metabólicas (Diabetes, gota). Doenças neurológicas e/ou psiquiátricas (Alzheimer em idade avançada, esquizofrenia, doença bipolar). Doenças musculoesqueléticas (artrite, transtornos reumáticos, osteoporose). Doenças dermatológicas (psoríase, eczema). Doenças respiratórias (asma, alergias, enfisema) DIAGNÓSTICO PREVENTIVO E PREDITIVO Ao associar um gene a uma doença, os testes genéticos permitem iniciar um tratamento que trate os sintomas ou retarde sua aparição (hemofilia, distrofia muscular de Becker-Duchenne, fibrose cística etc.). Contudo, quando se trata de uma doença para a qual não existe nem cura nem alívio, a existência de um teste de diagnóstico pode exigir escolhas muito complexas. Consideremos, por exemplo, a Coreia de Huntington, uma doença autossômica dominante de difícil tratamento e que se manifesta tardiamente. A decisão de fazer o teste depende da pessoa interessada, mas atinge seus familiares, porque o diagnóstico pode ser informativo sobre a constituição genética dos outros integrantes da família. Outro exemplo é o da transmissão familiar da doença de Alzheimer, em que algumas pessoas querem saber se vão a desenvolver os sintomas e outras preferem não saber. Os avanços tecnológicos recentes abrem caminho para o estudo das doenças que resultam da interação de fatores genéticos e ambientais. Já não se trata de prever uma doença, mas de calcular qual a probabilidade de vir a desenvolvê-la. A função de um diagnóstico preditivo é de dar ao paciente 243

254 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) a possibilidade de fazer escolhas saudáveis, modificando seu modo de vida e aumentando a vigilância frente a determinados sintomas. Hoje existem testes de predisposição a doenças cardiovasculares e a vários tipos de câncer. E estão sendo desenvolvidos testes preditivos de resposta a medicamentos. A predição tem suas limitações. Por exemplo, as mulheres com o gene BRCA1 têm 80% de chances de desenvolver câncer de mama aos 65 anos de idade; um risco considerado alto, mas sem certeza absoluta (Figura 18.6). Graças ao diagnóstico preditivo, elas poderão aumentar as medidas preventivas, isto é, mamografias, controles médicos etc.; outras, como a atriz Angelina Jolie, optarão por uma mastectomia e a extirpação de ovários. Contudo, do ponto de vista preventivo, a predisposição familiar responde só por 5 a 10% dos casos de câncer, os 90 a 95% restantes devem-se a mutações adquiridas ao longo da vida FIGURA O uso de arrays no diagnóstico de mutações nos genes BRCA1 e BRCA2 Compara-se o padrão obtido na hibridização dos fragmentos de DNA marcados de uma paciente e os de um controle normal. A hibridização de ambos DNAs, do DNA da paciente ou do DNA do controle com as sondas, detectada por varredura (scanner), é sinalizada com cores diferentes em uma imagem computadorizada. Tecido da paciente Tecido controle Extração de mrna Extração de mrna Preparação de cdna (transcriptase reversa) Preparação de cdna (transcriptase reversa) Amplificação do DNA e marcação com uma substância fluorescente Amplificação do DNA e marcação com outra substância fluorescente Mistura de ambos os cdnas marcados Hibridização com as sondas fixadas na placa do microarray e rinsagem Varredura e leitura Diagnóstico Os pontos verdes e vermelhos identificam, respectivamente, os sítios de hibridização de cada um dos DNAs testados. Os pontos amarelos identificam os sítios de hibridização de ambas as amostras, os pontos pretos, os de nenhuma das duas amostras. 244

255 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE/ TESTES DIAGNÓSTICOS Um caso muito controverso é o da empresa 23andMe, com sedes nos Estados Unidos e no Reino Unido. Mediante 199 dólares e uma amostra de saliva, acondicionada em um kit especialmente preparado e enviado pelo correio, a empresa informa o cliente sobre sua ancestralidade e algumas características gênicas que poderiam passar a sua descendência. Apesar de ser uma informação pouco relevante e sem utilidade para a maioria das pessoas, a empresa tem sucesso comercial. Calcula-se que, em 20 anos, nos países desenvolvidos, a expansão do mercado dos testes genéticos possibilitará tratamentos de saúde pré-sintomáticos. Quantos desses testes serão necessários? Quantas pessoas estarão dispostas a mudar seu estilo de vida em função de uma estimativa de risco? Quantas pessoas se sentirão erroneamente seguras em relação ao estilo de vida que adotarem? A implementação da medicina preditiva deve ser analisada criteriosamente por todos os setores da sociedade. Quem controlará a aplicação dos testes genéticos? Como garantir que a decisão de se submeter a um teste obedeça exclusivamente a uma escolha pessoal? Como seria armazenada essa informação e com quem seria compartilhada? Seria possível formar uma subclasse de indivíduos sem seguros de saúde nem empregos, discriminados em função de seus genes? AS PATENTES Nos Estados Unidos, até 2013, uma patente outorgava direitos sobre uma sequência de DNA ou um gene a quem os identificara pela primeira vez. O indivíduo ou a empresa que obteve a patente podia determinar, durante 20 anos, como essa sequência ou esse gene seriam usados em atividades de pesquisa ou em testes clínicos. Nessa data, e em ocasião do julgamento dos direitos da empresa Myriad sobre os genes BRCA1 e BRCA2, a Corte Suprema de Justiça revogou todas as patentes anteriores, disponibilizando mais de 4 mil genes. Os juízes argumentaram que, por ser um produto da natureza, um gene não poderia ser patenteado; em contraposição, o cdna poderia ser patenteado, porque é um produto elaborado pelo homem e não se encontra na natureza. No Brasil, não são patenteáveis as sequencias de nucleotídeos isolados de organismos vivos naturais. Contudo, o cdna pode ser patenteado sempre que seja diferente do DNA codificador, com base nos requisitos de novidade, atividade inventiva e aplicação industrial. O ESPORTE Na Olimpíada de Roma (1960), o atleta etíope Abebe Bikila ganhou a maratona correndo descalço. Um fato dessa magnitude desafia a estrutura do esporte. Treinamento? Sem dúvida. Predisposição genética? Hoje sabe-se que a aptidão para atividades de força ou de resistência está relacionada com a estrutura das fibras musculares e da proteína codificada pelo gene ACTN3. Teria a ancestralidade alguma relação com a subida ao pódio? Os atletas do leste africano brilham nas maratonas, os do norte e oeste africano nas corridas de velocidade, os asiáticos nas provas de levantamento de peso, os chineses na ginástica etc. Baseado nos dados coletados em numerosos atletas de destaque em diferentes modalidades, o próximo passo poderia ser a utilização de marcadores genéticos para selecionar atletas e direcioná-los para a modalidade esportiva considerada mais adequada. O determinismo genético pode, eventualmente, mostrar uma predisposição a certo tipo de esporte, mas não define quem levará as medalhas: a vontade de ganhar, os fatores culturais e um treinamento intenso parecem ser decisivos. 245

256 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A PRÁTICA FORENSE Com exceção dos gêmeos idênticos, nenhuma pessoa é geneticamente idêntica à outra. Durante quase um século, a identificação das pessoas dependeu das impressões digitais e, apesar das enormes dificuldades em encontrar uma quantidade suficiente de material em estado de conservação adequado, muitos crimes foram resolvidos graças a estudos bioquímicos e imunológicos. A análise do DNA para a identificação das pessoas é utilizada desde a década de 1980, quando A. Jeffreys idealizou a técnica do Fingerprint, estabelecendo uma relação única entre um indivíduo e sua sequência gênica. A identificação recorre a pequenas sequências não codificadoras dispersas no DNA, denominadas VNTRs ou vinters (do inglês, variable-number tandem repeats). Essas sequências polimórficas repetem-se um número de vezes que pode variar de um cromossomo ao seu homólogo, de modo que os fragmentos de restrição terão tamanhos diferentes. Sondas genéticas específicas identificam até 20 tipos diferentes de sequências VNTRs. No gel de eletroforese aparecerá um padrão de bandas individual, parecido com os códigos de barras usados no comércio. Como a probabilidade de duas pessoas escolhidas ao acaso terem o mesmo perfil de DNA é menor a um em um trilhão, o resultado é praticamente único para cada indivíduo. Na determinação da paternidade, os estudos de grupos sanguíneos e de proteínas do soro têm sido complementados ou substituídos pelos testes de DNA, que se transformaram no eixo de várias investigações muito comentadas na mídia. No Brasil, o jogador de futebol Pelé teve que reconhecer a paternidade de Sandra Regina, e o menino Pedrinho, sequestrado na maternidade logo após seu nascimento pôde, anos mais tarde, reencontrar sua verdadeira família. Apesar das críticas levantadas em relação às possibilidades de erros laboratoriais devidos à contaminação de amostras, ao risco da participação de pessoal treinado inadequadamente e às dificuldades de interpretar estatisticamente os dados, em poucos anos a análise de DNA se transformou em uma ferramenta indispensável na prática forense. Nos Estados Unidos, uma mancha de sêmem no vestido azul de uma estagiária se transformou em uma peça essencial para solicitar o impeachment do presidente Clinton. Depois de anos de mistérios e rumores, os cadáveres enterrados em uma fossa comum perto de Jekaterinburg foram reconhecidos, em 1994, como sendo os do tzar Nicolau II, sua família e servidores, assassinados durante a Revolução Russa (1918). Em 2012, a descoberta dos ossos do rei Ricardo III sob um estacionamento e a análise do cromossomo Y, transmitido de pai a filho, levantou dúvidas sobre a legitimidade da linha dos Plantagenetas ao trono da Inglaterra. Em 1992, os ossos encontrados, anos antes, em uma tumba no Brasil, foram identificados como pertencentes ao comandante do campo de extermínio de Auschwitz, Joseph Mengele, um dos homens mais procurados após a Segunda Guerra Mundial. Determinadas variantes gênicas foram decisivas para a sobrevivência, com 200 calorias diárias, dos defensores do sítio de Leningrado. A análise de DNA é a única forma de reconhecer as vítimas de catástrofes, conflitos bélicos e atentados como o do World Trade Center (Nova York, 2001) ou da estação de Madri (2004). E, anos mais tarde, de seu instigador, Osama Bin Laden. Quando as amostras estão muito degradadas, analisa-se o DNA mitocondrial. Transmitido por via materna, esse DNA conta com uma região muito variável, apta para identificar pessoas e esclarecer laços de parentesco. Entre 1976 e 1985, o regime militar que governou a Argentina exterminou 9 mil a 30 mil pessoas (desaparecidas). Muitas crianças pequenas, separadas de suas famílias, foram entregues para adoção. A comparação entre o seu DNA e o de suas avós maternas possibilitou a muitos filhos de desaparecidos recuperar sua identidade verdadeira. 246

257 C A P Í T U L O 19 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE A INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS A origem da farmácia é atribuída a Galeno (século II), um médico romano que utilizava preparações medicinais para tentar reestabelecer o equilíbrio destruído pela doença. Durante a Idade Média, conservou-se seu legado, a denominada farmácia galênica, em conventos e monastérios. No século XVI, o médico e alquimista suíço Paracelso formulou dois conceitos fundamentais: existe um remédio específico para cada doença e qualquer remédio pode ser tóxico, dependendo da dose. No século XVIII, o desenvolvimento da química na Europa resgatou do medievo algumas técnicas, como a destilação e a extração com solventes. A química orgânica nasceu na primeira metade do século XIX e, na mesma época, fundaram-se os primeiros laboratórios farmacêuticos. Rapidamente, os métodos artesanais foram substituídos por sistemas de produção industrial. Ao longo do século XX, gerou-se um setor que compreende os fabricantes de diversas categorias de medicamentos (de marca, genéricos e de venda liberada), além de empresas que elaboram produtos novos e outras que desenvolvem pesquisas, geralmente terceirizadas. O mercado mundial de medicamentos movimenta mais de um trilhão de dólares por ano. Os medicamentos mais vendidos são os oncológicos, os agentes respiratórios, os reguladores de lipídios, os antidiabéticos e os antipsicóticos. Apesar das empresas farmacêuticas dedicarem algumas pesquisas às doenças tropicais dos países em desenvolvimento, ainda faltam medicamentos adequados para a malária, a doença de Chagas, a doença do sono, a leishmaniose, a filariose, o dengue e a esquistossomose. Só 3% dos medicamentos desenvolvidos entre 1975 e 1999 foram dedicados ao tratamento das doenças negligenciadas, e a metade fora incentivada pela Organização Mundial da Saúde. O controle da produção de medicamentos depende das grandes corporações multinacionais, que evoluem em contínuos ciclos de fusão, consolidação e expansão. Por ser extremamente competitivo e dinâmico, o setor é capaz de absorver rapidamente os avanços científicos e tecnológicos. Na disputa por um mercado em crescimento, destacam-se como empresas líderes: Pfizer (Estados Unidos), Novartis (Suíça), SanofiAventisPasteur (França), Roche Holding (Suiça), Merck & Co (Estados Unidos), GlaxoSmithKline (Reino Unido), Amgen (Estados Unidos), AstraZeneca (Reino Unido), Eli Lilly & Co (Estados Unidos) e Abbott Laboratories (Estados Unidos). Apesar do número de medicamentos novos colocados no mercado ter diminuído nos últimos anos, o número de compostos em testes pré-clínicos ou clínicos aumentou. A estrutura do setor poderá ser reorganizada nos próximos anos, em função da chegada de novas tecnologias robóticas, informáticas e biológicas. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

258 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) O DESENVOLVIMENTO DE UM MEDICAMENTO NOVO A procura por um medicamento novo começa com estudos laboratoriais e testes em animais, destinados a selecionar algumas moléculas seguras e com a atividade biológica procurada. Na indústria cosmética, os testes em animais tendem a ser substituídos por testes em cultivos celulares e, na indústria farmacêutica, começam a ser realizados testes em micro-órgãos de 3 a 4 milímetros, criados a partir de células-tronco. No final da fase pré-clínica, elabora-se o pedido de patente das moléculas consideradas promissoras e solicita-se a aprovação das autoridades correspondentes para dar início aos testes clínicos em seres humanos. Uma vez aprovado o pedido, a primeira fase de testes visa o acompanhamento farmacocinético da molécula em questão em 20 a 100 voluntários sadios, nos quais são realizados os primeiros estudos de segurança e dosagem. A segunda fase analisa a eficiência do produto e detecta efeitos colaterais em 100 a 500 pacientes voluntários. Na terceira fase monitoram-se as reações adversas ao uso prolongado do medicamento em mil a 5 mil pacientes voluntários. As 3 fases de testes clínicos podem levar de 4 a 8 anos. O medicamento só poderá ser comercializado após a aprovação das autoridades, sendo necessária uma fase posterior de vigilância farmacológica, porque alguns efeitos secundários de baixa frequência só podem ser evidenciados em amostras numerosas. Muitos medicamentos não conseguem superar essa quarta fase, e houve casos em que um produto teve que ser retirado do mercado. É o caso do Vioxx (Merck), um medicamento comercializado para o tratamento da artrite e das dores articulares, descontinuado por aumentar o risco de ataques cardíacos e derrames. A indústria sustenta numerosas atividades de pesquisa e desenvolvimento de produtos novos. Das 5 mil a 10 mil substâncias que passam o crivo de uma primeira triagem, só uma chegará ao mercado, em um processo que leva de 10 a 15 anos, a um custo mínimo estimado em 1 bilhão de dólares. O retorno do investimento é garantido pelos lucros e por um sistema de patentes válido por 20 anos (Figura 19.1). PATENTES, GENÉRICOS E BIOSSIMILARES A patente sobre um medicamento confere à empresa que o desenvolveu o direito de exclusividade sobre sua comercialização durante 20 anos. Além de sustentar os custos de pesquisa e desenvolvimento de um medicamento, boa parte do orçamento das empresas farmacêuticas está dedicado a propaganda e marketing de seus produtos. Ao vencer a patente de um medicamento, este se torna de domínio público, sendo copiado e comercializado como medicamento genérico por um preço 30 a 50% menor. Esse medicamento que entra no mercado é uma molécula sintética com seu nome genérico (paracetamol, por exemplo) e sem o nome comercial (Tylenol). Com o mesmo princípio ativo e a mesma dose que o medicamento de referência, os produtos genéricos causam efeitos terapêuticos semelhantes. No Brasil, para ser comercializados, precisam da aprovação da Anvisa nos testes de qualidade. Em relação aos biofármacos, o medicamento produzido após o vencimento da patente é denominado biossimilar, porque é sintetizado por um agente biológico e porque o processo de obtenção pode não ser o mesmo. Sua atividade deve ser avaliada em ensaios bioquímicos, imunológicos e biológicos in vivo e só pode ser considerado biossimilar se apresentar a mesma qualidade, eficácia e segurança do produto original de referência. No Brasil, para ser comercializados, os medicamentos biossimilares também precisam da aprovação da Anvisa nos testes de qualidade. Em 248

259 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS 2015, o Remsima (infliximabe) foi o primeiro anticorpo monoclonal aprovado para uso no país, depois de demonstrada sua similaridade com o produto biológico inovador Remicade (infliximabe). A distribuição de genéricos e biossimilares na rede pública de saúde representa, em qualquer país, uma economia considerável. A produção de sete antivirais genéricos para o tratamento de HIV/Aids por Farmanguinhos, e a preferência destes sobre os medicamentos de marca, para sua compra e distribuição na rede pública de saúde, representaram para o Brasil uma economia de mais de US$ 400 milhões por ano. Admite-se que, em alguns casos, como situações de emergências nacionais, circunstâncias de extrema urgência e práticas anticompetitivas, o uso de uma patente sem a autorização do detentor do direito seja justificado. Esta salvaguarda se encontra no Acordo sobre Aspectos dos Direitos de Propriedade Intelectual Relacionados ao Comércio (TRIPS Agreement), da Organização Mundial do Comércio, vigente desde O artigo 31 assinala que o uso da patente sem autorização estaria justificado se tivessem sido feitos os esforços para sua utilização em condições comerciais razoáveis. Quando da ameaça terrorista de antraz, os Estados Unidos cogitaram quebrar a patente do antibiótico Cipro. Nos países em desenvolvimento, o acesso aos medicamentos é considerado um direito fundamental dos pacientes de HIV/Aids, porém, apesar das longas discussões no marco da Organização Mundial de Comércio, milhões de pessoas morrem anualmente por falta desses medicamentos FIGURA As etapas do desenvolvimento de um medicamento Descoberta Fase pré-clínica Testes clínicos compostos 5 compostos Início das pesquisas. Estudos laboratoriais e testes em animais para avaliar a atividade biológica e a segurança. Pedido de patente (3 a 4 anos). Pedido de aprovação para dar início aos testes em seres humanos. Fase I. Acompanhamento farmacocinético e primeiros estudos sobre segurança e dosagem em 20 a 100 voluntários sadios (1 a 2 anos). Fase II. Eficiência e efeitos colaterais em 100 a 500 pacientes voluntários (2 anos). Fase III. Monitoramento das reações ao uso prolongado do medicamento em a pacientes voluntários (3 a 4 anos). 1 composto Processo de aprovação do novo medicamento (1 a 2 anos) Fase IV. Vigilância farmacológica 18 Procedimentos administrativos Vencimento da patente Genéricos Anos 249

260 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) OS PRINCÍPIOS ATIVOS DAS PLANTAS O CASO DA ASPIRINA Devido a seu poder de curar febres e acalmar dores, a casca do salgueiro (Salix Alba) era utilizada, já no século XVIII, na preparação de poções medicamentosas. O princípio ativo é a salicilina, da qual foi extraído o ácido salicílico. Em 1874, fundou-se a primeira empresa para sintetizar quimicamente o ácido salicílico, uma substância que é capaz de aliviar eficazmente a dor, mas tem um gosto amargo muito desagradável e causa problemas estomacais. Por acetilação do ácido salicílico, o químico Felix Hoffman obteve o ácido acetilsalicílico, um produto com menos efeitos colaterais que começou a ser comercializado em 1900 pela Bayer, sob o nome de aspirina (Figura 19.2). Vendem-se hoje, aproximadamente, 10 bilhões de comprimidos por ano. Embora a aspirina alcançasse uma popularização extraordinária, o seu modo de ação permaneceu desconhecido por muito tempo. Isso não impediu que fosse utilizada pelos astronautas durante o primeiro voo à lua da nave Apolo, em Dois anos mais tarde, descobriu-se que a ligação entre o ácido acetilsalicílico e algumas enzimas dificulta a síntese de prostaglandinas, um grupo de substâncias que tornam os nervos mais sensíveis à dor e são produzidas naturalmente durante as infecções ou na ocasião de ferimentos. Por impedir a agregação das plaquetas, a aspirina também ajuda a prevenir problemas de coagulação sanguínea e ataques cardíacos FIGURA 19.2: A fórmula da aspirina COOH COOH Ácido salicílico Ácido acetilsalicílico OH O-CO-CH OS FITOTERÁPICOS Até o momento, os estudos etnobotânicos identificaram mais de 50 mil espécies de plantas medicinais. Muitas delas representam a única fonte de tratamento acessível para a população mais pobre. Também são utilizadas por outra parcela da população, adepta das medicinas alternativas e do consumo de medicamentos fitoterápicos tradicionais, considerados mais suaves e com menos efeitos colaterais. Nessa corrente de pensamento, o natural é percebido como bom, admitindo-se que o extrato vegetal seria mais eficiente que alguma de suas partes, entre as quais se encontra o princípio biologicamente ativo. Os fitoterápicos são produtos relativamente baratos, de venda livre e com poucas oportunidades de patentes. Contudo, sua eficácia depende das condições de cultivo das plantas, porque a síntese das substâncias ativas depende do solo, da estação e até do momento do dia. Outras limitações 250

261 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS importantes são a falta de conhecimento sobre os efeitos secundários, a ausência de estudos clínicos em grande escala e a carência de controles de qualidade estritos. A promoção da medicina tradicional pela WHO (do inglês, World Health Organization), enunciada na declaração de Alma-Ata (1978) sobre a atenção primária a saúde, marca uma mudança de atitude em relação aos fitoterápicos. A partir de 1990, o uso dos fitoterápicos aumentou significativamente, estimando-se que o mercado global seja de US$ 62 bilhões por ano. Com a publicação de um manual relativo ao controle de qualidade dos materiais extraídos das plantas medicinais (WHO, 1998) e o estabelecimento de diretrizes gerais sobre metodologias de pesquisa e avaliação das medicinas tradicionais (WHO, 2000), o mercado dos fitoterápicos entrou em uma nova etapa. AS TENDÊNCIAS RECENTES Em uma linha totalmente diferente perfilam-se as grandes empresas de produtos farmacêuticos. A descoberta recente de algumas substâncias antitumorais (taxol, vinblastina, vincristina etc.) de origem vegetal estimulou a procura por princípios ativos em plantas, animais e microrganismos, especialmente em regiões de grande biodiversidade. Contudo, as opiniões não são unânimes em relação a possíveis e eventuais descobertas de moléculas com aplicações terapêuticas. Algumas empresas farmacêuticas consideram que, em quase duzentos anos de prospecção, já teriam sido descobertos praticamente todos os princípios ativos de interesse e preferem passar ao desenho de medicamentos por química combinatória e modelos computacionais. Outras ponderam que é na diversidade dos microrganismos e das plantas que devem ser procuradas novas moléculas, porque ainda existiriam numerosas fontes de princípios ativos desconhecidos na flora tão diversa como mal estudada de muitas regiões. Recentemente, verificaram-se mudanças enormes no campo da pesquisa de produtos naturais, graças à disponibilidade de tecnologias baseadas na robótica e na automação dos ensaios biológicos. Em plena revolução cultural, a medicina chinesa obteve um antimalárico, a artemisina ou quinghaosu, a partir de um extrato vegetal. Contudo, em 2000, sua produção por biologia sintética reduziu o custo do tratamento a menos de 1 dólar. A análise das substâncias químicas (alcaloides, terpenos, esteroides, glicosídeos etc.) presentes em uma planta ou em seu extrato depende de técnicas analíticas automatizadas e de bancos de dados nos quais armazenar as informações (Chemical Fingerprint). Os estudos quimioinformáticos estabelecem correlações entre estrutura e atividade através de métodos estatísticos. Uma vez identificado um princípio ativo, suas características farmacológicas poderão ser melhoradas mediante transformações químicas, chegando-se a substituir uma molécula natural por outra sintética equivalente ou ligeiramente modificada. A robotização permite realizar ensaios de atividade biológica de até 200 mil produtos por dia em sistemas de alto rendimento (HTS, do inglês, high throughput screening). A IMPORTÂNCIA DE UM MARCO LEGAL Nos países que contam com uma biodiversidade importante, discute-se como desenvolver os estudos de bioprospecção e qual o papel que deveria ser desempenhado pelas instituições, nacionais e estrangeiras, e pelas empresas farmacêuticas. O risco de biopirataria é real. No século XIX, plantas de seringueira foram levadas de modo sub-reptício da Amazônia à Malásia. O captopril, um medicamento derivado do veneno da cobra Bothrops, é hoje importado pelo Brasil em uma versão sintética. Na Costa Rica, o InBio (Instituto Nacional de Biodiversidade) negociou, a partir de 1991, acordos de bioprospecção no valor de US$ 1 milhão com a Merck e, mais tarde, com outras empresas 251

262 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) farmacêuticas. Esses acordos contribuíram para aumentar a capacitação do país desde vários pontos de vista: científico, tecnológico e institucional. No entanto, apesar de ter encontrado várias moléculas promissoras, até o momento nenhuma delas originou um medicamento novo. Aproximadamente na mesma época teve início um programa de prospecção de agentes bioativos em terras áridas da América Latina. As numerosas críticas levantadas por estas e outras iniciativas, como o convênio Novartis-Fundação Bio-Amazônia (2000), mostram as dificuldades em estabelecer normas de trabalho dentro do marco legal para a proteção da biodiversidade, respeitando a Convenção da Diversidade Biológica (1992) e os acordos posteriores. Um exemplo recente refere-se às possíveis aplicações da sabara (Guiera senegalensis), uma planta do Sahel, tradicionalmente utilizada pelo povo Dogon (Mali). Pesquisadores franceses isolaram um princípio ativo (Guieranon B) que mostrara atividade anticancerosa nos testes pré-clínicos, registraram a patente e planejam desenvolver um medicamento. Até o momento não foi contemplada nenhuma compensação para o povo Dogon. AS SUBSTÂNCIAS ANTIBIÓTICAS O CASO DA PENICILINA Até a Segunda Guerra Mundial, as únicas armas disponíveis no combate às infecções eram umas poucas vacinas e antitoxinas. No início do século XX fora descoberto, no laboratório de Paul Ehrlich, um derivado do arsênico para o tratamento da sífilis. Comercializado em 1910 pela empresa Hoechst, o Salvarsan resultou em um terrível fracasso por duas razões: era tóxico e devia ser injetado, em uma época em que não existiam seringas. Os primeiros inibidores do crescimento microbiano bemsucedidos foram as sulfas, derivados da sulfonamida, no final da década de Em 1928, o bacteriologista Alexander Fleming observou a ausência de crescimento bacteriano em um cultivo de estafilococos contaminado por um fungo. Depois de isolar, cultivar e identificar o fungo como Penicillium notatum, Fleming conseguiu extrair a penicilina, uma substância antimicrobiana eficaz quando testada em animais. Esse resultado não teve repercussão alguma na comunidade científica, e, durante quase 10 anos, Fleming tentou infrutiferamente obter penicilina em estado puro. Em 1940, nos laboratórios da Universidade de Oxford, H. Florey e E. Chain obtiveram um sal sódico de penicilina que teve um efeito extraordinário nos primeiros ensaios clínicos (Figura 19.3). Contudo, a quantidade disponível era pequena para uso terapêutico e, em plena Segunda Guerra Mundial (1941), Florey e Chain transferiram-se para Peoria (Illinois, Estados Unidos), com o objetivo de iniciar uma produção em grande escala FIGURA A fórmula da penicilina Na fórmula da penicilina pode-se observar um anel -lactâmico e uma cadeia lateral (R). Algumas bactérias sintetizam -lactamases, enzimas que, ao destruir o anel correspondente, desativam as penicilinas naturais. Modificando a cadeia lateral, obtiveram-se as penicilinas semissintéticas, resistentes a essas enzimas. 252

263 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS Dois fatores possibilitaram a produção industrial de penicilina. O primeiro, a descoberta em um melão podre de uma linhagem de Penicillium chrysogenum capaz de produzir 200 vezes mais penicilina que a linhagem original. O segundo, a substituição do cultivo em garrafas pelo cultivo submerso em biorreatores, com capacidade entre 40 mil e 200 mil litros, possibilitando um aumento na produtividade que passou de 50 a 100 mg/l. A participação da indústria farmacêutica (Pfizer, Merck) foi decisiva para o sucesso do empreendimento. Em 1944, as forças aliadas dispuseram de suficiente penicilina para o tratamento dos soldados feridos na invasão da Europa. OS LIMITES AO USO DE ANTIBIÓTICOS O sucesso da penicilina estimulou a procura de microrganismos produtores de antibióticos no solo, um ambiente muito competitivo, onde um antimicrobiano confere uma vantagem seletiva. Assim, descobriram-se a actinomicina, a neomicina e a estreptomicina, o primeiro antibiótico eficiente para o tratamento da tuberculose. Um pouco mais tarde entraram no mercado alguns antibióticos de amplo espectro, como o cloranfenicol, a aureomicina e a terramicina. Paralelamente, a indústria aperfeiçoou os métodos de extração e de purificação e as pesquisas sobre formas moleculares alternativas mais eficientes. Alguns antibióticos de origem natural, como a penicilina e o cloranfenicol, podem ser sintetizados e/ou modificados quimicamente. A descoberta de outros antibióticos (eritromicina, vancomicina, ampicilina, meticilina, cefalosporina) possibilitou a cura de doentes e feridos para os quais, meio século atrás, a medicina não tinha tratamento. Contudo, o tempo mostrou o outro lado da moeda. O uso indiscriminado de antibióticos, na clínica médica e nas criações de animais, favoreceu a aparição de linhagens resistentes, que se espalharam rapidamente. Os antibióticos agem de diversos modos, mas sempre tendo como alvos algumas poucas funções vitais da célula bacteriana, tais como a síntese da parede celular, dos ácidos nucleicos, das proteínas ou do ácido fólico. Para cada alvo atingido, aparece uma forma específica de resistência. O anel - lactâmico das penicilinas e cefalosporinas, por exemplo, é desativado pelas bactérias produtoras de - lactamases. Uma modificação do sítio-alvo no ribossomo acaba com a inibição da síntese proteica pela estreptomicina. Basta uma alteração da permeabilidade celular para que a tetraciclina seja bombeada para fora das células. E a transferência horizontal de plasmídeos entre microrganismos pode disseminar a resistência múltipla às drogas. De fato, se quisermos manter alguma vantagem sobre as bactérias, nessa corrida sem fim entre a utilização de antibióticos e a aparição de microrganismos resistentes, novos medicamentos terão que ser descobertos. A NECESSIDADE DE INOVAÇÃO Existem muitas substâncias com propriedades antibióticas, mas poucas são interessantes do ponto de vista clínico. As principais classes de antibióticos foram descobertas entre 1940 e Depois de várias décadas sem grandes inovações nesse campo, foram descobertas as oxazolidinonas, moléculas bloqueadoras da síntese de proteínas bacterianas (Tabela 19.1). Em mais de 40 anos, nenhum antibiótico novo contra bactérias Gram negativas chegou ao mercado. Estima-se que, em 2050, os microrganismos multirresistentes a antibióticos poderiam causar a morte de 10 milhões de pessoas por ano e perdas econômicas de 100 trilhões de dólares. 253

264 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) TABELA A linha do tempo de entrada dos antibióticos e antibacterianos no mercado ANTIBIÓTICOS E ANTIBACTERIANOS Introdução Sulfonamidas (Sulfas) 1936 β-lactâmicos 1940 Cloranfenicol, Tetraciclinas 1949 Aminoglicosídeos 1950 Macrolídeos 1952 Quinolonas, estreptograminas 1962 Oxazolidinonas 2000 Lipopeptídeos 2003 Glicilciclinas 2005 Mutilinas Devido às dificuldades encontradas em descobrir moléculas novas, e para contornar a aparição de resistência, a indústria investiu nas chamadas me-too-drugs, isto é, substâncias iguais com pequenas modificações químicas. Por outro lado, o vencimento de muitas das patentes possibilitou o aparecimento das formas genéricas de alguns dos antibióticos mais difundidos, como o Augmentin (amoxacilina/clavulanato) ou o Cipro (ciproflaxin). Os antibióticos representam 65% do mercado de medicamentos anti-infecciosos, que inclui também os antivirais e os antifúngicos. Nos últimos anos, muitas empresas abandonaram o mercado para atender o setor, bem mais lucrativo, das doenças crônicas. Não obstante, cinco das maiores ainda continuam produzindo antibióticos: Abbott, Novartis, AstraZeneca, Merck, Pfizer e Johnson & Johnson. Outras firmas novas ocuparam o espaço vacante, como Basilea Pharmaceutica, que lançou o Ceftobiprole, uma cefalosporina de quinta geração, eficaz contra os MRSA (do inglês, meticillin-resistent Staphylococcus aureus) e outros supermicróbios. Atualmente, existem várias estratégias para o desenvolvimento de novos antibióticos. Sistemas robotizados para triagem de alto desempenho (HTS, high-throughput screening) podem testar a atividade inibitória do crescimento de microrganismos em centenas de compostos ou extratos naturais. Ou pesquisar os peptídeos naturais, produzidos por seres vivos terrestres e marinhos, e incrementar sua ação antibiótica mediante alterações na estrutura molecular. E, também, investigar a atividade antimicrobiana de peptídeos sintéticos, construídos por química combinatória. Procura-se algum alvo, no metabolismo bacteriano, que impeça a infecção. Os novos métodos in silico possibilitam a triagem de estruturas moleculares relacionadas com uma atividade biológica determinada, assim como a utilização dos dados genômicos para identificar um alvo medicamentoso. O desenho de produtos novos estaria ligado à genômica comparativa e funcional dos microrganismos, uma área capaz de esclarecer a função dos genes e de mostrar quais os alvos que poderiam ser atacados. Centenas de genomas bacterianos já têm sido sequenciados. Estima-se que os antibióticos baseados na genômica estejam disponíveis na próxima década. O caminho está sendo trilhado por algumas pequenas empresas biotecnológicas, apesar da dificuldade em enfrentar a etapa dos testes clínicos, que demandam inversões estimadas em 150 a 200 milhões de dólares, valores altíssimos que só podem ser cobertos pelas grandes empresas farmacêuticas. 254

265 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS AS PRIMEIRAS MOLÉCULAS TERAPÊUTICAS O CASO DA INSULINA A insulina é um mensageiro químico (hormônio), produzido no pâncreas, que regula o metabolismo do açúcar (glicose) no corpo. (Figura 19.4). A destruição das células do pâncreas pelo sistema imune causa uma deficiência na produção de insulina, um aumento no nível de glicose no sangue e sua excreção na urina. As complicações resultantes incluem nefropatias, retinopatias, neuropatias e doenças cardiovasculares. O quadro descreve o diabetes mellitus tipo 1, ou diabetes juvenil, uma doença que ataca crianças e adolescentes, conhecida há séculos e que hoje pode ser tratada. Existe outra forma da doença, diabete tipo 2, devida à redução do número de receptores de insulina nas células musculares e adiposas. O paciente não responde adequadamente à insulina ou não a produz em quantidade suficiente. Esta forma costuma se manifestar em pessoas mais velhas, com sobrepeso, inativas e com uma história familiar. O tratamento envolve dieta e exercícios moderados, além de medicamentos, entre os quais, eventualmente, a insulina. Em 1920, F. Banting comprovou o efeito hipoglicemiante de extratos de pâncreas de cachorro e, logo depois, deu-se início à comercialização de insulina extraída de pâncreas bovinos e porcinos. Essas insulinas animais salvaram numerosas vidas, mas, por diferir da insulina humana em alguns aminoácidos, acabavam provocando reações alérgicas. Do ponto de vista da estrutura química, as diferenças são pequenas. A molécula de insulina humana consta de 51 aminoácidos, distribuídos em duas cadeias unidas entre si por pontes bissulfeto. A insulina bovina difere da humana nas posições 8 e 10 da cadeia A e na posição 30 da cadeia B, mas a insulina porcina só difere na posição 30 da cadeia B (Figura 19.4 A). O tamanho da molécula de insulina torna a síntese química economicamente inviável (Figura 19.4 A). Contudo, basta substituir um aminoácido (alanina) por outro (treonina) na extremidade de uma das cadeias da insulina suína para que a sequência molecular seja igual à da insulina humana. Esta insulina semissintética representou um enorme progresso em relação às insulinas animais. A tecnologia do DNA recombinante revolucionou a produção de insulina humana, possibilitando a síntese em microrganismos geneticamente modificados: primeiro em Escherichia coli (Eli Lilly, 1982), mais tarde em leveduras (Novo, 1987). Por ser um produto mais estável e de melhor qualidade que os anteriores existentes no mercado, a insulina recombinante representa um dos primeiros e indiscutíveis sucessos da biotecnologia (Figura 19.4 B). A SUBSTITUIÇÃO DO PRODUTO NATURAL Seja por influência de fatores genéticos, ambientais ou culturais, ou também pela existência de melhores métodos de diagnóstico, milhões de pessoas no mundo inteiro dependem hoje de injeções regulares de insulina. A incidência da diabete de tipo 2 está aumentando em crianças e adolescentes, em alguns grupos étnicos que adotaram modos de vida e de alimentação diferente e, também, nas populações urbanas de migrantes. Em 2025, o número de diabéticos poderia chegar a 300 milhões. Nos próximos anos, o mercado passará por reformulações, ao expirar algumas patentes e serem disponibilizadas insulinas não injetáveis, administradas oralmente ou por inalação. Algumas inovações, como o grau de pureza e o tempo de reação, são de grande importância para a eficácia do tratamento. 255

266 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) FIGURA A insulina humana C. A molécula de insulina Cadeia B Cadeia A D. A síntese da insulina a) A síntese in vivo da insulina nas células pancreáticas Peptídeo-sinal Remoção do sinal e Remoção Tradução união das cadeias A e B da cadeia C mrna de insulina Molécula precursora Pró-insulina Insulina b) A síntese em Escherichia coli (1982) Um organismo procarionte é incapaz de realizar modificações pós-traducionais. É possível sintetizar pró-insulina para transformá-la enzimaticamente em insulina, ou sintetizar cada uma das cadeias em separado e associá-las mais tarde, como ilustrado no esquema. Síntese da cadeia A Inserção no plasmídeo e clonagem em E.coli Síntese da cadeia B Extração da cadeia proteica A União química das cadeias A e B Inserção no plasmídeo e clonagem em E.coli Extração da cadeia proteica B Insulina 256

267 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS Em 2001, a Novo Nordisk absorveu a área de produção da Biobrás, uma empresa brasileira que durante mais de 20 anos abasteceu de insulina grande parte do mercado latino-americano. Uma parceria entre a Fundação Oswaldo Cruz e a empresa Biomm, que conservou a patente para a insulina humana desenvolvida anteriormente pela Biobrás, poderá colocar a insulina no mercado e distribuí-la no SUS (Sistema único de Saúde), a partir de Atualmente, a produção de insulina humana recombinante se concentra em três grandes conglomerados farmacêuticos: Eli Lilly, Novo Nordisk e Sanofi. AS PROTEÍNAS RECOMBINANTES AS BASES TECNOLÓGICAS As proteínas de uso terapêutico têm um tamanho 100 vezes maior que o das moléculas presentes nos medicamentos convencionais. Sua produção seria inviável sem a tecnologia do DNA-recombinante, porque os métodos extrativos fornecem quantidades mínimas que nunca chegariam a satisfazer a demanda do mercado. A rápida incorporação das novas tecnologias nos métodos de produção facilitou, já na década de 1980, a obtenção de insulina e de interferon mediante bactérias e leveduras modificadas geneticamente, cultivadas em biorreatores. Mais tarde, os microrganismos foram substituídos em alguns processos por células animais que, apesar de mais difíceis de cultivar, são capazes de levar a cabo as modificações pós-traducionais indispensáveis. Com o objetivo de aumentar a produtividade e diminuir os custos, foram construídos plantas e animais transgênicos (vacas, cabras, ovelhas etc.) para uma centena de proteínas de tipo recombinante, muitas das quais se encontram já na fase de testes clínicos. O primeiro anticoagulante extraído do leite de uma cabra transgênica entrou no mercado em 2009 (Atryn, GTC Biotherapeutics). O medicamento ZMapp (Mapp Biopharmaceuticals), para tratamento de Ebola, reúne 3 anticorpos monoclonais humanizados, produzidos em folhas de tabaco. Ainda em fase experimental, teve sucesso quando utilizado emergencialmente para tratar pessoal de saúde contaminado por ocasião da epidemia que assolou vários países africanos. A hostilidade da sociedade, em relação às plantas e animais transgênicos, não existe quando se trata de produzir medicamentos. O princípio de equivalência, contencioso no setor de agroalimentos, é totalmente aceito em relação aos novos medicamentos. Uma atitude contraditória que incita à reflexão. OS PRODUTOS E SUAS UTILIZAÇÕES Além da insulina recombinante, um dos primeiros produtos obtidos por engenharia genética foi o interferon (IFN), uma proteína que interfere na replicação de vírus, bactérias e células tumorais. Existem vários tipos e são utilizados no tratamento de câncer, esclerose múltipla, hepatite B e C. As proteínas terapêuticas de origem recombinante cumprem diversas funções (Tabela 19.2). Algumas substituem ou complementam moléculas naturais, tais como hormônios, interferones, interleucinas, fatores estimuladores do crescimento celular, fatores de coagulação sanguínea, enzimas. Outras são produtos especialmente desenhados para cumprir uma função medicamentosa: trombolíticos (tpa ou fator ativador de plasminogênio, estreptoquinase, uroquinase), anticorpos monoclonais e antígenos bacterianos para vacinas. Utilizam-se fundamentalmente nas áreas de hematologia, oncologia, diabetes e endocrinologia, artrite, inflamação, doenças imunes e doenças genéticas lisossômicas (Gaucher, Hurler, Fabry, Pompe). 257

268 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) Proximamente estarão vencendo as patentes de várias moléculas: -interferon, insulina humana, hormônio de crescimento, vacina contra a hepatite B etc. Dado o custo que os novos medicamentos representam para os sistemas de saúde, cogita-se a produção de genéricos de várias proteínas terapêuticas. OS MEDICAMENTOS PERSONALIZADOS A FARMACOGENÔMICA O mapeamento do genoma foi o primeiro passo para o desenvolvimento de novos produtos e ações terapêuticas, um terreno onde se firma a farmacogenômica, uma disciplina nova que visa identificar as diferenças genéticas associadas a diversas doenças. Os seres humanos compartilham 99,9% do genoma, de modo que as variações entre eles devem ser procuradas no 0,1% restante, isto é, entre os 30 milhões de polimorfismos de um único nucleotídeo ou SNPs (do inglês, single nucleotide polymorphisms). Trata-se de variações de uma base a cada nucleotídeos, distribuídas ao longo do genoma. As mais interessantes são as que ocorrem dentro de um gene ou em uma região reguladora. Sabendo que dois pontos que se encontram muito próximos no cromossomo tenderão a ser transmitidos juntos, pode-se dividir o cromossomo em blocos de aproximadamente 10 mil bases (haplótipos) e caracterizá-los por alguns dos SNPs de cada bloco. Esse era o objetivo do International HapMap, recentemente concluído e baseado no genoma de pessoas de origem europeia, asiática e africana. A importância do mapeamento do genoma foi claramente percebida pelas empresas farmacêuticas. Antes de se completar, algumas das grandes empresas farmacêuticas (Glaxo Wellcome, Novartis) começaram a compilar informações sobre genes associados a doenças e a localizar SNPs em alguns genes previamente selecionados. Essas informações serão complementadas com os dados obtidos mediante os novos métodos de sequenciamento. Em 1999, a empresa americana decode obteve, por 200 milhões de dólares, a exclusividade para elaborar um gigantesco banco de dados com os registros de saúde, as genealogias e os perfis de DNA dos habitantes da Islândia. O objetivo principal era o estudo das doenças no contexto históricoevolutivo de uma população homogênea dos 270 mil habitantes da ilha, povoada mil anos atrás pelos viquingues e com poucos contatos externos posteriores. O projeto suscitou controvérsia. Um acordo da decode com a Hoffmann-La Roche visava identificar os genes responsáveis por várias doenças. No caso de serem obtidos resultados positivos, os habitantes de Islândia teriam direito, por cinco anos, à gratuidade nos medicamentos desenvolvidos. Em função dos problemas éticos e legais, levantados oportunamente, a empresa enfrentou algumas dificuldades na construção de seu banco de dados de islandeses. Apesar de ter descoberto uma dezena de alvos medicamentosos, entre os quais proteínas envolvidas em doença cardíaca, osteoporose e esquizofrenia, a empresa não obteve resultados suficientemente rápidos para satisfazer os seus investidores. Em bancarrota, a empresa acabou sendo vendida, sendo atualmente propriedade da Amgen Decode Genetics. Devido a impedimentos legais, os dados e as amostras biológicas não puderam ser vendidos e permanecem na Islândia. A empresa conta hoje com dados parciais de 150 mil pessoas voluntárias e com o sequenciamento de 10 mil genomas que, associados aos registros de saúde, permitiram inferir quais os riscos de determinadas variantes gênicas. Contudo, em função de uma condição de sigilo contratual, a empresa não pode transmitir aos voluntários a informação sobre quais os seus riscos de doença. Existem outros projetos na mesma linha de investigação, tais como Estonian Genome (Estonia), Galileo Genomics (Canadá), Oxagen (Inglaterra), Rockefeller University (Micronésia), UK.Bank 258

269 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS (Inglaterra). Wellcome Trust Case Control Consortium encontrou 24 associações a 7 doenças (Crohn, diabetes 1 e 2, doença cardiovascular, hipertensão, artrite reumatoide e transtorno bipolar). A FARMACOGENÉTICA Outra disciplina nova é a farmacogenética, que investiga as diferenças genéticas em uma população que permitem prever diferentes respostas a um medicamento. Receadas por médicos e pacientes, as reações adversas são temidas pela indústria farmacêutica, que se protege mediante bulas cuidadosamente redigidas. Nos Estados Unidos, as reações adversas causam 100 mil mortes e 2 milhões de hospitalizações por ano. Os medicamentos passam por várias fases de estudos clínicos antes de chegar ao mercado. Contudo, as pessoas não reagem do mesmo modo a um medicamento, que pode ser eficiente para uns e tóxico para outros. Aproximadamente 60% dos medicamentos são metabolizados por uma família de enzimas (citocromo P450). Algumas pessoas os degradam rapidamente, outras não, dependendo de suas características enzimáticas individuais. Sabendo a qual dos dois grupos pertence um paciente, podese determinar qual a dose do anticoagulante que lhe deverá ser administrada, minimizando os efeitos adversos. Associando marcadores genéticos a respostas diferenciais a medicamentos, pode-se dividir a população em subgrupos e oferecer um tratamento personalizado. Atualmente, antes de iniciar um tratamento de câncer de mama com a herceptina, deve-se realizar um teste genético na paciente para saber se o medicamento se ajusta, ou não, ao seu caso. Em pacientes HIV positivos, procura-se determinar a presença do alelo HLA-B*5701 antes de iniciar o tratamento com abacavir, porque os portadores desse alelo podem ser hipersensíveis ao medicamento. Aprovado pela FDA, o Bidil é um medicamento para doença cardiovascular, destinado exclusivamente aos pacientes afroamericanos. O desenvolvimento da farmacogenética dará aos pacientes mais chances de receber a medicação adequada e na dose certa. Por outro lado, as empresas farmacêuticas poderão escolher seus voluntários para os testes clínicos no subgrupo apropriado, evitando que um produto novo seja descartado por falta de resposta adequada. No futuro, em vez de um único produto campeão de vendas, as empresas farmacêuticas poderão oferecer medicamentos diferentes, cada um dos quais respondendo às expectativas de um tipo de consumidor. AS DOENÇAS ÓRFÃS Uma doença é considerara rara, ou órfã, quando atinge um número pequeno de pessoas. Existem aproximadamente 7 mil tipos de doenças raras, 80% de origem genética, que afetam 350 milhões de pessoas. Para a indústria, a menos que receba algumas compensações, qualquer doença que afete menos de 200 mil pessoas é desinteressante, em termos de pesquisa e desenvolvimento de medicamentos. Nos Estados Unidos, o Orphan Drug Act (1983) garante incentivos financeiros às empresas farmacêuticas que desenvolvam produtos para essas doenças. Também garante que, durante sete anos, nenhum medicamento equivalente será aprovado, a não ser que se trate de outro que lhe seja superior. Legislações equivalentes foram promulgadas em outros países (Japão, 1993; Austrália, 1998; Cingapura, 1999; União Europeia, 2000). Abre-se assim um campo no qual as empresas de biotecnologia se inserem com sucesso, já que seus produtos visam doenças de origem genética, envolvendo alterações de receptores celulares, enzimas e proteínas estruturais. Em 2015, a metade dos medicamentos aprovados correspondia a doenças órfãs e, atualmente, mais de 560 encontram-se em desenvolvimento. 259

270 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) TABELA Alguns biofármacos de interesse médico Fonte: Nature Biotechnology, 2003, vol. 21, nº8, em Porque Biotecnologia, Cuaderno n 0 49 PRODUTO INDICACÃO TERAPÊUTICA FATORES DE COAGULAÇÃO Fator VIII Fator IX Fator VIIa ANTICOAGULANTES Fator ativador de plasminogênio Fator ativador de plasminogênio Hirudina HORMÔNIOS Insulina Hormônio de crescimento Hormônio folículo-estimulante Hormônio paratiróideo Gonadotrofina coriônica Tirotrofina Hormônio luteinizante Calcitonina Glucagon FATORES HEMATOPOIÉTICOS Eritropoietina (EPO) Fator estimulante de colônias de granulócitos/macrófagos (GM-CSF) INTERFERON E INTERLEUCINAS Interferon alfa (IFN alfa) Interferon beta (IFN beta) Interferon gamma (IFN gamma 1b) Interleucina 2 (IL-2) VACINAS Hepatite B Hepatite A Doença de Lyme ANTICORPOS MONOCLONAIS RECOMBINANTES Anti-IgE (recombinante) Anti-TNF (recombinante) Anti-IL2 OUTROS PRODUTOS RECOMBINANTES Proteína morfogênica do osso-2 Galactosidase Iaronidase Proteína C β-glucocerebrosidase DNAse 260 Hemofilia A Hemofilia B Certas formas de hemofilia Infarto de miocárdio Infarto de miocárdio Trombocitopenia e prevenção de trombose Diabete Deficiência do hormônio em crianças, acromegalia, síndrome de Turner Infertilidade, anovulação e superovulação Osteoporose Reprodução assistida Detecção /tratamento de câncer de tireoide Algumas formas de infertilidade Doença de Paget Hipoglicemia Anemia Neutropenia, transplante autólogo de medula Hepatite B e C, diferentes tipos de câncer Esclerose múltipla Granulomatose crônica Câncer de rim Imunização contra a hepatite B Imunização contra a hepatite A Imunização contra a doença de Lyme Asma Artrite reumatoide Prevenção da rejeição aguda do transplante de rim Fratura de tíbia Doença de Fabry (deficiência de α-galactosidase) Mucopolissacaridose Sepse severa Doença de Gaucher Fibrose cística

271 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS Dada a demora e as dificuldades inerentes ao lançamento de um medicamento novo, as doenças órfãs representam um filão economicamente interessante, tanto para as pequenas como para as grandes empresas. Além de receber mais rapidamente a aprovação das autoridades, o grupo-alvo é integrado com pacientes diagnosticados e não tratados, dispostos a aceitar o uso de um medicamento. Se a resposta dos pacientes for favorável, as possibilidades de lucro aumentam consideravelmente. E do ponto de vista dos pacientes? Consideremos o caso de Kalideco, de Vertex Pharmaceuticals, que rende aproximadamente 300 mil dólares por ano. Trata-se de uma medicação para fibrose cística muito eficiente para os pacientes com uma mutação em G551D, presente em 4% dos 70 mil casos de fibrose cística, mas ineficiente em pacientes com a mutação em F508, que afeta 50% dos casos existentes. O MERCADO DOS BIOMEDICAMENTOS A TENDÊNCIA GERAL Estima-se que o mercado global de produtos biotecnológicos represente pouco mais da décima parte do mercado farmacêutico mundial. Mais de 300 proteínas recombinantes aprovadas e muitas outras em testes clínicos indicam um mercado em crescimento, do qual o setor mais dinâmico é o dos anticorpos monoclonais. Vários desses biofármacos, líderes de vendas, destinam-se aos tratamentos oncológicos, de artrite e de outras doenças imunes e inflamatórias. (Tabela 19.3). Contudo, existe pelo menos um que permite a obtenção de imagens, e outro em que a molécula se encontra acoplada a uma toxina que destrói a célula cancerosa. Em função dos avanços nos estudos genômicos, muitos outros biofármacos, visando uma centena de doenças, serão descobertos e patenteados nos próximos anos. Os imensos bancos de dados e as técnicas de triagem assistidas por computador permitirão diminuir o tempo necessário para os estudos experimentais. Os principais alvos de uma centena de doenças dos mais de 900 medicamentos que se encontram em desenvolvimento são o câncer (37%), as doenças infecciosas (vacinas, 15%), doenças autoimunes (8%) e doenças cardiovasculares (6%). Do consumo mundial de medicamentos, 88% correspondem a um bloco de regiões formado por América do Norte (49%), Europa (28%) e Japão (11%). Como a população destes países está envelhecendo, os principais alvos para o desenvolvimento de medicamentos novos são as doenças cardiovasculares, o câncer, as alterações respiratórias e as que afetam a qualidade de vida (osteoporose, artrite, doenças de Parkinson e de Alzheimer). A maioria das grandes corporações está instalada nos Estados Unidos, onde, além de seu principal mercado, encontram uma legislação favorável. Na América Latina, o setor está dominado pelas empresas internacionais e, salvo algumas exceções (Bio Sidus, ProBioMed, Heber Biotec), há poucos investimentos na pesquisa e no desenvolvimento de novos produtos. O custo dos medicamentos depende em grande parte dos investimentos da indústria farmacêutica em pesquisa e desenvolvimento de novos produtos. O tempo e o custo de desenvolvimento de um medicamento dependem da duração dos testes clínicos e do uso da tecnologia (robótica, bioinformática, química combinatória, triagem de compostos biológicos em alta velocidade, biochips e microarrays). Em 2014, as principais empresas produtoras de proteínas terapêuticas foram Roche Holding (Suiça), Gilead Sciences (Estados Unidos), Amgen (Estados Unidos), Biogen (Estados Unidos), Celgene (Estados Unidos), Shire (Reino Unido), CSL (Estados Unidos), Crifols (Espanha), UCB (Bélgica) e Novo Nordisk (Dinamarca). Estima-se que, em 2020, a metade dos 100 medicamentos mais vendidos seja biotecnológica. 261

272 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) TABELA Os medicamentos biológicos mais lucrativos em 2014 (Statista, Phrma) TRATAMENTO NOME COMERCIAL (Nome genérico) EMPRESAS / VENDAS (MILHÕES DE DÓLARES) Artrite reumatoide e doenças relacionadas HUMIRA (Adalimumab) Abbott / REMICADE (Infliximab) Johnson & Johnson / RITUXAN (Rituximab) Biogen Idec / ENBREL (Etarnecept) Amgen / Diabete LANTUS (Insulina Humana) Sanofi / Diversos tipos de câncer AVASTIN (Bevazizumab) Roche / HERCEPTIN (Trastuzumab) Roche / NEULASTA (Pegfilgastrin) Amgen / REVLIMID (lenalidomide) Celgene / GLEEVEC (Imatinib) Novartis / VELCADE (Bortezomibe) Takeda/J&J / 1766 Pneumonia meningocóccica PREVNAR (Vacina) Pfizer/ Esclerose múltipla AVONEX (α e β Interferon) Biogen Idec / REBIF (β interferon) Merck / Doenças hematológicas SOLIRIS (Eculizumab) Alexion Pharmaceuticals / ADVATE (Fator VIII) Baxter / Para as grandes empresas farmacêuticas, uma medida do sucesso significa conseguir um medicamento que alcance um valor de vendas de 1 bilhão de dólares (blockbusters). Em 2014, os maiores lucros corresponderam aos medicamentos destinados ao tratamento de artrite e doenças relacionadas, diversos tipos de câncer, diabete, esclerose múltipla e uma vacina antimeningocóccica (Tabela 19.3). No mesmo ano, dos dez medicamentos melhor colocados, 6 eram anticorpos monoclonais. AMÉRICA LATINA Na América Latina existe uma indústria farmacêutica que fabrica medicamentos para consumo interno e para exportação, destacando-se Argentina, Brasil, Cuba e México. Os principais produtos biotecnológicos são os anticoagulantes (eritropoietina), os hormônios, os interferones (α e β) e os fatores estimuladores do crescimento celular. A Argentina conta com um setor farmacêutico sólido e competitivo. Várias proteínas recombinantes são produzidas localmente, por três empresas biotecnológicas nacionais (Bio Sidus, PCgen, Zelltek) que vendem seus produtos através de suas empresas farmacêuticas correspondentes (Sidus, Pablo Cassará) e os exportam para diversos países de Ásia, Oriente e América Latina. Uma empresa estrangeira, Sanofi, produz vacinas contra a hepatite B. 262

273 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / INDÚSTRIA DE MEDICAMENTOS Bio Sidus obteve sucesso com seu tambo farmacéutico, pequenos rebanhos de vacas transgênicas produtoras de hormônio de crescimento, de insulina ou de leite maternizado, um empreendimento que irá sem dúvida lhe garantir uma posição de destaque no setor produtivo. O Laboratório Pablo Cassará é outra empresa tradicional que proximamente irá colocar no mercado uma nova vacina em duas doses contra a hepatite B e, recentemente, obteve uma enzima recombinante capaz de reparar as lesões causadas pela exposição aos raios X. Ambas as empresas distribuem seus produtos no Brasil. Diferente da Argentina, no Brasil as empresas públicas como Farmanguinhos e Instituto Butantã tem um papel determinante na produção de medicamentos, destacando-se respectivamente na produção de retrovirais e eritropoietina. Contudo, depende-se ainda da importação de biofármacos, alguns dos quais são distribuídos pelo Sistema Único de Saúde (eritropoietina, imunoglucerase, infliximab, interferon, somatotropina recombinante humana). Acordos de transferência de tecnologia, envolvendo laboratórios nacionais (públicos e privados) e estrangeiros, visam reverter essa dependência. México é produtor de medicamentos de alta tecnologia (antibióticos, antiinflamatórios, tratamentos contra o câncer). A empresa ProBioMed tem desenvolvido com o setor universitário uma dezena de proteínas recombinantes (anticoagulantes, interferones, fatores estimuladores do crescimento celular) para uso interno e exportação para outros países de América Central e América do Sul. Outros laboratórios (Instituto Bioclón, grupo Silanes) têm se destacado na produção de antitoxinas. Cuba tem registrados numerosos produtos biotecnológicos, desenvolvidos por Centros de Pesquisa (Centro de Inmunología Molecular, Centro de Ingeniería Genética y Biotecnología, Centro Nacional de Biopreparados e Instituto Finlay) e comercializados por empresas farmacêuticas associadas (Heber Biotec, CIMAB etc.). Hoje Cuba produz vacinas, moléculas terapêuticas e vários sistemas de imunodiagnóstico. Esses produtos renderam aproximadamente 900 patentes no exterior e são exportados para 40 países. Assim como o níquel, o tabaco e o açúcar, a biotecnologia é um dos principais produtos de exportação da ilha. 263

274 C A P Í T U L O 20 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE OS NOVOS TRATAMENTOS A APROVAÇÃO DE UM TRATAMENTO EXPERIMENTAL Assim como qualquer medicamento novo, um tratamento passa por várias etapas antes de se instituir como prática médica. Os estudos pré-clínicos iniciais incluem as pesquisas relativas a lesões ou doença, em testes laboratoriais e experimentação em animais, desenvolvidas em universidades ou empresas e financiadas com dinheiro público e/ou privado. Os resultados são revisados, publicados e repetidos numerosas vezes pela comunidade científica, até que, em função da quantidade de informação reunida, pareça razoável estender o procedimento ao ser humano. O novo tratamento será considerado experimental quando utilize medicamentos, vacinas, testes diagnósticos, aparelhos ou técnicas que sejam, ainda, objeto de investigações em seres humanos. Solicita-se então, por meio de um processo formal, uma autorização para dar início aos testes clínicos, que fornecerão informações sobre a segurança, a eficácia e os efeitos colaterais desse tratamento. Os ensaios ou testes clínicos seguem desenhos experimentais rigorosos e controles severos para garantir a confiabilidade dos estudos. Abrangem um número pequeno de participantes, que deverão assinar previamente um termo de consentimento informado, reconhecendo estarem cientes das opções de tratamento e dos riscos, assim como de seus direitos e responsabilidades. Durante os testes clínicos, o tratamento experimental pode se revelar melhor ou pior que os já existentes. Se os resultados forem satisfatórios, será solicitada a aprovação da agência reguladora correspondente (FDA, US Food and Drug Administration, nos Estados Unidos; EMA, European Medical Agency, na União Europeia; Anvisa, Agência Nacional de Vigilância Sanitária, no Brasil; Anmat, Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica, na Argentina). Uma vez autorizado, o tratamento experimental passa a ser uma prática médica de uso geral, mas continuará a ser objeto de vigilância para monitorar efeitos negativos que só possam ser detectados em uma população maior. BIOTECNOLOGIA: ENSINO E DIVULGAÇÃO (

275 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / NOVOS TRATAMENTOS OS TRANSPLANTES OS TRANSPLANTES DE ÓRGÃOS Em 1899, a primeira tentativa de transplante de rim de um cachorro a outro causou a morte do receptor, mostrando que o fenômeno de rejeição seria o principal obstáculo aos transplantes de órgãos. Uma exceção é a córnea, cujo primeiro transplante bem-sucedido realizara-se em O primeiro transplante de coração, realizado pelo cirurgião Christian Barnard (África do Sul, 1967), teve uma repercussão enorme nos meios de comunicação. O mundo inteiro acompanhou os comunicados médicos emitidos na Cidade do Cabo, até a morte do paciente, 18 dias mais tarde. Durante vários anos, os problemas de rejeição pareceram intransponíveis. Na década de 1980, a melhoria das técnicas cirúrgicas, a caracterização dos antígenos dos tecidos e a descoberta dos primeiros medicamentos imunossupressores (ciclosporinas) revolucionaram os transplantes, que se tornaram uma intervenção rotineira. Hoje, em centros médicos de todos os países são substituídos, com sucesso, diversos órgãos e tecidos: coração, rim, fígado, pulmão, intestino, timo, córneas, medula óssea, pele, pâncreas, válvulas cardíacas, veias etc. A relação entre o doador e o receptor simplifica, ou dificulta, o procedimento. Não há rejeição no isotransplante, em que a transferência de um ovário ou de um rim é feita de um indivíduo a seu gêmeo idêntico; nem no autotransplante, em que se substitui uma artéria coronária por uma safena do mesmo indivíduo, ou um fragmento de pele danificado por outro. Contudo, o alotransplante, em que um órgão é transferido a outro indivíduo, requer a supressão do sistema imune, para que o organismo possa aceitar uma parte non-self. Caso contrário, o órgão será rejeitado e, também, o órgão poderá rejeitar o hospedeiro. OS XENOTRANSPLANTES À dificuldade em achar um doador compatível se soma a de encontrar doadores, já que o número de doações é insuficiente em relação à demanda. Uma alternativa seria o xenotransplante, isto é, a transferência de um órgão de um animal ao homem. Devido ao tamanho e a estrutura de seus órgãos, o porco parece o animal mais indicado. Já em 1902, ligara-se o rim de uma paciente a um porco, em uma experiência que resultou fatal. Hoje é sabido que, devido à presença nas células suínas de um tipo de molécula ( -1-3-galactose), ausente em primatas, a não ser que sejam aplicadas doses maciças de medicamentos imunossupressores, ocorrerá um fenômeno de rejeição violento. Em 2002, duas empresas (PPL Therapeutics e Immerge Bio Therapeutics) anunciaram a clonagem de porcos com o gene da -1-3-galactose desativado, por knockout duplo. Esses porcos poderiam vir a ser uma fonte de órgãos, para transplantes temporários em seres humanos, eliminando o perigo da rejeição aguda. Porém, não se evitaria o processo lento de rejeição que seria desencadeado pelas proteínas suínas. Existe outra objeção aos xenotransplantes, que é o risco de introduzir retrovírus de outras espécies em seres humanos, com resultados imprevisíveis. O encapsulado das células animais em uma matriz inerte que as isole e, ao mesmo tempo, deixe passar os nutrientes e produtos celulares, poderia evitar a rejeição. Este procedimento foi utilizado recentemente em pacientes diabéticos, que receberam células suínas encapsuladas e passaram a secretar insulina. E em uma centena de pacientes de câncer, para a secreção de moléculas que aliviassem a dor. 265

276 M.A.MALAJOVICH - BIOTECNOLOGIA (2016) A ENGENHARIA DE TECIDOS A engenharia de tecidos, uma área que visa a substituição de órgãos e tecidos, ocupa uma interface existente entre a biologia celular, a medicina, a bioquímica e a bioengenharia. O cultivo de pele in vitro é utilizado rotineiramente para reparar as lesões causadas por queimaduras. Um pequeno fragmento de pele, isolado do próprio paciente, é o bastante para, em três semanas, formar uma superfície 50 vezes maior. Amolda-se a nova pele a uma superfície biodegradável para evitar que rasgue quando aplicada no paciente. O procedimento se adapta ao tratamento de queimaduras e de lesões de difícil cicatrização. A biomimética consegue reparar in vivo o tecido ósseo, utilizando como molde um polímero, para onde migram e se expandem as células regenerativas internas. A tecnologia se aplica na reparação de fraturas e de lesões causadas por doença periodontal, assim como a reconstrução da cartilagem das articulações. Recentemente, transplantou-se com sucesso uma traqueia, construída com células-tronco do próprio paciente cultivadas sobre um molde poroso. Talvez seja esse o primeiro passo na construção in vitro de estruturas tridimensionais análogas aos órgãos. As estruturas mecânicas com poucos tipos celulares diferentes parecem mais fáceis de construir que órgãos complexos, como um rim ou um pulmão. Uma técnica promissora contempla a eliminação das células animais até deixar uma estrutura inerte que seria repovoada com células-tronco. Essa estrutura também poderia ser obtida por impressão em 3D. Do ponto de vista experimental, um dos avanços mais importantes é o crescimento in vitro de organoides a partir de células-tronco. Pode-se, por exemplo, transformar uma célula da pele em ipsc (do inglês, induced pluripotent stem cells), diferenciá-la em neurônio e cultivar uma estrutura análoga a um cérebro, comparável ao de um feto com um trimestre de desenvolvimento. AS TERAPIAS CELULARES As células-tronco multipotentes são as responsáveis pelo crescimento e a reparação dos tecidos. Presentes em tecidos adultos, conservam a capacidade de se diferenciar em vários tipos celulares, em resposta a estímulos adequados. As células-tronco hematopoiéticas encontram-se em frequências baixíssimas na medula óssea (1: a 1:15.000) e no sangue periférico (1: ). Embora não apresentem características morfológicas que as distingam das outras células, a presença de marcadores moleculares específicos na membrana permite separá-las e introduzi-las mais tarde na mesma pessoa ou em outra que seja compatível. O procedimento possibilita a regeneração dos elementos sanguíneos no tratamento de leucemias e de linfomas, de doenças hereditárias hematológicas e na recuperação dos pacientes que receberam quimioterapia. Numerosos bancos de sangue, públicos e privados, oferecem um serviço de armazenamento de sangue de cordão umbilical que asseguraria a recuperação de células-tronco hematopoiéticas, em caso de necessidade. Como a probabilidade de uma pessoa vir a precisar de suas próprias células é baixíssima (1/ ), a existência de grandes bancos públicos representa a garantia de encontrar doadores compatíveis. Até o momento, o único produto terapêutico aprovado para o tratamento de doenças do sistema hematopoiético é o Hemacord, do New York Blood Center. A presença de células multipotentes em tecidos e órgãos explica o sucesso alcançado em outros tratamentos. A capacidade regenerativa das células-tronco adultas permite a cicatrização de queimaduras, a substituição de células da córnea, a regeneração de osso e cartilagem, o tratamento da artrite e a reparação de fraturas. 266

277 BIOTECNOLOGIA E SAÚDE / NOVOS TRATAMENTOS Terapias experimentais para a regeneração do miocárdio de doentes cardíacos tiveram resultados promissores. Encontram-se em andamento numerosos ensaios clínicos de terapias com células-tronco para diabetes, derrame, esclerose amiotrófica lateral e regeneração da medula espinal. FRAUDES E DESATINOS No início da década de 2000, a perspectiva de utilizar células-tronco embrionárias nas pesquisas parecia uma via promissora. Em 2004, um grupo sul-coreano anunciou avanços na direção da clonagem terapêutica com a obtenção de linhagens de células-tronco embrionárias a partir de um embrião humano clonado. Essas linhagens poderiam ser utilizadas na regeneração de órgãos lesionados, sem problemas de rejeição e, eventualmente, depois de ter passado por uma terapia gênica (Figura 20.1). Quando se descobriu que os resultados eram fraudulentos, e o trabalho realizado em condições éticas inadmissíveis, a comunidade científica ficou abalada. Afortunadamente, a obtenção das células ipsc abriu perspectivas menos conflitivas, e as pesquisas foram orientadas em outra direção. Por outro lado, no fim de 2002, a seita dos raelianos anunciou na mídia o nascimento de vários bebês humanos clonados. Eles teriam usado a técnica de transferência nuclear para gerar indivíduos geneticamente idênticos ao doador. Considerando as dificuldades técnicas a falta de provas apresentadas, concluiu-se que o anúncio não passaria de um golpe publicitário. A clonagem reprodutiva é considerada um crime contra a humanidade e, por enquanto, restringida ao domínio da fantasia e da ficção científica. Outro efeito perverso do entusiasmo com as terapias celulares é a proliferação do turismo médico atrás das promessas de curas milagrosas. Recentemente, um garoto israelense com ataxiatelangiectasia desenvolveu um tumor cerebral depois de um tratamento com células-tronco fetais realizado na Rússia. Os estudos com marcadores celulares mostraram que, na origem do tumor, estavam as células implantadas FIGURA O princípio da clonagem terapêutica, uma forma de gerar células-tronco embrionárias com a informação genética do doador do núcleo Paciente Célula saudável Transferência nuclear Ovócito Fusão celular Embrião Infusão Ovócito anucleado Células-tronco diferenciadas Células-tronco recuperadas 267