HIDROXIALUMINOSILICATOS E A IN VIVO

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1 UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA CENTRO DE CIÊNCIAS NATURAIS E EXATAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA HIDROXIALUMINOSILICATOS E A BIODISPONIBILIDADE DO ALUMÍNIO: AVALIAÇÃO IN VIVO TESE DE DOUTORADO Simone Mores d Silv Noremerg Snt Mri, RS, Brsil 212

2 HIDROXIALUMINOSILICATOS E A BIODISPONIBILIDADE DO ALUMÍNIO: AVALIAÇÃO IN VIVO Simone Mores d Silv Noremerg Tese presentd o Curso de Doutordo do Progrm de Pós-Grdução em Químic, Áre de Concentrção em Químic Anlític, d Universidde Federl de Snt Mri (UFSM, RS), como requisito prcil pr otenção do gru de Doutor em Químic. Orientdor: Profª. Drª. Denise Bohrer do Nscimento Snt Mri, RS, Brsil 212

3 Universidde Federl de Snt Mri Centro de Ciêncis Nturis e Exts Progrm de Pós-Grdução Em Químic A Comissão Exmindor, ixo ssind, prov Tese de Doutordo HIDROXIALUMINOSILICATOS E A BIODISPONIBILIDADE DO ALUMÍNIO: AVALIAÇÃO IN VIVO elord por Simone Mores d Silv Noremerg como requisito prcil pr otenção do gru de Doutor em Químic COMISSÃO EXAMINADORA: Profª. Drª. Denise Bohrer do Nscimento (Presidente/Orientdor) Profª. Dr. Frncielli Weer Sntos Ciin (UNIPAMPA) Profª. Dr. Lucielli Svegngo (UFPEL) Profª. Dr. Mri Ros Chitolin Schetinger (UFSM) Profª. Dr. Morgn Bzzn Dessuy (UFRGS) Snt Mri, 1 de dezemro de 212.

4 Dedico este trlho Á minh fmíli, pelo incentivo e crinho. O orgulho que perceo em vocês cd conquist renov minhs forçs pr continur. Ao Mrcelo Kunz, pelo compnheirismo, mor e forç. Pel compreensão e poio em todos os momentos.

5 Agrdeço À professor Denise Bohrer, por ter confido em mim e proporciondo que eu fizesse o doutordo. Pelo crinho e os cuiddos que sempre teve comigo, prendi com você muito mis do que químic nlític. À professor Frncielli Weer Sntos Ciin por ser ess pesso querid e que consegue tornr tudo mis simples e possível. Origd pel grnde jud e crinho.

6 AGRADECIMENTOS À Prof. Dr. Denise Bohrer do Nscimento, pel orientção, confinç, conselhos e ensinmentos durnte relizção deste trlho. Tmém grdeço pel mizde, dedicção e poio demonstrdos durnte noss convivênci. Ao Prof. Dr. Pulo Nscimento pelos seus ensinmentos e pel mizde. À Prof. Dr. Mri Ros Chitolin Schetinger, pel colorção e pel disponiilizção do lortório e pel jud de seus lunos, em especil o Jessié Gutierres, Jmile Gonçlves, Roséli Spnevello e André Birros. Às Prof. Dr. Frncielli Weer Sntos Ciin e Lucielli Svegngo pel disponiilizção do lortório, pelo incentivo e por nunc medirem esforços em me judr. Quero deixr meu grdecimento especil, pois contriuição de vocês foi essencil pr relizção deste trlho. À Lur Muscchio, Melin Sores e Ariely Izguirry pelo uxílio, tenção, disponiilidde, incentivo, pel mizde. À Suzi Wollenhupt, Cristino Spizzi e Jefferson de Jesus Sores por não medirem esforços e terem enfretdo cors e lgrtos, literlmente, pr me judr. Com legri e mizde de vocês tudo fic mis engrçdo e divertido. Origd pelo crinho de vocês. Aos migos e colegs do LACHEM grdeço pel mizde, conselhos, incentivo e pelos momentos de descontrção vividos o longo deste período em que trlhmos juntos. Em especil Mrlei Veig, Vness Mörschächer, Sndr Mri Rieiro, Luís Ferrz e Alexndre Schneider pelos conselhos, pelo poio, pel confinç, e por nunc negrem jud qundo precisei. Ao Mrcelo e tod minh fmíli que estiverm sempre o meu ldo torcendo por mim, origd pelo poio, mo vocês. À Monlis e João, Rone e Gustvo, Ttin e João, Ntáli e Mrcelo, Mrcele e Vinícius pel grnde mizde, doro vocês. A todos os funcionários e professores que colorrm diret ou indiretmente pr o desenvolvimento deste trlho. À Universidde Federl de Snt Mri pel oportunidde oferecid de relizr o curso de grdução, mestrdo e doutordo. A Deus por ter me ddo forç e condições pr minhs conquists.

7 RESUMO Tese de Doutordo Progrm de Pós-Grdução em Químic Universidde Federl de Snt Mri HIDROXIALUMINOSILICATOS E A BIODISPONIBILIDADE DO ALUMÍNIO: AVALIAÇÃO IN VIVO AUTORA: SIMONE MORAES DA SILVA NOREMBERG ORIENTADORA: DENISE BOHRER DO NASCIMENTO Locl e Dt d Defes: Snt Mri, 1 de dezemro de 212. O lumínio (Al) e o silício (Si) são contminntes encontrdos em sustâncis usds n nutrição prenterl (NP). Devido o seu grnde volume, soluções de nutrição e de infusão são os fármcos, dministrdos por vi prenterl, que presentm mis efeitos dversos se contiverem contminntes. Hidroxiluminosilictos (HAS) insolúveis e iologicmente inertes podem se formr em soluções contendo Al e Si qundo o ph > 4,5. Est interção químic é considerd de grnde interesse no cmpo iológico devido o seu possível ppel n desintoxicção ou proteção contr toxicidde do metl. Neste trlho, foi investigd iodisponiilidde do Al n presenç do Si e de lguns componentes d NP in vivo. Primeirmente otimizou-se os métodos de ertur de tecido iológico pr nálise de Al e Si coexistentes ns mostrs por espectromentri de sorção tômic com forno de grfite. Foi nlisd distriuição do Al e Si no orgnismo de rtos Wistr pós 6 dministrções de,5 mg/kg/di de Al e/ou 2 mg/kg/di de Si n presenç ou não de gluconto de cálcio ou dihidrogenofosfto de potássio em concentrções semelhntes s usds ns soluções de NP. Foi tmém vlid tividde d enzim δ-minolevulinto desidrtse (δ-ala-d) e espécies retivs o ácido tioritúrico (TBARS) nos tecidos dos nimis. As melhores recuperções de Al e Si ns mostrs de tecido niml ocorrerm pós dissolução com hidróxido de tetrmetilmônio (HTMA) utilizndo Si 15 mg/l como modificdor pr determinção de Al e Pd 2 g/l pr Si. Foi necessário o recorimento do forno com Zr pr medid ds mostrs dissolvids com HTMA. O Al se cumulou em todos os tecidos, principlmente no fígdo, rim, osso e sngue. O Si diminuiu o cúmulo do metl nos tecidos, ms esse efeito é menos pronuncido em meio os componentes

8 d NP. Foi oservdo o depósito de Si nos tecidos, principlmente no trtmento com fosfto. Apesr do Al ter se depositdo nos tecidos, não form oservdos efeitos pronuncidos de toxicidde. Em poucos tecidos oservou-se umento n peroxidção lipídic nos trtmentos e tividde d enzim δ-ala-d, qundo lterd, prece umentd nos grupos trtdos com Al, principlmente no trtmento com gluconto de C. Como conclusão, o Si não diminui deposição do Al e, portnto, iodisponiilidde do metl em meio os componentes d NP. Plvrs-chve: Alumínio. Silício. Hidroxiluminosilictos. Soluções de Nutrição prenterl. δ-ala-d. TBARS.

9 ABSTRACT Doctorl Disserttion in Chemistry Grdute Pos in Chemistry Universidde Federl de Snt Mri HYDROXYALUMINOSILICATES AND THE BIODISPONIBILITY OF ALUMINUM: EVALUATION IN VIVO AUTHOR: SIMONE MORAES DA SILVA NOREMBERG ADVISOR: PROFª DR A. DENISE BOHRER DO NASCIMENTO Aluminium (Al) nd silicon (Si) re contminnts found in sustnces used in the prenterl nutrition (PN). Becuse of its lrge volume, nutrition nd infusion solutions re phrmceuticl products prenterlly dministered, which present higher risks of dverse effects when contminted. Insolule nd iologiclly inert species of hydroxyluminosilictes (HAS) my e formed in solutions contining Al nd Si when ph > 4.5. This chemicl interction is considered of gret interest in iology ecuse of its possile role in detoxifiction or protection ginst metl toxicity. In this study the Al iovilility ws investigted in the presence of Si nd some PN components in vivo. Al nd Si ody distriution in Wistr rts ws nlyzed fter 6 dministrtions of Al.5 mg/kg/dy nd/or Si 2 mg/kg/dy in the presence or sence of clcium gluconte or potssium dihydrogenphosphte in concentrtions similr to those used in the PN solutions. δ -Aminolevulinic cid dehydrtse enzyme ctivity nd tiorituric cid rective species (TBARS) content ws lso evluted in niml tissues. Tissue digestion methods were optimized for the determintion of oth Al nd Si in the sme smples y Grphite Furnce Atomic Asorption Spectrometry (GFAAS). Better Al nd Si recoveries in niml tissue smples occurred fter dissolution with tetrmethylmmonium hydroxide (TMAH) using Si 15 mg/l s modifier for Al determintion nd Pd 2 g/l for Si. Before the mesurements, grphite furnce ws coted with Zr following specific heting progrm. Al ccumulted in ll tissues, especilly in the liver, kidneys, ones nd lood. Si decresed Al ccumultion, this effect ws less pronounced in the presence of PN components though. Si tissue ccumultion ws lso oserved, minly when dministered together with phosphte. Although Al ws deposited in the tissues, pronounced toxicity effects were not oserved. Increse in lipidic

10 peroxidtion ws oserved in few tissues. When δ-ala-d ctivity ws ltered, it ws incresed in Al treted groups, minly in C gluconte tretment. As conclusion, Si did not decrese Al deposition nd therefore the metl iodisponiility midst the NP components. Keywords: Aluminium. Silicon. Hydroxyluminosilictes. Solutions for prenterl nutrition. δ-ala-d. TBARS

11 LISTA DE FIGURAS Figur 1: Esquem d formção de HAS B prtir de HAS A envolvendo um form de trnsição, HAS AB...29 Figur 2: Esquem d possível interferênci dos metis n tividde d enzim δ-minilevulinto desidrtse (δ-ala-d)...41 Figur 3: Curvs de pirólise e tomizção pr 1, pg de lumínio...67 Figur 4: Curvs de pirólise e tomizção pr 1 pg de silício...69 Figur 5: Médis semnis dos pesos dos nimis durnte os trtmentos pr os qutro grupos: controle, Al, Si e Al+Si...76 Figur 6: Concentrção de Al no soro, osso, fígdo e rim dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si...78 Figur 7: Concentrção de Al no pulmão dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si...82 Figur 8: Concentrção de Al no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si...83 Figur 9: Concentrção de Si no soro, rim e pulmão dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si...85 Figur 1: Concentrção de Si no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si...86 Figur 11: Efeito d dministrção intrperitonel de Al e/ou Si n tividde d enzim δ-ala-d fígdo dos rtos Figur 12: Efeito d dministrção intrperitonel de Al e/ou Si n tividde d enzim δ-ala-d no rim, pulmão, músculo e corção dos rtos...89 Figur 13: Níveis de MDA no soro e rim dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si...92 Figur 14: Níveis de MDA no músculo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si...93 Figur 15: Níveis de MDA ns estruturs cereris dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si...95 Figur 16: Médis semnis dos pesos dos nimis durnte os trtmentos pr os qutro grupos: controle, Al com KH 2 PO 4, KH 2 PO 4, Al+Si com KH 2 PO Figur 17: Concentrção de Al no soro, fígdo, pulmão e osso dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si...98 Figur 18: Concentrção de Al no músculo, corção e rim dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si...99 Figur 19: Concentrção de Al no testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si...1

12 Figur 2: Concentrção de Al no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si...11 Figur 21: Concentrção de Si no soro, músculo, corção e pulmão dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si Figur 22: Concentrção de Si no rim, testículo e fígdo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si...13 Figur 23: Concentrção de Si no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si...14 Figur 24: Efeito d dministrção intrperitonel de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si n tividde d enzim δ-ala-d no fígdo, corção, músculo e pulmão dos rtos Figur 25: Níveis de MDA no fígdo e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si (Si)...17 Figur 26: Níveis de MDA ns estruturs cereris dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si Figur 27: Médis semnis dos pesos dos nimis durnte os trtmentos pr os qutro grupos: controle, Al com gluconto de C, gluconto de C e Al+Si com gluconto de C Figur 28: Concentrção de Al no soro, fígdo e pulmão dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si Figur 29: Concentrção de Al no rim, osso e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si Figur 3: Concentrção de Al no músculo e corção dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si Figur 31: Concentrção de Al no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si Figur 32: Concentrção de Si no soro, músculo, corção e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si Figur 33: Concentrção de Si no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si Figur 34: Efeito d dministrção intrperitonel de gluconto de C e Al e/ou Si n tividde d enzim δ-ala-d no sngue, fígdo e testículo dos rtos Figur 35: Efeito d dministrção intrperitonel de gluconto de C e Al e/ou Si n tividde d enzim δ-ala-d no rim, pulmão, músculo e corção dos rtos Figur 36: Níveis de MDA no soro, corção, rim, pulmão e músculo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si (Si) Figur 37: Níveis de MDA no fígdo e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si (Si) Figur 38: Níveis de MDA ns estruturs cereris dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si (Si) Figur 39: Grnuloms formdos no tecido dominl do grupo de nimis com 6 dministrções intrperitoneis de Al,5 mg/kg/ di (), tecido dominl sem grnuloms no grupo controle ()

13 LISTA DE TABELAS Tel 1: Prâmetros instrumentis pr determinção de Al e Si por GFAAS e trtmento do forno com Zr...48 Tel 2: Proporção entre mss do tecido e volume de Tris/HCl pr homogeneizção...6 Tel 3: Volume de soluções e mostr pr nálise de δ-ala-d tecidul com respectivo tempo de incução pr cd tecido Tel 4: Volume de soluções e sngue pr nálise de δ-ala-d...62 Tel 5: Volume de homogento e regentes pr nálise de TBARS...64 Tel 6: Curv pdrão de mlondildeído Tel 7: Curv pdrão de lumin pr determinção de proteín Tel 8: Recuperções de Al e Si em mostrs de fígdo erts com ácido nítrico...7 Tel 9: Recuperções de Al e Si em mostrs de fígdo erts com HTMA 72 Tel 1: Concentrção de Al no pdrão de fígdo ovino pós ertur com,5 ml de HTMA...73 Tel 11: Concentrção de Al (µg/g) no músculo, corção e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si...81 Tel 12: Concentrção de Si (µg/g) no fígdo, músculo, corção e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si...86 Tel 13: Níveis de porfiirinogênio no sngue (nmol PBG/h/mL) e testículo (nmolpbg/mgptn h) dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si Tel 14: Níveis de MDA no pulmão, corção, fígdo e testículo (nmolmda/g de tecido) dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si Tel 15: Níveis de MDA no hipotálmo de rtos trtdos com Al e/ou Si...95 Tel 16: Níveis de porfiirinogênio no sngue (nmolpbg/h/ml), rim e testículo (nmolpbg/mgptn h) dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si e KH 2 PO Tel 17: Níveis de MDA no soro (nmolmda/ml), rim, corção, músculo e pulmão (nmolmda/g de tecido) dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si...17 Tel 18: Níveis de MDA no hipotálmo de rtos trtdos com KH 2 PO 4 e Al e/ou Si...19 Tel 19: Concentrção de Si (µg/g) no fígdo, rim e pulmão dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si Tel 2: Níveis de MDA no hipotálmo de rtos trtdos com gluconto de C e Al e/ou Si...127

14 Tel 21: Concentrção de Al medid nos órgãos e sngue nos diferentes grupos trtdos qundo comprdos os seus respectivos controles Tel 22: Concentrção de Si medid nos órgãos e sngue nos diferentes grupos trtdos qundo comprdos os seus respectivos controles Tel 23: Atividde d enzim δ-ala-d nos órgãos e sngue nos diferentes grupos trtdos qundo comprdos os seus respectivos controles Tel 24: Sustâncis retivs o ácido tioritúrico (TBARS) nos órgãos e sngue nos diferentes grupos trtdos qundo comprdos os seus respectivos controles...134

15 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO OBJETIVOS Ojetivos geris Ojetivos específicos REVISÃO BIBLIOGRÁFICA Alumínio Silício Interção entre silício e lumínio (Hidroxiluminosilictos) Formção de hidroxiluminosilictos Hidroxiluminosilictos e iodisponiilidde do lumínio Nutrição prenterl Estresse Oxidtivo δ-aminolevulinto Desidrtse (δ-ala-d) Análise de Si e Al em mostrs iológics Aertur Alclin Determinção de Alumínio Determinção de Silício MATERIAL E MÉTODOS Controle d contminção Otimizção do método pr determinção de Al e Si por GFAAS Instrumentção Regentes e Soluções Determinção de lumínio e silício Otimizção do método de digestão ds mostrs de tecido niml Instrumentção Regentes e Soluções Digestão do fígdo com ácido nítrico Dissolução do fígdo com hidróxido de tetrmetilmônio Dissolução do osso com hidróxido de tetrmetilmônio Digestão do osso com ácido nítrico...51

16 Determinção de lumínio e silício Administrção de lumínio e silício em rtos (Wistr) Instrumentção Regentes e Soluções Animis Trtmento Trtmento com Al e Si Trtmento com Al, Si e dihidrogenofosfto fosfto de potássio Trtmento com Al, Si e gluconto de cálcio Análise de Alumínio e Silício Trtmento ds mostrs de sngue Amostrs de fígdo, corção, cérero, músculo, testículo e rim Amostrs de osso Determinção de Al e Si Análises ioquímics Instrumentção: Regentes e soluções: Prepro do homogento Atividde d δ-aminolevulinto Desidrtse (δ-ala-d) δ-ala-d Tecidul δ-ala-d snguíne Espécies Retivs o Ácido Tioritúrico (TBARS) TBARS Tecidul TBARS Snguíneo Determinção de proteíns totis Análise esttístic RESULTADOS E DISCUSSÃO Otimizção do método pr quntificção do Alumínio Otimizção do método pr quntificção de silício Otimizção do método de digestão ds mostrs de tecido niml Digestão do fígdo com ácido nítrico Dissolução do fígdo com hidróxido de tetrmetilmônio Dissolução do osso com hidróxido de tetrmetilmônio Digestão do osso com ácido nítrico Administrção de lumínio e silício em rtos Wistr Trtmento com Al e Si Desenvolvimento dos nimis durnte o trtmento Distriuição do lumínio nos tecidos dos rtos Wistr Distriuição de silício nos tecidos dos rtos Wistr δ-aminolevulinto Desidrtse (δ-ala-d) Espécies Retivs o Ácido Tioritúrico (TBARS) Trtmento com Al e Si e dihidrogenofosfto de potássio Desenvolvimento dos nimis durnte o trtmento...96

17 Distriuição do lumínio nos tecidos dos rtos Wistr Distriuição de silício nos tecidos dos rtos Wistr δ-aminolevulinto Desidrtse (δ-ala-d) Espécies Retivs o Ácido Tioritúrico (TBARS) Trtmento com Al e Si e gluconto de C Desenvolvimento dos nimis durnte o trtmento Distriuição de silício nos tecidos dos rtos Wistr δ-aminolevulinto Desidrtse (δ-ala-d) Espécies Retivs o Ácido Tioritúrico (TBARS) Efeito do trtmento nos tecidos CONCLUSÃO...13 REFERÊNCIAS...135

18 LISTA DE ABREVIATURAS Al- Alumínio ASCN- Sociedde Americn de Nutrição Clinic (do inglês- Americn Society of Clinicl Nutrition) ASPEN- Sociedde Americn de Nutrição Perenterl e Enterl (do inglês- Americn Society of Prenterl nd Enterl Nutrition) CAT- Ctlse DA- Doenç de Alzheimer ER- Espécie retiv ERN- Espécie retiv de nitrogênio ERO- Espécie retiv de oxigênio FCM- Ftor de clirção médio FDA- Food nd Drug Administrtion GFAAS- Espectrometri de sorção tômic com forno de grfite (do inglês- Grphite Furnce Atomic Asorption Spectrometry) GPx- Gluttion peroxidse GR-Gluttion redutse GSH- Gluttion reduzid GSSG- Gluttion oxidd HAS- Hidroxiluminosilictos HTMA- Hidróxido de tetrmetilmônio MDA- Mlondildeído NP- Nutrição prenterl NPT- Nutrição prenterl totl PBG- Porfiirinogênio SDS- Dodecil sulfto de sódio Si- Silício SOD- Superóxido dismutse TBA- Ácido tioritúrico TBARS- Espécies retivs o ácido tioritúrico TCA- Ácido triclorocético

19 TFK- Tmpão fosfto de potássio TGI- Trto gstrointestinl Tris/HCl- Tris(hidroximetil)minometno hidrocloreto δ-ala- Ácido δ-minolevulínico δ-ala-d- δ-minolevulinto desidrtse δ-ala-s- δ-minolevulinto sintse

20 2 1. INTRODUÇÃO Apesr de lumínio (Al) e (Si) serem dois dos três elementos mis undntes n litosfer, durnte evolução humn mos tem sido, n mior prte ds vezes, excluídos de processos ioquímicos (MEDEL et l., 1996). O lumínio pode cusr doençs nos ossos e no cérero em pcientes que receem terpi de nutrição prenterl por longo tempo. Além disso, tmém pode ocorrer o cúmulo de lumínio no osso de crinçs premturs que receem terpi de nutrição prenterl totl (NPT) (KLEIN et l., 25). Alguns estudos epidemiológicos e experimentis sugerem que sílic pode reduzir sorção orl e/ou umentr excreção do lumínio e proteger contr os efeitos dversos induzidos pelo metl. Os hidroxiluminosilictos são, provvelmente, principl fse minerl que control soluilidde do Al em mientes nturis (BIRCHALL et l., 1989). O silício é o segundo elemento mis undnte n litosfer e está distriuído uiqumente n nturez, ocorrendo principlmente ns forms de luminosilictos e hidrtos de dióxido de silício. Quntiddes consideráveis de silício são encontrds em vários produtos limentres e em tods s águs nturis (BISSÉ et l., 25). Por mis de 35 nos, o interesse nutricionl no Si pr nimis superiores e seres humnos tem sido centrdo nos seus efeitos enéficos sore o colágeno e formção ou função do glicosminoglicno, que poderim influencir n formção ósse, mnutenção d súde crdiovsculr e n cictrizção de ferids. Apesr de numerosos sinis de deficiênci prentes de Si terem sido descrits, gerlmente ele não é ceito como um nutriente essencil pr os nimis superiores e seres humnos (NILSEN, 29). Estudos mostrrm que lumínio e silício são contminntes encontrdos em sustâncis usds n nutrição prenterl. A Nutrição Prenterl (NP) é dministrção de nutrientes por meio intrvenoso em pcientes que não podem consumi-los por vi gstrointestinl. Devido o seu grnde volume, soluções de nutrição e de infusão são os fármcos, dministrdos por vi prenterl, que presentm mis efeitos dversos por conterem contminntes (BOHRER et l., 28). Dentre os seus componentes

21 21 individuis, o gluconto de cálcio e o dihidrogenofosfto de potássio estão entre os mis contmindos com Al e Si. Um estudo nterior do nosso grupo de trlho teve como ojetivo investigr formção de HAS em soluções em ph fisiológico, incluindo ensios com componentes d nutrição prenterl que presentm mior contminção por Al e Si, o gluconto de cálcio e o dihidrogenofosfto de potássio. Foi comprovd hipótese de que o Si interge com o Al em ph fisiológico, entretnto formção de HAS não foi confirmd em meio os componentes d nutrição prenterl in vitro. Como continução deste trlho, iodisponiilidde do lumínio n presenç de silício e dos componentes d nutrição prenterl form investigdos gor in vivo por dministrção intrperitonel em rtos. Os efeitos ioquímicos cusdos pelo trtmento tnto com Al qunto com Si tmém form nlisdos, pois lém de verificr seu cúmulo nos órgãos é importnte investigr se ção deste como um protetor d toxicidde do Al não interfere n tividde d enzim δ- ALA-D, e no estresse oxidtivo, trvés d medid d peroxidção lipídic.

22 22 2. OBJETIVOS 2.1. Ojetivos geris O ojetivo deste estudo é vlir o ppel do silício n iodisponiilidde do lumínio trvés d formção de HAS qundo dministrdo concomitntemente com o lumínio por vi intrperitonel em ph fisiológico em rtos e ind influênci de lguns dos componentes d nutrição prenterl n formção do HAS Ojetivos específicos - Desenvolver um técnic pr ertur de mostrs de tecido niml pr determinção de Al e Si, com recuperção stisftóri dos dois elementos. - Determinr concentrção de Al e Si no cérero, fígdo, músculo, pulmão, testículo, ossos, rins, corção e sngue dos rtos trtdos com Al e/ou Si n presenç ou não dos componentes d nutrição prenterl, pós 6 dministrções por vi intrperitonel. - Avlir tividde d enzim δ-ala-d no fígdo, músculo, pulmão, testículo, rins, corção e sngue dos rtos trtdos com Al e/ou Si e os componentes d nutrição prenterl. - Verificr os efeitos do lumínio e do silício e dos componentes d nutrição prenterl sore peroxidção lipídic trvés d medid do TBARS sore os diferentes tecidos (fígdo, músculo, pulmão, testículo, rins, corção e soro) e estruturs cereris (córtex, cereelo, hipocmpo, hipotálmo e estrido) dos rtos.

23 23 3. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 3.1. Alumínio O lumínio é o elemento metálico mis undnte d crost terrestre, o terceiro em gerl e tem sido descrito como onipresente, pois ele pode ser encontrdo em quntiddes mensuráveis em limentos, solo, águ e r (PERRY; KEELING-TUCKER, 1998). O Al é lierdo pr o meio miente por processos nturis, processos de erosão do solo e erupções vulcânics, e por ções ntropogênics. A fonte mis importnte de otenção do metl é uxit, que contém 55% de óxido de lumínio. As tividdes industriis, tis como fundição, são principl fonte de emissões o miente, no entnto, o uso do lumínio tmém está estendido os limentos comerciis e o trtmento d águ potável (LLOPIS; DÍEZ, 22). O lumínio tem um vlênci fix de III, de modo que os compostos de lumínio podem liertr o íon hidrtdo Al 3+, Al(H 2 O) 3+ 6, em solução quos. Apens pequens quntiddes de Al 3+ existem em solução quos, exceto em ph ixo, pois os sis de lumínio em ph 7,4 hidrolism rpidmente e formm polihidróxidos moderdmente solúveis (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 1999). O Al é um elemento não essencil e grnde importânci d vlição ds fontes deste metl é devido à ssocição deste elemento com doençs ósses (GURA; PHARM, 21) e cereris podendo estr envolvido em um série de doençs neurológics, como por exemplo, doenç de Alzheimer (DA) (BEQUET et l., 1994), e lgums doençs hepátics (MAILLOUX et l., 211). A lt iodisponiilidde do Al livre no meio fisiológico levou à hipótese de que ele pode competir com outros metis, cusndo mudnçs n tividde de muits enzims em como fetndo o processo de minerlizção dos ossos (MENDEL et l., 1996). A toxicidde gud do lumínio nos sistems iológicos pode ser relciond ele ser um metl duro preferindo ligr-se com ligntes duros, tis como grupos fosfto em memrns e no DNA e ATP (PERRY; KEELING-TUCKER, 1998).

24 24 A DA é provvelmente o resultdo de um processo multiftoril, no qul estão inclusos componentes genéticos e mientis; supõe-se que s crcterístics genétics dos indivíduos modulm exposições mientis. Dentre os ftores de risco mientis, relciondos com o desenvolvimento d DA, encontr-se exposição o Al, um dos ftores potenciis mis estuddos. Em 1965, foi reltd inoculção intrcererl de fosfto de Al em coelhos, que resultou em degenerção neurofirilr significtiv similr d DA; relção entre o Al e doenç começou ser estudd desde então. Em 1973, foi pulicdo o primeiro rtigo que demonstrou o umento n concentrção de Al em céreros de pcientes com DA (FERREIRA et l., 28). Segundo Wlton (26) o Al poderi estr ssocido à formção de emrnhdos neurofirilres no cérero devendo, portnto, ser considerdo um ftor cusl d DA. Além disso, o Al é encontrdo ssocido com emrnhdos de peptídeos etmilóides no cérero dos pcientes com DA (EXLEY, 25, 26). Ferreir et l. (28) relizrm um revisão sistemátic d litertur produzid entre 199 e 25, selecionndo 34 trlhos pr pesquis, desses, 68% estelecerm relção entre o Al e DA, 23,5% não presentrm ddos conclusivos e 8,5% não estelecerm nenhum relção entre o Al e DA. A prtir dos resultdos otidos, verificrm que o Al intervém em diversos processos neurofisiológicos responsáveis pel degenerção crcterístic d DA. Apesr d polêmic existente, evidênci científic demonstr, o longo dos últimos nos, que o Al pode estr ssocido com o desenvolvimento d DA. Recentemente, foi demonstrdo que o umento d inflmção de regiões do cérero e d interferênci com função de projeções colinérgics podem representr os mecnismos de ção trvés do qul o Al pode cusr déficits de prendizgem e de memóri e contriuir com processos ptológicos n DA (PLATT et l., 21). Além disso, o Al pode influencir permeilidde d rreir snguecérero e lterr o fluxo de moléculs e íons pr dentro e for do cérero (BANKS et l pud KAIZER et l., 27). O pulmão e pele são rreirs nturis eficzes n redução d sorção do lumínio, ssim como o trto gstrointestinl (TGI), de tl form que, pensv-se que toxicidde não fosse possível. Um dulto sorve um estimtiv de 15 µg (,3,5%) dos tuis 5 mg Al/di em um diet orl típic. Est quntidde que tinge circulção lig-se às proteíns e, em prte, é elimind por vi renl. Se ingerido em doses excessivs sorção do lumínio dministrdo por vi orl

25 25 torn-se possível, qundo cpcidde do sistem excretor é excedid. Qundo dministrdo por vi prenterl, o lumínio ultrpss rreir protetor do TGI e pode depositr-se no osso, fígdo, ço, cérero, rim, e outros tecidos. Por infusão intrvenos cerc de 4% do lumínio é sorvido em dultos e té 78% é retido em recém-nscidos (BOHRER et l., 21). Além disso, um vez sorvido, ele permnece no corpo por um longo tempo (GURA; PHARM, 21), pois há reltos de que em humnos mei-vid do Al é de 7 nos (PRIEST et l., 1998). A ingestão de lumínio em excesso lev o cúmulo em órgãos-lvo e tem sido ssocido dno de testículo de seres humnos e nimis. Alts concentrções de lumínio em espermtozóides humnos e no plsm seminl são correlcionds com diminuição d motilidde e viilidde do esperm (YOUSEF; SALAMA, 29). Zmn et l. (1993) demonstrrm que o lumínio tem efeitos tóxicos sore morfologi ds céluls snguínes em rtos. A ocorrênci uíqu do lumínio n litosfer, terceiro elemento mis comum pós oxigênio e silício, e usênci complet de qulquer necessidde iológic pr o elemento se cominm levndo um prdoxo intrignte. Não é suficiente pontr pr insoluilidde ou conhecid toxicidde do lumínio pr explicr este enigm. O ferro é significntemente mis insolúvel e o cálcio igulmente citotóxico. Por um perspectiv evolutiv, poderi ser rgumentdo que iot ou sistems iológicos, que form dependentes do lumínio, não terim sorevivido rigores d seleção nturl, ou, lterntivmente, que pesr de su undânci, o lumínio tem permnecido indisponível em grnde prte d evolução ioquímic. A últim possiilidde fvorece propost de que o silício tue com um controldor iológico d disponiilidde geoquímic do lumínio (EXLEY; BIRCHALL, 1992) Silício Depois do oxigênio, o silício é o segundo elemento mis undnte n litosfer, representndo cerc de 28% d crost terrestre. Está distriuído uiqumente n nturez, ocorrendo principlmente ns forms de luminosilictos e hidrtos de dióxido de silício (BISSÉ et l., 25). As principis fontes limentres são os cereis/grãos e seus produtos (por exemplo: cereis mtinis, pão, cervej),

26 26 lgums fruts e vegetis (por exemplo: nns, psss, feijão, lentilh) e águ potável não filtrd (JUGDAOHSINGH et l., 24). O Si existe mis comumente como sílic minerl, SiO 2. Qundo exposto à águ, silictos lierm ácido ortosilícico Si(OH) 4 num concentrção de 1-15 mg/l de SiO 2. É dest form que o silício está disponível pr interção com lumínio em solução e pr sorção no trto gstrointestinl. Estim-se que diet humn contém 2-5 mg SiO 2 /di, dos quis 2% é derivd d águ d torneir e eids. Do restnte, 6% é derivdo de cereis e está presente como sílic fitolític, um polímero hidrtdo SiO 2.nH 2 O, que é de ix iodisponiilidde (BELLIA et l., 1994). A sorção exigiri su decomposição em espécies solúveis muito menores, como o ácido ortosilícico. O ácido ortosilícico (Si(OH) 4 ) é principl espécie de Si presente n águ potável e em outros líquidos, incluindo cervej, que é fonte mis prontmente disponível de Si o homem (REFFITT et l., 1999). A excreção humn é de 15-2 mg diáris de Si, enqunto que os herívoros excretm 1 2 vezes mis (PÉREZ; MANCILLA, 212). O Si gerlmente é considerdo como sendo um elemento de ix toxicidde (CAROLI, 1996). As proprieddes tóxics de compostos inorgânicos solúveis e insolúveis de silício são conhecids por cusr prolems nos pulmões e nos rins, conhecidos como firose pulmonr e nefropti dos Bálcãs. Estes efeitos tóxicos, entretnto, se mnifestm por um exposição elevds concentrções de Si. Altos níveis de compostos de silício n águ potável podem tmém levr o umento n freqüênci de orto espontâneo, e elevdos níveis séricos de silício são oservdos em pcientes com insuficiênci renl crônic (LUGOWSKI et l., 1998). O ppel do Si n nturez ind é reltivmente ml compreendido. Em certos orgnismos e plnts, o silício é extrído ds águs de superfície, polimerizdo e incorpordo com função de estilizção (reforço) n prede celulr ou nos esqueletos de plnts. Ele tmém pode cumprir um ppel iológico nos mmíferos e vários estudos têm sugerido que é um elemento trço necessário pr o desenvolvimento d crtilgem ósse e do colágeno do tecido conjuntivo (LUGOWSKI et l., 1998). Em nimis superiores, incluindo rtos e pintos, o silício tem demonstrdo ser um elemento trço essencil já que um diet deficiente lev normliddes no crescimento e esquelétics (PERRY; KEELING-TUCKER, 1998). Além disso, o consumo elevdo de Si prentemente pode ser enéfico, fcilitndo sorção ou utilizção de lguns mineris, incluindo core e mgnésio, que são

27 27 essenciis pr o crescimento e mnutenção ósse, súde crdiovsculr e cictrizção de ferids. Apesr de numerosos sinis de deficiênci prente de Si terem sido descritos, ele gerlmente não é ceito como um nutriente essencil pr os nimis superiores e seres humnos. Não há ddos mostrndo su essencilidde pr completr o ciclo de vid de um mmífero, ou definindo um ppel ioquímico pr su necessidde (NIELSEN, 29). Nos verterdos o Si tem sido encontrdo em quntiddes mrcntes no celo, plums, pele, fígdo, corção, músculos, rins e tendões. A su concentrção em tecidos prenquimáticos foi estimd em 2-1 µg/g. Assim, ssumindo um fix similr de deposição de silício em outros tecidos, o seu teor totl no corpo pr um pesso com 7 kg de peso corporl pode ser extrpoldo em um fix de 14 7 mg. Isto fz com que o silício sej o terceiro elemento trço mis undnte constituinte do corpo (depois do ferro e zinco) (BISSÉ et l., 25). Os enefícios do silício pr súde, no que diz respeito à função esquelétic, neurológic e posicionl, têm sido recentemente reconhecidos (CHUMLEA, 27 pud GONZALEZ-MUÑOZ et l., 28). Além disso, efeitos enéficos d dministrção de silício em pcientes humnos e em outros nimis com osteoporose têm sido reltdos (BISSÉ et l., 25). O Si e o ácido silícico podem diminuir iodisponiilidde do lumínio, loquendo su sorção pelo trto gstrintestinl (PARRY, KEELING-TUCKER, 1998) e impedindo resorção (REFFITT et l., 1999). No entnto, existem poucs informções disponíveis sore os possíveis efeitos enéficos do Si n toxicidde neurológic, sistem ntioxidnte e nos mrcdores de estresse de certos distúrios neurológicos (GONZALEZ- MUÑOZ et l., 28).

28 Interção entre silício e lumínio (Hidroxiluminosilictos) Formção de hidroxiluminosilictos O ácido silícico (Si(OH) 4 ) rege com o lumínio pr formr hidroxiluminosilictos. A reção não é com o íon Al 3+ (q), ms envolve condensção competitiv de Si(OH) 4 entre os grupos hidroxil em átomos djcentes de Al, que fzem prte d estrutur de um hidróxido de lumínio (Al(OH) 3(s) ). A reção é descrit como competitiv, porque o Si(OH) 4 deve competir com formção de hidroxiluminocomplexos, de tl form que o Si(OH) 4 tem sido descrito como um iniidor do crescimento do Al(OH) 3(s). Deste modo, qundo o Si(OH) 4 está presente em soluções em que o Al(OH) 3(s) é rpidmente formndo, ele rege com os primeiros precursores d fse sólid pr rndr o seu crescimento e precipitção n solução. Mesmo qundo o Si(OH) 4 é diciondo à gregdos préformdos de Al(OH) 3(s), ele rege com fse sólid dividindo- em pequens uniddes individuis (EXLEY; BIRCHALL, 1993). Pr grntir que Si(OH) 4 sej espécie presente, é importnte que solução estej ixo de ph 9, (pk pr Si(OH) 4 é de cerc de 9,6) e não sturd no que diz respeito à soluilidde de Si(OH) 4 (que utocondens qundo [Si(OH) 4 ] > 2, mmol/l). Qundo esses critérios são preenchidos, HAS de estequiometri e estruturs distints são formdos e podem precipitr em solução (STREKOPYTOV; EXLEY, 25). De cordo com Exley et l. (1997) form mis simplificd de formção de HAS est demonstrd n equção 1, pr n=2. nal 3+ (q) [Al(OH) 3 ] n (AlO) n (SiO) n/2 (OH) 2n (1) OH - Si(OH) 4 Íon de lumínio livre Hidróxido de lumínio morfo Hidroxiluminosilicto Hidroxiluminosilictos são, provvelmente, principl fse minerl que control soluilidde do Al em mientes nturis (DOUCET et l., 21). Eles têm sido estuddos pelo menos nos últimos 5 nos (EXLEY et l., 22) e pesquiss

29 29 recentes determinrm estrutur e estequiometri de dus forms distints, HAS A e HAS B (DOUCET et l., 21). HAS A se form idelmente qundo rzão Si:Al é de,5 e qundo todos os átomos de Al estão octedricmente coordendos. A formção de HAS B envolve um reção de deshidroxilção que, à tempertur e pressão mientes, prece ser inicid pelo excesso de Si(OH) 4 em solução, com um rzão Si:Al de 1,, e com té 5% dos íons Al presentes em coordenção tetrédric (Figur 1). Qundo s concentrções de Al e Si(OH) 4 n solução mãe são iguis ou Si(OH) 4 está presente em pelo menos um ftor de dois em relção o Al, mos os tipos de HAS estão presentes n fse sólid. A últim oservção levou sugestão de que HAS B são formdos trvés d condensção competitiv do Si(OH) 4 entre os grupos hidroxil nos HAS A (STREKOPYTOV; EXLEY, 25). +Si(OH)4 +Si(OH)4 e/ou tempo Figur 1: Esquem d formção de HAS B prtir de HAS A envolvendo um form de trnsição, HAS AB, que sofre um deshidroxilção com o tempo ou com um excesso de Si(OH) 4 (STREKOPYTOV; EXLEY, 25). N miori ds águs do solo, dissolução não estequiométric de mineris de luminosilictos comindo com dissolução de outros silictos grntem que concentrção de Si(OH) 4 fique em excesso em relção o Al e, portnto, que o principl HAS formdo sej o HAS B (SCHNEIDER et l., 24). Tem sido demonstrdo que espécies de HAS insolúveis e iologicmente inertes podem se formr em soluções contendo lumínio em níveis quse

30 3 fisiológicos qundo o ph está cim de 4,5 (EXLEY; BIRCHALL, 1993). Sugere-se que o mecnismo pelo qul estes HAS se formm é iniição d nucleção do hidróxido de lumínio. Est interção químic entre lumínio e silício é tulmente considerd de grnde interesse no cmpo iológico devido o seu possível ppel n desintoxicção do lumínio (PERRY; KEELING-TUCKER, 1998). Em um trlho nterior (NOREMBERG, 21) foi investigd formção de HAS n presenç ou não de componentes d nutrição prenterl in vitro. O método de filtrção em memrn foi usdo pr investigr formção e o tmnho de prtículs em soluções contendo Al (,5 mg/l) e Si (,5; 1,; 5,; 1 e 2 mg/l), n presenç ou usênci de gluconto de cálcio 2% ou dihidrogenofosfto de potássio 1M. Trnscorridos 24h, 1, 2, 3 ou 6 meses do prepro, s líquots ds soluções form filtrds, em memrns de porosidde,1;,2 ou,45 µm e o Al e Si form determindos no filtrdo. O Al form hidróxidos em soluções de ph neutro ou próximo d neutrlidde que ficm retidos ns memrns utilizds. N presenç de silicto, Al e Si trvessrm s memrns, provvelmente devido à formção de HAS. A formção de HAS ocorreu em soluções com concentrção,5 mg/l de Al e concentrção de Si igul ou mior 1 mg/l. Em solução de dihidrogenofosfto de potássio houve retenção de prtículs pels memrns, ms ests são formds provvelmente pel interção deste com o silício e não com o Al, pois concentrção de Si no filtrdo diminuiu enqunto do Al permneceu constnte. A nálise do precipitdo mostrou presenç fósforo e Si. N presenç de gluconto de cálcio oservou-se o predomínio de prtículs com tmnho entre 1-1 nm, que ficrm retids ns memrns. Esss prtículs são provvelmente formds por lumínio ligdo o gluconto, pois concentrção de Si não se lterou com filtrção e nálise do mteril retido n memrn mostrou presenç de C e Al. Apesr de ocorrer interção e formção de prtículs entre s espécies estudds, pôde-se verificr que ests não excedem o tmnho recomenddo pr mteril prticuldo pr soluções prenteris.

31 Hidroxiluminosilictos e iodisponiilidde do lumínio Considerndo todos os efeitos dversos que podem estr relciondos o lumínio, os estudos epidemiológicos e experimentis que sugerem que sílic pode reduzir sorção orl e/ou umentr excreção do lumínio e proteger contr esses efeitos induzidos pelo metl (PERRY et l., 1998; REFFITT et l., 1999; GONZALEZ-MUÑOZ et l., 28) são de grnde relevânci. De cordo com Gillette Guyonnet e colordores (27) sílic é provvelmente o ntídoto nturl o Al e poderá desempenhr um efeito enéfico diminuindo iodisponiilidde do mesmo. Esses utores sugerem possiilidde d utilizção de silictos como gente terpêutico pr DA. Bohrer e colordores (29) reltrm que pel contminção de soluções de NP com silicto, oriund do vidro, o silicto pode se ligr o lumínio pr formr hidroxiluminosilictos estáveis, que podem reduzir iodisponiilidde do lumínio. Além disso, qundo soluções de NP form quecids, lierção de silício e lumínio foi celerd. Eles oservrm que, qundo proporção molr de silício:lumínio er mior que 5, não hvi lumínio livre n solução. Se rzão er menor que 5, o montnte de lumínio livre er mior. Rondeu et l. (28) exminrm ssocição entre exposição o lumínio ou sílic trvés d águ potável e o risco do declínio cognitivo e DA. A nálise não mostrou nenhum evidênci d ingestão de sílic estr ssocid com evolução d função cognitiv, porém mostrou um ssocição invers entre ingestão de sílic d águ potável e o risco de demênci, ou mis especificmente doenç de Alzheimer. O potencil do silício em influencir n iodisponiilidde do lumínio foi primeirmente demonstrdo em peixes (BIRCHALL et l., 1989). Experimentos com slmão do Atlântico em águ com concentrção de lumínio de 6-7 µm e ph 5, demonstrrm que peixes podem soreviver est cominção tóxic gud, n presenç de silício em excesso, devido à formção de HAS, um form iologicmente inerte que especificmente liviou toxicidde do lumínio. Sem o ácido silícico, mortlidde dos peixes foi de 1%, resultdo de grndes dnos n estrutur e função rnquiis. Qundo 1 µm de ácido silícico estvm presentes, não ocorrerm mortes, estrutur ds rânquis permneceu norml e sorção

32 32 sistêmic de lumínio no osso, cérero e outros órgãos foi iniid. Concentrções mis ixs de ácido silícico presentrm um redução no processo de proteção, demonstrndo que 1 µm de ácido silícico são necessários pr formção de espécies de HAS estáveis. As experiêncis em seres humnos tmém têm sido relizds pr investigr relção entre lumínio e silício. Birchll e Chppell (1989) sugerirm que presenç de silício deve reduzir sorção gstrointestinl de lumínio, o que foi posteriormente confirmdo por Edwrdson et l. (1993) e Jugdohsingh et l. (2). No estudo de Edwrdson et l. (1993), suco de lrnj contendo Al foi ddo à voluntários com e sem dição de 1 µm de ácido silícico (o mínimo necessário pr formr HAS estáveis), e os níveis plsmáticos form determindos pós 1 e 6 h. Os resultdos mostrrm que presenç de ácido silícico reduziu sorção de Al em 15% qundo comprd com os indivíduos que ingerirm eid sem dição de ácido silícico. Isto ocorreu pesr d presenç de citrto, que é conhecido por umentr sorção de lumínio. Em outro estudo, em voluntários com função renl norml, foi verificdo que o ácido silícico não só foi cpz de reduzir sorção gstrointestinl de lumínio, ms tmém de lierr e excretr lumínio de sítios do corpo, incluindo os ossos (BELLIA et l., 1996). Estes resultdos mostrm que o silício, de lgum form pode intergir com s espécies de lumínio presente n solução e no estdo sólido e pode reverter formção de fses mineris em grnde prte insolúvel. Gonzlez-Muñoz et l. (28) demonstrrm que o consumo de cervej fet cinétic de sorção e excreção de lumínio, possivelmente devido um interção entre o Al e Si no trto digestivo. Gonzlez-Muñoz et l. (28) mostrrm que inclusão de Si n diet, em form de cervej ou de ácido silícico, reduz os efeitos nocivos cusdos pel peroxidção cererl, diminuindo níveis de Al no cérero. A formção de HAS é um importnte controle d disponiilidde iológic do Al. No entnto, prece que esse controle é principlmente de nturez geoquímic com HAS contriuindo pr o controle d soluilidde do Al no miente nturl. A onipresenç do Al n crost terrestre é lentmente compnhd pelo número de plicções do metl n vid modern. Se quisermos mnter est disponiilidde do Al temos que grntir que ele será usdo com segurnç e su químic inorgânic

33 33 únic com Si(OH) 4, pode ser importnte pr tingir este ojetivo (EXLEY et l., 22) Nutrição prenterl A nutrição prenterl totl (NPT) pode ser definid como o processo pelo qul todos os nutrientes necessários são dministrdos por vi intrvenos. Nqueles indivíduos que são incpzes de consumir limentos por vi orl ou enterl, nutrição prenterl (NP) é necessári pr sustentr vid (HARRAKI et l. 1995). Produtos pr nutrição prenterl são comercilizdos n form de soluções estéreis e incluem eletrólitos (N, K, C, Mg, cloreto, icronto, cetto e fosfto), minoácidos, croidrtos (glicose e polióis), oligoelementos (Cu, Zn, Cr, Mn), lumin, vitmins e lipídios (FISCHER, 1978). A NPT é, muits vezes, necessári como djuvnte à terpi do câncer ou em outrs circunstâncis específics, como qundo um pciente não é cpz de tomr cloris orlmente por mis de sete dis, tem cpcidde de sorção indequd pós cirurgi, fístul, flh hepátic ou renl gud, ou doenç inflmtóri do intestino. A nutrição prenterl tmém pode ser útil n cirurgi pr equilirr o lnço de nitrogênio e permitir que os pcientes suportem melhor o estresse, em como em peditri pr grntir um om crescimento e desenvolvimento (HARRAKI et l. 1995). Além de fornecer um lnço clórico positivo com infusão otimizd de proteíns, croidrtos, lipídios, eletrólitos e vitmins, dequd suplementção de micronutrientes essenciis tmém deve ser incluíd e personlizd pr cd situção clínic do pciente (LEUNG, 1995). Devido o seu grnde volume, soluções de nutrição e de infusão são os fármcos dministrdos por vi prenterl que presentm mis efeitos dversos por conterem contminntes. O volume ddo um pciente em nutrição prenterl totl pode chegr 3 ml por di, dependendo do peso corporl. Além disso, NPT é dministrd pcientes em estdo crítico ou pcientes com comprometimento metólico e d função dos órgãos, grvndo o efeito deletério dos contminntes. Emor o silício e o lumínio presentes nos limentos e n águ

34 34 sejm seletivmente sorvidos no trto gstrointestinl, su introdução diretmente n corrente snguíne, não enfrent rreirs (BOHRER et l., 28). A Food nd Nutrition Bord (21 pud NILSEN, 29) considerou que os ddos nimis e humnos erm demsidmente limitdos pr definição d Ingestão Alimentr de Referênci pr Si. Com se n quntidde excretd n urin em 24 hors, exigênci mínim diári pr Si pode estr em torno de 1-25 mg/di. Assim, ingestão dests quntiddes proximds trvés d nutrição prenterl típic pode ser enéfic pr súde ósse e cictrizção de ferids. Um número muito limitdo de rtigos indicou que miori ds soluções de NP não fornece ess quntidde de Si, que vem somente d contminção dos ingredientes. Bohrer et l. (28) determinrm o teor de Si em numeross formulções comerciis utilizds pr dministrção prenterl e mostrrm que em médi s soluções continhm menos de 1 mg/l de Si. Entretnto, gluconto de cálcio, icronto de sódio e fosfto de potássio form s que presentrm níveis mis ltos de Si, entre 1 e 4 mg/l. A nálise urinári de pcientes em trtmento com NP indicrm que receerm somente 1-3 mg Si/di (NILSEN, 29). O lumínio é um contminnte de váris soluções de NP, como sis de cálcio e fosfto e lumin, que são usdos em dministrção intrvenos. Alvrez et l. (27) determinrm o teor de Al em soluções de nutrição prenterl e seus componentes e otiverm um médi de 15,7 µg/l de lumínio pr soluções de NPT; pr os seus componentes individuis, gluconto de cálcio 1% (médi de 2711,7 µg/l) e fosfto monopotássico 1M (médi de 333,1 µg/l) form os mis contmindos, ssim como o icronto de sódio 1M (médi de 772,1 µg/l). A grnde vriilidde encontrd no teor de lumínio de soluções sugere que contminção ocorre durnte o processo de fricção (BOHRER et l., 22). O rim prece ser principl vi pr eliminção do lumínio sistêmico. Acredit-se que pessos em condições sudáveis, são cpzes de excretr todo o lumínio sorvido. No entnto, em pcientes so NPT que receem soluções contminds com Al, su cpcidde é excedid, mesmo nqueles com função renl norml, e prte do metl infundido é mntido (BERTHON, 22). Os pcientes com mior risco toxicidde do lumínio são queles com função renl reduzid, soretudo premturos. A toxicidde prece ser negtivmente correlciond com idde gestcionl. Além de possuir função renl imtur, premturos são mis propensos à toxicidde do lumínio, devido às

35 35 sus necessiddes de cálcio e fósforo umentds, ssim expondo-os mis contminntes destes mineris. Mesmo ingestão de < 2 µg/kg/d, o nível sugerido pel Sociedde Americn de Nutrição Clinic (ASCN) e de Nutrição Prenterl e Enterl (A.S.P.E.N.) como sendo seguro, pode ser tóxic pr ess populção (GURA; PHARM, 21). Existem vários ftores que influencim o gru de contminção de lumínio em um solução prenterl. A fonte d mtéri-prim pode ser responsável pel vrição entre lotes dentro do mesmo produto fricdo pel mesm empres (BOHRER et l., 22). As tmps de vidro e orrch usds pr emlgem têm considervelmente mis lumínio do que s de plástico. Os recipientes de vidro são em conhecidos por serem um fonte significtiv de contminção devido à lixivição. A qulidde do vidro é um ftor importnte n determinção d quntidde de lumínio que pode lixivir pr o líquido. Até mesmo o tipo de produto emldo em vidro terá impcto sore quntidde de lixivição. Por exemplo, os sis de cálcio e fósforo tem um lt finidde pelo lumínio e umentm su lixivição (BOHRER et l., 23). Atulmente, existem poucs opções disponíveis pr reduzir crg de lumínio em soluções de NP. Um dels é sustituir o fosfto de potássio por sis de fosfto de sódio que possuem considervelmente menos lumínio. Pr perceer os enefícios de tl mudnç, no entnto, é necessário o uso de fosfto de sódio emldo em frscos de plástico. Infelizmente, estes frscos estão disponíveis pens em recipientes de 1 ml, tornndo-se inconveniente pr s instituições que utilizm dispositivos utomáticos de composição pr mistur soluções de NP (GURA; PHARM, 21). Bohrer et l. (23) concluirm que, sem considerr outrs fontes do processmento industril, esterilizção de soluções de NP por seu quecimento em recipientes de vidro ou em recipientes com tmps de orrch, pode ser responsável, principlmente, pel presenç de Al nesss soluções. No entnto, lierção de Al ocorre somente so certs condições, por exemplo, um ph elevdo, presenç de cátions n solução com proprieddes similres o Al ou ligntes cpzes de se ligr o metl. Um solução óvi pr minimizr o teor de Al é mudr pr recipientes de plástico, emor tenh ind de ser rçdo universlmente pel indústri. Condições de rmzenmento e dt de vlidde tmém determinm quntidde máxim que um produto potencilmente pode conter. Qunto mis tempo um

36 36 produto fic n prteleir, mior o potencil de lixivição n solução do frsco de vidro (FDA, 2). Em relção os sis de cálcio, poucos fricntes tulmente utilizm recipientes de plástico pr s soluções de gluconto de cálcio. Em um estudo de contminção de lumínio, foi encontrdo menos Al no gluconto de cálcio em recipientes de polietileno que queles emldos em frscos de vidro convencionl (FREY; MAIER, 2). Desde 1986, tem sido em conhecido que os sis de gluconto de cálcio são um importnte fonte de contminção de lumínio em pcientes de NP. Um vez que esses sis são um grnde fonte de contminção, recém-nscidos presentm um grnde risco devido os seus requisitos de cálcio juntmente com insuficiênci renl e imturidde. Sis de cloreto de cálcio são inerentemente menos contmindos e, em teori, poderim ser usdos como um lterntiv os sis de gluconto de cálcio. Ser um sl de cloreto, no entnto, poderi predispor os doentes, especilmente crinçs, um risco potencilmente mior de desenvolver cidose metólic, devido à crg de cloreto umentd (GURA; PHARM, 21). Tmém, gluconto de C é trdicionlmente usdo em vez de cloreto de C em fluidos prenteris, porque é muito menos provável su reção com fosfto do que o cloreto de C (BUCHMAN; MOUKARZEL, 2). A toxicidde do lumínio ssocid o uso d NP tem sido reconhecid desde o início dos nos 198. Depois de oservr complicções semelhntes s oservds em pcientes em diálise, necessidde de limitr quntidde de exposição de lumínio em pcientes receendo soluções de NP tornou-se evidente. Em 1986, Food nd Drug Administrtion (FDA) e junt ssessor de drogs metólics recomendou que o lumínio deve ser controldo nos ingredientes utilizdos n composição de soluções NP (GURA; PHARM, 21). A ASCN e ASPEN propuserm restrição d contminção de lumínio de soluções prenteris de grnde volume (ou sej, minoácidos, águ estéril pr injeção, dextrose, emulsões lipídics) pr um máximo de 25 µg/l. Pr soluções de pequenos volumes ou outros ditivos, tis como multivitmins, oligoelementos e eletrólitos, não foi proposto um nível máximo, entretnto os rótulos devem informr quntos microgrms de Al por litro o produto contém (KLEIN et l., 1991). Desde julho de 24, FDA exige que os fricntes coloquem concentrção de lumínio nos rótulos de todos os ditivos utilizdos pr compor soluções de PN. O teor máximo de lumínio no momento d expirção do produto deve ser colocdo no

37 37 rótulo, juntmente com declrção firmndo que pcientes que receem mis de 5 µg/kg/di de lumínio podem estr em risco de toxicidde (GURA; PHARM, 21). Moreno e colordores (1994) comprrm os níveis de lumínio em recémnscidos receendo NP versus controles não trtdos. Os níves no soro e urin form nlisds pr todos os sujeitos. N utópsi, concentrção de lumínio no cérero, ossos, fígdo e rins tmém foi nlisd. Os utores concluirm que 88% do consumo totl de lumínio devido NP foi retido e resultou em um umento nos níveis tnto no soro qunto n urin. Por outro ldo, devido à menor necessidde de cálcio e fósforo, juntmente com um tmnho totl do corpo mior, dolescentes e dultos precem não ser tão fetdos pelo lumínio em NP tnto qunto recémnscidos. Entretnto, pcientes idosos tmém podem presentr risco semelhnte á toxicidde relciond o lumínio. Em pcientes geriátricos, sorção de lumínio se torn mis eficiente com o vnço d idde. A toxicidde pode não ser tão dependente d função renl, ms devido um rreir de proteção gstrointestinl enfrquecid. A doenç ósse metólic é um complicção conhecid em pcientes so NP de uso prolongdo e foi primeirmente reltd por Klein e colegs em Ele oservou doenç ósse metólic triuíd contminção de lumínio em té 84% dos pcientes que receerm NP por mis de 6 meses. Os sinis e sintoms incluírm dor ósse grve, hiperclciúri, e umento nos níveis de fosftse lclin séric. As iópsis ósses mostrrm osteomláci irregulr. Em eês, o desenvolvimento d doenç pode ocorrer mis rpidmente. Devido à conhecid contminção ds soluções de nutrição prenterl com silício e lumínio e s doençs e complicções que este último pode cusr nos pcientes, é importnte verificr o potencil do Si em diminuir iodisponiilidde do metl em meio os componentes d NP in vivo Estresse Oxidtivo A oxidção é prte fundmentl d vid eróic e do metolismo e, ssim, os rdicis livres e espécies retivs são produzidos nturlmente, principlmente n cdei de trnsporte de elétrons, ou por lgum disfunção iológic. Esses

38 38 rdicis livres cujo elétron desemprelhdo encontr-se centrdo nos átomos de oxigênio, nitrogênio ou cloro são denomindos espécies retivs de oxigênio (EROs), espécies retivs de nitrogênio (ERNs) ou espécies retivs de cloro (ERCs). No orgnismo, encontrm-se envolvidos n produção de energi, fgocitose, regulção do crescimento celulr, sinlizção intercelulr e síntese de sustâncis iológics importntes (HALLIWELL; WHITEMAN, 24). O oxigênio (O 2 ) é molécul oxidnte mis importnte nos orgnismos eróicos. Muitos tipos de EROs são formdos dentro dos orgnismos e s forms mis comuns incluem: ânion superóxido (O - 2 ), rdicl hidroxil ( OH), oxigênio singleto ( 1 O 2 ), e peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ). Esss EROs, são produtos do receimento de um elétron do O 2, que é o precursor d miori ds EROs e o medidor ns reções oxidtivs em cdei. O rdicl hidroxil ( OH) é o rdicl mis retivo, o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ) é produzido in vivo em muits reções e pode ser convertido no ltmente retivo ( OH) (HALLIWELL, 26). As céluls são cpzes de se defender dos efeitos dnosos ds espécies retivs (ERs) em condições fisiológics normis, por meio de mecnismos ntioxidntes endógenos que incluem um sistem enzimático e não-enzimático, como vitmins e lgums moléculs ntioxidntes. Normlmente, há um equilírio entre produção e destruição ds ERs. O estresse oxidtivo é crcterizdo por um significnte umento n concentrção de EROs e ERNs, e/ou um decréscimo nos mecnismos de detoxificção celulr. Esse excesso present efeitos prejudiciis, tis como peroxidção dos lipídios d memrn e gressão às proteíns dos tecidos e ds memrns, s enzims, os croidrtos e o DNA (BARREIROS et l.,26). Os orgnismos vivos têm um complexo sistem ntioxidnte, enzimático e não enzimático que protege contr os efeitos deletérios dos rdicis livres (SODHI et l., 28). Os ntioxidntes não-enzimáticos são gerlmente moléculs pequens, tis como scorto e gluttion, que ocorrem em fses quoss (fluido intrcelulr), enqunto os ntioxidntes lipofílicos (tocoferóis e crotenóides) são tivos ns memrns celulres (NOCTOR & FOYER, 1998; SMIRNOFF & WHEELER, 2). Dentre os ntioxidntes enzimáticos, estão superóxido dismutse (SOD) que desempenh um importnte ppel nos mecnismos de defes ntioxidnte ds céluls contr o estresse oxidtivo, convertendo o ânion superóxido à molécul

39 39 menos retiv H 2 O 2 e moléculs de oxigênio; gluttion peroxidse (GPx), enzim contendo selênio que remove o H 2 O 2 coplndo redução de H 2 O 2 com oxidção d gluttion reduzid (GSH) pr formr H 2 O e gluttion oxidd (GSSG) (HALLIWELL, 26); e ctlse (CAT) que é um clássic enzim, d fmíli ds oxirredutses, presente nos peroxissomos, que converte H 2 O 2 em H 2 O. A ctlse tem um importnte função protetor contr os efeitos tóxicos dos peróxidos gerdos nos peroxissomos e os remove com grnde eficiênci (SIRAKI et l., 22). As SODs estão presentes nos nimis contendo sítio tivo de mngnês (MnSOD) n mtriz mitocondril, e de core e zinco (CuZnSOD) no espço mitocondril intermemrn e no resto d célul (HALLIWELL, 26). O Al, um metl não redox-tivo, possui tividde pró-oxidnte, que pode ser 2+ explicd pel formção de superóxidos semireduzidos de Al, o íon rdicl AlO 2 (EXLEY, 25). A formção de AlO 2+ 2 tem implicções significtivs pr oxidção iológic, pois ctlis formção de H 2 O 2 e reduz Fe(III) Fe(II). Em cominção estes dois eventos podem levr um tque oxidtivo cpz de resultr em dnos oxidtivos (EXLEY, 212). Qundo s EROs tcm s memrns plsmátics que são formds por cmds de moléculs lipídics, com dupls ligções de ácidos grxos insturdos ltmente retivos, cusm peroxidção lipídic (ZATTA et l., 22). A peroxidção lipídic é reltd como um importnte cus do dno oxidtivo às memrns celulres, e que eventulmente levm à morte celulr. Um om indicdor d injúri oxidtiv e um produto finl d peroxidção lipídic é formção de mlondildeído (MDA). Como espécies retivs de oxigênio intergem com tods s mcromoléculs iológics, incluindo lipídios, proteíns, ácidos nucléicos e croidrtos, umentm o estresse resultndo n morte neuronl, o que contriui com neuroptologi ssocid com váris doençs (GONZÁLEZ-MUÑOZ, 28). O cérero é prticulrmente vulnerável o dno oxidtivo, devido o seu lto consumo de oxigênio e por conter ltos teores de lipídeos fcilmente oxidáveis e de metis de trnsição, cpzes de ctlisr formção de EROs (ABUBAKAR et l., 24). Segundo Kizer et l. (25) Al e Al+citrto podem levr o estresse oxidtivo em lgums regiões específics do cérero. Os utores concluírm que Al, um metl não-redox-tivo, é um pró-oxidnte tnto in vivo e in vitro. Prte d neurotoxicidde do lumínio é devido à contriuição do íon Al 3+ o dno oxidtivo neuronl induzido por ferro. Os dois metis gem sinergicmente,

40 4 coordenção do lumínio n memrn neuronl fcilit o tque por rdicis livres induzidos por ferro. Enqunto que oxidção d memrn por su vez ument ligção do lumínio, grvndo oxidção. Este círculo vicioso depende em grnde prte d cpcidde dos dois metis em concorrerem os grupos finis crregdos negtivmente ds moléculs nfifílics que constituem s memrns (BERTHON, 22). Pnchlingm et l. (1991), notrm que xenoióticos diversos, incluindo Al, podem lterr icmd lipídic d memrn por ligção com seus componentes. Além disso, Vn Rensurg et l. (1995) disserm que, qundo os íons Al tcm fosftos djcentes à memrn fosfolipídic sus crgs positivs se repelem, formndo lcuns ou espços vzios n memrn, expondo ácidos grxos gentes oxidntes, como Fe, induzindo produção de rdicis livres. O Al é cpz de sustituir o Fe em diverss iomoléculs e umentr s concentrções intrcelulres de Fe, promovendo reção de Fenton (YOUSEF, 24), umentndo produção de EROs, o que explic o umento d peroxidção lipídic. Yousef (24) e Yousef et l. (27) oservrm que o lumínio ixou tividde de enzims ntioxidntes, como SOD e CAT, in vivo e in vitro umentndo os níveis de rdicis livres e o estresse oxidtivo δ-aminolevulinto Desidrtse (δ-ala-d) A δ-minolevulinto desidrtse (δ-ala-d), conhecid como porfoilinogênio sintse, é um enzim contendo sulfidril, que ctlis condensção ssimétric de dus moléculs de δ-minolevulinto (ácido minolevulínico, δ-ala) pr produzir porfoilinogênio, que ns céluls é o precursor d síntese dos tetrpirróis. Os tetrpirróis, como o heme e clorofil, são essenciis pr o metolismo eróico e pr fixção do crono (ROCHA et l., 212). Est enzim é mplmente distriuíd no fígdo, cérero, rim e céluls eritrocitáris (ZAMAN et l., 1993). A iniição d δ-ala-d pode fetr desfvorecidmente s vis iossíntese do heme, podendo ter conseqüêncis ptológics, como nemi (SILVA et l. 27). δ-ala-d é um metloenzim sulfidrílic que requer íons zinco pr su tividde

41 41 (VIEIRA et l., 2). Além disso, pode ser iniid por sustâncis que competem com o zinco ou ind que oxidem os grupos SH. Est situção pode estr ssocid com o estresse oxidtivo, pois lém d insuficiente produção de heme, iniição d δ-ala-d pode resultr no cúmulo do sustrto δ-ala, que está relciondo com superprodução de EROs (BRITO et l., 211), como demonstrdo n figur 2. EROs Figur 2: Esquem d possível interferênci dos metis n tividde d enzim δ- minilevulinto desidrtse (δ-ala-d). Ao iniir tividde d enzim síntese de porfoirinogênio (PBG) é diminuíd e ocorre o cúmulo do sustrdo ácido δ- minolevulinico (ALA) que está relciondo com produção de espécies retivs de oxigênio (EROs). Adptdo de Roch et l. (212) (Grphicl Astrct). A tividde d δ-ala-d é ltmente sensível à presenç de metis pesdos como mercúrio, chumo e outros compostos que oxidm grupos sulfidril. Há um número limitdo de estudos que mostrm que cátions divlentes, tis como Fe 2+, lém de Zn 2+, pode tivr enzim, enqunto outros cátions divlentes, tis como Cu 2+ iniem enzim. Os cátions trivlentes como In 3+ iniem δ-ala desidrtse in vitro, enqunto os efeitos do Al 3+ são stnte contrditórios. A nemi ssocid à toxicidde do lumínio pode ocorrer devido o rompimento induzido pelo metl d vi iossintétic do heme, porém, seus efeitos sore enzims envolvids n hemeiossíntese são contrditórios. Há estudos que pontm um iniição d hemeiossíntese, pós exposição o lumínio in vitro, ms prdoxlmente, tividde ds enzims delt minolevulinto sintse (δ-ala-s) e δ-ala-d são umentdos pós exposição in vivo (VIEIRA et l., 2).

42 42 Vieir et l. (2) encontrrm, pós sumeter cmundongos um trtmento crônico orl, que o trtmento com citrto e lumínio mis citrto ument tividde d δ-ala-d in vivo e o umento d tividde d enzim foi prlel o umento do teor de lumínio no sngue e plsm. Estes resultdos mostrm que o lumínio tem um efeito distinto sore tividde d δ-ala-d: em primeiro lugr, em concentrções reltivmente mis ixs é tivd, e em lt concentrção pode iniir δ-ala-d no sngue in vitro; segundo, ele tivou enzim qundo dministrdo trvés d águ potável. Schetinger et l. (1999) demonstrrm que exposição o sulfto de lumínio n águ potável inie tividde de δ-ala-d no rim, porém ument no fígdo. Considerndo o fto de o Al ser um dos elementos mis undntes d crost terrestre, que este metl é responsável pelo desenvolvimento de nemis, especilmente em pcientes com flênci renl, cujo mecnismo prece envolver síntese do heme e os seus efeitos discrepntes sore δ-ala-d torn-se de extrem importânci mis estudos sore o efeito do Al sore tividde d enzim em condições similres os d NP Análise de Si e Al em mostrs iológics Aertur Alclin Amostrs iológics usulmente requerem um extensivo pré-trtmento pr serem nlisds, normlmente trvés de digestão com ácidos mineris e quecimento. O hidróxido de tetrmetilmônio, um solução lclin, tem sido utilizdo pr o pré-trtmento de mostrs como um trente lterntiv pr sustituição d digestão ácid de mteriis iológicos pr determinção de elementos trço por diferentes técnics de espectrometri tômic (BATISTA et l., 28). A soluilizção com TMAH é muito simples e rápid, e já que não existe quecimento ou pens um leve quecimento é necessário, perd de sustânci

43 43 volátil é impedid. Além disso, um vez que pens um pequen quntidde de HTMA é utilizd este método oferece diluição d mostr reltivmente ix, resultndo em lts concentrções elementres ns soluções d mostr pr medid em um procedimento reltivmente simples e seguro (RIBEIRO et l, 2; GIACOMELLI et l., 22). A nálise de mostrs soluilizds em HTMA diminui grndemente o tempo de vid útil do forno de grfite (SILVA et l., 23). Um lterntiv pr diminuir ess degrdção é o revestimento do tuo com trvés do uso de modificdores permnentes. As principis vntgens triuíds o uso de modificdores permnentes são: fácil e rápid produção d cmd do modificdor sore pltform ou prede do tuo usndo um progrm de deposição térmic; n limpez in situ durnte produção d cmd contriuindo pr ix dos vlores do rnco e melhorndo os limites de detecção, umento de mostrs com progrms rápidos; eliminção ou minimizção ds interferêncis espectris e nãoespectris, permitindo nálise diret de lgums mostrs complexs sem digestão, proteção do tuo de grfite, resultndo em um considerável umento d vid útil do tuo, reduzindo o custo d nálise (GIACOMELLI et l., 22) Determinção de Alumínio A espectrometri de sorção tômic com forno de grfite (GFAAS) é provvelmente técnic mis dequd pr determinção de ixs concentrções de Al em mostrs quoss geoquímics e iológics (HUANG, 1995). O lumínio é um elemento onipresente, é o terceiro elemento mis undnte n crost terrestre. A exposição é inevitável por cus d mpl utilizção deste elemento no di--di e n indústri. Ele está presente em muitos limentos industrilizdos e tmém é diciondo à águ potável pr purificção. Esses usos fzem do Al contminnte muito comum, e pode chegr o miente de nálise trvés de prtículs no r, dos regentes utilizdos pr digerir e diluir mostrs e mteriis de lortório. A contminção é frequentemente encontrd e pode levr estudos ineficzes, prticulrmente queles que medem Al no sngue e no

44 44 cérero em concentrções muito ixs. A crg corporl totl de Al em indivíduos humnos sudáveis é de proximdmente 3-5 mg e um desiguldde de distriuição deste elemento em vários tecidos tem sido reltd em condições normis, pr seres humnos expostos o lumínio e em nimis experimentis trtdos com lumínio, su quntificção em qulquer órgão ou tecido deve ser relizd cuiddosmente pr evitr contminção extern (BOHRER, et l., 28). Portnto, pr diminuir o risco de contminção, tods s soluções devem ser rmzends e preprds em frscos de plástico previmente descontmindos e cidificds com ácido nítrico ou cítrico pr estilizção do metl e pr prevenir perds n sorção (BOHRER et l., 28) e o mnuseio de mteriis, mostrs e soluções deve ser relizdo em câmr de fluxo lminr. Schneider e Exley (21) identificrm o ácido silícico (Si(OH) 4 ) como um importnte modificdor do sinl de sorânci do lumínio medido por GF-AAS. A presenç de Si(OH) 4 umentou o sinl em té 5%. A extensão do umento dependeu d concentrção de Al e Si(OH) 4 e foi máxim qundo concentrção de Al er menor ou igul 4,44 µmol/l e de Si(OH) 4 mior ou igul,5 mmol/l (14 mg/l de Si). A melhori do sinl de sorvânci do Al não foi linermente relciondo com concentrção Si(OH) 4 e o efeito foi, gerlmente, sturdo, pr todos s concentrções de Al testds, com [Si(OH) 4 ],5 mmol/l. Isso ocorre tlvez pel redução d formção de cretos de Al durnte tomizção n presenç do Si. Si(OH) 4 foi significtivmente mis eficz n melhori do sinl de sorvânci do Al que Mg(NO 3 ) 2. E, dest form, pode ser stisftorimente utilizdo como um modificdor químico pr determinção de Al por GF-AAS Determinção de Silício A onipresenç do Si represent um severo risco de contminção durnte su determinção, entretnto, sendo miori dos compostos de Si de difícil dissolução, presenç se silício como contminnte é reduzid. Apesr disso, extremo cuiddo é necessário, especilmente n determinção de Si em ixs concentrções.

45 45 Outro prolem relciondo determinção de Si é que soluções ácids de Si são instáveis e tendem precipitr (WELZ; SPERLING, 1999). A determinção de Si por espectrometri de sorção tômic present como ftores limitntes formção de creto de silício refrtário e de compostos voláteis de óxido de silício durnte o ciclo de tomizção no tuo de grfite. Dest form, determinção do elemento por GFAAS pode sofrer efeitos de memóri, interferêncis pel mtriz e ter sensiilidde reltivmente ix (HUANG, 1995). As tenttivs pr superr esses prolems gerlmente envolvem o uso de tuos de grfite revestidos com cretos de metis e/ou pltforms de L'vov e modificdores químicos (HUANG, 1995). Weltz e Sperling (1999) recomendm o uso de modificdores de Pd pr diminuir s perds do nlito durnte pirólise por voltilizção. Pr o revestimento dos tuos de grfite e/ou pltforms, vários elementos formdores de cretos podem ser usdos pr melhorr medid de silício, incluindo o molidênio, tântlo, zircônio, tungstênio, lntânio e nióio (HUANG, 1995). Mukhtr; Limeck (29) utilizrm tuos de grfite trtdos com zircônio e consttrm que este impede formção de cretos estáveis de Si durnte medid d mostr.

46 46 4. MATERIAL E MÉTODOS 4.1. Controle d contminção A águ utilizd no prepro de tods s soluções foi destild, deionizd e dicionlmente purificd no sistem Milli-Q. Apens mteril plástico foi utilizdo no prepro e rmzengem ds soluções pr diminuir contminção com Si e Al, mos constituintes do vidro n form de SiO 2 e Al 2 O 3. Esse mteril foi deixdo por pelo menos 24h mergulhdo em solução etnólic de HNO 3 1% (v/v), sendo, pós este período, lvdo undntemente com águ purificd. Tods s etps do prepro de soluções e mnuseio ds mostrs form conduzids dentro d câmr de fluxo lminr clsse 1, ligd mei hor ntes do início dos ensios Otimizção do método pr determinção de Al e Si por GFAAS Pr verificr melhor tempertur pr determinção de Al e Si por espectrofotometri de sorção tômic com forno de grfite (do inglês- Grphite Furnce Atomic Asorption Spectrometry- GFAAS) e verificr se mtriz ds mostrs erts com hidróxido de tetrmetilmônio interfere n medid form feits curvs de pirólise e tomizção pr os elementos. Atrvés dests, tmém form verificdos os efeitos dos modificdores de Si 15 mg/l, pr determinção de Al, e de Pd 2 g/l, no cso do Si e Zr como modificdor permnente.

47 Instrumentção Sistem de purificção de águ Milli Q com resistividde 18,2 MΩ.cm -1, Millipore, Bedford, MA, USA. Blnç nlític com qutro css de precisão Srtorius, Goettingen, Alemnh. Destildor de ácidos, Berghof Suoiling, BSB-939-IR. Câmr de fluxo lminr clsse 1, Trox, Curiti, Brsil. Espectrofotômetro de sorção tômic com forno de grfite Anlytikjen, ZEEnit 6, com mostrdor utomático MPE Regentes e Soluções O regente hidróxido de tetrmetilmônio, solução 25% Sigm-Aldrich foi utilizdo n ertur d mostr de fígdo. As soluções de Al e Si utilizds ns medids no espectrômetro de sorção tômic com forno de grfite form preprds trvés d diluição corret do pdrão 1 g/l (Specsol) dos respectivos elementos. A solução de Zr,5 g/l utilizd pr o recorimento do forno de grfite pr s medids de Si e Al nos órgãos dos rtos foi preprd trvés d dissolução de,1278 g de ZrCl 4, Merck, em 5 ml de águ ultrpur. A solução de nitrto de pládio 2 g/l usd como modificdor n medid de Si foi preprd dicionndo-se,3 ml de HNO 3,2 g do regente nlítico (Merck) e diluindo-se 1 ml em lão volumétrico com águ ultrpur. Pr ertur ds mostrs o ácido nítrico (Merck) foi idestildo.

48 Determinção de lumínio e silício As medids de lumínio e silício form relizds no espectrofotômetro de sorção tômic com forno de grfite Anlytikjen. As leiturs form feits com sorânci integrd, modo áre do pico, correção de fundo sed no efeito Zeemn, com gás inerte rgônio. Form utilizdos fornos do tipo prede (sem pltform). Os progrms de tempertur pr nálise de Al e Si em GFAAS estão n tel 1. As medids de Al form feits no comprimento de ond de 39,3 nm, fend de,8 nm e corrente de 6, ma e como modificdor foi utilizd um solução de Si 15 mg/l pr pdronizr o umento de sinl que esse elemento cus n medid de Al. A curv de clirção foi confecciond utomticmente pel diluição de um pdrão estoque de 5 µg/l de Al. Tel 1: Prâmetros instrumentis pr determinção de Al e Si por GFAAS e trtmento do forno com Zr. Prâmetros Al Si Zr Comprimento de ond (nm) 39,3 251,6 _ Modificdor (µl) Si (5) Pd (NO 3 ) 2 (5) Zr (4) Progrm de tempertur ( C) (tempo ( rmp time ) (s), tempo de quecimento (s)) Secgem 1 9 (5, 2) 9 (5, 2) 9 (7, 15) Secgem 2 15 (3, 2) 15 (3, 2) 14 (1, 15) Secgem 3 11 (2, 1) 11 (2, 1) _ Pirólise 15 (25, 1) 12 (25, 1) 1 (1, 1) Atomizção 26 (FP, 4) 26 (FP, 3) 2 (FP, 5) Limpez 265 (5, 4) 265 (5, 4) _

49 49 As medids de Si form feits no comprimento de ond de 251,6 nm, fend de,2 nm e corrente de 1 ma e como modificdor de mtriz foi usd um solução de nitrto de pládio 2 g/l. A curv de clirção foi confecciond utomticmente pel diluição de um pdrão estoque de 5 µg/l de Si. Pr determinção destes elementos em mostrs decomposts com hidróxido de tetrmetilmônio, foi necessário o recorimento do forno de grfite com um modificdor permnente pr umentr o seu tempo de vid útil. Zr foi utilizdo pr este fim. As medids de Si form feits pelo método de dição do pdrão com lvgem do cpilr entre injeção dos componentes, pois o pládio precipit em meio lclino (HTMA) entupindo o cpilr. O tuo de grfite foi trtdo com solução de Zr,5 g/l trvés de um progrm específico de tempertur (Tel 1) com injeção de um volume de 4 µl cd vez, por 25 vezes. O recorimento do forno foi necessário cd 3 queims ou qundo recuperção de Si e Al ns mostrs com Spike não erm stisftóris. Foi ceito um limite de recuperção de 9 11% d concentrção de Al ou Si diciondo e cd 5 mostrs um com dição foi medid Otimizção do método de digestão ds mostrs de tecido niml Pr otimizr o método de digestão ou dissolução ds mostrs de órgãos testou-se diferentes trtmentos em fígdo ovino e ossos de frngo. O fígdo foi escolhido por ser um mtriz orgânic de digestão mis difícil entre os demis órgãos e o osso devido à presenç de fosfto de cálcio n composição, levndo um mior dificuldde de dissolução em meio lclino Instrumentção A instrumentção utilizd pr otimizção do método de digestão é mesm citd no item

50 Regentes e Soluções O regente HTMA, solução 25% Sigm-Aldrich foi utilizdo n ertur dos órgãos, com exceção do osso que foi erto com ácido nítrico idestildo, Merck. Amostr certificd Bovine Liver, Stndrd Reference Mteril (SRM) 1577 (NIST). Os demis regentes utilizdos estão listdos no ítem Digestão do fígdo com ácido nítrico O fígdo foi pesdo (entre,2 e,3 g) e diciondo de diferentes volumes de ácido nítrico concentrdo idestildo: 1,; 2,; 3, e 5, ml em frscos de plástico de 5 ml previmente descontmindos. O ensio de cd volume de ácido foi feito em duplict e em um deles foi diciondo 1 µl de solução de Al 1 mg/l e 3 µl de solução de Si 1 mg/l, pr dr um concentrção finl de 1 e 3 µg/l de Al e Si, respectivmente. As mostrs form mntids em nho-mri 1 C por um hor e em repouso por mis 24 h. Um ensio em rnco (somente com ácido nítrico, sem mostr ou pdrão) tmém foi feito pr cd volume de ácido. Após esse procedimento, o volume foi completdo 1 ml com águ ultrpur e silício e lumínio form determindos por GFAAS pr verificr s recuperções e o volume ótimo de ácido nítrico pr decomposição d mostr Dissolução do fígdo com hidróxido de tetrmetilmônio O fígdo foi pesdo (entre,2 e,3 g) e diciondo de diferentes volumes de hidróxido de tetrmetilmônio 25%:,5; 1, e 2, ml em frscos de plástico de 5 ml previmente descontmindos. O ensio de cd volume de hidróxido foi feito em duplict e em um deles foi diciondo 1 µl de solução de Al 1 mg/l e 3 µl de solução de Si 1 mg/l, pr dr um concentrção finl de 1 e 3 µg/l de Al e

51 51 Si, respectivmente. As mostrs form mntids em nho-mri 1 C por um hor e em repouso por mis 24 h. Um ensio em rnco (somente com HTMA, sem mostr ou pdrão) tmém foi feito pr cd volume de HTMA. Após esse procedimento, o volume foi completdo 1 ml com águ ultrpur e silício e lumínio form medidos por GFAAS pr determinr s recuperções e o volume ótimo de HTMA pr decomposição d mostr. O mteril certificdo de fígdo ovino (SRM 1577) contendo 3 µg/g de Al tmém foi dissolvid com,5 ml de HTMA conforme o procedimento cim. Entretnto foi pesdo somente,5 g (correspondente um mss úmid de,25 g) do SRM pr ertur já que er um mostr sec Dissolução do osso com hidróxido de tetrmetilmônio A dissolução de mostrs de osso foi feit d mesm form que pr o fígdo (item 4.3.4) Digestão do osso com ácido nítrico A ertur do osso foi feit com,5 e 1 ml de ácido nítrico (conforme item 4.3.3) e pós o volume foi completdo 1 ml com solução de hidróxido de sódio 4 e 8%, respectivmente, pr neutrlizção d solução. Um ensio em rnco (sem mostr de osso) tmém foi feito pr cd volume de ácido e neutrlizdo conforme s mostrs. Houve formção de um precipitdo (sulfto de cálcio) ns mostrs de osso, ests form centrifugds por 15 min 24 rpm, e, então, lumínio e silício form determindos no sorendnte por GFAAS.

52 Determinção de lumínio e silício Procedimento descrito no item Administrção de lumínio e silício em rtos (Wistr) Instrumentção Sistem de purificção de águ Milli Q com resistividde 18,2 MΩ.cm -1, Millipore, Bedford, MA, USA. Blnç digitl com dus css de precisão, Bel Engenering, pr pesgem dos nimis. Destildor de ácidos, Berghof Suoiling, BSB-939-IR phmetro digitl DM 2, Digimed, São Pulo, Brsil. Câmr de fluxo lminr clsse 1, Trox, Curiti, Brsil. Serings pr insulin de 1 ml, Injex Regentes e Soluções Tods s soluções form preprds com águ ultrpur e rmzends em recipientes plásticos previmente descontmindos. A solução de Si 1 g/l utilizd n dministrção nos rtos foi preprd trvés d dissolução de,85 g de silicto de sódio (Merck), composto por 63% de SiO 2 e 37% de N 2 O, em 25 ml de águ ultrpur. A solução contendo 1 g/l de Si e,25 g/l de Al foi preprd d mesm mneir com dição de,39 g de cloreto de lumínio, Merck. Já pr o prepro d solução de Al,25 g/l dissolveu-se,39 g de cloreto de lumínio em 25 ml de águ ultrpur. Tods s soluções tiverm o

53 53 ph justdo proximdmente 7 com solução diluíd de ácido nítrico idestildo ou de hidróxido de sódio 1% (Merck). Nos trtmentos com dihidrogenofosfto de potássio e gluconto de cálcio, cloreto de lumínio e/ou silicto de sódio form diciondos ns soluções destes componentes preprds conforme descrito ixo. Segundo sugestões de fórmuls pr nutrição prenterl d Frmáci de Mnipulção e Aditivção de Produtos Prenteris (FAMAP, 21) um solução pr nutrição prenterl periféric pode conter 11 mmol ou 22 mmol de fósforo. O uso recomenddo de 22 mmol por di em um pciente de 6 kg corresponde,367 mmol/kg. Pr um rto pesndo 2 g, dosgem seri de,734 mmol de fósforo.,734 mmol de fósforo em,4 ml (volume pr injetr em um rto de 2 g), corresponde,1835 mmol/ml. Um solução de 2 meq/ml de fosfto contém:,1567 g de K 2 HPO 4 e,3 g de KH 2 PO 4 e cd 1 ml contém 1,1 mmol/l de fósforo. Pr preprr um solução contendo,1835 mmol/l de fósforo pesou-se 6,535 g de K 2 HPO 4 (Merck) e 1,25 g de KH 2 PO 4 (Merck) e dissolveu-se em 25 ml de águ ultrpur. A solução form um tmpão com ph 7,6, portnto não há necessidde de juste do ph. Um solução pr nutrição prenterl periféric pode conter 2,25 mmol ou 4,5 mmol de cálcio (FAMAP, 21). O uso de 2,25 mmol por di, concentrção normlmente recomendd, em um pciente de 6 kg corresponde,375 mmol/kg. Pr um rto pesndo 2 g, dosgem seri de,75 mmol de cálcio.,75 mmol de cálcio em,4 ml (volume pr injetr em um rto de 2 g), corresponde,1875 mmol/ml. Pr preprr um solução contendo,1875 mmol/l de cálcio pesou-se 2,1 g de gluconto de cálcio (Sigm-Aldrich) e diluiu-se com águ ultrpur 25 ml. O ph d solução foi justdo 7,3. Pr o juste do ph ds soluções utilizou-se um solução de hidróxido de sódio, preprd trvés d dissolução de 1 g do regente P.A. (Merck) em 1 ml de águ ultrpur, e ácido nítrico idestildo (Merck) diluído 1 vezes.

54 Animis Form usdos neste estudo cento e vinte rtos Wistr mchos dultos, com 7-8 semns de idde, pesndo proximdmente 2 g. Os nimis form mntidos em um sl com r-condiciondo (22-25 C), so condições de iluminção rtificil, rigdos em número de cinco por cix e limentdos com rção pr rtos e águ d liitum. Todos os procedimentos com nimis form provdos pelo comitê de étic institucionl d Universidde Federl de Snt Mri (Número de protocolo 71/21) Trtmento As soluções de trtmento form injetds intrperitonilmente com sering de insulin de 1 ml, durnte 5 dis consecutivos, seguidos por 2 dis sem trtmento cd semn, completndo um totl de 6 dministrções por niml. O volume injetdo vriou de cordo com o peso do niml, ficndo em torno de 4 µl. Tods s soluções dministrds, inclusive águ, tiverm o ph justdo proximdmente 7,. O grupo controle receeu dministrção de águ ultrpur e não solução slin (NCl,9%), normlmente injetd, devido presenç de contminntes neste sl. Mesmo utilizndo regentes ultrpuros, esses n miori ds vezes presentm lt concentrção de Al. A injeção de águ ultrpur foi feit pr minimizr contminção e perceer com mior significânci diferenç, qundo houver, entre este grupo e os demis. Os nimis form pesdos cd sete dis durnte todo o trtmento. Após 48 h d últim dministrção, os nimis form nestesidos e de 5 6 ml de sngue foi retirdo diretmente do corção ind em tividde com sering de plástico. O sngue foi dividido em dois frscos plásticos de 5 ml de cpcidde, previmente descontmindos, um contendo 1 µl de heprin (nticogulnte) e outro não. O fígdo, pulmão, testículos, corção, cérero, osso, músculo e os rins

55 55 form removidos usndo pens instrumentos de plástico, tmém previmente descontmindos. Os órgãos de 5 rtos de cd trtmento form usdos pr nálises de Al e Si e os dos outros 5 pr s nálises ioquímics Trtmento com Al e Si Os nimis form divididos letorimente em qutro grupos experimentis de 1 nimis (dus cixs pr cd grupo). No primeiro grupo foi dministrdo águ ultrpur (grupo controle); no segundo grupo, cloreto de lumínio n dose de,5 mg/kg/di de lumínio (grupo Al); no terceiro grupo silicto de sódio n dose de 2 mg/kg/di de silício (grupo Si); e no qurto grupo foi dministrd um solução de cloreto de lumínio e silicto de sódio n dose de,5 mg/kg/di de lumínio e 2 mg/kg/di de silício (grupo Si+Al) Trtmento com Al, Si e dihidrogenofosfto fosfto de potássio Os nimis form divididos letorimente em qutro grupos experimentis de 1 nimis (dus cixs pr cd grupo). No primeiro grupo foi dministrdo águ ultrpur (grupo controle); no segundo grupo foi dministrdo dihidrogenofosfto de potássio em concentrção de 62 mg/kg/di (grupo (F)); no terceiro grupo, dihidrogenofosfto de potássio em concentrção de 62 mg/kg/di e lumínio,5 mg/kg/di (grupo Al+F); no qurto grupo solução de dihidrogenofosfto de potássio em concentrção de 62 mg/kg/di com silício e lumínio em concentrções de,5 mg/kg/di e 2 mg/kg/di, respectivmente (grupo Al+Si+F).

56 Trtmento com Al, Si e gluconto de cálcio Os nimis form divididos letorimente em qutro grupos experimentis de 1 nimis (dus cixs pr cd grupo). No primeiro grupo foi dministrdo com águ ultrpur (grupo controle); no segundo grupo foi dministrdo gluconto de C em concentrção de 16 mg/kg/di (grupo G); no terceiro grupo, gluconto de C em concentrção de 16 mg/kg/di e lumínio,5 mg/kg/di (grupo Al+G); no qurto grupo solução de gluconto de C em concentrção de 16 mg/kg/di com silício e lumínio em concentrções de,5 mg/kg/di e 2 mg/kg/di (grupo Al+Si+G), respectivmente Análise de Alumínio e Silício Trtmento ds mostrs de sngue As mostrs de sngue form processds no mesmo di d colet. Form centrifugds durnte 15 minutos 24 rpm, pr que houvesse seprção do soro. A seprção do soro foi executd em câmr de fluxo lminr clsse 1, utilizndo pens mteril plástico previmente descontmindo. Após seprção, o soro foi diluído n proporção 1:1 utilizndo-se águ ultrpur, pr determinção de lumínio e silício por GFAAS Amostrs de fígdo, corção, cérero, músculo, testículo e rim Pr dissolução ou ertur s mostrs form pesds (,25 g), dicionds de,5 ml de solução de hidróxido de tetrmetilmônio 25%, mntids em nho-mri 1 C por um hor e em repouso por mis 24 h. Após esse

57 57 procedimento, o volume foi completdo 1 ml com águ ultrpur e silício e lumínio form determindos por GFAAS. Algums ds mostrs de fígdo, corção, cérero, músculo, testículo e rim form nlisds em duplict pr ensios de recuperção. A um dels foi diciondo 1 µl de solução de Al 1 mg/l e de 3 µl de solução de Si 1 mg/l, pr dr um concentrção finl de 1 e 3 µg/l de Al e Si respectivmente Amostrs de osso Pr ertur, s mostrs de osso form pesds (,25 g), dicionds de,5 ml de solução de ácido nítrico idestildo, mntids em nho-mri 1 C por um hor e em repouso por mis 24 h. Após esse procedimento, o volume foi completdo 1 ml com águ ultrpur e o lumínio foi determindo por GFAAS. Algums ds mostrs de osso form nlisds em duplict pr ensios de recuperção. A um dels foi diciondo 1 µl de solução de Al 1 mg/l, pr concentrção finl de 1 µg/l de Al Determinção de Al e Si A nálise de Alumínio e Silício no sngue, osso e demis tecidos foi feit conforme descrito no item Tmém form nlisds s soluções de gluconto de cálcio e de dihidrogenofosfto de potássio usds pr injetr nos rtos, pois, mesmo utilizndo regentes ultrpuros, esses não são isentos de contminção.

58 Análises ioquímics Pr nálises d peroxidção lipídic e d tividde d δ-ala-d form retirdos o rim, fígdo, pulmão, testículo, corção e músculo dos rtos. Pr o TBARS, s estruturs do cérero (hipocmpo, córtex, hipotálmo, cereelo e estrido) form seprds. Como o hipotálmo possuí um mss muito pequen, foi feito um pool dess estrutur pr cd grupo trtdo. O sngue foi coletdo com heprin (nticogulnte) pr nálise de δ-ala-d e sem nticogulnte pr nálise de TBARS, este último foi centrifugdo durnte 15 minutos 24 rpm, pr que houvesse seprção do soro Instrumentção: Câmr de fluxo lminr clsse 1, Trox, Curiti, Brsil; Bnho-Mri, Sol, Brsil; Espectrofotômetro de sorção moleculr, Femto 8XI; Agitdor mgnético, Nov Étic, Brsil; Blnç nlític, Shimdzu Ay22; Filipins Regentes e soluções: Pr o prepro d solução de tris(hidroximetil)minometno hidrocloreto (Tris/HCl) 5 mm,788 g do regente form dissolvidos em 1 ml de águ destild. O ph foi justdo com tris(hidroximetil)minometno se (pó) té 7,4 no phmetro. A solução de ácido tioritúrico,8% foi preprd pel dissolução de,8 g de TBA (J.T. Bker) em 1 ml de águ destild. Est foi gitd e hidróxido de sódio em pó (Merck) foi cuiddosmente diciondo té que ficsse límpid (ph próximo de 3,2). A solução foi gurdd n geldeir.

59 59 A solução tmpão de ácido cético foi preprd trvés d dição de 75,35 ml de ácido cético glcil (Vetec) em 5 ml de águ destild e 22,5 ml de ácido clorídrico P.A. (Vetec). O ph foi corrigido com hidróxido de sódio em pó té ph 3,4 no phmetro. O volume foi completdo 1 ml. Todo o procedimento foi feito em nho de gelo. Pr o prepro do dodecil sulfto de sódio (SDS) 8,1%, form dissolvidos 8,1 g de SDS (Vetec) em águ destild té 1 ml. Pr o prepro do tmpão fosfto de potássio (TFK) 1M ph 6,8 form preprds dus soluções prévis. Form dissolvidos 13,68 g de fosfto de potássio monoásico (Vetec) em 1 ml de águ destild e 17,418 g de fosfto de potássio diásico (Vetec) em 1 ml de águ destild. O TFK foi preprdo trvés d dição d solução tmpão de fosfto de potássio monoásico sore solução tmpão de fosfto de potássio diásico té o ph desejdo (6,8). A solução foi rmzend em geldeir. A solução do ácido delt-minolevulínico (ALA) 12 mm foi preprd trvés d dissolução de,5 g do ácido delt-minolevulínico cloridrto (Sigm- Aldrich) em 25 ml com águ ultrpur. A solução foi gurdd congeld. Pr o prepro do ácido triclorocético (TCA) 1% com 1 mm de HgCl 2, form pesdos 1 g de TCA (Vetec) diciondos,27 g de HgCl 2 (Vetec) e o volume foi completdo com águ destild té 1 ml. O regente Pré-Erlich foi preprdo trvés d dissolução de,7g de HgCl 2 em 168 ml de ácido cético glcil com posterior gitção por 3 minutos. Após isso form diciondos 4 ml de ácido perclórico 7% (Vetec). O volume foi completdo té 22 ml com ácido cético glcil. A solução foi rmzend em geldeir em frsco âmr. Já pr o regente de Erlich, 1, g de 4-dimetil minoenzldeído (Vetec) form dissolvidos em 55 ml do regente Pré-Erlich. O regente de Coomssie foi preprdo pel dissolução de 1 mg de zul de Coomssie G (Vetec) em 5 ml de álcool etílico 95% (Synth) e pós, crescentou-se 1 ml de ácido orto-fosfórico 85% (Vetec). O volume foi completdo pr 1, L com águ destild. A solução foi gitd por 2 hors, rmzend em frsco âmr e filtrd sempre ntes d utilizção. Pr o prepro do ácido orto-fosfórico,2 mol/l form diciondos 3, ml do regente em águ destild e o volume completdo 2 ml.

60 6 Pr o prepdo do ácido tioritúrico (TBA),1 mol/l, foi pesdo,8 g de TBA e dissolvido em 5 ml de hidróxido de sódio,1 mol/l. O mlondildeído (MDA),3 mm foi preprdo trvés d diluição de um solução mãe de,6 mm, feit pel dissolução de,197 g de tetrutilmônio de mlondildeído (Sigm-Aldrich) em 2 ml de águ ultrpur. A heprin 5 UI/mL utilizd como nticogulnte pr s mostrs de sngue foi preprd no di d colet pel dissolução de,165 g do regente (Sigm-Aldrich) 5 ml com águ ultrpur Prepro do homogento Os tecidos form homogeneizdos em Tris/HCl 5 mm ph 7.4 em proporção dependente do tecido (Tel 2). Após, o homogento foi centrifugdo por 1 min 25 rpm e o sorendnte rmzendo pr nálises posteriores. Tel 2: Proporção entre mss do tecido e volume de Tris/HCl pr homogeneizção. Tecido Proporção Fígdo 1:1 Rim 1:1 Músculo 1:4 Cérero 1:5 Testículo 1:1 Pulmão 1:5 Corção 1:4

61 Atividde d δ-aminolevulinto Desidrtse (δ-ala-d) O princípio deste método é sedo n incução d enzim com um excesso de ácido δ-minolevulínico. O porfiirinogênio (PBG), que é formdo em um tempo fixdo, qundo misturdo com o regente de Ehrlich, desenvolve cor que pode ser medid espectrofotometricmente δ-ala-d Tecidul Os ensios form relizdos segundo Sss (1982). Prepro d Amostr: Form diciondos em tuos de ensio o TFK, águ e o tecido homogeneizdo que form pré-incudos por 1 minutos 37 C. Após, o sustrto (ALA) foi crescentdo e todos os tuos form incudos conforme o tempo determindo pr cd tecido (Tel 3). Após o tempo de incução reção foi prd com dição de 25 µl de TCA 1 % com 1 mm de HgCl 2 e o conteúdo foi centrifugdo. Tel 3: Volume de soluções e mostr pr nálise de δ-ala-d tecidul com respectivo tempo de incução pr cd tecido. Tecido TFK (µl) ALA (µl) Homogento (µl) H 2 O (µl) Tempo de Incução (h) Fígdo Rim Músculo Testículo Pulmão Corção

62 62 Termindo o tempo de incução, os tuos de leitur form preprdos trvés d dição de 5 µl do sorendnte, 1 µl do regente de Erlich e 5 µl de águ destild. Esses form incudos por 1 minutos tempertur miente. A leitur foi feit em espectrofotômetro moleculr em 555 nm. Tods s mostrs form nlisds em duplict. O resultdos form expressos em nmol PBG/mg Ptn/hor e form como form clculdos está descrit no pêndice δ-ala-d snguíne Os ensios form relizdos segundo Berlin & Schller (1974). Prepro d Amostr: Após colet do sngue com heprin, form diciondos 1 µl de Triton X- 1 1% em 5 µl do sngue totl heprinizdo, o tuo foi gitdo e deixdo em repouso por 1 minutos. Form diciondos em tuos de ensio o tmpão fosfto de potássio, águ e o sngue que form pré-incudos por 1 minutos 37 C. Após, o sustrto (ALA) foi crescentdo, tel 4, e todos os tuos form incudos por 6 minutos, 37 C. Após o tempo de incução reção foi prd com dição de 25 µl de TCA 1% com 1 mm de HgCl 2 e os tuos centrifugdos por 5 minutos 3 rpm. Tel 4: Volume de soluções e sngue pr nálise de δ-ala-d. TFK ALA Sngue H 2 O Tuo (µl) (µl) (µl) (µl) Amostr Termindo o tempo de incução, os tuos de leitur form preprdos trvés d dição de 4 µl do sorendnte, 55 µl de Erlich e 55 µl de águ

63 63 destild e incudos por 1 minutos tempertur miente. A leitur foi feit em espectrofotômetro moleculr em 555 nm. Tods s mostrs form feits em duplict. Os resultdos form expressos em nmol PBG/hor/mL sngue e form como form clculdos está descrit no pêndice Espécies Retivs o Ácido Tioritúrico (TBARS) Est técnic tem como ojetivo medir formção de mlondildeído, sustânci formd pel reção dos rdicis livres com lipídios de memrn (lipoperoxidção) em mostrs iológics. O MDA, qundo quecido n presenç de TBA, form um composto rosdo que pode ser medido espectrofotometricmente TBARS Tecidul Os ensios form relizdos segundo Drpur & Hodley (199). Prepro d Amostr: O ácido tioritúrico,8%, tmpão ácido cético e águ, qundo necessário, form diciondos em tuos de ensio. N hor d incução o dodecil sulfto de sódio 8,1% e o tecido homogeneizdo ou o mlondildeído form diciondos, conforme tel 5 pr nálise dos tecidos e tel 6 pr curv pdrão. Após todos os tuos form incudos durnte 2 hors 95 C em nho-mri. Após esfrir foi feit leitur em espectrofotômetro moleculr em 532 nm. Qundo s mostrs ficrm turvs, form centrifugds por 1 min 2 rpm. Tods s mostrs form nlisds em duplict.

64 64 Tel 5: Volume de homogento e regentes pr nálise de TBARS. Tecido Quntidde de homogento TBA,8 % Tmpão Ácido Acético SDS 8,1 % H 2 O (µl) (µl) (µl) (µl) (µl) Fígdo Rim Bço Cérero (estruturs) Testículo Pâncres Pulmão Corção Tel 6: Curv pdrão de mlondildeído. Tuos Águ (µl) MDA,3 mm (µl) Sistem (SDS+ TBA+ Tmpão) (ml) Concentrção finl (nmol) Brnco , ,2 1, ,2 3, ,2 6, ,2 9, Os resultdos form expressos em nmol MDA/g tecido ou nmol MDA/ mg ptn pr s estruturs do cérero e form como form clculdos o ftor de correção d curv de MDA e os resultdos encontrdos est descrit no pêndice 1.

65 TBARS Snguíneo no soro. Os ensios form relizdos conforme Jentzsch et l. (1996) pr nálise Prepro d Amostr: Form diciondos em tuos de ensio 2 µl d mostr de soro, 25 µl de ácido tioritúrico,1 mol/l, 55 µl de águ destild e 1, ml de ácido ortofosfórico,2 mol/l. A curv pdrão pr o cálculo do ftor de correção foi feit conforme Tel 6. Todos os tuos form incudos durnte 45 minutos 95 C em nho-mri. Após esfrir foi feit leitur em espectrofotômetro moleculr em 532 nm. As mostrs que ficrm turvs form centrifugds por 1 min 2 rpm. Tods s mostrs form nlisds em duplict. Os resultdos form expressos em nmol MDA/mL e form como form clculdos o ftor de correção d curv de MDA e os resultdos encontrdos está descrit no pêndice Determinção de proteíns totis As proteíns cereris form determinds segundo Brdford (1976). Os homogentos do hipotálmo, hipocmpo, córtex e cereelo form diluído com águ n proporção 1:1 e do estrido n proporção 1:2. Em um tuo de ensio form diciondos 5 µl d mostr diluíd e 2,5 ml do regente de Coomssie. Após 1 minutos foi feit leitur em espectrofotômetro moleculr 59 nm.

66 66 Tel 7: Curv pdrão de lumin pr determinção de proteín. Alumin 1mg / ml (µl) Águ (µl) Comssie (ml) [ ] finl (mg) Brnco - 5 2, ,5, ,5, ,5,5 O resultdos form expressos em mg/ml e form como form clculdos o ftor de clirção médio (FCM) d curv de Alumin e concentrção de proteín d mostr est descrit no pêndice Análise esttístic Os cálculos esttísticos form relizdos com o softwre Sttistic sistem 6. (Sttsoft Inc., 21). Os ddos form presentdos como médi ± desvio pdrão ns figurs, médi ± erro pdrão ns tels e comprdos usndo nálise de vrinç one-wy ANOVA, seguido pelo teste de comprção de médis Post-Hoc Duncn. Um vlor de p <,5 foi considerdo significtivo. Pr confecção dos gráficos foi utilizdo o progrm Slide Writer. A correlção de Person icudl foi usd pr vlir relção entre dus vriáveis e utilizou-se o progrm GrphPd Prism (GrphPd Softwre, Inc.)

67 67 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 5.1. Otimizção do método pr quntificção do Alumínio A presenç do Si em solução interfere n quntificção de lumínio por GFAAS. Como mostrdo n curv de pirólise e tomizção pr 5 µg/l de lumínio, com utilizção de Si 15 mg/l como modificdor pode-se verificr um umento significnte n sorvânci, podendo resultr em um superestimção d concentrção de Al ns mostrs, figur 3. De cordo com Schneider e Exley (21), influênci do Si no umento do sinl de Al é sturd em concentrções cim de 14 mg/l. Assim, utilizou-se como modificdor um solução de Si 15 mg/l tornndo o créscimo n sorvânci igul em tods s mostrs e pdrões medidos. Figur 3: Curvs de pirólise e tomizção pr 1, pg de lumínio com e sem modificdor de Si 15 mg/l e modificdor de Si 15 mg/l com dição do pdrão em mostr de fígdo decompost com HTMA.

68 68 As miores sorvâncis ocorrerm em tempertur de pirólise de 15 C e tomizção de 26 C, sendo ssim s temperturs selecionds pr s medids de Al. A presenç do hidróxido de tetrmetilmônio não interfere n sorvânci integrd do lumínio. As curvs de pirólise e tomizção não diferem significntemente pr pdrão diluído em águ injetdo com e sem dição do regente d ertur Otimizção do método pr quntificção de silício A químic do Si no forno de grfite é stnte complex e ind não totlmente compreendid, pesr de lgums pesquiss já terem sido relizds neste cmpo. A cpcidde do Si pr produzir óxidos de silício voláteis em temperturs de C e cretos refrtários em lts temperturs ovimente influencim sensiilidde e precisão d su medid (LUGOWSKI et l., 1998). No nosso trlho nterior (NOREMBERG, 21) foi vlid ocorrênci ou não de melhori e umento do sinl do Si n presenç dos modificdores CCl 2 1%, Pd+C, Pd+Mg, e somente Pd. O uso de 5 µl de Pd(NO 3 ) 2 2g/L fez com que os sinis ficssem mis ltos e em estreitos, sendo o que mostrou melhor resultdo entre os modificdores testdos, por isso o uso deste modificdor foi dotdo neste trlho. N curv de pirólise e tomizção pr o Si, figur 4, pode-se notr o umento significtivo n sorvânci integrd com o uso do modificdor de Pd. As miores sorvâncis ocorrerm em tempertur de pirólise de 12 C e tomizção 26 C, sendo ests s temperturs selecionds pr s medids de Si.

69 69 Figur 4: Curvs de pirólise e tomizção pr 1 pg de silício com e sem modificdor de Pd 2 g/l e modificdor de Pd 2g/L com dição do pdrão em mostr de fígdo decompost com HTMA. Diferentemente do que contece pr medid de Al, presenç de HTMA n mostr pós ertur interfere n sorvânci do Si (Figur 4). Os sinis de sorvânci do elemento são menores com dição do pdrão. A concentrção de Si diciondo ou presente ns mostrs não será recuperd se relciond um curv de clirção norml, pois sem presenç do HTMA sorvânci do pdrão é reltivmente mior. Qundo curv de clirção é confecciond no modo dição do pdrão (pdrões injetdos juntmente com um mostr ert com HTMA) os pdrões sofrem mesm interferênci d mostr, melhorndo correlção entre eles. Assim, tods s determinções de Si nos tecidos form feits com curvs de dição do pdrão, e pr cd tecido medido foi feit um nov curv de clirção. O uso de Pd como modificdor é, neste cso, um ftor de complicção, pois um precipitdo é formdo qundo solução ácid de Pd é misturd com solução lclin de HTMA, necessitndo de progrms de temperturs e pipetgem específicos e longos. Pr evitr precipitção, solução ácid de Pd pode ser pipetd seprdmente d mostr de solução lclin, pr isso foi utilizd opção de lvgem do cpilr entre os componentes.

70 Otimizção do método de digestão ds mostrs de tecido niml A digestão ácid é o método frequentemente utilizdo pr determinção de Al em mostrs de tecido niml por GFAAS (SCHETINGER et l., 1999, BOHRER et l., 28, IGLESIAS et l., 27). Ms, soluções ácids de Si são instáveis e tendem precipitr (WELZ e SPERLING, 1999) o que levou necessidde de otimizção de um método de ertur pr s mostrs de tecido que pudesse ser usd pr determinção de mos nlitos sem perds Digestão do fígdo com ácido nítrico Testou-se o método de digestão com ácido nítrico ns mostrs de fígdo pr verificr, principlmente, recuperção de Si diciondo. Tel 8: Recuperções de Al e Si em mostrs de fígdo erts com ácido nítrico Àcido nítrico Alumínio Silício Amostrs (ml) µg/l Recuperção % µg/l Recuperção % Brnco 3,9 9, Fig 32,5 35,6 Fig+spk* 164,5 132, 35,8 _ Brnco 17,8 N.D. Fig 28,3 N.D. Fig+spk* 193,8 165,5 N.D. _ Brnco 38,4 N.D. Fig 41,6 N.D. Fig+spk* 126,1 84,5 N.D. _ Brnco 52, N.D. Fig 118,3 N.D. Fig+spk* 176,3 58 N.D. _ * Fig+spk- mostr com dição de 1 µg/l de Al e 3 µg/l de Si. N.D.- não determindo, resultdo d medid do limite de detecção.

71 71 As recuperções de Al tmém não form stisftóris, sendo que com volumes menores de ácido form muito lts e com volumes miores mis ixs que o idel. Como já esperdo, devido à instilidde e formção de precipitdos de Si em soluções ácids, não houve recuperção do elemento diciondo n ertur com ácido nítrico. N miori ds mostrs, não foi possível determinção de Si, otendo-se concentrções ixo do limite de detecção (Tel 8) Dissolução do fígdo com hidróxido de tetrmetilmônio Um lterntiv pr digestão ácid é um simples e rápido pré-trtmento com HTMA, um se forte e solúvel em águ. A mostr é simplesmente misturd com um pequeno volume de um solução de HTMA em um frsco erto, não necessitndo de quecimento, ou somente de um suve quecimento ix tempertur (SILVA et l., 23). Amostrs trtds com HTMA são dequds pr nálises por GFAAS, pois ess técnic não requer dissolução ou digestão totl d mostr (SILVA et l., 23). Entretnto, nálise de mostrs soluilizds em HTMA diminui grndemente o tempo de vid útil do forno de grfite. O revestimento do tuo com o uso de modificdores permnentes diminui ess degrdção. O uso de Zr como modificdor permnente umentou o tempo de vid útil do forno de proximdmente 2 queims pr mis de 6. Sem o recorimento, ntes de 2 queims er possível verificr um umento n rugosidde e desfrgmentção n superfície intern do forno, lém disso, o sinl de sorvânci dos elementos ficv lrgdo e muits vezes duplicdo, dificultndo recuperção corret d concentrção diciond dos elementos. O recorimento er necessário cd 3 queims ou qundo mudnç no sinl de sorvânci er oservd e recuperção de Si e Al ns mostrs com spike não er stisftóri. Com esse procedimento, pouc ou nenhum modificção n superfície do forno foi oservd, comprovndo eficáci do uso do modificdor permnente no umento d vid útil do forno.

72 72 As mostrs de fígdo form totlmente dissolvids pós 1 h em nho-mri 1 C com todos os volumes testdos de HTMA:,5, 1, e 2 ml. As recuperções do Si diciondo ns mostrs erm muito ixs, ou prticmente não ocorrim qundo s medids erm feits com um curv de clirção norml, conforme citdo no item 5.2. As medids então form feits utilizndo um curv com dição do pdrão, onde curv é confecciond em condições próxims ds mostrs. N tel 9 são mostrds medids de Al com curv sem dição de pdrão e Si com dição de pdrão form otids melhores recuperções pr o Si. Tel 9: Recuperções de Al e Si em mostrs de fígdo erts com HTMA HTMA Alumínio Silício Amostrs (ml) µg/l Recuperção % µg/l Recuperção %,5 1, 2, Brnco 126,9 148,7 Fig 16,2 544,4 Fig+spk* 258,1 97,9 835,7 97,1 Brnco 249,8 14, Fig 298,3 93,6 Fig+spk* 391,2 92,9 426,3 11,9 Brnco 27,4 653,4 Fig 74,6 26,6 Fig+spk* 187,5 112,9 416,9 7,1 *Fig+spk- mostr com dição de 1 µg/l de Al e 3 µg/l de Si. Pr o cálculo ds recuperções de Si os vlores do rnco não form descontdos. As melhores recuperções do Al e Si diciondos ns mostrs form otids n dissolução com,5 ml e 1, ml de HTMA. O volume de,5 ml foi o escolhido pr ser utilizdo ns erturs pel reprodutiilidde e extidão n recuperção dos dois nlitos e porque volumes miores de HTMA levrm um deteriorção mis centud do forno de grfite durnte medid por AAS. Form feitos vários rncos d ertur com,5 ml de HTMA e foi verificdo que concentrção de Al vri de um pr outro sem presenç d mostr. A fim de encontrr um vlor de rnco, ou sej, concentrção de Al

73 73 correspondente o regente de ertur (HTMA) utilizou-se um mostr pdrão de fígdo contendo um concentrção conhecid de Al. Como no rnco não há consumo do HTMA, foi feit ertur de um mteril certificdo de fígdo ovino, Bovine Liver Stndrd Reference Mteril 1577 (NIST), em triplict, contendo 3, µg/g de Al, pr vlir influênci HTMA n medid do Al. Form pesdos,5 g (mss que corresponde,25 g de tecido úmido) do pdrão pr ertur com,5 ml de HTMA e dissolvido 1 ml com águ ultrpur, o que result em um concentrção de 15 µg/l de Al. As concentrções de Al encontrds n medid do pdrão estão n tel 1. Tel 1: Concentrção de Al no pdrão de fígdo ovino pós ertur com,5 ml de HTMA Pdrão fígdo Al (µg/l) 84,2 83,4 84,5 A médi de Al encontrd é de 84 µg/l, entretnto somente 15 µg/l estão relciondos ele, o restnte (69 µg/l) foi utilizdo como vlor de rnco pr tods s medids de Al nos tecidos. Nesse procedimento ocorre o consumo do HTMA pelo pdrão de fígdo, d mesm mneir que qundo mostr está presente. Então 69 µg/l podem ser descontdos, pois devem estr relciondos à interferênci do HTMA n medid do metl por GFAAS ou contminção. Este não é o procedimento mis dequdo nliticmente, ms como s medids são comprtivs imprecisão ssocid o cálculo ocorrre em tods s mostrs. Pr o Si o mior prolem encontrdo n determinção ns mostrs dissolvids com HTMA foi otenção de vlores elevdos ns medids dos rncos. Oservou-se que o HTMA interfere n medid de Si por GFAAS umentndo o sinl de sorção resultndo em vlores ltos de concentrção. É possível oservr n tel 9 que os vlores ds mostrs são n miori ds vezes menores que o vlor do rnco. Se lt concentrção de Si encontrd n medid desss mostrs fosse devido à contminção do regente de ertur, tmém deveri ser encontrd qundo o fígdo estivesse presente. Portnto,

74 74 idéi de contminção do regente foi descrtd, pois qundo mostr (tecido) é diciond n ertur o HTMA é consumido e interferênci é diminuíd. Est interferênci não é corrigid com curv de clirção com dição do pdrão porque curv é confecciond n presenç de um mostr ert com HTMA (neste cso mostr de fígdo). Se for feit com o rnco s sorvâncis d curv serão umentds e s mostrs drão vlores muito ixos ou ixo d curv de clirção. A lterntiv encontrd foi utilizr somente os vlores de medid qundo mostr estv presente, pois pr fins de comprção entre grupos esses vlores são stisftórios. Além disso, mesmo sem descontr o vlor do rnco foi possível verificr recuperção do Si diciondo (spike), conforme presentdo n tel Dissolução do osso com hidróxido de tetrmetilmônio Sendo possível recuperção do Si diciondo ns mostrs de fígdo dissolvids com HTMA, tentou-se relizr esse tipo de ertur pr determinção desse elemento no osso. Ms, como o osso é composto principlmente por um mtriz inorgânic (5% d mss do osso é compost por hidroxiptit ou sis mineris), principlmente fosfto de cálcio (JUNQUEIRA; CARNEIRO, 24) não houve dissolução complet d mostr com HTMA Digestão do osso com ácido nítrico Já foi demonstrdo que digestão de mostrs de osso com ácido nítrico ger resultdos stisftórios com ixos desvios-pdrão n determinção de Al por GFAAS (BOHRER et l., 28), por isso esse método foi utilizdo sem necessidde de otimizção. Já pr determinção de Si no osso, tentou-se neutrlizção d mostr com hidróxido de sódio pós ertur com ácido nítrico, devido não-dissolução no HTMA e dificuldde de medir Si em soluções ácids. Entretnto, pós este

75 75 procedimento, houve formção de um precipitdo (provvelmente de sulfto de cálcio) ns mostrs. Ests form centrifugds e tentou-se fzer medid no sorendnte por GFAAS, ms interferênci do sulfto e té mesmo do hidróxido foi muito grnde tornndo impossível utilizção deste método n determinção de Si no osso. Deste modo, somente o lumínio foi determindo no osso utilizndo-se ertur com ácido nítrico sem dição de hidróxido Administrção de lumínio e silício em rtos Wistr Tem sido sugerido que silictos podem reduzir iodisponiilidde do lumínio, já que complexos de HAS se formm em condições fisiológics. Est interção químic entre lumínio e silício é tulmente considerd de grnde interesse no cmpo iológico devido o seu possível ppel n desintoxicção do lumínio (RAGGI et l., 1999). Alguns trlhos já demonstrrm que o Si diminui toxicidde do Al em peixes em águs ácids (BIRCHALL et l., 1989, EXLEY et l., 1997), que ingestão de Si ument excreção de Al (REFFITT et l., 1999) e que o Si diminui sorção gstrointestinl do Al em humnos (EDWARDSON et l., 1993, JUGDAOHSINGH et l., 2). Entretnto, não foi encontrd nenhum citção n litertur dess ção do silício em ph fisiológico (ph 7,) qundo dministrdo vi intrvenos, como feito n nutrição prenterl. Como já foi demonstrdo nteriormente, s sustâncis químics podem presentr contminção por lumínio (BOHRER et l., 22; BOHRER et l., 23; ALVAREZ et l., 27) e silício (BOHRER et l., 28), principlmente se há um finidde entre os componentes d sustânci e o lumínio e/ou silício. No presente trlho, concentrção de Al e Si ns soluções de gluconto de cálcio e dihidrogenofosfto de potássio foi determind pr verificr contminção dos sis com esses elementos. N solução de dihidrogenofosfto de potássio,1835 mmol/l, concentrção de Al e Si encontrd foi de 7,45 µg/l e 4,19 µg/l, respectivmente, e n solução de gluconto de C,1875 mmol/l foi de 42,9 µg/l de Al e 58,76 µg/l de Si. Esses vlores podem ser considerdos ixos qundo

76 76 comprdos às quntiddes utilizds ns soluções dministrds nos nimis,,25 g/l de Al e 1, g/l de Si Trtmento com Al e Si Desenvolvimento dos nimis durnte o trtmento Os nimis form pesdos semnlmente durnte todo o trtmento pr juste do volume de dministrção individul. Não foi perceid diferenç no comportmento entre os grupos, com exceção dos rtos dos grupos trtdos com Al, que presentrm irritilidde e menor tolerânci o trtmento. Relcionndo-se o desenvolvimento com o peso dos nimis, oserv-se n figur 5 que este foi semelhnte pr todos os grupos, não hvendo influênci do trtmento no gnho ou perd de peso. Figur 5: Médis semnis dos pesos dos nimis durnte os trtmentos pr os qutro grupos: controle, Al, Si e Al+Si. As doses form: Al,5 mg/kg/di, Si 2 mg/kg/di.

77 Distriuição do lumínio nos tecidos dos rtos Wistr Fiejk et l. (1996) considerrm o cúmulo de Al significnte no fígdo somente pós 6 dministrções de,1 mg/kg. Pr grntir ocorrênci desse cúmulo nos órgãos dos nimis em estudo e tornr possível comprção entre os grupos que receerm ou não Si, escolheu-se dose de,5 mg/kg de Al por di pr dministrção intrperitonel. A dose de Al utilizd nesse estudo ind é considerd ix qundo comprd com outros estudos de dministrção intrperitonel (MIU et l., 23, IGLESIAS et l., 27). Entretnto, Sociedde Americn de Nutrição Prenterl e Enterl juntmente com Sociedde Americn de Nutrição Clínic ASCN-ASPEN (KLEIN, 1991) estim que um ingestão "segur" de lumínio pel nutrição prenterl é um dose de 2 µg/kg/di e um dose "insegur" é de 15-3 µg/kg/di. A dose "segur" não result em cúmulo de lumínio nos tecidos ou fluidos e está ssocido efeitos tóxicos desconhecidos. Um dose "insegur" é o montnte que result em cúmulo em tecidos, ms não document toxicidde. A dose "tóxic" é quel que result em cumulo tecidul e sintoms de toxicidde. Est dose "tóxic" foi derivd dos efeitos de cúmulo de lumínio no osso, com desenvolvimento de doenç ósse ssocid NPT pós o receimento de 6 µg/kg/di. A dose utilizd nesse estudo está em cim d dose considerd insegur, sendo propício o cúmulo de Al nos tecidos e, ssim, se o Si diminuir ionisponiilidde do Al, este efeito poderá ser oservdo. Após 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si, determinou-se concentrção de Al nos tecidos dos rtos. Os resultdos estão presentdos ixo. A concentrção de Al encontrd no soro dos rtos do grupo controle concord com encontrd n miori dos indivíduos sudáveis, pois segundo Bronner (28) s concentrções de Al no plsm desses indivíduos são de proximdmente 2 µg/l. É possível perceer um grnde umento n concentrção de Al no sngue, no osso, fígdo e em menor proporção nos rins dos rtos trtdos com o metl, demonstrndo que ele pode se depositr e cumulr nesses órgãos (Figur 6).

78 78 Soro Osso c c Controle Si Al Al + Si 32 Controle Si Al Al + Si Fígdo Rim c c 6 Controle Si Al Al + Si 22 Controle Si Al Al + Si Figur 6: Concentrção de Al no soro, osso, fígdo e rim dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de 1,52 µg/l no soro, 1,19 µg/g no osso,,67 µg/g no fígdo e,21 µg/g no rim. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). Qundo o Al (,25 g/l) foi dministrdo n presenç de 1g/L de Si, concentrção de Al no soro foi proximdmente 3% menor que oservd n usênci de Si. No osso dministrção de Al e Al+Si cusou um créscimo n concentrção de lumínio qundo comprdos com o grupo controle. Houve diferenç significtiv entre o grupo Al e o Al+Si, entretnto o Si diminui pens 16% concentrção de Al neste tecido. Outros estudos tmém já demonstrrm que o Al se cumul no osso. Klein e colordores (1982) oservrm que pcientes em nutrição prenterl totl por longo tempo presentvm níveis elevdos de lumínio no osso, urin e plsm.

79 79 Eles verificrm doenç ósse metólic triuíd contminção de lumínio fetndo té 84% dos pcientes que receerm NP por mis de 6 meses. Os sinis e sintoms incluírm dor ósse grve, hiperclcinúri, e iópsis ósses mostrrm osteomláci irregulr. Doenç ósse ssocid o lumínio pode ocorrer em crinçs que receem NP por 3 semns de terpi (GURA; PHARM, 21). O Al 3+ pode competir diretmente ou sustituir vários íons de metis essenciis in vivo. A respeito disso, o C 2+ é o seu primeiro lvo sendo vlido prtir d osteomlci induzid por Al (ZATTA et l., 22). No fígdo, dministrção de Al e Al+Si tmém cusou um créscimo n concentrção de lumínio qundo comprdos com o grupo controle (Figur 6). Novmente verific-se diferenç significtiv entre o grupo Al e o Al+Si, o cúmulo foi 72,5% menor qundo o Si estv presente. O Al se cumul no rim qundo dministrdo n presenç ou não de Si, o Si diminui concentrção de Al, que foi de té 44,9% menor. Belli e colordores (1996) sugerirm que o ácido ortosilícico (n cervej) ument excreção urunári de Al tlvez por intergir com o Al filtrável nos túulos renis, formndo HAS, e previnindo resorção do metl. O rim represent principl rot de excreção do Al com quntiddes insignificntes excretds n ile. Klein e colordores (1982) notrm excreção continud de quntiddes significtivs de Al n urin e persistente elevção de Al no plsm em pcientes que receerm NPT, evidencindo ix tx de depurção renl e indicndo que o prte do Al pode ser moilizd pr outros tecidos. Bohrer et l. (21) verificrm trvés d quntificção de Al n urin que, devido os ltos níveis de Al presente ns soluções prenterlmente dministrds em premturos, excreção urinári não é cpz de eliminr todo o metl infundido. A lt concentrção de Al oservd no rim, figur 6, confirm ix cpcidde de excreção do metl, pois o metl c se cumulndo neste e em outros tecidos estuddos. Not-se tmém, que o Si minimiz esse cúmulo, possivelmente por umentr excreção e diminuir moilizção pr os demis tecidos. Belli e colordores (1994 pud BERTHON, 22) investigrm o efeito do silício n excreção urinári de lumínio em pcientes pós trnsplnte renl. A excreção urinári de lumínio teve pico entre 4 e 8 dis pós-trnsplnte e foi muito significtivmente e positivmente correlciond com o silício n urin. Foi

80 8 sugerido que os dois elementos podem ser elimindos pelo rim trvés de um mecnismo comum ou como um espécie químic, possivelmente como HAS. Estes resultdos concordm com os encontrdos por Fiejk et l. (1996), que mostrrm que dministrção prolongd de Al(OH) 3 prenterlmente em rtos normis result no cúmulo de Al predominntemente no fígdo e no osso. Eles presumirm que o cúmulo no tecido do fígdo pode ser um ds rreirs pr o cesso do lumínio outros órgãos do corpo. Edwrdson et l. (1993) dministrrm Al orlmente em cinco voluntários sudáveis n presenç e usênci de Si e comprovrm que o Si dissolvido, em um concentrção encontrd em muits águs potáveis (1 µmol/l), reduz concentrção de Al no plsm em té 15%. Alemmri et l. (211) injetrm lumínio intrperitonilmente em porcos recém nscidos e perceerm que quntidde de Al cumuld no fígdo estv diretmente relciond com o tempo de durção d terpi, concentrção médi pós 4 semns foi de 81,75 ± 3,8 µg/g pós dministrção de 15 µg/kg de cloreto de lumínio. A infusão de Al prenterlmente cusou injúri neste órgão. No presente estudo, concentrção de Al no fígdo pós 6 dministrções foi té 6 vezes menor (17,14 ± 4,29 µg/g), figur 6, ms concentrção de Al dministrd nos rtos foi 3 vezes menor,,5 mg/kg (5 µg/kg), que injetd nos porcos do trlho menciondo. A concentrção de Al no fígdo dos nimis trtdos neste trlho não pode ser comprd com encontrd no trlho citdo, pois lém de serem espécies diferentes, deve-se levr em considerção que o tempo de trtmento tmém não é o mesmo, ms os ddos mostrm que o metl é retido considervelmente neste órgão. O grnde decréscimo do cúmulo de Al no fígdo e rim n presenç de Si confirm que formção de HAS diminui iodisponiilidde do lumínio, ou sej, diminui su sorção e/ou ument su excreção. Nosso ensio in vitro demonstrou que concentrção de Si necessit ser mior que 1 mg/l (NOREMBERG, 21) pr permitir formção de HAS em solução. A diminuição d iodisponiilidde do Al foi confirmd in vivo, concentrção de 1 g/l de Si dministrd diminuiu significtivmente o cúmulo de Al no sngue, osso, fígdo e rim dos nimis. Belli et l. (1996) tmém oservrm ess ção protetor do Si. Eles verificrm em voluntários com função renl norml que o ácido silícico não só foi

81 81 cpz de reduzir sorção gstrointestinl de lumínio, ms tmém de lierr e excretr lumínio de sítios do corpo, incluindo do osso. Estes resultdos mostrm que o silício, de lgum form pode intergir com s espécies de lumínio presente n solução e no estdo sólido e pode reverter formção de fses mineris em grnde prte insolúveis. No músculo, corção e testículo não há diferenç significtiv entre os grupos trtdos com Al e/ou Si e o grupo controle (Tel 11). Tel 11: Concentrção de Al (µg/g) no músculo, corção e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Tecido Grupos trtdos Controle Si Al Al+Si Músculo,147 ±,27,288 ±,7,17 ±,39,134 ±,42 Corção,568 ±,92,293 ±,87,386 ±,14,221 ±,76 Testículo 1,26 ±,65 1,173 ±,141 1,264 ±,15 1,339 ±,63 Vlores expressos como médi ± EP, n = 5 pr cd grupo trtdo. Guo et l. (25) verificrm cúmulo de Al no soro e testículo de cmundongos pós dministrção sucutâne de 7 e 13 mg/kg de cloreto de lumínio por dus semns. No soro concentrção encontrd foi de proximdmente 2 µg/l e 4 µg/l pr menor e mior dose dministrd, respectivmente. Já no testículo foi de proximndmente 21 µg/g e 35 µg/g. No nosso estudo não há diferenç n concentrção de Al cumuldo no testículo entre os grupos trtdos e o controle, que foi de proximdmente 1,2 µg/g, entretnto dose dministrd foi tmém menor, 5 µg/kg. No sngue concentrção de Al ficou entre 5 e 1 µg/l. Esses vlores são ltos, principlmente pr o sngue, qundo comprdos o estudo citdo, se dose dministrd for levd em considerção. Isso pode ser triuido injeção intrperitonel utilizd neste estudo, pois neste tipo de dministrção solução entr em contto direto com um região ltmente vsculrizd umentndo sorção, e tmém o mior tempo de trtmento.

82 82 18 Pulmão Controle Si Al Al + Si Figur 7: Concentrção de Al no pulmão dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de 1,38 µg/g. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). No pulmão há um umento significtivo n concentrção de Al qundo dministrdo juntmente com Si, figur 7. Nesse cso prece um efeito contrário o oservdo nos demis tecidos estuddos. No pulmão, lém de não oservr-se um ppel protetor do Si, ele potenciliz o cúmulo do metl nesse órgão. Mssie et l. (1988), pós trtr cmundongos com,1m de AlCl 3 n águ de eer, encontrrm vlores médios de Al no osso inferiores 15 ppm e no pulmão de 6 ppm. No presente estudo, vlores menores no pulmão, té 2 ppm form encontrdos. Já no osso nossos vlores concordm, té 16 ppm (µg/g) de Al form encontrdos. As diferençs estão provvelmente relcionds o trtmento ds mostrs, pois no trlho citdo form utilizds mostrs secs. No cérero, figur 8, pesr de existir um tendênci o umento d concentrção do Al nos grupos qundo comprdos o controle, diferenç é significtiv somente no grupo trtdo com Al e Si. Neste cso o Si não ge como protetor, umentndo concentrção do metl em relção o controle.

83 83 5 Cérero Controle Si Al Al + Si Figur 8: Concentrção de Al no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de,63 µg/g. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). No trlho de Schetinger et l. (1999), pesr d exposição de cmundongos o lumínio ser n águ pr eer, tmém foi reltdo que s concentrções do metl umentrm significtivmente no fígdo e rim, ms não se lterou no cérero. Já Iglesis et l. (27) estudrm o cúmulo e distriuição do lumínio no cérero de rtos, tnto com dministrção intrperitonel como orl. A miori ds áres do cérero mostrou o cúmulo de lumínio, ms um mior e mis significtivo umento foi oservdo no grupo que receeu lumínio trvés d dministrção intrperitonel. O cérero possui menor concentrção de Al em relção os demis tecidos (YOKEL; MCNAMARA, 21). Relmente, concentrção de Al no cérero é mis ix encontrd neste trlho no controle (,63 µg/g) e nos trtmentos, onde pesr do umento dos níveis do metl esses não ultrpssm os verificdos nos outros tecidos. Klein (25) diz que, qundo infundido continumente, tl como com um solução de nutrição prentéric ou mesmo em um dilisdo pr pcientes urêmicos, o lumínio se lig à trnsferrin e pens 5% é ultrfiltrável, indicndo que trnsferrin ligd o lumínio não é excretd, ms entr em um equilírio dentro de vários tecidos, incluindo fígdo, osso e cérero. Como neste trlho utilizou-se

84 84 injeção intrperitonel, est pode ser justifictiv pr permnênci do Al nesses tecidos, figur 6 e Distriuição de silício nos tecidos dos rtos Wistr São poucos os trlhos relciondos distriuição de Si nos tecidos nimis. Segundo Jugdohsingh e colordores (24) muito pouco se se sore este elemento em espécies de mmíferos, especilmente em humnos, eles dizem que complexidde d químic dos silictos quosos e d nálise de silício tem iniido estudos detlhdos dos níveis fisiológicos de silício. Emor o silício presente nos limentos e n águ sej seletivmente sorvido no trto gstrointestinl, su introdução, diretmente n corrente snguíne, como ocorre n NP, não enfrent rreirs. Em vist disso, concentrção de Si foi determind nos tecidos dos rtos, pós 6 injeções intrperitoneis pr mimetizr um trtmento crônico de NP. Os resultdos estão presentdos seguir. N figur 9 not-se que concentrção de Si no sngue e no rim ument nos grupos trtdos com o elemento qundo comprdos o controle. No pulmão esse umento só é verificdo no grupo Si. Reffitt e colordores (1999) reltrm frmcocinétic e o metolismo do Si em voluntários sudáveis pós ingestão de ácido ortosilícico n águ (proximdmente 6 ml contendo mg/l de Si). Eles verificrm lt depurção e filtrilidde renl do Si e sugerirm que o ácido ortosilícico é prontmente sorvido pelo trto gstrointestinl do homem e, em seguid, prontmente excretdo n urin. Entretnto, o Si dministrdo por vi intrperitonel (2 mg/kg/di) nos nimis não deve ter sido totlmente excretdo n urin, pois nos grupos trtdos com esse elemento verific-se que ele se cumul no rim, no soro e no pulmão, figur 9. Os resultdos mostrm que o sngue é um om indicdor d contminção de Al e Si, já que, mesmo pós dois dis d últim dministrção, permnecem em lt concentrção no soro snguíneo.

85 85 Soro Rim c c Controle Si Al Al + Si Controle Si Al Al + Si Pulmão Controle Si Al Al + Si Figur 9: Concentrção de Si no soro, rim e pulmão dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Si no controle foi de 12,21 µg/l no soro, 6,21 µg/g no rim e 8,8 µg/g no pulmão. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). O Si não se cumul no fígdo, músculo, corção e testículo dos rtos, pois não se verific diferenç significtiv entre os grupos trtdos e o controle, tel 12. Nielsen (29) mostrou que injeção intrvenos diári de 5 mg ou mis de sílic em coelhos induziu firose do fígdo, umento do ço e nefrite intersticil. No presente trlho, concentrção de Si dministrd foi menor que no trlho citdo, 2 mg/kg, e não foi oservdo cúmulo do elemento no fígdo, ms no rim retenção do elemento foi significtiv, podendo cusr lgum lterção neste órgão.

86 86 Tel 12: Concentrção de Si (µg/g) no fígdo, músculo, corção e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Tecido Grupos trtdos Controle Si Al Al+Si Fígdo 8,84 ±,666 9,417 ±,638 6,924 ±,942 8,86 ±,667 Músculo 1,24 ±,329,941±,211 1,43 ±,285,644 ±,186 Corção 1,421 ±,344 2,113 ±,197 1,645 ±,24 2,33 ±,537 Testículo 1,9 ±,252 1,38 ±,121 1,622 ±,24 1,296 ±,34 Vlores expressos como médi ± EP, n = 5 pr cd grupo trtdo. O Si prece umentdo no cérero em todos os grupos em relção o controle, Figur Cérero Controle Si Al Al + Si Figur 1: Concentrção de Si no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Si no controle foi de,56 µg/g. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). As concentrções de Si no cérero dos nimis do grupo Al form superiores os dos nimis do grupo controle, provvelmente devido um série de cuss diferentes. Há evidêncis de que o Al é cpz de produzir rdicis livres que cusm peroxidção lipídic, dnificndo s memrns neuronis e umentndo

87 87 permeilidde d rreir hemto-encefálic (SRIVASTAVA; JAIN, 22), permitindo que mis Si poss ingressr no tecido cererl (EXLEY, 26). Lugowski et l. (1998) mostrou que o silício é encontrdo no cérero, no fígdo, pulmão, rins, ossos, sngue, urin e suor dos seres humnos. Já Lndeghem et el. (1998) disserm que escssos ddos indicm presenç do elemento no fígdo, ço e pulmão dos pcientes em diálise renl e tmém em modelos nimis. São poucos os trlhos que reltm sore presenç de Si no corpo humno ou de nimis experimentis. Nosso estudo mostrou que esse elemento pode se depositr no rim, pulmão e cérero dos rtos, precendo tmém em concentrção elevd no soro dos nimis δ-aminolevulinto Desidrtse (δ-ala-d) A δ-minolevulinto desidrtse (δ-ala-d), um enzim d vi d heme iossíntese, é essencil pr todos os orgnismos eróios (VALENTINI et l., 27). A nemi ssocid à toxicidde do lumínio pode ocorrer devido o rompimento induzido pelo metl d vi heme iossintétic, porém, os efeitos do elemento sore enzims envolvids n hemeiossíntese são contrditórios. Após exposição in vivo, o Al cus tnto iniição, estímulo ou não cus efeito n tividde d δ-ala-d, dependendo do tecido, form químic do Al(III) dministrdo e d vi de dministrção (ROCHA et l., 212). Os níveis de porfoilinogênio form medidos nos homogentos otidos dos tecidos pr verificr s interferêncis do Al e Si n tividde d enzim δ-ala-d trvéz d injeção intrperitonel em trtmento crônico pr simulr NP. Os níveis de porfoirinogênio no sngue e testículo não precem lterdos nos grupos trtdos qundo comprdos o controle (Tel 13). Já no fígdo dministrção de Al, principlmente n presenç do Si, umentou tividde d enzim (Figur 11).

88 88 Tel 13: Níveis de porfiirinogênio no sngue (nmol PBG/h/mL) e testículo (nmolpbg/mgptn h) dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Tecido Grupos trtdos Controle Si Al Al+Si Sngue 1,267 ±,17 1,184 ±,37 1,229 ±,18 1,142 ±,9 Testículo 16,228 ±,671 16,59 ± 1,29 15,5 ±,85 15,424 ±,571 Vlores expressos como médi ± EP, n = 5 pr cd grupo trtdo. Fígdo c c 32 Controle Si Al Al + Si Figur 11: Efeito d dministrção intrperitonel de Al e/ou Si n tividde d enzim δ-ala-d fígdo dos rtos. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A tividde d δ-ala-d no controle foi de 71,39 nmolpbg/mgptn h. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). Vieir et l. (2) encontrrm, pós sumeter cmundongos um trtmento crônico orl, que o trtmento com citrto e lumínio mis citrto umentou tividde d δ-ala-d in vivo e que o umento d tividde d enzim foi prlelo o umento do teor de lumínio no sngue e plsm. Após exposição in vivo o Al 3+ trvés d águ potável, tividde de δ-ala-d no sngue foi umentd em 9%. No nosso estudo os teores de Al no soro precem umentdos nos grupos trtdos com o metl (Figur 6), entretnto tividde d enzim não foi lterd significtivmente no sngue, tel 13.

89 89 Rim Pulmão 16 7 c Controle Si Al Al + Si Controle Si Al Al + Si Músculo Corção c Controle Si Al Al + Si Controle Si Al Al + Si Figur 12: Efeito d dministrção intrperitonel de Al e/ou Si n tividde d enzim δ-ala-d no rim, pulmão, músculo e corção dos rtos. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A tividde d δ- ALA-D no controle foi de 28,23 no rim, 3,37 no pulmão, 2,85 no músculo e 5,73 no corção, resultdos expressos em nmolpbg/mgptn h. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). No rim tividde d enzim δ-ala-d é tivd n presenç do Al, dministrção de Si juntmente com o metl reverte ess tivção os níveis do grupo controle (Figur 12). No músculo, corção e pulmão tividde d enzim δ-ala-d é lterd de form semelhnte. Com exceção do músculo, nos outros tecidos o Si diminui significntemente tividde d enzim, que prece umentd nos nimis expostos o Al. Após exposição por inlção os efeitos do Al são exercidos principlmente no sistem respirtório, podendo cusr sm e decréscimo ds funções pulmonres. Entretnto, ptologis no sistem respirtório pel exposição o Al por outrs vis

90 9 de dministrção não form oservds (NAYAK, 22). Neste trlho não se oservou cúmulo de Al no pulmão, ms um ddo interessnte é grnde elevção d tividde d enzim δ-ala-d neste órgão no grupo Al, mior que 5% em relção o grupo controle. A tivção d enzim não cus dnos o tecido, ms pode ser um respost exposição prolongd o Al. O Si demonstrou grnde eficáci no sentido de reduzir iodisponiilidde do metl, pois os níveis de porfoirinogênio são revertidos e iguldos o grupo Si. Schetinger et l. (1999) demonstrrm que exposição o sulfto de lumínio n águ potável inie tividde de δ-ala-d no rim, porém ument no fígdo. Neste estudo o Al umentou tividde d enzim no fígdo, rim, músculo, pulmão e corção, e nos demis tecidos estuddos, pesr de não hver diferenç significtiv entre os grupos, tmém não há iniição d enzim pel exposição o metl. A intivção d δ-ala-d pode levr um cúmulo de ácido deltminolevulínico (sustrto) que pode cusr um produção excessiv de espécies retivs de oxigênio que, por su vez, poderi explicr os efeitos tóxicos de metis. Estes processos podem contriuir pr o estresse oxidtivo em céluls e podem estr relciondos processos degenertivos dos mecnismos celulres (SCHETINGER et l., 1999). Nosso estudo mostrou que o Al cus tivção d enzim, n miori dos tecidos, ou não mud su tividde, neste cso não precendo ter ção tóxic no orgnismo dos nimis. A presenç do Si em lguns csos reverteu ção do metl, não podendo ser considerd um tividde protetor d toxicidde, ms demonstrndo su cpcidde de diminuir iodisponiilidde do Al. Chmielnick et l. (1996) relizrm um experimento utilizndo fêmes de rtos que form trtdos todos os dis intrperitonelmente, durnte 3 semns, com cloreto de lumínio 4 mg Al/kg e nenhum mudnç n tividde de ALA-D no fígdo, rim e sngue foi oservd. O umento d tividde d enzim oservdo no rim neste presente estudo poderi, portnto, ser triuído um respost do orgnismo um mior tempo de exposição, de proximdmente 3 meses. Vieir et l. (2) sugerirm que sensiilidde d enzim o Al 3+ é ix, pois o lumínio inie tividde d δ-ala-d in vitro somente qundo testdo em um concentrção reltivmente lt (n fix mm). Em concentrções reltivmente ixs, (1-5 µm), o Al 3+ cusou um umento de δ-ala-d no sngue,

91 91 que tingiu um máximo de 4%. No presente estudo utilizmos um concentrção de Al considerd ix,,5 mg/kg (18,5 µm/kg), confirmndo ess suposição, pois qundo ocorreu lterção n tividde d enzim el foi umentd. Compostos de lumínio têm sido utilizdos como djuvntes em vcins pr estimulr s céluls de imunidde int e desempenhr um ppel chve n eficáci e n nturez d susequente respost imune dpttiv (RIMANIOL et l., 27). O heme tmém regul imunidde (ISHIZUKA et l., 211). A síntese do heme ocorre no citoplsm e n mitocôndri ds céluls trvés de 8 tipos de enzims, entre els está enzim δ-ala-d. O umento d tividde d enzim oservdo nos tecidos com dministrção do Al pode estr relciondo com cpcidde do metl em estimulr respost imune, trvés do umento n produção de heme Espécies Retivs o Ácido Tioritúrico (TBARS) A peroxidção lipídic é um indicção do estresse oxidtivo, que interrompe integridde estruturl ds memrns celulres e tmém pode levr à formção de ldeídos, que por su vez, cusm dnos em lipídios, proteíns e DNA (SILVA et l., 27). No que diz respeito à peroxidção lipídic, o Al não é um metl de trnsição e não sofre reções redox in vivo (KAIZER et l., 25). Portnto, o Al é considerdo um metl não redox tivo, que promove oxidção iológic in vitro e in vivo por cus de su tividde pró-oxidnte. Os níveis de mlondildeído, um produto d peroxidção lipídic, form medidos nos homogentos otidos dos tecidos pr vlir o estresse oxidtivo. O Si prece diminuir o TBARS snguíneo. Os grupos Si, emor não significtivmente, e Si+Al possuem níveis de MDA menores em relção os grupos controle e Al (Figur 13). No rim o Al ument os níveis de MDA, entretnto não há diferenç significtiv entre o grupo Al e o grupo Si. A dministrção de Si juntmente com o metl, diminui esse estresse, figur 13.

92 92 Soro Rim c c Controle Si Al Al + Si Controle Si Al Al + Si Figur 13: Níveis de MDA no soro e rim dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de MDA no controle foi de 61,75 nmolmda/ml no soro e 1922,29 nmolmda/gde tecido no rim. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). A dministrção de Al com ou sem Si não interferiu significtivmente n produção de MDA no pulmão, corção, fígdo e testículo, tel 14. Tel 14: Níveis de MDA no pulmão, corção, fígdo e testículo (nmolmda/g de tecido) dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Tecido Grupos trtdos Controle Si Al Al+Si Pulmão 12,75 ± 73,8 1219,91 ± 76,1 1152,52 ± 66,8 1253,87 ± 37,5 Corção 554,78 ± 6, 489,63 ± 26,6 5,53 ± 2,6 51,49 ± 19,1 Fígdo 2253,24 ± 176,1 2214,51 ± 162,6 2498,4 ± 119,7 216,89 ± 35,9 Testículo 895,21 ± 13,6 153,16 ± 12,5 115,5 ± 95,1 196,92 ± 95,8 Vlores expressos como médi ± EP, n = 5 pr cd grupo trtdo. Rghuvnshi e colordores (212) verificrm um umento significtivo nos níveis de peroxidção lipídic nos rins, fígdo e pulmão pós dministrção de nnoprtículs de sílic em um concentrção considervelmente mis lt que neste trlho, 5 mg/kg de SiO 2 intrperitonelmente por 6 semns. Utilizndo-se um dose mis ix de Si, 2 mg/kg/di em 6 dministrções intrperitoneis (12

93 93 semns), qui neste trlho foi oservdo um umento d peroxidção lipídic somente no rim no grupo trtdo com Si, provvelmente pelo cúmulo do elemento no órgão por ter ultrpssdo su cpcidde excretor Músculo c 26 Controle Si Al Al + Si Figur 14: Níveis de MDA no músculo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de MDA no controle foi de 1294,89 nmolmda/g de tecido. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). No músculo o Al reduz grndemente os níveis de MDA qundo comprdo os grupos controle e Si. O Si tende umentr esses níveis qundo dministrdo juntmente com o Al, ms não os níveis do controle, figur 14. O cúmulo de ALA, sustrto 5-minolevulinto, ocorre qundo tividde d enzim δ-ala-d está diminuid e pode estr envolvido n produção excessiv de espécies tivs de oxigênio (SILVA et l., 27). Neste cso, o umento d tividde d enzim δ-ala-d umentndo o consumo do sustrto pode estr reduzindo o estresse oxidtivo. No músculo o Al umentou tividde d enzim δ-ala-d e os níveis de MDA form diminuídos, portnto tivção d enzim pode estr exercendo tividde ntioxidnte. Ess idei é reforçd o verificr um relção invers, positiv e siginifictiv no coeficiente de correlção de Person de -,99 entre tividde d δ-ala-d (Figur 12) e o TBARS (Figur 14) no músculo dos rtos trtdos com gluconto, Al e Si.

94 TBARS Cererl O cérero pode ser prticulrmente vulnerável dnos oxidtivos, e se-se que um ds vis de dnos e morte de neurônios n doenç de Alzheimer é medid por rdicis livres, principlmente porque o cérero é rico em ácidos grxos peroxidáveis (KAIZER et l., 25). Os níveis de mlondildeído form medidos nos homogentos otidos ds estruturs cereris pr vlir o estresse oxidtivo. A dministrção de Al nos nimis elevou os níveis de MDA no cereelo e estrido e presenç do Si reduziu esses níveis nests estruturs, figur 15. O efeito protetor do Si, diminuindo peroxidção lipídic pode ser verificdo com mior intensidde no estrido, onde os níveis de MDA não somente se igulm o grupo controle, como contece no cereelo, ms são significntemente menores que este. Gonzlez-Muñoz et l. (28) mostrrm que inclusão de Si n diet, em form de cervej ou de ácido silícico, reduz os efeitos nocivos do umento d peroxidção cererl, diminuindo níveis de Al no cérero. Este chdo é relevnte porque o umento dos níveis de estresse oxidtivo e dos produtos d peroxidção lipídic no tecido cererl são os ftores que mis contriuem no desenvolvimento de doençs neurodegenertivs. Nossos resultdos tmém mostrrm que o Si diminui os níveis de TBARS no cereelo e em mior escl no estrido. Já no hipocmpo presenç de Si e Al umentm peroxidção lipídic. A peroxidção lipídic é um cus importnte de dnos em neurônios, como em lesões isquêmics, neurotrum e doençs neurodegenertivs, como Prkinson e Doenç de Alzheimer. As experiêncis de Kizer et l. (25) demonstrrm que Al ument peroxidção lipídic, medid pel formção de TBARS, principlmente no córtex e hipocmpo. Neste trlho tmém se verificou que ests estruturs cereris são fetds pelo Al, entretnto os resultdos form contrditórios no córtex onde peroxidção lipídic diminui n presenç do Al e o Si prece como um indutor d formção de TBARS, figur 15.

95 95 Cereelo Estrido c d Controle Si Al Al + Si Controle Si Al Al + Si Cortex Hipocmpo c Controle Si Al Al + Si Controle Si Al Al + Si Figur 15: Níveis de MDA ns estruturs cereris dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de MDA no controle foi de 4,1 no cereelo, 28,66 no estrido, 42,42 no córtex e 26,93 no hipocmpo, resultdos expressos em nmolmda/mg de proteín. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). Pr dosgem de TBARS no hipotálmo foi feito um pool ds mostrs de cd grupo, devido isso os resultdos não presentm desvio pdrão, tel 15. Tel 15: Níveis de MDA no hipotálmo de rtos trtdos com Al e/ou Si Grupo Controle Si Al Al+Si 1 83,43 8,13 77,1 MDA (nmol)/mg de proteín 21,8 18,2 17,4 16,8

96 96 No hipotálmo oserv-se um diminuição dos níveis de MDA nos grupos trtdos de proximdmente 2% em relção o controle, entretnto não é possível firmr que Al e Si diminuem peroxidção lipídic ness estrutur, pois não se se vrição entre os vlores nos grupos. Ms verific-se que o Al e o Si não umentm o TBARS Trtmento com Al e Si e dihidrogenofosfto de potássio O dihidrogenofosfto de potássio (KH 2 PO 4 ) é um dos componentes d nutrição prenterl que present mior contminção de Al e Si em solução. Apesr de não ter sido comprovdo in vitro formção de HAS n presenç deste componente (NOREMBERG, 21), sugerindo que o Si não teri efeito protetor d toxicidde do Al nesse meio, verificou-se neste trlho in vivo interferênci do KH 2 PO 4 n ção do Al e Si nos tecidos dos rtos Desenvolvimento dos nimis durnte o trtmento D mesm mneir que no trtmento com Al e Si, os nimis ttdos com Al, ou sej, os grupos Al+F e Al+Si+F, presentrm irritilidde e menor tolerânci o trtmento. Tmém não há influênci do trtmento no gnho de peso dos rtos, oserv-se n figur 16 que o desenvolvimento dos nimis em função do tempo de trtmento é semelhnte entre os grupos.

97 97 Figur 16: Médis semnis dos pesos dos nimis durnte os trtmentos pr os qutro grupos: controle, Al com KH 2 PO 4, KH 2 PO 4, Al+Si com KH 2 PO 4. As doses form: Al,5 mg/kg/di, Si 2 mg/kg/di, KH 2 PO 4 62 mg/kg/di Distriuição do lumínio nos tecidos dos rtos Wistr Foi determind concentrção de Al nos tecidos dos rtos pós 6 dminstrções de Al e/ou Si com dihidrogenofosfto de potássio em concentrção similr encontrd em soluções pr NP. A concentrção de Al nos grupos trtdos com esse elemento é significtivmente mior qundo comprdo os grupos controle e Si no soro, fígdo, pulmão e osso dos rtos trtdos com KH 2 PO 4. É interessnte oservr que neste trtmento o pulmão present grnde umento n concentrção de Al nos grupos qundo comprdos o controle (Figur 17), o que não ocorreu no trtmento somente com Al e Si (Figur 7). O fosfto, portnto, prece fvorecer permnênci ou entrd do Al neste órgão. No trtmento com fosfto concentrção de Al no osso não diminuiu n presenç do Si no osso e umentou no soro, fígdo e pulmão (Figur 17). Nossos resultdos in vitro justificm menor proteção exercid pelo Si em meio de KH 2 PO 4, eles indicrm que deve ocorrer um ligção entre esss dus espécies (NOREMBERG, 21). Como o Si está ligdo o KH 2 PO 4, não há formção de HAS e o Al fic livre em solução. A justifictiv pr menor concentrção do metl no grupo Al+F é que qundo o Si não está presente o fosfto fic livre pr intergir com o Al, diminuindo o seu cúmulo.

98 98 Soro Fígdo c d c Controle F Al+F Al+Si+F 38 Controle F Al+F Al+Si+F Pulmão Osso 8 d c Controle F Al+F Al+Si+F Controle F Al+F Al+Si+F Figur 17: Concentrção de Al no soro, fígdo, pulmão e osso dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de 1,82 µg/l no soro,,68 µg/g no fígdo,,5 µg/g no pulmão e 1,19 µg/g no osso. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). Strekopytov e Exley (25) concluírm, trvés d investigção d formção de HAS n presenç equimolr de Si(OH) 4 e fluoreto (F - ) ou fosfto (HPO -2 4 ), que este último result n precipitção de hidroxifosfto de lumínio e inie formção de HAS, exceto qundo concentrção de Al for significtivmente superior de HPO -2 4, onde HAS foi co-precipitdo. Não houve evidêncis de que o fosfto estivesse incluído n formção do HAS. Como concentrção de Al no presente estudo é menor do que de fosfto, não deve ocorrer formção de HAS e por ess rzão neste meio o Si não diminui o cúmulo de Al nos órgãos. No músculo, corção e rim tmém ocorreu o cúmulo de Al. A justifictiv pr um mior concentrção do metl no grupo Al+Si+F como ocorreu no soro, fígdo e pulmão, tmém pode ser plicd gor no rim, figur 18.

99 99 É importnte oservr que no músculo, corção e rim o grupo que receeu dministrção de somente fosfto presentou um cúmulo de Al n mesm proporção ou té mior que o grupo Al (no corção) (Figur 18). Possivelmente o KH 2 PO 4 estej moilizndo o Al presente no orgnismo do niml, pois mesmo os não trtdos com o metl estão expostos contminção presente no miente, n limentção e n águ. No pulmão e no soro, figur 17, tmém ocorreu um umento n concentrção de Al no grupo F qundo comprdo o controle, ms em menor proporção. Músculo Corção c Controle F Al+F Al+Si+F Controle F Al+F Al+Si+F Rim 14 c Controle F Al+F Al+Si+F Figur 18: Concentrção de Al no músculo, corção e rim dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de,79 µg/g no músculo,,57 µg/g no corção e,21 µg/g no rim. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5).

100 1 Gur e Phrm (21) slientrm que como os rins são principl vi de eliminção, os pcientes com mior risco de toxicidde o lumínio são queles com função renl reduzid. Relmente o rim cumul grnde prte do Al não excretdo té mesmo em indivíduos com função renl noml, como podem ser considerdos os rtos utilizdos neste experimento. No testículo (Figur 19) contrditorimente o comportmento nos demis órgãos, o Al se cumul somente nos grupos trtdos com o metl, ms o Si diminui esse cúmulo, exercendo su cpcidde protetor mesmo em meio de KH 2 PO Testículo c Controle F Al+F Al+Si+F Figur 19: Concentrção de Al no testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de,75 µg/g. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. Onewy ANOVA Duncn s test (p <,5). No cérero novmente concentrção de Al prece umentd em todos os grupos trtdos com o fosfto, figur 2, reforçndo hipótese de que este componente pode fcilitr entrd e permnênci do metl nestes tecidos. Além disso, o trtmento com KH 2 PO 4 umentou expresivmente concentrção de Al no cérero qundo comprdo com o trtmento somente com Al e Si, figur 8.

101 11 Cérero Controle F Al+F Al+Si+F Figur 2: Concentrção de Al no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de,76 µg/g. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. Onewy ANOVA Duncn s test (p <,5) Distriuição de silício nos tecidos dos rtos Wistr Após 6 dministrções intrperitoneis de dihidrogenofosfto de potássio e Al e/ou Si, mediu-se tmém concentrção de Si nos tecidos dos rtos. No soro os níveis de Si são miores nos grupos que receerm o trtmento com o de KH 2 PO 4 qundo comprdos o grupo controle. Esse comportmento se repete no músculo, corção e pulmão, figur 21. Assim como pr o Al o fosfto prece moilizr o Si presente no orgnismo e umentr su concentrção nos tecidos.

102 12 Soro Músculo Controle F Al+F Al+Si+F Controle F Al+F Al+Si+F Corção Pulmão Controle F Al+F Al+Si+F Controle F Al+F Al+Si+F Figur 21: Concentrção de Si no soro, músculo, corção e pulmão dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Si no controle foi de 61,6 µg/g no soro, 1,4 µg/g no músculo, 4,2 µg/g no corção e 1,9 µg/g no pulmão. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). A concentrção de Si nesses órgãos é considervelmente mior neste trtmento, com excessão do pulmão, qundo comprdo o trtmento somente com Al e Si, provvelmente porque o fosfto se lig o Si, como demonstrdo in vitro (NOREMBERG, 21), diminuindo su excreção e umentndo o cúmulo nos tecidos. Schwrz (1977) rgument que o silício tu no metolismo do colesterol e há hipótese de que usênci de Si pode contriuir n etiologi d terosclerose. O utor mencion que s forms tivs de silício funcionrim como constituintes essenciis do tecido conjuntivo e, ssim, contriuirim pr integridde e estilidde ds predes rteriis. Pr (198) lemr que há um relção negtiv entre o teor de silício n prede rteril e terosclerose, sendo que em regiões de

103 13 "águ dur" (teor de silício de 7 8 mg/l) encontr-se menor incidênci de doençs coronrins. Bsedo nesss evidêncis, é possível sugerir que o fosfto, por umentr concentrção de Si no corção poderi minimizr incidênci desss doençs. No rim não há diferenç significtiv n concentrção de Si entre os grupos trtdos e o controle, figur 22. Rim Testículo c Controle F Al+Si Al+Si+F Controle F Al+F Al+Si+F Fígdo Controle F Al+F Al+Si+F Figur 22: Concentrção de Si no rim, testículo e fígdo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Si no controle foi de 3,47 µg/g no rim, 2,45 µg/g no testículo e 8,8 µg/g no fígdo. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). No testículo novmente há cúmulo de Si nos grupos trtdos com KH 2 PO 4, entretnto no grupo Al+F este foi menor (Figur 22). Já no fígdo só há diferenç

104 14 significtiv n concentrção de Si qundo comprdo o controle no grupo trtdo com Al+Si+F Cérero Controle F Al+F Al+Si+F Figur 23: Concentrção de Si no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Si no controle foi de,62 µg/g. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). Os níveis de Si no cérero no trtmento com KH 2 PO 4 são semelhntes os encontrdos no trtmento com Al e Si. Em todos os grupos trtdos com fosfto concentrção do elemento prece umentd qundo comprd o controle, figur 23, como ocorreu em todos os tecidos neste trtmento, com excessão do rim. Como citdo nteriomente o Al pode estr permitindo o ingresso do Si no tecido cererl, qui verificmos que o fosfto tmém prece exercer este ppel δ-aminolevulinto Desidrtse (δ-ala-d) A tividde d enzim δ-ala-d não foi lterd pelo trtmento com dihidrogenofosfto de potássio e Al e/ou Si no sngue, rim e testículo dos rtos, tel 16.

105 15 Tel 16: Níveis de porfiirinogênio no sngue (nmolpbg/h/ml), rim e testículo (nmolpbg/mgptn h) dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de Al e/ou Si e KH 2 PO 4. Tecido Grupos trtdos Controle F Al+F Al+Si+F Sngue,91 ±,17,76 ±,94,848 ±,112,76 ±,49 Rim 37,869 ± 1,968 4, ± 1,928 37,18 ± 2,522 36,229 ± 2,147 Testículo 9,872 ±,738 1,914 ±,729 9,92 ±,577 9,536 ±,112 Vlores expressos como médi ± EP, n = 5 pr cd grupo trtdo. No trtmento nterior com Al e Si tmém não form oservds lterções nos níveis de porfoilinogênio no sngue e testículo dos rtos. No rim, entretnto, o fosfto prece diminuir ção do Al, pois no trtmento sem esse componente enzim preci tivd n presenç do metl e gor se presentou inlterd. No fígdo, corção e pulmão ess lterção tmém ocorre, figur 24. No fígdo e no corção presenç do fosfto ument tividde d enzim, entretnto o Al diminui ess ção, pois no grupo Al+F ess tivção não é oservd. No fígdo, corção, músculo e pulmão o cúmulo de Al foi mior nos grupos trtdos com Al+Si+F qundo comprdos o controle, podendo ser justifictiv pr o umento d tividde d enzim. Entretnto, no músculo todos os grupos tiverm um concentrção mis elevd de Al qundo comprdos o controle, ocorrendo, portnto, um relção diret entre o umento d concentrção de Al e elevção d tividde d enzim nesses tecidos, com coeficiente de correlção de Person de,57, não significtivo devido o umento pouco pronuncido nos níveis de MDA oservdo no grupo F comprdo à concentrção de Al.

106 16 Fígdo Corção Controle F Al+F Al+Si+F Controle F Al+F Al+Si+F Músculo Pulmão Controle F Al+F Al+Si+F Controle F Al+F Al+Si+F Figur 24: Efeito d dministrção intrperitonel de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si n tividde d enzim δ-ala-d no fígdo, corção, músculo e pulmão dos rtos. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A tividde d δ-ala-d no controle foi de 38,36 no fígdo, 15,8 no corção, 8,21 no músculo e 11,38 no pulmão, resultdos expressos em nmolpbg/mgptn h. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5) Espécies Retivs o Ácido Tioritúrico (TBARS) No soro, rim (figur 13) e músculo (figur 14) dos rtos trtdos com Al e Si verificou-se lterção nos níveis de TBARS. Contrditorimente, no trtmento com fosfto não há diferenç significtiv entre os grupos trtdos e o controle nesses tecidos, tel 17. No corção e pulmão os níveis de MDA tmém não são lterdos n presenç de KH 2 PO 4, concordndo com os resultdos encontrdos no trtmento com Al e/ou Si.

107 17 Tel 17: Níveis de MDA no soro (nmolmda/ml), rim, corção, músculo e pulmão (nmolmda/g de tecido) dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si. Tecido Grupos trtdos Controle F Al+F Al+Si+F Soro 3,72 ± 2,4 38,27 ± 4, 29,36 ± 3,4 43,12 ± 1,9 Rim 1865,55 ± 153,2 1694,63 ± 82,2 1877,1 ± 148,7 1614,81 ± 93,1 Corção 553,85 ± 25,2 514,24 ± 37,9 497,52 ± 21,2 511,2 ± 49,4 Músculo 1186,2 ± 98,4 1399,4 ± 115,5 1331,9 ± 1,1 173,88 ± 71,7 Pulmão 774,5 ± 27,4 718,45 ± 78,4 64,9 ± 41,3 644,14 ± 62,5 Vlores expressos como médi ± EP, n = 5 pr cd grupo trtdo. No fígdo dministrção de Si diminui significtivmente os níveis de MDA qundo comprdo o grupo controle, ess diminuição tmém pode ser perceid no testículo, entretnto o grupo trtdo com Si é significntemente diferente do grupo Al+F, figur 25. Fígdo Testículo Controle F Al+F Al+Si+F Controle F Al+F Al+Si+F Figur 25: Níveis de MDA no fígdo e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si (Si). Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de MDA no controle foi de 1532,41 no fígdo e 394,86 no testículo, expressos em nmol MDA/g de tecido. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5).

108 18 Yousef e Slm (29) encontrrm um umento significtivo nos níveis de sustâncis retivs o ácido tioritúrico (TBARS) no testículo em rtos trtdos co Al qundo comprdos com o grupo controle. Neste trlho só foi verificd um tendênci esse umento no trtmento com fosfto. O umento do TBARS nos testículos pode ser conferido à susceptiilidde dos espermtozóides o dno oxidtivo. Esses possuem lt concentrção de ácidos grxos insturdos, limitd cpcidde ntioxidnte, em como cpcidde de gerr EROs (AITKEN, 1995). No trtmento com fosfto (Figur 25) presenç do Si prece iniir tendênci do Al em umentr os níveis de MDA no testículo. O Si juntmente com o fosfto podem estr diminuindo formção de EROs induzids pelo Al TBARS cererl No trtmento com fosfto, dministrção de Al com Si tende umentr o estresse oxidtivo pelo umento do TBARS no estrido (Figur 26). No hipocmpo diministrção de somente fosfto diminui os níveis de MDA. No cereelo e cortex não verific-se diferenç significtiv entre os grupos.

109 19 Cereelo Estrido Controle F Al+F Al+Si+F Controle F Al+F Al+Si+F Cortex Hipocmpo Controle F Al+F Al+Si+F Controle F Al+F Al+Si+F Figur 26: Níveis de MDA ns estruturs cereris dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de KH 2 PO 4 e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de MDA no controle foi de 32,74 no cereelo, 3,62 no estrido, 38,14 no córtex e 37,23 no hipocmpo, resultdos expressos em nmolmda/mg de proteín. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). No hipotálmo o fosfto interfere de mneir contrári encontrd no hipocmpo, nos grupos trtdos com o composto os níveis de MDA precem umentdos, principlmente no grupo que não receeu Si e Al (grupo F), tel 18. Tel 18: Níveis de MDA no hipotálmo de rtos trtdos com KH 2 PO 4 e Al e/ou Si Grupo Controle F Al+F Al+Si+F 1 241,1 156,1 127,2 MDA (nmol)/mg de proteín 21,9 52,7 34,1 28,7

110 11 O fosfto, portnto, não pode ser considerdo um minimizdor do stress oxidtivo no cérero, pel medid d peroxidção lipídic, pois pesr de diminuir os níveis de MDA no hipocmpo, ns demis estruturs esse efeito não é oservdo Trtmento com Al e Si e gluconto de C O gluconto de C foi escolhido pr simulr interferênci d NP n iodisponiilidde do Al n presenç do Si in vivo por ser, ssim como o dihidrogenofosfto de potássio, um dos componentes que present miores níveis de contminção com esses elementos (BOHRER et l., 22, 28) Desenvolvimento dos nimis durnte o trtmento Como nos trtmentos nteriores, não foi perceid diferenç no comportmento entre os grupos, com exceção dos rtos dos grupos trtdos com Al, que presentrm irritilidde e menor tolerânci o trtmento. Relcionndo-se o desenvolvimento com o peso dos nimis, oserv-se no trtmento com gluconto de C, figur 27, que os nimis do grupo controle, os quis não receerm dministrção do sl, tem menor gnho de peso que os demis. O ácido glucônico e os sis de gluconto derivm d oxidção incomplet d glicose. O ácido glucônico pode ser trnsformdo em 6-fosfogluconto, composto que fz prte d rot de oxidção d glicose pel vi ds pentoses (Rmchndrn et l., 26). Com dministrção de gluconto nos nimis, pode ter ocorrido um diminuição do consumo de glicose, pois o sl form um suproduto de su oxidção. A glicose proveniente d limentção e té mesmo o gluconto podem não ter sido totlmente utilizdos e o excesso pode ter sido usdo n síntese de lipídeos. Ess pode ser possível cus pr o mior gnho de peso dos nimis trtdos com o gluconto de C.

111 111 Outr explicção pr o gnho de peso dos nimis pode ser que durnte oxidção do 6-fosfogluconto ocorre formção NADPH n vi ds pentoses e os tecidos utilizm o NADPH produzido por ess vi pr síntese de ácidos grxos (NELSON; COX, 26). Figur 27: Médis semnis dos pesos dos nimis durnte os trtmentos pr os qutro grupos: controle, Al com gluconto de C, gluconto de C e Al+Si com gluconto de C. As doses form: Al,5 mg/kg/di, Si 2 mg/kg/di e gluconto de C 16 mg/kg/di Distriuição do lumínio nos tecidos dos rtos Wistr Nossos resultdos in vitro não comprovrm interção do Al e Si em meio o gluconto de C, pois pr tods s concentrções de Si concentrção de Al preci diminuíd n solução filtrd (NOREMBERG, 21), concluindo-se ssim que o gluconto interge com o Al, impedindo interção com o Si pr formr HAS de menor iodisponiilidde. É possível perceer um grnde umento n concentrção de Al no soro, pulmão e principlmente no fígdo dos rtos trtdos com o metl. E relmente em meio o gluconto de C não há diminuição d concentrção do Al n presenç do Si nesses tecidos, figur 28.

112 112 Soro Fígdo Controle G Al+G Al+Si+G 152 Controle G Al+G Al+Si+G 65 Pulmão Controle G Al+G Al+Si+G Figur 28: Concentrção de Al no soro, fígdo e pulmão dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de 1,55 µg/l no soro,,76 µg/g no fígdo e,45 µg/g no pulmão. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). Um ddo importnte considerr é o grnde umento d concentrção de Al no fígdo dos rtos neste trtmento, de té 4 vezes mis que nos nteriores. No rim, osso e testículo, onde tmém ocorre deposição de Al nos grupos trtdos com o metl, o Si diminui su iodisponiilidde, diminuindo concentrção do Al mesmo em meio o gluconto de C, figur 29.

113 113 Rim Osso 27 c d Controle G Al+G Al+Si+G c Controle G Al+G Al+Si+G 35 Testículo c 7 Controle G Al+G Al+Si+G Figur 29: Concentrção de Al no rim, osso e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de,38 µg/g no rim, 1,14 µg/g no osso e,69 µg/g no testículo. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). Não é possível esclrecer de que mneir, ms s diferentes crcterístics e funções dos tecidos interferem n cpcidde de deposição e de interção entre o Al e Si n presenç do gluconto. Por exemplo, no fígdo no trtmento somente com Al e Si este último diminuí o cúmulo do metl, entretnto não demostrou ess cpcidde em meio o gluconto. Já no testículo, onde no trtmento sem os componentes d NP não foi oservdo umento d concentrção de Al, neste trtmento este foi verificdo, com redução n presenç do Si. Perry & Keeling-Tucker (1998) encontrrm silício ns áres de crescimento tivo no osso jovem de cmundongos e rtos e com o umento d minerlizção, s concentrções de cálcio e de silício umentrm congruentemente. A fse minerl do osso é compost principlmente de cálcio e fosfto. Um vriedde de metis

114 114 que podem estr presentes n corrente snguíne é retid pelo tecido esquelético. A sorção pelo tecido esquelético é um função d finidde de um ddo metl pelo minerl ósseo e pel mtriz extrcelulr e d concentrção do metl no plsm. É tmém um função do gru de minerlizção do esqueleto (BRONNER, 28). Considerndo que o Si pode estr diretmente ligdo o umento d minerlizção ósse, su presenç pode diminuir sorção de metis, neste cso o Al. Isso justificri diminuição do cúmulo de Al no osso qundo Si e gluconto de C são injetdos juntmente com o metl, presenç de Si e C terim umentdo minerlizção ósse e ocsiondo diminuição d sorção de Al. Segundo Gur e Phrm (21), o lumínio fet o desenvolvimento dos ossos por um vriedde de mecnismos. Qundo níveis elevdos são encontrdos no osso, minerlizção é prejudicd. O Alumínio tu diretmente sore o osso por induzir deficiênci de fosfto trvés d su ligção com o fósforo e pode prejudicr sorção de cálcio pelos ossos. Cofirmou-se nesse trlho que o Al se cumul no osso durnte os trtmentos, podendo cusr dnos neste tecido. Músculo Corção c c Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Figur 3: Concentrção de Al no músculo e corção dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de,8 µg/g no músculo e,68 µg/g no corção. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). No músculo e corção novmente verific-se um diferenç significtiv entre os grupos trtdos e o grupo controle, figur 3. Nesses tecidos e no rim, em menor

115 115 escl, no grupo gluconto ocorre cúmulo de Al. Esse comportmento tmém foi oservdo nesses e em outros tecidos no trtmento fosfto. Prece que o gluconto possui mesm cpcidde de moilizr o Al presente no orgnismo e umentr o seu depósito nesses tecidos. Tmém pode-se oservr que o Si não diminui concentrção do metl cumuldo. No cérero o gluconto tmém ument concentrção de Al em todos os grupos em relção o controle, e não oserv-se efeito protetor do Si, figur Cérero Controle G Al+G Al+Si+G Figur 31: Concentrção de Al no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Al no controle foi de,73 µg/g. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). O primeiro psso n cptção de íons de metl no cérero é pssgem trvés d rreir sngue-cérero. Ess rreir é formd por um únic cmd de céluls unids por juncões estreits. Pr trvessr rreir, miori dos solutos devem, portnto: (i) dissolver e se difundirem trvés dos lipídios d memrn d célul por difusão pssiv, que depende muito d lipofilicidde d sustânci, ou (ii) ser trnsportdos trvés de um trnsportdor específico, cnl ou mecnismo receptor, por exemplo glicose (BERTHON, 22). O Gluconto de C e o dihidrogenofosfto de potássio precem ser fcilitdores d pssgem do Al pel rreir sngue-cérero, podendo estr gindo como trnsportdores (como citdo em ii), já que nestes trtmentos concentrção do metl é em mis lt qundo comprds s do trtmento somente com Si e Al.

116 116 O Al foi ssocido doençs neurológics em pcientes que receem nutrição prenterl longo przo e premturos que receem limentção intrvenos (KLEIN et l., 1991; KLEIN, 25; BISHOP et l., 1997). Ess firmção concord com nossos resultdos, pois os componentes d nutrição prenterl, o gluconto de C e o dihidrogenofosfto de K, umentrm concentrção de Al no cérero. Gonzlez-Muñoz e colordores (28) verificrm que o ácido silícico, qundo dissolvido juntmente com o Al n águ de eer durnte três meses, reduz concentrção do metl no cérero de cmundongos, chegndo os mesmos vlores oservdos no grupo controle. Neste trlho, verificou-se que diministrção de Si juntmente com o Al intrperitonelmente não diminui retenção do metl no cérero dos rtos em nenhum dos trtmentos, demonstrndo que nest vi de dministrção o Si não tu como protetor n disponiilidde do Al neste tecido Distriuição de silício nos tecidos dos rtos Wistr A concentrção de silício nos tecidos dos rtos trtdos com gluconto de C e Al e/ou Si tmém foi determind pós 6 dministrções intrperitoneis, simulndo o trtmento de NP. No soro e músculo verificou-se um umento significtivo d concentrção de Si tnto nos grupos trtdos com o elemento como nos que receerm gluconto e gluconto e Al qundo comprdos o controle, figur 32. Novmente, como oservdo no trtmento com fosfto, not-se que o gluconto é cpz de moilizr o Si presente no orgnismo e concentrá-lo em lguns tecidos. Esse comportmento tmém ocorre no testículo, entretnto nesse órgão e no corção presenç do Al diminui o cúmulo do Si.

117 117 Soro Músculo c Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Corção Testículo c c Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Figur 32: Concentrção de Si no soro, músculo, corção e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Si no controle foi de 59,46 µg/l no soro, 1,54 µg/g no músculo, 3,98 µg/g no corção e 2,45 µg/g no testículo. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). O sngue medi s interções metólics entre todos os tecidos (NELSON; COX, 26), portnto o que não for metolizdo ou rmzendo nos tecidos permnece nele, justificndo mior concentrção de Si e Al oservd no soro durnte os trtmentos. Mesmo os nimis que receerm somente gluconto de C e dihidrogeniofosfto de potássio, presentrm grndes níveis de Si no soro, provvelmente porque esses compostos fixm o elemento diminuindo ou retrdndo o seu metolismo. Bissé et l. (25) demonstrrm que o teor de silício d ort humn diminui com idde e que concentrção de silício n prede rteril diminui com o desenvolvimento d terosclerose, o que mostr que esse elemento deve ter relção com o om funcionmento ds funções rteriis. Nossos resultdos mostrrm que

118 118 o gluconto e o fosfto umentm concentrção de Si no corção, o que pode ser importnte pr mnutenção d estrutur rteril. Lndeghem et l. (1998) tmém verificrm o cúmulo de Si n pele e n ort. O fto do Al diminuir concentrção de Si no corção pode ser considerdo um influênci negtiv d su dministrção. No fígdo, rim e pulmão não há diferenç significtiv n concentrção de Si entre os grupos trtdos com gluconto de C, Al e Si e o grupo controle, tel 19. Tel 19: Concentrção de Si (µg/g) no fígdo, rim e pulmão dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si. Tecido Grupos trtdos Controle G Al+G Al+Si+G Fígdo 1,86 ±,137 2,375 ±,45 2,56 ±,384 2,251 ±,877 Rim 2,354 ±,142 2,292 ±,315 2,619 ±,264 2,32 ±,239 Pulmão 1,83 ±,183,987 ±,143 1,555 ±,76 1,324 ±,17 Vlores expressos como médi ± EP, n = 5 pr cd grupo trtdo. No cérero o gluconto de C tmém ument deposição do Si, mesmo qundo dminstrdo com Al, figur Cérero Controle G Al+G Al+Si+G Figur 33: Concentrção de Si no cérero dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de Si no controle foi de,6 µg/g. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5).

119 119 O Si é considerdo por muitos um elemento essencil. No entnto, teori que prevlece é que ele pode proteger, em virtude de um mecnismo evolutivo, contr toxicidde de lumínio. Um série de sítios iológicos tem sido identificdos em que Si e Al são co-depositdos ou co-loclizdos. Um ds áres investigds em mior detlhe é o núcleo d plc senil no córtex cererl de pcientes portdores de demênci senil tipo Alzheimer. Medids de ressonânci mgnétic nucler de lt resolução de estdo sólido em regiões centris desss plcs têm mostrdo que o Si e Al estão presentes como um espécie de lumínosilicto (BIRCHALL; CHAPPELL, 1989). Est suposição resultou em grnde dete sore o uso de suplementos limentres de Si como um medid preventiv pr est doenç, emor tis estruturs de plc tmém tivessem sido oservds em pcientes idosos mentlmente normis (GONZALEZ-MUÑOZ, 28). Nosso estudo confirmou est co-deposição de Al e Si no cérero dos rtos, os trtmentos, principlmente com fosfto e gluconto, umentrm concentrção dos elementos nos grupos qundo comprdos o controle. Além disso, não foi verificd um diminuição d concentrção de Al no cérero dos rtos trtdos com Si, demonstrndo que o Si não previne deposição de Al neste tecido δ-aminolevulinto Desidrtse (δ-ala-d) A tividde d enzim não foi lterd no sngue nos trtmentos nteriores. Neste trtmento, com gluconto de C, presenç do Al ument de form significtiv tividde d δ-ala-d no sngue. No fígdo e testículo os níveis de porfoirinogênio tmém precem umentdos nos grupos trtdos com Al, figur 34. Nestes tecidos, o Si não diminui significntemente elevção d enzim, oservd no grupo Al+G.

120 12 Sngue Fígdo Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Testículo Controle G Al+G Al+Si+G Figur 34: Efeito d dministrção intrperitonel de gluconto de C e Al e/ou Si n tividde d enzim δ-ala-d no sngue, fígdo e testículo dos rtos. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A tividde d δ- ALA-D no controle foi de 1,56 nmolpbg/h/ml no sngue, 65,86 nmolpbg/mgptn h no fígdo e 9,31 nmolpbg/mgptn h no testículo. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). Vlentini e colordores (27) triuírm à iniição d tividde d enzim δ-ala-d em pcientes de hemodiálise o mior nível de Al encontrdo no sngue destes pcientes. Entretndo eles dizem que o envolvimento do Al n iniição d δ- ALA-D nesses pcientes não está em esclrecido, pois outros estudos não detectrm este comportmento pós intoxicção gud. No presente trlho, tmém não foi veirifcd iniição d enzim durnte o trtmento crônico com Al, e, contrditorimente, n miori ds vezes é tivd n presenç do metl. Schetinger et l. (1999) reltrm que Iniição in vitro d enzim hepátic foi oservd somente em lts concentrções de lumínio (superior 4, mm). Bsedo no efeito iniitório de um dose elevd de lumínio seri mis rzoável

121 121 esperr um iniição d δ-ala-d hepátic pós exposição in vivo. No entnto, tividde d δ-ala-d hepátic de rtos expostos o lumínio n águ potável foi umentd cerc de 3-4% qundo comprdo o grupo controle. Além disso, tivção cusd pelo lumínio foi provvelmente relciond o umento n concentrção de lumínio neste órgão. A mior concentrção do Al pode ser justifictiv pr elevção d tividde d enzim encontrd no trtmento com gluconto, pois neste cso o cúmulo de Al foi em mior que nos demis trtmentos e presentou coeficiente de correlção de Person de,8, que, pesr de não ser significtivo, represent um considerável relção diret entre s dus vriáveis. A mior deposição de lumínio no fígdo oservd no presente estudo está em conformidde com s conclusões do Fiejk e colordores (1996) que mostrrm que o fígdo é o principl órgão lvo pr o cúmulo e toxicidde do metl. Presumivelmente, tivção hepátic d δ-ala-d pode ser considerd como um mnifestção d toxicidde do lumínio, ou como prte de um respost dpttiv hepátic o seu cúmulo. No testículo, sngue e rim tmém oserv-se um correlção diret entre concentrção de Al e os níveis de porfoilinogênio, r=,97,,98 e,94 respectivmente, sugerindo que o cúmulo do metl interfere n tividde d enzim nesses tecidos. No rim, pulmão, músculo e corção tividde d enzim δ-ala-d tmém é tivd n presenç do Al (Figur 35), ms nesses tecidos dministrção de Si diminui significtivmente ess tivção, demonstrndo cpcidde de reduzir iodisponiilidde do metl. Com exceção do rim, nestes tecidos não houve correlção considerável entre o cúmulo do Al e tividde d enzim (r=,57 no pulmão, r=,49 no músculo e r=,17 no corção) não precendo ser o seu depósito cus d elevção dos níveis de porfoilinogênio.

122 122 Rim Pulmão c c 7 52 Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Músculo Corção c c Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Figur 35: Efeito d dministrção intrperitonel de gluconto de C e Al e/ou Si n tividde d enzim δ-ala-d no rim, pulmão, músculo e corção dos rtos. Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A tividde d δ-ala-d no controle foi de 8,97 no rim, 6,5 no pulmão, 3,82 no músculo e 8,17 no corção, expressos em nmolpbg/mgptn h. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5) Espécies Retivs o Ácido Tioritúrico (TBARS) O gluconto de C diminui o TBARS no sngue e corção, pois todos os grupos trtdos com o sl presentrm níveis menores em relção o controle, figur 36.

123 123 Soro Corção Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Rim Pulmão Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Músculo Controle G Al+G Al+Si+G Figur 36: Níveis de MDA no soro, corção, rim, pulmão e músculo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si (Si). Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de MDA no controle foi de 31,19 nmolmda/ml no soro, 66,61 no corção, 2322,42 no rim, 121,73 no pulmão e 1291,18 no músculo, expressos em nmolmda/g de tecido. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. Onewy ANOVA Duncn s test (p <,5).

124 124 As mitocôndris perfzem quse metde do volume ds céluls musculres crdícs (NELSON; COX, 26) e são nels trvés d respirção celulr, que ocorre mior prte d formção de EROs. O gluconto complexndo o Al (metl pró-oxidnte) presente ns céluls, pode ter diminuído iodisponiilidde do metl e consequentemente minimizdo formção de EROs e o TBARS no corção. No músculo tmém ocorreu um diminuição d peroxidção lipídic pós exposição o gluconto, entretnto el só é significtivmente diferente do controle no grupo Al+Si+G. No rim e pulmão qundo Al é dministrdo juntmente com gluconto de cálcio os níveis de MDA precem diminuídos em relção os grupos G e Al+Si+G. Como dito nteriormente o umento d tividde d enzim δ-ala-d ument o consumo do sustrto (δ-ala) minimizndo o estresse oxidtivo. A diminuição do estresse oxidtivo nos nimis trtdos com gluconto pode estr relciond com mior tividde d enzim oservd nesses grupos. Reforçndo idei d tividde ntioxidnte. A nálise de correlção confirm relção invers entre os níveis de MDA e tividde d enzim no soro r= -,92, corção r= -,65, rim r= -,93 e pulmão r= -,79. A gluttion peroxidse (GPx) é um importnte enzim ntioxidnte, pois remove o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ), espécie retiv de oxigênio, pel conversão d gluttion reduzid (GSH) em gluttion oxidd (GSSG). A ção d GPx é dependente d gluttion redutse (GR), enzim NADPH dependente, pois ess regener GSH (NELSON; COX, 26). Como já menciondo, o gluconto poderi umentr produção de NADPH e este umento tmém pode ser o motivo d diminuição dos níveis de MDA nos grupos trtdos com o composto, pois, o umento d produção de NADPH, estimul ção d enzim GR iniindo peroxidção lipídic por diminuir os níveis de EROs. Ou simplesmente pode estr umentndo regenerção d GSH, um poderoso ntioxidnte não enzimático. O sngue e o corção são ltmente oxigendos e mis propensos ocorrênci de formção de EROs, sendo supostmente ess justifictiv pr mior redução dos níveis de peroxidção lipídic promovid pel exposição o gluconto nesses tecidos, figur 36. O Al ument peroxidção lipídic do fígdo n presenç de gluconto de C e o Si diminui ess peroxidção, ms não os níveis dos grupos controle e G, figur 37.

125 125 Fígdo Testículo c Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Figur 37: Níveis de MDA no fígdo e testículo dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si (Si). Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de MDA no controle foi 1712,74 no fígdo e 485,81 no testículo, expressos em nmolmda/g de tecido. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). No testículo não houve diferenç significtiv entre os trtmentos, figur 36. A exposição dos heptócitos, uniddes funcionis do fígdo, o Al lev diminuição d iodisponiilidde do Fe n mitocôndri e o stress oxidtivo (MAILLOUX et l., 211). O gluconto de lgum form ument toxicidde do Al no fígdo pel peroxidção lipídic, figur 37. Como o tempo de metolismo do Al ligdo o gluconto é mior do que qundo está livre, su permnênci no fígdo pode ter umentdo seus efeitos tóxicos TBARS cererl No cereelo o trtmento com gluconto de C diminui o TBARS, esse efeito é perceido significtivmente nos grupos trtdos com gluconto, Al e Si. No córtex verific-se um grnde umento nos níveis de MDA no grupo trtdo com Al e gluconto e ness estrutur dministrção de Si reverte o TBARS os níveis do controle, figur 38, demonstrndo ser um protetor d toxicidde do Al.

126 126 Cereelo Estrido Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Cortex Hipocmpo Controle G Al+G Al+Si+G Controle G Al+G Al+Si+G Figur 38: Níveis de MDA ns estruturs cereris dos rtos pós 6 dministrções intrperitoneis de gluconto de C e Al e/ou Si (Si). Cd colun represent médi ± D.P. (n=5) como porcentgem do controle. A concentrção de MDA no controle foi de 53,99 no cereelo, 36,2 no estrido, 43,55 no cortex e 36,33 no hipocmpo, expressos em nmolmda/mg de proteín. Ns coluns letrs diferentes significm diferenç significtiv entre os grupos. One-wy ANOVA Duncn s test (p <,5). No estrido e hipocmpo não form encontrds diferençs significtivs entre os grupos neste trtmento. No hipotálmo tmém não se oserv um grnde lterção nos níveis de MDA nos grupos trtdos em relção o controle, tel 2. No córtex e cereelo os resultdos oservdos no trtmento com gluconto são inversos os encontrdos no com somente Al e Si, demonstrndo que os componentes d NP interferem n ção do Al no cérero. O lumínio pode exercer tnto efeito oxidnte como ntioxidnte ns memrns cereris dos rtos. Foi sugerido que su ção pró-oxidnte ocorre por meio de interções do íon Al 3+ com s memrns, lterções sutis no rerrnjo dos lípidios que umentm disponiilidde de ácidos grxos o tque dos rdicis

127 127 livres ou fcilitm propgção d peroxidção lipídic. Em contrste, íons Al 3+ exercem um ção ntioxidnte um concentrção muito ix, presumivelmente trvés d sustituição do ferro em sítios de ligção celulr (BERTHON, 1996). Esse efeito contrditório do Al foi oservdo no córtex: no trtmento com Al e Si, onde em concentrção mior, ou sej, não ligdo, presentou efeito oxidnte umentndo peroxidção lipídic, já no trtmento com gluconto, onde provvelmente está em concentrção mis ix ou menos disponível por estr ligdo o sl, presentou efeito ntioxidnte diminuindo os níveis de MDA. Tel 2: Níveis de MDA no hipotálmo de rtos trtdos com gluconto de C e Al e/ou Si Grupo Controle G Al+G Al+Si+G 1 13,8 115,7 113, MDA (nmol)/mg de proteín 2,6 21,4 23,8 23,3 Níveis miores de lumínio têm sido detectdos em áres do cérero de pcientes com plcs senis e emrnhdos neurofirilres, mos os quis são crcterísticos d doenç de Alzheimer. O hipocmpo e córtex são considerdos regiões vulneráveis DA devido o cúmulo de proteín β-milóide (plcs senis são formds pelo depósito dess proteín no espço existente entre os neurônios) em cmundongos e humnos (CACCAMO et l., 25). Relmente o cortex e o hipocmpo, pesr de não presentrem modificções nos níveis de MDA no trtmento com fosfto e gluconto, respectivmente, form s estruturs mis fetds pelos trtmentos. Foi proposto que os efeitos tóxicos do lumínio são medidos, pelo menos em prte, por gerção de rdicis livres. No entnto, est premiss é inconsistente com o fto de que os íons de lumínio não são cpzes de promover peroxidção lipídic d memrn de form independente, emor possm umentr peroxidção lipídic d memrn Fe 2+ -dependente. O mecnismo pelo qul isso pode ocorrer não é esclrecido, emor tenh sido sugerido que s interções com lumínio podem induzir sutis mudnçs estruturis ns memrns celulres, com conseqüente perturção funcionl incluindo o umento d vulnerilidde dnos

128 128 dos rdicis livres e os efeitos sore funções lisossômics e mitocondril (ZATTA et l., 22). O Al fet ioquímic cererl de mneir diferente ns regiões estudds do cérero pr os trtmentos vlidos neste estudo, possivelmente porque interj de mneir desigul n promoção d peroxidção lipídic com vrição do locl de ção e d composição químic de dministrção. Estudos nteriores mostrrm que o lumínio influenci ns tividdes de rdicis livres em enzims. Yousef (24) oservou que dministrção do lumínio ixou tividde de enzims ntioxidntes e umentou peroxidção lipídic nos testículos, fígdo, rim e cérero de coelhos. Neste trlho tmém foi verificdo o umento do TBARS nesses órgãos, ms em trtmentos diferentes: nos testículo no trtmento fosfto, no rim no trtmento gluconto e no fígdo somente no trtmento com Si e Al. No cérero esse efeito não foi verificdo de form pronuncid ns estruturs, com exceção do cortex onde os níveis de MDA são contrditórios dependendo do trtmento Efeito do trtmento nos tecidos Os nimis que receerm dministrção intrperitonel de Al,5 mg/kg/di, com ou sem fosfto e gluconto (grupos Al, Al+F e Al+G), presentrm grnuloms no tecido dominl, figur 39 (), possivelmente formds pel glomerção de prtículs formds pel precipitção do hidróxido de Al formdo em solução em ph fisiológico. Os demis grupos não presentrm esses glomerdos, figur 39 ().

129 129 () () Figur 39: Grnuloms formdos no tecido dominl do grupo de nimis com 6 dministrções intrperitoneis de Al,5 mg/kg/ di (), tecido dominl sem grnuloms no grupo controle (). Bommer (1993) refere-se vários trlhos que citm glomerção de mteriis estrnhos em órgãos de pcientes em diálise. Atrvés d nálise por fluorescênci de rio-x conectd á microscopi de vrredur eletrônic confirmrm presenç de silício, cloreto de lumínio, ferro e potássio ns estruturs. Durnte o trtmento de diálise os pcientes são sumetidos procedimentos onde o sngue pode entrr em contto com mteriis ou sustâncis contminds com Al e Si, contminção que, como já menciondo nteriormente neste trlho, tmém prece ns soluções de nutrição prenterl.