PROPOSIÇÃO, VALIDAÇÃO E ANÁLISE DOS MODELOS QUE CORRELACIONAM ESTRUTURA QUÍMICA E ATIVIDADE BIOLÓGICA

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1 658 Gaudo & Zandonade Qum. Nova Qum. Nova, Vol. 4, No. 5, , 001. Dvulgação PROPOSIÇÃO, VALIDAÇÃO E ANÁLISE DOS MODELOS QUE CORRELACIONAM ESTRUTURA QUÍMICA E ATIVIDADE BIOLÓGICA Anderson Coser Gaudo * Departamento de Físca, Centro de Cêncas Exatas, Unversdade Federal do Espírto Santo, Campus de Goaberas, Vtóra - ES Elana Zandonade Departamento de Estatístca, Centro de Cêncas Exatas, Unversdade Federal do Espírto Santo Recebdo em 7/4/00; aceto em 15/1/00 PROPOSITION, VALIDATION AND ANALSIS OF QSAR MODELS. The present paper ams to brng under dscusson some theoretcal and practcal aspects about the proposton, valdaton and analyss of QSAR models based on multple lnear regresson. A comprehensve approach for the dervaton of extrathermodynamc equatons s revewed. Some examples of QSAR models publshed n the lterature are analyzed and crtczed. Keywords: quanttatve structure-actvty relatonshps; multple lnear regresson; valdaton of QSAR models. INTRODUÇÃO Em sua sétma edção do ano de 1973, o Journal of Medcnal Chemstry publcou um artgo de autora de Unger e Hansch 1 que é consderado por mutos como um marco no desenvolvmento de QSAR, abrevação em nglês para Relações Quanttatvas entre Estrutura e Atvdade. O artgo tornou-se célebre por estabelecer regras geras para a elaboração e valdação dos modelos matemátcos que correlaconam estrutura químca e atvdade bológca. A publcação desse artgo fo conseqüênca da publcação anteror de dos outros artgos, em que seus autores apresentaram modelos matemátcos dstntos para analsar a atvdade bológca da mesma sére de compostos. Tudo começou com o artgo de Hansch e Len, em que se analsou a atvdade antadrenérgca de vnte e dos compostos dervados da N,N-dmetl-α-bromo-fenletlamna (1), substtuídos nas posções meta e para do anel fenla, cujos valores havam sdo determnados cnco anos antes 3. * e-mal: anderson@cce.ufes.br. 1 CHCH NMe Segundo Hansch e Len, a atvdade antadrenérgca dos compostos dervados da estrutura 1 podera ser representada como uma função lnear dos efetos lpofílco e eletrônco que os grupos e proporconam à estrutura 1 (eq 1). log 1/C = 1, π - 1,59 σ + 7,89 (1) (n = ; R = 0,918; s = 0,38) Na eq 1, C representa a concentração do fármaco, em moles/kg de peso corporal, capaz de produzr 50% de antagonsmo à ação vasopressora de uma dose padrão de epnefrna em ratos, π é a constante lpofílca de Hansch 4, σ é a constante eletrônca de Hammett 5, n é o número de compostos ncluídos no modelo, R é o coefcente de correlação do modelo e s é o Br desvo-padrão do modelo. Neste ponto cabe um esclarecmento. Optou-se por apresentar as equações ctadas em sua forma orgnal. Assm que o formato aproprado de apresentação dos modelos matemátcos de QSAR for mostrado (ver adante), o letor poderá comparar as dversas formas de apresentação já utlzadas ao longo do tempo. Em 197, Cammarata 6 apresentou a eq como alternatva para a representação da atvdade dos compostos dervados da estrutura 1. log 1/C = 0,747 (±0,13) π m - 0,911 (±0,49) σ m + 1,666 (±0,14) r v p + 5,769 () (n = ; R = 0,961; s = 0,168) Na eq, π m e σ m são as constantes lpofílca e eletrônca dos grupos químcos presentes na posção meta do anel fenla p da estrutura 1 (), r v é o rao de van der Waals do substtunte na posção para () e os números entre parênteses correspondem aos desvos-padrão dos coefcentes da equação. Os valores numércos de R e s na eq ndcam que o modelo de Cammarata consegue explcar maor quantdade da varabldade dos valores da atvdade bológca do que o modelo representado pela eq 1. No entanto, deve-se levar em consderação que o segundo membro da eq contém uma varável a mas do que a eq 1, o que certamente contrbu para sua melhor qualdade. Em 1973, Unger e Hansch 1 reagram ao modelo proposto por Cammarata, afrmando que o mesmo contnha nconsstêncas relatvas às varáves utlzadas para descrever a atvdade bológca e de forma alguma apresentava embasamento boquímco, o que o nvaldava. Alguns dos argumentos ctados foram: (a) o modelo não atrbu efeto hdrofóbco aos substtuntes presentes na posção para. A varável r p v dos poucos substtuntes (ses) na posção para utlzados no modelo está acdentalmente correlaconada aos efetos hdrofóbco (R = 0,840) e hdrofóbco/eletrônco (R = 0,983). Portanto, não é possível afrmar com segurança qual é o efeto que realmente é mportante nos compostos substtuídos na posção para. Além dsso, (b) o snal do coefcente de r p v na eq possu snal postvo. Isso ndca que o efeto estéreo do substtunte ntensfca a atvdade, o que raramente é observado. Nos casos em que o aumento do tamanho do substtunte ntensfca a atvdade, a propredade relevante é a hdrofobcdade e não o efeto estéreo 7 e; (c) utlzou-se apenas o efeto eletrônco dos

2 Vol. 4, No. 5 Proposção, Valdação e Análse dos Modelos que Correlaconam Estrutura Químca e Atvdade Bológca 659 substtuntes na posção meta. Segundo Unger e Hansch 1, sso não está em acordo com o mecansmo de ação proposto para esses compostos, cuja etapa lmtante é a nteração entre o carbocáton (), produzdo rapdamente através da hdrólse do fármaco (1) em ph fsológco, e o provável ambente nucleofílco localzado no síto de ação (representado por Z - ). 1 Br CHCH NMe C + HCH NMe CH CH N + Me Z - CHCH NMe Unger e Hansch 1 magnaram que se esse mecansmo de ação estvesse correto, então a constante eletrônca σ +, aproprada para substtuntes capazes de deslocalzar uma carga eletrônca resdual postva, devera ser mas adequada do que σ. De fato, essa hpótese pôde ser verfcada através da eq 3, que claramente possu melhor ajuste do que a eq 1. log 1/C = 1,15 π - 1,47 σ + + 7,8 (3) (n = ; R = 0,944; s = 0,197) Nesse mesmo artgo, Unger e Hansch 1 estabeleceram cnco regras geras para a proposção de modelos matemátcos de relações estrutura-atvdade, que são enuncadas a segur. (a) Seleção de varáves ndependentes: deve-se testar grande número de varáves, nclundo propredades de natureza lpofílca, eletrônca, estérea e de polarzabldade 7,8. Também devem ser testadas varáves geradas a partr de cálculos de mecânca quântca 9 e varáves ndcadoras 10. As varáves seleconadas na melhor equação devem ser essencalmente ndependentes; (b) Valdação estatístca das varáves seleconadas: cada varável ncluída na melhor equação precsa ser valdada por testes estatístcos aproprados, tas como o teste F, o teste t para os coefcentes de cada varável, etc.; (c) Prncípo da parcmôna (Navalha de Occam): quando houver dúvda na escolha de um entre mutos modelos (aproxmadamente) equvalentes, deve-se escolher o mas smples; (d) Número de varáves em cada modelo: para mnmzar a ocorrênca de correlação por concdênca, deve haver, no mínmo, cerca de cnco ou ses compostos para cada varável ncluída no modelo; (e) Modelo qualtatvo para o mecansmo de ação dos compostos: é essencal que o modelo quanttatvo de relação entre estrutura e atvdade seja consstente com o mecansmo de ação, em nível molecular, dos compostos testados. A déa por detrás dessas regras era dscplnar a metodologa de elaboração de modelos de QSAR para que essa área de conhecmento, crstalzada por Hansch e colaboradores apenas nove anos antes, não caísse em descrédto pela má utlzação dos modelos matemátcos. Apesar dsso, o que se tem observado na lteratura nternaconal é que a maora dos modelos publcada ano após ano é crada sem que essas regras sejam ntegralmente aplcadas. Acredta-se que há alguns motvos predomnantes que colaboram com esse estado de cosas: (a) embora a matemátca envolvda na elaboração de um modelo de QSAR seja trval (regressão lnear múltpla), os pressupostos para sua aplcação e a nterpretação de suas conseqüêncas Z não os são. Além dsso, (b) ajustar um conjunto de dados a um modelo lnear é fácl, porém, proceder a um conjunto de testes estatístcos consstentes para fazer sua valdação requer algum conhecmento de estatístca. Mutos químcos medcnas não possuem esse conhecmento. (c) Pelo fato de ldar com modelos matemátcos muto smples, a área de QSAR costuma atrar grande número de entusastas que vêem na regressão lnear (e no seu coefcente de correlação) a ferramenta deal para produzr publcações fáces. A falta de experênca em químca medcnal certamente pode dfcultar a nterpretação aproprada dos modelos crados. Este trabalho tem como objetvo prncpal esclarecer alguns aspectos teórcos e, prncpalmente, prátcos sobre proposção, valdação e análse dos modelos matemátcos de QSAR. Pretende-se analsar as prncpas regras de proposção de modelos de QSAR à luz da estatístca e analsar alguns exemplos lustratvos. Assm, espera-se que os alunos e pesqusadores da área de QSAR, especalmente aqueles anda nexperentes, possam soldfcar seu embasamento nessa área, sejam capazes de adotar postura mas crítca em relação aos trabalhos publcados na área de QSAR e, eventualmente, possam melhorar a consstênca dos modelos matemátcos que venham a propor. METODOLOGIA Os cálculos envolvdos na construção e análse dos modelos de regressão presentes neste trabalho foram executados através do programa Buld QSAR, desenvolvdo no Departamento de Físca da UFES 11. REGRESSÃO LINEAR MÚLTIPLA Nos dversos ramos da cênca, freqüentemente deseja-se estabelecer relações quanttatvas entre um fenômeno observado e algumas varáves ndependentes que se acredtam ter relevânca na explcação do fenômeno. Em outras palavras, deseja-se construr um modelo matemátco que seja capaz de explcar o fenômeno observado e que também seja capaz de proporconar prevsões dentro e, se possível, fora dos lmtes nvestgados. Em QSAR, o fenômeno observado é a atvdade bológca e as varáves ndependentes são propredades de natureza lpofílca, eletrônca, estérea e polar. Acredtando-se que essas propredades sejam relevantes na explcação do nível de atvdade bológca, procura-se construr um modelo matemátco que estabeleça relação quanttatva entre essas grandezas. O modelo de Hansch-Fujta 7, 8, 1-14 propõe que a medda quanttatva da atvdade farmacológca ou toxcológca, genercamente desgnada de atvdade bológca, de uma sére de compostos pode ser correlaconada às suas propredades físco-químcas e estruturas através de um modelo multdmensonal lnear (eq 4) ou quadrátco (eq 5). log 1/C = a Lpofílco + b Eletrônco + c Estéreo + d Polar + e (4) log 1/C = -a Lpofílco + b Lpofílco + c Eletrônco + d Estéreo + e Polar + f (5) Nessas equações, C é a concentração molar de cada composto capaz de produzr resposta bológca defnda (tas como IC50, a concentração molar do fármaco capaz de proporconar 50% de nbção da atvdade fsológca de um sstema bológco, como por exemplo, a atvdade catalítca de uma enzma; LD100, a concentração molar do fármaco capaz de matar 100% dos ndvíduos em que é admnstrado; ED50, concentração molar do fármaco capaz de produzr 50% de seu efeto máxmo; etc.), os símbolos s são varáves que representam as propredades físco-químcas e estruturas locas (constantes de substtuntes) ou globas (propredades moleculares) de cada composto analsado e os símbolos a-f são coefcentes de ajuste. Embora a

3 660 Gaudo & Zandonade Qum. Nova eq 5 seja não lnear, o método de obtenção dos seus coefcentes é o mesmo utlzado para a obtenção dos coefcentes dos modelos lneares (eq 4). O modelo lnear é uma combnação lnear de varáves ndependentes, também chamadas explcatvas, 1,,, k, capaz de reproduzr da melhor forma possível os valores expermentas de um grupo de n observações do fenômeno (eq 6). β + β + β + + β + ε (6) = kk Na eq 6, β 0 é o termo constante de ajuste, β 1, β,, β k são os coefcentes das varáves ndependentes e ε é o erro assocado ao modelo. Em estatístca, β 0, β 1,, β k são chamados de parâmetros. Em QSAR, a desgnação parâmetro costuma ser atrbuída às varáves ndependentes, como por exemplo parâmetro lpofílco, π, parâmetro eletrônco, σ, etc. Neste trabalho, restrngr-se-á o uso do termo parâmetro às constantes β 0, β 1,, β k, enquanto que os termos b o, b 1,, b k (ver abaxo) serão referencados como estmatvas dos parâmetros ou smplesmente coefcentes da regressão. Na eq 6, são conhecdos apenas os valores de 1,,, k e e não os de ε. A natureza estocástca do modelo de regressão mplca que, para cada valor 1,,, k, em que o índce refere-se ao -ésmo objeto (composto) ncluído no modelo, haja uma dstrbução de probabldade total para os valores de. Isto sgnfca que uma dada observação nunca poderá ser exatamente prevsta. A ncerteza relatva a surge por causa da presença do erro ε. A eq 6, que também poderíamos chamar de verdadero modelo de regressão, é exata no sentdo de que se os coefcentes β e o erro ε forem conhecdos, o modelo será capaz de reproduzr exatamente o valor observado. No entanto, a determnação exata dos valores de β só pode ser feta se todos os possíves valores de forem ncluídos no modelo, o que é uma tarefa muto dfícl. Em QSAR, sso sgnfcara nclur no modelo todos os compostos com alguma atvdade sobre o sstema bológco em estudo. Na prátca sso parece nexeqüível, pos de antemão não é possível saber quantos compostos, conhecdos e desconhecdos, apresentam atvdade sobre um dado sstema. Além dsso, a determnação do erro ε é tarefa muto dfícl porque os fatores que contrbuem para o seu valor são rregulares, tas como possíves erros aleatóros nerentes ao fenômeno observado, erros expermentas na medda de e (apesar dos valores de serem supostamente sentos de erro, na prátca não o são) e a própra qualdade do ajuste do modelo, como a ausênca de varável explcatva mportante. Portanto, na prátca os parâmetros verdaderos da eq 6 permanecerão desconhecdos. Tudo o que se pode fazer é obter uma estmatva do modelo através da análse de uma amostra do conjunto de todos os objetos. Em QSAR, sso sgnfca analsar um pequeno subconjunto de compostos, dentre os ncontáves compostos, conhecdos e desconhecdos, que apresentam alguma atvdade sobre o sstema bológco em estudo, para construr uma estmatva do modelo que somente sera conhecdo se todos aqueles compostos fossem efetvamente analsados. Apesar de, tecncamente, o termo correto para referrem-se às equações de regressão, tas como as eqs. 1, e 3, seja estmatva do modelo, é usual referrem-se a essas equações apenas como modelos. Neste trabalho os autores não se esforçarão em dferencar esses termos. É mportante salentar que, em QSAR, a desgnação de modelo ou estmatva de modelo é reservada para as equações de regressão que realmente representem alguma relação entre estrutura e atvdade em que as regras de proposção de modelos de Unger e Hansch 1 tenham sdo observadas. A estmatva do modelo é uma equação capaz de fornecer valores prevstos para, que são geralmente representados por Ŷ (eq 7). Ŷ = b (7) 0 b11 b bkk Nesta equação, b 0, b 1,, b k são estmatvas para os valores dos parâmetros β 0, β 1,, β k, respectvamente. A construção da estmatva do modelo, representada pela eq 7, requer a aplcação do método dos mínmos quadrados, ou MMQ. Este consste em encontrar o conjunto de valores b 0, b 1,, b k capaz de mnmzar os desvos (ao quadrado) entre cada um dos valores observados,, e os respectvos valores prevstos, Ŷ n. Ou seja, o somatóro ( ˆ) = 1 deve ser mnmzado. A metodologa para a determnação das estmatvas dos parâmetros b s pode ser encontrada em lvros-texto báscos de estatístca 15-1 e não será dscutda aqu. Entretanto, é precso destacar alguns aspectos mportantes da construção de modelos através do MMQ. A obtenção do modelo representado pela eq 7 nca-se com a construção de um conjunto de dados contendo uma amostra de n observações, ou objetos, e m varáves explcatvas (Quadro 1). Em QSAR, sso sgnfca seleconar uma amostra de n compostos, determnar expermentalmente as respectvas atvdades e escolher um conjunto de m descrtores físcoquímcos e estruturas que se acredtam ser capazes de explcar a atvdade bológca observada. O símbolo m refere-se ao número de descrtores presentes no conjunto de dados, enquanto que o símbolo k (eq. 6) refere-se ao número de descrtores efetvamente ncluídos nos modelos de QSAR. Quadro 1. Conjunto de dados, contendo n objetos e m propredades descrtvas, necessáro à construção de modelo lnear semelhante à eq j m 1 1,1 1, 1,j 1,m,1,,j,m,1,,j,m n n,1 n, n,j n,m A construção de modelos lneares compreende alguns pressupostos báscos em relação aos componentes do modelo: (a) os valores de 1,,, m são fxos, sto é, 1,,, m não são varáves aleatóras. Apesar de mutas das varáves utlzadas em QSAR orgnarem-se de meddas expermentas, como π e σ, o erro assocado à medda ou ao cálculo dos valores dessas varáves é, em geral, consderado muto menor do que o erro assocado à medda da atvdade bológca; (b) o erro ε tem dstrbução de probabldade normal; (c) a méda de ε é gual a zero; (d) para um dado conjunto de valores 1,,, n, a varânca do erro ε é sempre constante; (e) o erro de uma observação é não-correlaconado com o erro de outra observação; (f) duas varáves ndependentes quasquer,, j, são não correlaconadas, com j. Um aspecto mportante na construção do conjunto de dados é o comportamento de, o valor observado do -ésmo objeto. Caso fossem fetas dversas meddas expermentas de, dfclmente havera mutas concdêncas. O erro expermental do processo de medção faz com que cada medda resulte num valor lgeramente dferente de, fcando todos esses valores agrupados em torno de sua méda,. Um dos plares do MMQ pressupõe que os valores obtdos em dversas medções de apresentam dstrbução normal em torno de (Fgura 1). Em QSAR, sso sgnfca dzer que a execução de dversas meddas da atvdade de um dado composto resultara numa coleção de valores que apresentara dstrbução normal em torno de sua méda. Apesar dessa suposção ser razoável, raramente vê-se comprovação expermental da dstrbução normal dos valores

4 Vol. 4, No. 5 Proposção, Valdação e Análse dos Modelos que Correlaconam Estrutura Químca e Atvdade Bológca 661 de. Quando muto, a atvdade bológca de cada composto é medda em trplcata, o que não é sufcente para observar qualquer possível padrão de dstrbução. Em geral, a acetação da hpótese da dstrbução normal dos valores de é decorrente da valdação estatístca e boquímca dos modelos de QSAR. estmatva correta para a varânca do modelo de regressão (s ) e; (c) estmar o grau de ajuste e sgnfcânca do modelo. A análse da varânca ajuda a compreender o sgnfcado de alguns dos termos que aparecem numa equação de regressão, como por exemplo R, s e F. A ANOVA é geralmente apresentada em forma de tabela e é construída com base nos valores de (observado), Ŷ (prevsto) e (méda global dos valores de ). A Fgura mostra como essas grandezas estão relaconadas para o -ésmo objeto de um conjunto de dados. Freqüênca ^ = b 0 + b 1 Fgura 1, Dstrbução dos valores obtdos em n meddas expermentas de, o -ésmo valor de. Esses valores devem apresentar dstrbução normal em torno de sua méda para que possa ser apropradamente utlzado em RLM. ^ ^ = e _ ^ _ É mportante observar que o fato de se tentar descrever um conjunto de observações expermentas através de um modelo lnear não sgnfca que essas observações possam ser bem descrtas através desse modelo. A descrção de um conjunto de observações a um modelo lnear, bem como a qualquer outro tpo de modelo, é feto por hpótese. Imagnando-se que as observações possam ser descrtas por dado modelo lnear, crase a hpótese as observações podem ser adequadamente descrtas pelo modelo lnear. Porém, acredtar-se numa hpótese não a torna necessaramente verdadera. É precso testá-la. Uma vez construído o modelo, é precso submetê-lo a testes para verfcar a veracdade da hpótese em que o mesmo está fundamentado. AVALIAÇÃO DE MODELOS LINEARES A avalação consste em verfcar se a especfcação do modelo adapta-se convenentemente aos dados observados. A avalação do modelo pode ser dvdda em três partes: (a) avalação do grau de ajuste; (b) avalação do grau de sgnfcânca e; (c) avalação do grau de prevsbldade. Avalação do grau de ajuste O grau de ajuste do modelo é meddo em termos de sua capacdade de reproduzr o valor observado dos objetos. Essa parte da avalação é feta através do cálculo do coefcente de correlação (R), do coefcente de correlação ajustado (R Ajust ), que permte comparações entre modelos com número dferente de varáves, e do desvo-padrão (s), além da análse dos. O que se espera de um modelo em relação ao grau de ajuste é que ele apresente R o mas próxmo possível de 1, que o valor de s seja o mas próxmo possível de zero e que os resíduos apresentem dstrbução normal em torno de zero. A avalação do ajuste do modelo pode ser feta através da análse da varânca (ANOVA) da regressão. Será feta breve pausa na análse da avalação dos modelos de regressão para detalhar o conteúdo da ANOVA. resíduos ( Ŷ ) Análse da varânca Os prncpas objetvos da análse da varânca são (a) verfcar se há falta de ajuste no modelo (lack of ft); (b) obter Fgura. Representação gráfca do -ésmo objeto (x, y ) de um conjunto de dados, do valor prevsto desse objeto obtdo pelo método dos mínmos quadrados ( ) e da méda dos valores observados de ( ). De acordo com a Fgura, é válda a dentdade representada pela eq 8. ( ) = ( Ŷ ) + ( Ŷ) (8) Nesta equação, ( ) é o desvo do -ésmo valor observado de em relação à méda de todos os valores de, ( Ŷ ) é o desvo do -ésmo valor prevsto de em relação à méda dos seus valores e ( Ŷ ) é o desvo entre o -ésmo valor observado de e o seu respectvo valor prevsto, também chamado de -ésmo resíduo, ou e ( e = Ŷ). Pode ser demonstrado 15 que se ambos os membros da eq 8 forem elevados ao quadrado e seus termos forem somados de = 1,,, n, o resultado será dado pela eq 9. ( Ŷ) = ( Ŷ ) + ( Ŷ) (9) A eq 9 também pode escrta da segunte forma: SS Tot = SS Reg + SS Res, em que a abrevação SS refere-se à soma dos quadrados dos desvos (sum of squares). O termo SS Tot é a varabldade total da regressão, SS Reg é a varabldade explcada pelo modelo de regressão e SS Res é a varabldade que o modelo não consegue explcar e refere-se aos resíduos. O esquema smplfcado da ANOVA é mostrado no Quadro. O Quadro mostra que o quadrado do coefcente de correlação, R = SS Reg /SS Tot, corresponde à fração da varabldade total que é explcada pelo modelo. Por exemplo, um modelo de QSAR em que R = 0,9 é dto capaz de explcar 90% da varabldade total dos valores observados da atvdade bológca, em torno de sua méda. Pode-se defnr a méda da soma dos quadrados da regressão como MS Reg = SS Reg /k e a méda da soma dos quadrados dos resíduos como MS Res = SS Res /(n-k-1).

5 66 Gaudo & Zandonade Qum. Nova Quadro. Análse da varânca (ANOVA) do modelo de regressão lnear múltpla. Fonte a df b SS c MS Regressão k ( Ŷ ) SS Reg /df Reg F = MS Reg /s Resíduo n - k - 1 ( ˆ) s = SS Res /df Res R = SS Reg /SS Tot Total n - 1 ( ) SS Tot /df Tot a df = Graus de lberdade (degrees of freedom); b SS = Soma dos quadrados (sum of squares); c MS = Méda da soma dos quadrados (mean square); Utlzando-se esta notação, defne-se o quadrado do desvo-padrão ou estmatva da varânca como s = MS Res. Como s é a razão entre a varabldade não explcada pelo modelo e o número de graus de lberdade relatvo aos resíduos da regressão, quanto maor for a varabldade dos valores de que o modelo for capaz de explcar (maor R), menor será o desvo-padrão. O teste F é defndo como F = MS Reg /s, sendo portanto uma razão entre a varabldade explcada pelo modelo e a varabldade que permanece sem explcação. Um bom modelo deve apresentar o maor valor possível para F, sendo que o valor mínmo acetável é dado por tabelas de referênca que podem ser encontradas em lvros-texto de estatístca 15,17,19. O quadrado do coefcente de correlação ajustado, ctado na Seção anteror, é calculado de acordo com a eq 10. R Ajust.1 ( R ) k 1 = R n (10) k Há uma observação mportante acerca da varânca. A varânca de um modelo de regressão, σ, somente poderá ser determnada se o verdadero modelo de regressão for construído. Como fo vsto anterormente, o verdadero modelo de regressão é o que nclu todos os possíves compostos com atvdade sobre o sstema bológco em questão (eq 6). Como sso nunca é possível, o valor de σ sempre será desconhecdo. Quando o modelo proposto é correto, a méda da soma dos quadrados dos resíduos, s, é um estmador não vesado (não tendencoso) da verdadera varânca σ. Entretanto, quando o modelo não é adequado, s estará estmando algo maor do que σ, pos na soma dos quadrados estarão ncluídos os veses devdos à nadequação do modelo. A estmatva da varânca, s, pode ser obtda através da construção da estmatva do modelo (eq 7). No entanto, a estmatva correta da varânca somente é possível em modelos onde não houver falta de ajuste 15. Em outras palavras, somente em modelos bem ajustados há possbldade de obter-se a estmatva correta da varânca. Neste ponto parece haver um paradoxo. O desvo-padrão do modelo, s, que é a raz quadrada da estmatva da varânca, é um crtéro de ajuste do modelo. No entanto, só poderemos saber se s é a estmatva correta de σ, ou seja, se s tem sgnfcado, se não houver falta de ajuste no modelo. Pode-se romper este cclo verfcando-se, em prmero lugar, a falta de ajuste do modelo proposto através da utlzação dos resíduos da regressão. Os resíduos de um modelo de regressão contêm toda a nformação necessára à compreensão dos motvos que fazem com que o mesmo não consga explcar 100% da varabldade dos valores observados de. Exstem bascamente dos motvos para que sso ocorra: (a) presença de erros aleatóros relatvos à determnação expermental dos valores de e (b) especfcação mprópra do modelo (falta de ajuste). Uma vez que os valores de tenham orgem em meddas expermentas, os erros aleatóros estarão sempre presentes e, devdo a sso, nenhum modelo consegue explcar 100% da varabldade de. Por outro lado, a especfcação do modelo é responsabldade de quem o constró. A especfcação do modelo dz respeto à sua forma fnal, ou seja, se é lnear, parabólco, exponencal, se contém termos cruzados, se o número de termos presentes é adequado, etc. Portanto, deve haver especal cudado na verfcação da falta de ajuste. Exstem duas stuações que devem ser bem caracterzadas em relação à verfcação da falta de ajuste do modelo. A prmera é quando cada valor presente no conjunto de dados fo determnado uma únca vez, ou seja, quando cada valor de for o resultado de uma medda de ponto únco. Neste caso, a verfcação da falta de ajuste pode ser feta qualtatvamente através da análse da dstrbução dos resíduos do modelo. Nos casos em que o modelo é bem ajustado, o conjunto de resíduos e contém apenas os erros aleatóros ctados anterormente. Portanto, a análse vsual gráfca dos resíduos deverá revelar um padrão estrtamente aleatóro para a dstrbução dos mesmos. Quando o modelo apresenta falta de ajuste, além dos erros aleatóros, os resíduos contêm erros sstemátcos devdos à especfcação ncorreta do modelo. A presença desses erros pode ser detectada com relatva facldade na análse vsual da dstrbução dos resíduos. A Fgura 3 mostra quatro stuações típcas encontradas na verfcação qualtatva da falta de ajuste de modelos lneares 15. Caso 1 Caso 3 Caso Caso 4 Fgura 3. Casos típcos de dstrbução de pontos encontrados na nvestgação qualtatva de falta de ajuste em modelos de regressão lnear. No Caso 1 não há falta de ajuste pos os pontos estão dspostos aleatoramente ao longo da reta ajustada. Portanto, o modelo = b b deverá ser adequado aos dados observados. O Caso Ŷ 0 + 1

6 Vol. 4, No. 5 Proposção, Valdação e Análse dos Modelos que Correlaconam Estrutura Químca e Atvdade Bológca 663 também não revela falta de ajuste. No entanto, o modelo de regressão Ŷ = b0 + b1 não apresentará sgnfcânca estatístca. Neste caso, o modelo Ŷ = será mas adequado. No Caso 3 observa-se clara falta de ajuste devdo ao padrão não aleatóro da dstrbução dos pontos e, portanto, dos resíduos. O modelo Ŷ = b0 + b1 + b11 deverá representar adequadamente os dados observados. De forma semelhante, no Caso 4 há falta de ajuste, sendo que o modelo Ŷ = b0 + b1 + b11 também poderá ajustar-se adequadamente aos dados observados. A segunda stuação é quando os valores de presentes no conjunto de dados foram determnados em replcata (duplcata, trplcata, etc.). Em QSAR, sso sgnfca fazer duas ou mas meddas expermentas da atvdade bológca para cada composto da sére. Neste caso, as repetções das meddas de podem ser utlzadas para obter a estmatva da varânca do modelo. Tal estmatva representa o chamado erro puro, pos se o conjunto de valores 1,,, k (Quadro 1) é o mesmo para duas ou mas observações, somente erros aleatóros podem nfluencar os valores de e gerar dferenças entre eles. Essas dferenças podem proporconar estmatva da varânca mas confável do que qualquer outra fonte de nformação 15. Nos casos em que os valores de forem determnados em replcata, o termo SS Res pode ser dvddo em duas partes: a soma dos quadrados devda ao erro puro do modelo, SS e, e a soma dos quadrados devda à falta de ajuste do modelo, SS LOF, sendo que SS Res = SS e + SS LOF. O termo SS LOF é determnado por dferença. O cálculo de SS e é feto de acordo com a eq 11. n n ( ) SS = (11) e = 1u= 1 u Na eq 11, u é a u-ésma repetção (u = 1,,, n ) da medda de para 1,,, k, n é o número de dferentes valores para 1,,, k, que é equvalente ao número de dferentes objetos, n é o número de repetções fetas para e é a méda das repetções 1,, n,. O esquema da ANOVA, nclundo o teste para falta de ajuste, é mostrado no Quadro 3. A verfcação da falta de ajuste de um modelo de regressão é feta através da construção da tabela ANOVA, nclundo o teste de falta de ajuste, e verfcação da sgnfcânca estatístca do valor encontrado para F LOF. Para que o valor de F LOF seja consderado sgnfcante, deverá ser maor ou gual ao respectvo valor de referênca (nível de confança de 95%), F ( df LOF, df e ), que pode ser encontrado em lvros-texto de estatístca 15,17,19. Se F LOF for sgnfcante, então há falta de ajuste no modelo construído e outro tpo de modelo deverá ser testado. Devdo à sua relevânca, torna-se mportante lustrar esse assunto com um exemplo prátco. A Tabela 1 contém um conjunto de dados com ses dervados do -bromo-etanoato, cuja atvdade bactercda em B. dphtherae fo medda em replcata. Os valores médos da atvdade (log 1/C) e os valores do coefcente de partção (log P) foram extraídos da lteratura. Os valores das repetções de log 1/C são fctícos, uma vez que, quando fetos, raramente são publcados. Na maora dos casos, os valores da atvdade bológca que aparecem nos conjuntos de dados referem-se às médas das repetções. Portanto, o conjunto de dados habtualmente encontrado na lteratura nclura apenas a méda de log 1/C e log P (colunas log 1/C Méda e log P, Tabela 1). A Tabela mostra a ANOVA para o modelo de regressão log 1/C = b 0 + b 1 log P, construída de acordo com o Quadro, em que foram consderados apenas os valores médos de log 1/C. Tabela 1. Atvdade bactercda de -bromo-etanoatos substtuídos (RCHBrCOO - ) em B. dphtherae (log 1/C) em função do logartmo de seu coefcente de partção octanol-água (log P). Os valores numércos apresentados na coluna Repetções são fctícos. R log 1/C log P Repetções Méda CH (CH ) 6 CH 3 1,3 1,53 1,60 0,3 1,95 CH (CH ) 8 CH 3,5,0 1,3,15 CH (CH ) 10 CH 3,39,50,3,1,79,61 CH (CH ) 1 CH 3 3,15 3,84 3,41 3,3 3,4 CH (CH ) 14 CH 3 3,98 4,31 4,3 4,65 4,17 4,44 CH (CH ) 16 CH 3 4,3 3,91 4,01 5,3 3,80 Quadro 3. Análse da varânca (ANOVA), nclundo o teste para falta de ajuste, do modelo de regressão lnear múltpla. Fonte a df b SS c MS Regressão k ( Ŷ ) SS Reg /df Reg F = MS Reg /s Resíduo n - k - 1 ( ) Ŷ s = SS Res /df Res R = SS Reg /SS Tot n Falta de ajuste(lof) -k -1- ( n ) n n 1 ( ) = 1 n Ŷ SS LOF /df a LOF F LOF = MS LOF /s e = 1 n Erro puro (e) ( 1) = 1 n n n ( ) = 1u= 1 u b s e = SS e /df e Total n - 1 ( ) SS Tot /df Tot a F LOF = Teste de sgnfcânca para a falta de ajuste do modelo. Se F LOF for sgnfcatvo em relação ao nível de confança estpulado, por exemplo 95%, há falta de ajuste no modelo; b s e = Estmatva correta da varânca do modelo, caso F LOF seja não sgnfcatvo;

7 664 Gaudo & Zandonade Qum. Nova Tabela. Análse da varânca (ANOVA) do modelo de regressão lnear múltpla log 1/C = b 0 + b 1 log P referente ao conjunto de dados mostrado na Tabela 1 (n = 6; k = 1). Foram utlzados os valores médos de log 1/C na construção da ANOVA. Fonte df SS MS Regressão 1 5,1955 5,1955 F = 47,4067 Resíduo 4 0,4384 s = 0,1096 R = 0,9 Total 5 5,6339 1,168 Analsando-se apenas os números que aparecem na Tabela, pode-se acredtar que log 1/C = b 0 + b 1 log P é um excelente modelo de regressão, pos R = 0,96 1, s é pequeno e F = 47,4 é grande, comparado com o valor de referênca F (1,4) = 7,71 (nível de confança de 95%). No entanto, utlzando-se as replcatas de log 1/C para construr a ANOVA, de acordo com o Quadro 3, o resultado é bem dferente (Tabela 3). Tabela 3. Análse da varânca (ANOVA), nclundo o teste de falta de ajuste, do modelo de regressão lnear múltpla log 1/ C = b 0 + b 1 log P referente ao conjunto de dados mostrado na Tabela 1 (n = 19; k = 1). Foram utlzados os valores repetdos de log 1/C na construção da ANOVA. Fonte df SS MS Regressão 1 16, ,8569 F = 107,0940 Resíduo 17,6758 s = 0,1574 R = 0,8630 Falta de ajuste 4 1,5800 0,3950 F LOF = 4,686 Erro puro 13 1,0958 s e = 0,0843 Total 18 19,537 1,085 Na construção da Tabela 3, SS e = SS e1 + SS e + + SS e6, em que SS e1 = (1,3 + 1,53 + 1,95 ) - 3 [(1,3 + 1,53 + 1,95) / 3] = 0,058, com 3-1 = graus de lberdade; SS e = (,5 +,15 ) - [(,5 +,15) / ] = 0,0050, com - 1 = 1 grau de lberdade; SS e3 = (,39 +,1 +,79 +,61 ) - 4 [(,39 +,1 +,79 +,61) / 4] = 0,194, com 4-1 = 3 graus de lberdade; SS e4 = (3,15 + 3,84 + 3,4 ) - 3 [(3,15 + 3,84 + 3,4) / 3] = 0,814, com 3-1 = graus de lberdade; SS e5 = (3,98 + 4,65 + 4,17 + 4,44 ) - 4 [(3,98 + 4,65 + 4,17 + 4,44) / 4] = 0,610, com 4-1 = 3 graus de lberdade e; SS e6 = (4,3 + 3,91 + 3,80 ) - 3 [(4,3 + 3,91 + 3,88) / 3] = 0,150, com 3-1 = graus de lberdade. Logo SS e = 0, , , , , ,150 = 1,0958 e df e = = 13. Portanto, SS LOF = SS Res - SS e = 1,6540-0,0740 = 1,5800 e df LOF = df Res - df e = = 4. Fnalmente, MS LOF = 1,5800 / 4 = 0,3950, s e = 1,0958 / 13 = 0,0843 e F LOF = 0,3950 / 0,0843 = 4,686. Na Tabela 3, s e = 0,0843 sera a estmatva correta da varânca da regressão, caso não houvesse falta de ajuste no modelo testado (log 1/C = b 0 + b 1 log P). No entanto, F LOF é maor do que o valor de referênca, F (4, 13) = 3,18, ndcando haver falta de ajuste no modelo. A explcação para a exstênca de falta de ajuste neste modelo decorre prncpalmente da atvdade bológca do composto R = CH (CH ) 16 CH 3, cujo valor, log 1/C = 4,01, sofreu quebra de lneardade em relação aos compostos anterores. Essa dmnução repentna da atvdade, por sua vez, é conseqüênca da elevada lpossolubldade do composto, que faz com que haja dfculdades no transporte e bodsponbldade do fármaco. Compostos com alta lpossolubldade tendem a fcar retdos nas membranas celulares que precsam atravessar para atngrem a bofase. Devdo à falta de ajuste verfcada no modelo log 1/C = b 0 + b 1 log P, outro tpo de modelo devera ser testado, como por exemplo o parabólco 3, log 1/C = b 0 + b 1 log P + b 11 log P, ou o blnear 4, log 1/C = b 0 + b 1 log P + b 11 log (βp + 1). No entanto, a nclusão de mas uma varável num modelo com tão poucos compostos (ses) aumenta a probabldade de ocorrênca de correlação por concdênca (regra d, ctada na Introdução deste artgo). Avalação do grau de sgnfcânca O grau de sgnfcânca é meddo através da execução de testes de valdação (teste estatístco de hpótese), sendo que cada teste destna-se a verfcar a sgnfcânca de dferentes partes do modelo. Para testar a sgnfcânca estatístca de R, aplca-se um teste de hpótese conhecdo como teste F, cujo valor é obtdo na tabela ANOVA assocada à regressão (Quadro ). O teste F verfca o quanto da varabldade de pode ser explcada pelas varáves 1,,, k, e o quanto pode ser atrbuída ao efeto do erro aleatóro ε. Para valdar R através do teste F, é precso comparar o valor de F obtdo no modelo com o valor de referênca. Este, em geral, se refere ao nível de confança de 95% e pode ser obtdo em tabelas apropradas. Por exemplo, seja um modelo lnear com as seguntes característcas: n = 0, k = 3, R = 0,85, s = 0,3 e F = 1,54. Para saber se o valor de R possu ou não sgnfcânca estatístca, é precso comparar o valor de F com o valor de referênca que, neste caso, vale F (k,n-k-1) = F (3,16) =,8. Como F > F (3,16), então R é sgnfcatvo. Os valores do teste F de dos ou mas modelos de regressão, que possuam dferentes valores de n e k, em prncípo não podem ser comparados. Por exemplo, sejam dos modelos lneares, M1 e M, com as característcas: M1 (n = 0, k = 3, R = 0,85, s = 0,3, F = 1,54) e M (n = 3, k = 4, R = 0,91, s = 0,30, F = 15,3). Apesar de M apresentar as estatístcas R, s e F superores em relação a M1, não é possível afrmar com segurança que M é mas sgnfcatvo do que M1 apenas com base nessas nformações. Nesse caso, deve-se calcular as probabldades (p-valor) assocadas aos valores de F. O p-valor fornece um meo seguro de comparação do nível de sgnfcânca de modelos com dferentes números de objetos e varáves. Um valor de p = 0,0001, sgnfca que o valor de R é estatstcamente sgnfcante e o erro envolvdo na afrmação dessa hpótese é de 0,01%. Se para M1 p = 0,0001 e para M p = 0,0005, então M1 terá maor sgnfcânca estatístca do que M. A sgnfcânca estatístca dos coefcentes da regressão é testada medante o cálculo de seus ntervalos de confança (T), geralmente referentes a um nível de confança de 95% (t). O resultado do teste é mostrado em assocação com o respectvo coefcente (eq 1). Ŷ = b 0 (± T 0 ) + b 1 (± T 1 ) b (± T ) b k (± T k ) k (1) O valor de T é calculado de acordo com a eq 13, T = s.t. ' (13) ( ) ( ) 1 n k 1,95, em que s é o desvo-padrão da regressão, t (n-k-1,95) é o valor da dstrbução t de Student para a probabldade de 95% e o argumento da raz quadrada refere-se ao elemento dagonal (lnha, coluna ) da matrz resultante da operação ndcada com a matrz das varáves ndependentes,. Se T for maor do que o valor do própro coefcente b, sgnfca que o valor b = 0 pertence ao ntervalo de confança de 95% consderado. Isso mplca em que a varável, em relação à qual b está assocada, não contrbu para a explcação da varabldade dos valores observados de. Naturalmente que quanto mas T se aproxma de b, menor será a sgnfcânca estatístca de b.

8 Vol. 4, No. 5 Proposção, Valdação e Análse dos Modelos que Correlaconam Estrutura Químca e Atvdade Bológca 665 Avalação do grau de prevsbldade O grau de prevsbldade do modelo é testado através da valdação cruzada (cross valdaton) 5-8. O processo de valdação cruzada consste nas seguntes etapas: (a) exclur um dos objetos do modelo; (b) reconstrur o modelo sem esse objeto; (c) utlzar esse modelo para calcular o valor do objeto excluído; (d) obter o desvo entre o valor observado e o valor prevsto para esse objeto; (e) refazer as etapas a-d para os demas objetos do conjunto de dados, um por vez; (f) calcular o valor da estatístca PRESS (PREdctve Sum of Squares), que corresponde à soma dos quadrados dos desvos obtdos no tem d e; (g) calcular o quadrado do coefcente de correlação da valdação cruzada (Q ) e o desvo-padrão da valdação cruzada (s PRESS ). Um modelo com elevado grau de prevsbldade para objetos não ncluídos no mesmo apresentará Q próxmo de 1 e s PRESS próxmo de zero. A forma de calcular Q e S PRESS é mostrada nas eqs ( Ŷ) PRESS = (14) Q PRESS 1 = S PRESS ( ) (15) = PRESS n k 1 (16) ANÁLISE DAS REGRAS DE ELABORAÇÃO DE MODELOS Nesta seção são analsadas as regras de elaboração de modelos e, sempre que possível, a análse de cada regra será acompanhada de exemplos lustratvos de aplcação da mesma. Seleção de varáves ndependentes Parece haver consenso no que dz respeto à utlzação de grande número de varáves explcatvas (m) na construção do conjunto de dados. Essas varáves devem abranger ampla gama de propredades (lpofílca, eletrônca, estérea e polar). Além das constantes de substtuntes utlzadas em QSAR clássco 7,8,9-33, devem-se nclur na análse propredades físco-químcas moleculares tas como área superfcal e volume moleculares 34, propredades dervadas de cálculo de orbtal molecular 9, 35-37, varáves ndcadoras 7,8,38, índces de smlardade 39-4 e índces topológcos 34. A utlzação de grandes conjuntos de dados em QSAR pressupõe a necessdade de algum tpo de método de seleção de varáves, como por exemplo, a busca sstemátca 43, as redes neuras 44-50, os algortmos genétcos e evoluconáros 43,45,51-56 e os métodos multvarados 5,45,5, Estes métodos são utlzados para detectar combnações de varáves capazes de fornecer equações de regressão com elevado coefcente de correlação, baxo desvo-padrão ou elevado teste F, e que tenham algum potencal para tornarem-se modelos de QSAR. Embora o camnho entre uma equação de regressão e um modelo de QSAR seja relatvamente longo, a seleção de varáves é um dos prmeros passos nessa dreção. Alguns conjuntos de dados que podem ser destacados por sua dmensão são os de Supuran e Clare 61 (n = 8, k = 17), Mracec e colaboradores 6 (n = 49, k = 1), Kelder e Greven 63 (n = 55, k = 4), Menzan e colaboradores 64 (n = 9, k = 7), Gaudo 65 (n = 45, k = 37), Selwood 66 (n = 31, k = 53), Cocch e colaboradores 67 (n = 40, k = 66) e Gaudo 68 (n = 36, k = 9). Pode-se lustrar o processo de seleção de varáves aplcando-se o método da busca sstemátca ao conjunto de dados que deu orgem às eqs e 3. Para sso, é necessáro estmar os valores de R, s, F e p das equações de regressão da atvdade bológca (log 1/C) em função de todas as possíves combnações das varáves π, π m, σ +, σ m e r v p. Porém, ao recalcular modelos antgos, é mportante fazer a revsão e a atualzação dos valores das constantes de substtuntes presentes no respectvo conjunto de dados. Sendo consstente com essa flosofa, construu-se a Tabela 4, que apresenta valores revsados e atualzados para essas constantes de substtuntes. Esses valores foram obtdos a partr de recentes complações de constantes de substtuntes 30, 69. A execução da busca sstemátca sobre o conjunto de dados da Tabela 4 gerou 31 equações de regressão, sendo cnco equações com uma varável, dez equações com duas varáves, dez com três varáves, cnco com quatro varáves e uma equação com cnco varáves. Os valores de R, s, F e p dessas combnações são mostrados na Tabela 5. A melhor equação com uma varável é log 1/C = f (r v p ), cuja avalação é R = 0,878, s = 0,79, F = 67,06 e p < 0, (No. 5, Tabela 5), que é capaz de explcar cerca de 77% da varabldade da atvdade. Como r v p é capaz de explcar a maor parte da varabldade da atvdade, é de esperar-se que ela também esteja presente nos melhores modelos com maor número de varáves. Assm, a melhor equação com duas varáves é log 1/C = f (π m, r v p ), cuja avalação é R = 0,936, s = 0,10, F = 67,51 e p < 0, (No. 1, Tabela 5). Da equação No. 5 para a No. 1 houve aumento do valor do coefcente de correlação e dmnução do desvo-padrão. Para construr a melhor equação com três varáves é necessáro retrar π m da equação No.1 e acrescentar as varáves π e σ +. O resultado dessa mudança é a equação log 1/C = f (π, σ +, r v p ), cuja avalação é R = 0,963, s = 0,166, F = 76,3 e p< 0, (No. 0, Tabela 5). A comparação dos valores de R, s e F das equações No. 1 e 0 ndca que a regressão No. 0 é capaz de explcar maor quantdade da varabldade de log 1/C do que a regressão No. 1, apesar daquela conter uma varável a mas do que esta. Como conseqüênca, deve ser mas vantajoso representar a atvdade bológca dos compostos da sére através de uma equação com três varáves do que com duas. O mesmo não pode ser dto ao consderarem-se as melhores equações com quatro e cnco varáves. Os resultados da Tabela 5 mostram que os modelos com mas de três varáves não são capazes de melhorar a explcação da atvdade bológca em relação à equação No. 0. Dessa forma, o resultado da busca sstemátca ndca que a atvdade dos compostos da sére poderá ser representada por uma equação de três varáves. Isso não quer dzer que essa equação seja a de No. 0, pos há outras equações com três varáves que possuem avalações equvalentes, como por exemplo as equações No. 16, 3 e 4. Avalações mas aprofundadas deverão ser executadas sobre essas equações para decdr-se qual é a equação de melhor qualdade estatístca. É mportante verfcar o grau de correlação entre as varáves ao proceder-se à seleção de varáves. A construção de modelos através do MMQ exge que as varáves presentes num dado modelo sejam essencalmente ndependentes. Além de descreverem a mesma propredade, duas ou mas varáves altamente correlaconadas geram problemas de dependênca lnear no conjunto de dados e mprecsão numérca na construção do modelo. É nteressante frsar que a construção de modelos de QSAR através de métodos multvarados, como PCR (Prncpal Component Regresson) e PLS (Partal Least Squares) 70, não é prejudcada pela presença de correlação elevada entre as varáves. O grau de correlação entre as varáves é verfcado através da construção da matrz de correlação. A matrz de correlação das varáves ndependentes da Tabela 4 é mostrada na Tabela 6, que revela que as úncas varáves que não devem ser combnadas numa mesma equação são σ + e σ m, pos apresentam coefcente de correlação gual a 0,70. No exemplo de seleção de varáves acma (Tabela 5), as equações de três varáves seleconadas para posteror estudo, ou seja Nos. 16, 0, 3 e 4, não ncluem essas varáves smultaneamente.

9 666 Gaudo & Zandonade Qum. Nova Tabela 4. Conjunto de dados utlzado por Unger e Hansch 1 na dedução da eq. Os valores publcados orgnalmente foram revsados e atualzados partr de recentes complações de constantes de substtuntes 30,69. No Substtunte log 1/C Obs π π m σ + σ m p r v a log 1/C Calc Res. 1 H 7,46 0,00 0,00 0,00 0,00 1,0 7,80-0,34 4-F 8,16 0,14 0,00-0,07 0,00 1,47 8,05 0, Cl 8,68 0,71 0,00 0,11 0,00 1,75 8,48 0,0 4 4-Br 8,89 0,9 0,00 0,15 0,00 1,85 8,67 0, 5 4-I 9,5 1,1 0,00 0,14 0,00 1,98 8,91 0, Me 9,30 0,58 0,00-0,31 0,00 1,97 8,85 0, F 7,5 0,14 0,14 0,35 0,34 1,0 7,53-0, Cl 8,16 0,71 0,71 0,40 0,37 1,0 8,1 0, Br 8,30 0,9 0,9 0,41 0,39 1,0 8,34-0, I 8,40 1,1 1,1 0,36 0,35 1,0 8,63-0, Me 8,46 0,58 0,58-0,07-0,07 1,0 8,55-0, Cl, 4-F 8,19 0,85 0,71 0,33 0,37 1,47 8,36-0, Br, 4-F 8,57 1,06 0,9 0,34 0,39 1,47 8,59-0, Me, 4-F 8,8 0,7 0,58-0,14-0,07 1,47 8,80 0,0 15 3,4-Cl 8,89 1,4 0,71 0,51 0,37 1,75 8,79 0, Br, 4-Cl 8,9 1,63 0,9 0,5 0,39 1,75 9,0-0, Me, 4-Cl 8,96 1,9 0,58 0,04-0,07 1,75 9,3-0, Cl, 4-Br 9,00 1,63 0,71 0,55 0,37 1,85 8,98 0,0 19 3,4-Br 9,35 1,84 0,9 0,56 0,39 1,85 9,1 0, Me, 4-Br 9, 1,50 0,58 0,08-0,07 1,85 9,4-0,0 1 3,4-Me 9,30 1,16 0,58-0,38-0,07 1,97 9,60-0,30 3-Br, 4-Me 9,5 1,50 0,9 0,10 0,39 1,97 9,39 0,13 a Calculado através da eq. Tabela 5. Resultado da seleção de varáves através de busca sstemátca executada sobre o conjunto de dados mostrado na Tabela 4. Modelos com dferentes números de varáves estão separados pelas lnhas horzontas. No. π π m σ + σ m p r v R s F p < 1 0,760 0,379 7,9 0, ,06 0,570 0,88 0, ,15 0,575 0,48 0, ,134 0,577 0,37 0, ,878 0,79 67,06 0, ,844 0,30 3,57 0, ,93 0,17 6,54 0, ,874 0,90 30,8 0, ,94 0,8 55,87 0, ,364 0,556 1,45 0, ,406 0,546 1,88 0, ,936 0,10 67,51 0, ,153 0,590 0,3 0, ,878 0,86 31,88 0, ,879 0,85 3,9 0, ,953 0,186 59,15 0, ,886 0,85 1,86 0, ,936 0,15 4,76 0, ,93 0,3 39,53 0, ,963 0,166 76,3 0, ,939 0,11 44,69 0, ,409 0,560 1,1 0, ,953 0,187 58,77 0, ,959 0,174 68,56 0, ,881 0,91 0,73 0, ,964 0,167 56,55 0, ,963 0,170 54,53 0, ,959 0,179 48,57 0, ,964 0,169 55,33 0, ,959 0,178 48,97 0, ,964 0,17 4,65 0,000001

10 Vol. 4, No. 5 Proposção, Valdação e Análse dos Modelos que Correlaconam Estrutura Químca e Atvdade Bológca 667 Tabela 6. Matrz de correlação, em termos de R, das varáves ndependentes da Tabela 4. As úncas varáves que apresentam alto grau de correlação são σ + e σ m. Valdação estatístca das varáves seleconadas É fundamental que testes de avalação do modelo e das varáves seleconadas sejam executados. A avalação mínma que se exge para um modelo de regressão lnear envolve os seguntes testes. (a) Verfcação do grau de ajuste do modelo, que envolve o cálculo do coefcente de correlação (R) e do desvo-padrão (s), análse do gráfco da atvdade observada em função da atvdade prevsta pelo modelo ( x Ŷ) e do gráfco dos resíduos da regressão em função da atvdade observada ( - Ŷ) x Ŷ) ; (b) verfcação do grau de sgnfcânca do modelo, que envolve o cálculo do teste F (95% confança), cálculo do p-valor relatvo ao resultado do teste F e cálculo do ntervalo de confança dos coefcentes da regressão (95% de confança) e; (c) verfcação do grau de prevsbldade do modelo, através da execução do teste de valdação cruzada e o subseqüente cálculo do coefcente de correlação (Q ) e do desvo padrão (s PRESS ) das prevsões. Como exemplo de avalação estatístca de uma equação de regressão lnear, pode-se avalar o própro modelo apresentado por Unger e Hansch 1 (eq 3) como alternatva ao modelo de Cammarata (eq ). A eq 17 corresponde à versão recalculada da eq 3, em que podem ser notadas pequenas alterações em sua forma orgnal. A avalação da eq 17 é apresentada a segur. log 1/C = 1,14 (±0,1) π - 1,5 (±0,40) σ ,80 (±0,1) (17) (n = ; R = 0,93; s = 0,17; F = 6,54; p < 0,000001; Q = 0,808; s PRESS = 0,6) Análse do grau de ajuste π π m σ + σ m R v p π 1,000 0,413 0,19 0,17 0,361 π m 1,000 0,6 0,419 0,018 σ + 1,000 0,70 0,035 σ m 1,000 0,043 p R v 1,000 O modelo de regressão representado pela eq 17 é capaz de explcar cerca de 87% da varabldade dos valores observados da atvdade (R 100), o que é um excelente nível de ajuste. A excelênca do ajuste é confrmada pelo baxo valor do desvopadrão (s = 0,17). Esses valores podem ser objetvamente analsados em termos de dos gráfcos: log 1/C Obs em função de log 1/C Prev e resíduos da regressão em função de log 1/C Obs (Fgura 4). No gráfco da atvdade observada em função da atvdade prevsta (Fgura 4a) é mportante observar o alnhamento dos pontos em relação à reta ajustada, bem como a dstrbução dos pontos ao longo do ntervalo de valores de atvdades estudado. Caso haja agrupamento de pontos em certas regões do gráfco e/ou pontos solados, prncpalmente nos extremos do gráfco, deve-se estudar com cudado o mpacto que a presença desses pontos tem sobre a estrutura da equação de regressão. A reconstrução do modelo na ausênca desses pontos deverá fornecer dados mportantes sobre sso. Na Fgura 4a, observa-se que, dos compostos estudados, 10 estão fora da área delmtada pelas lnhas tracejadas, que corresponde à regão do gráfco onde exste 95% de probabldade de passar a verdadera reta do gráfco log 1/C Obs em função de log 1/C Prev. Entretanto, oto dos compostos fora da regão tracejada encontram-se bem próxmos a ela. Apenas dos compostos apresentam desvos aprecáves, sendo eles os compostos 5 (4-I) e 6 (4-Me), cujos resíduos são, respectvamente, 0,34 e 0,45. Compostos que apresentam grandes resíduos num modelo de regressão são denomnados outlers. Na maora dos casos observados na lteratura, a detecção da presença de outlers é sucedda pela exclusão dos compostos correspondentes e pelo recálculo da equação. Este costuma ser o destno dos outlers, pos sua exclusão fatalmente melhora o grau de ajuste da equação. Pode ser mportante analsar o motvo do não ajuste de um outler a dado modelo, pos acredta-se que, assm fazendo, nformações mportantes sobre o mecansmo de ação dos compostos da sére podem ser obtdas 7,14. Na Fgura 4b, deve-se observar a dstrbução dos resíduos em torno de zero, que corresponde à lnha horzontal central. Espera-se que um modelo adequado aos dados observados tenha seus resíduos aleatoramente dspersos em torno de zero. E é exatamente sso o que se observa na Fgura 4b. log 1/C Obs Resíduos 10,0 9,6 9, 8,8 8,4 8,0 7,6 7, 7, 7,6 8,0 8,4 8,8 9, 9,6 10,0 0,6 0,4 0, 0,0-0, log 1/C Prev (a) -0,4 7, 7,6 8,0 8,4 8,8 9, 9,6 10,0 log 1/C Prev (b) Fgura 4. (a) Atvdade bológca observada em função da atvdade prevsta; (b) resíduos da regressão em função da atvdade prevsta. As lnhas tracejadas delmtam a regão dentro da qual o valor prevsto da atvdade dfere, no máxmo, 5% em relação ao valor observado. Grau de sgnfcânca do modelo O valor de referênca do teste F para um nível de confança de 95% (p = 0,05) é F (k, n-k-1) = F (, 19) = 3,5. Como o teste F da eq 17 (F = 6,54) é bem maor do que o correspondente valor de referênca (F (, 19) = 3,5), o nível de sgnfcânca do modelo também é bem maor do que 95%. Na verdade, como p < 0,000001, o nível de sgnfcânca do modelo é maor do que 99,9999%. Analsando-se o ntervalo de confabldade dos coefcentes, percebe-se que todos os coefcentes da regressão são sgnfcatvos, no nível de confança equvalente a 95%. Essa constatação decorre do fato de que os ntervalos de confança, mostrados entre parênteses juntos aos respectvos coe-

11 668 Gaudo & Zandonade Qum. Nova fcentes, apresentam valores nferores aos dos própros coefcentes. Por exemplo, o coefcente de π é 1,14 e seu ntervalo de confança é ±0,1. Portanto o valor verdadero desse coefcente, que se está tentando descobrr ao construr a equação de regressão, é algum valor entre 1,14-0,1 = 0,93 e 1, ,1 = 1,35, com 95% de probabldade. Caso o ntervalo de confança fosse maor do que o própro valor do coefcente, o ntervalo nclura o valor zero para o coefcente. Grau de prevsbldade do modelo Valores de Q próxmos à undade e de s PRESS próxmos a zero revelam alto grau de prevsbldade do modelo. Infelzmente não exstem regras que estabeleçam, em termos absolutos, se o grau de prevsbldade é bom ou rum a partr do valor de Q e s PRESS. Estes valores têm muto mas utldade quando se deseja comparar a capacdade de prevsão de dos modelos: o que possu maor Q e menor s PRESS possu maor grau de prevsbldade. Na eq 17, o valor de Q (0,808) é muto mas próxmo da undade do que de zero, ndcando bom poder de prevsão. Prncípo da parcmôna Trata-se de um prncípo fundamental que pode ser utlzado em todas as áreas da cênca. Em QSAR, é comum dsporse de mas de uma possbldade em termos de modelos para a escolha daquele que será consderado o melhor modelo de relação estrutura-atvdade. A necessdade da escolha de uma entre váras opções de modelos, aproxmadamente equvalentes, cra dúvdas em relação a qual deve ser consderado o melhor. Naturalmente que, em se tratando de modelos com o mesmo número de varáves explcatvas, deve-se dar preferênca para a equação que apresentar a melhor avalação (maor R, menor s, maor F, etc.). Nos casos em que os modelos possuírem dferentes números de varáves explcatvas, o prncípo da parcmôna aconselha a escolha do modelo com menor número de varáves. Mas é precso lembrar que esse prncípo deve ser aplcado somente quando se comparam modelos aproxmadamente equvalentes. Como saber se dos modelos com número de varáves dferentes são equvalentes se, nesses casos, os valores de R, s e F não podem ser dretamente comparados? Em stuações como essas, o coefcente de correlação ajustado (R Ajust, eq 10) e o p-valor são mas adequados à comparação, pos seus valores consderam correções para o número de varáves e para o número de compostos utlzados. Assm, a equação preferda sera aquela com o maor R Ajust e o menor p-valor. Como exemplo da aplcação do prncípo da parcmôna, podem-se comparar as eqs (Cammarata) e 3 (Unger e Hansch), recalculadas, supondo-se que ambas possam explcar adequadamente a atvdade dos compostos da sére (como fo dto na Introdução deste trabalho, sso não é verdade). Para sso, é necessáro recalcular a eq, da mesma forma como fo feto para a eq 3. Utlzando-se os dados da Tabela 4, o modelo de Cammarata passa a ser representado pela eq 18. log 1/C = 0,74 (±0,7) π m - 0,75 (±0,50) σ m + 1,67 (±0,7) r v p + 5,75 (±0,47) (18) (n = ; R = 0,959; s = 0,174; F = 68,55; p < 0,000001; Q = 0,874; s PRESS = 0,18) A pergunta é: qual, dentre as eqs 17 e 18, deve ser consderada como sendo a melhor? O prncípo da parcmôna dz que entre dos modelos (aproxmadamente) equvalentes devese optar pelo mas smples. Segundo esse prncípo, a eq 17 deve ser escolhda como sendo a melhor, pos contém uma varável a menos. No entanto, embora o julgamento do que seja mas smples seja relatvamente fácl, o julgamento do que seja (aproxmadamente) equvalente pode não ser. Para decdr sobre a equvalênca da qualdade estatístca das eqs 17 e 18, deve-se proceder à avalação das mesmas. A segur é mostrado o resultado dessa avalação. Análse do grau de ajuste Não é possível comparar os coefcentes de correlação das eq 17 (R = 0,93) e 18 (R = 0,959), pos essas equações possuem dferentes números de varáves. Neste caso, é precso comparar os coefcentes de correlação ajustados das duas equações. A eq 17 possu R Ajust = 0,94 enquanto que a eq 18 possu R Ajust = 0,95. Isso sgnfca que a eq 18 (Cammarata) possu maor grau de ajuste. Análse do grau de sgnfcânca Também não é possível comparar os valores dos teste F das eq 17 (F = 6,54) e 18 (F = 68,55), devdo ao número dferente de varáves envolvdas. É precso comparar o p-valor das duas equações. A eq 17 possu p < 0, e a eq 18 também possu p < 0, Assm, ambas as equações possuem aproxmadamente o mesmo grau de sgnfcânca. Análse do grau de prevsbldade A eq 17 possu Q = 0,808 e s PRESS = 0,6, enquanto que a eq 18 possu Q = 0,874 e s PRESS = 0,18. Portanto, a eq 18 (Cammarata) possu maor capacdade de fazer prevsões acerca da atvdade bológca de compostos não ncluídos no conjunto de dados do que a eq 17 (Unger e Hansch). Portanto, conclu-se que a eq 18 é superor à eq 17 em termos de ajuste e prevsbldade e é equvalente à eq 17 em termos de sgnfcânca. Em termos estatístcos, a conclusão óbva é que a eq 18 (Cammarata) é melhor do que a eq 17 (Unger e Hansch), mesmo tendo aquela uma varável a mas do que esta. Mas cabe outra pergunta: será que a superordade estatístca da eq 18 é tal que a torna não-equvalente à eq 17? Esta pergunta, como mutas outras semelhantes, não tem resposta exata pos não se dspõe de uma tabela contendo valores de referênca para auxlar a tomada de decsão. Porém, deve-se notar que, ao menos ntutvamente, os valores de R Ajust e Q das duas equações são próxmos (os desvos de R Ajust e Q, relatvos aos seus maores valores nas eqs 17 e 18, são % e 8%, respectvamente) e, não sendo muto exgente, podem-se consderá-las estatstcamente equvalentes. Uma vez consderadas equvalentes, aplca-se o prncípo da parcmôna. Neste caso, a melhor equação é a eq 17, pos é mas smples. Mas cabe uma observação fnal. O fato da eq 18 não ser consstente com o mecansmo de ação dos compostos envolvdos 1, torna a mesma não equvalente à eq 17, sendo, portanto, desnecessára a aplcação do prncípo da parcmôna. Pela nconsstênca com o mecansmo de ação, a eq 18 não podera se tornar um modelo de QSAR. Como fo dto anterormente, a análse comparatva das eqs 17 e 18 fo feta desprezando-se essa observação. Outra análse deste mesmo caso fo feta por Kubny 7. Número de varáves em cada modelo Baseado no trabalho de Toplss e Costello 71, Unger e Hansch 1 sugerem que, para cada varável explcatva ncluída em modelos de QSAR, devem haver, no mínmo, cerca de cnco ou ses compostos. Essa regra tenta evtar a ocorrênca de correlação por concdênca. No entanto, Kubny 7 ressalta que, para conjuntos de dados com poucos compostos, pode-se volar essa regra de forma controlada (por exemplo nclundo-se duas varáves quando se dspõe de apenas oto compostos), desde que a avalação do modelo justfque a presença dessas

12 Vol. 4, No. 5 Proposção, Valdação e Análse dos Modelos que Correlaconam Estrutura Químca e Atvdade Bológca 669 varáves. Além dsso, Kubny acrescenta que a dsponbldade de mutos compostos pode gerar modelos com grande número de varáves (um conjunto de dados com 36 compostos permtra a construção de modelos com sete varáves, o que pode ser um exagero), aumentando a probabldade de ocorrênca de correlação por concdênca. Enfm, vale dzer que esta é apenas uma regra geral. Serve apenas para guar os autores com pouca experênca em estatístca na elaboração de modelos de QSAR baseados em regressão lnear múltpla. Exemplo extremo de utlzação dessa regra é fornecdo por Km e colaboradores 7, que analsaram a atvdade antmalaral em ratos de nada menos do que 646 compostos dervados de fenantrenos, qunolnas e prdnas (eq 19, em que não será menconado o sgnfcado das varáves ctadas). log 1/C = 0,576 (+0,09) σ + 0,168 (+0,05) π + 0,105 (+0,05) log P - 0,167 (+0,07) log (βp + 1) - 0,169 (+0,10) c-sde + 0,319 (+0,136) CNR - 0,139 (+0,06) AB - 0,795 (+0,06) <3-cures + 0,78 (+0,11) MR-4 - (19) Q + 0,5 (+0,18) Me-6,8-Q + 0,084 (+0,10) -Pp + 0,151 (+0,19) NBrPy - 0,683 (+0,) QP ,67 (+0,11) Py +,76 (+0,15) (n = 646; R = 0,898; s = 0,309; log b = -3,959; log P Ótmo = 4,19) Neste modelo foram ncluídas 14 varáves, número que certamente é justfcado pela mensa quantdade de compostos analsados. Se a eq 19 for consstente com algum mecansmo de ação, fato que os autores não analsaram, esse mecansmo deverá ser extremamente complexo. Pode-se afrmar com alguma segurança que a eq 19 é o mas complexo modelo de QSAR já apresentado na lteratura. A lteratura também apresenta algumas equações que devem servr de exemplo negatvo quanto ao número de varáves explcatvas em relação ao número de compostos analsados. É o caso da eq 0, construída por Jha e colaboradores 73 para explcar a atvdade antneoplásca de dervados do ácdo glutâmco. log % ITW = 1,4111 (log P) - 0,5971 log P - 0,1714 π Al - 3,93 σ Al + 0,9595 E s Al - 6,6199 σ I + 1,349 (0) (n = 8; R = 0,991; s = 0,0310) Na eq 0, nota-se a presença de ses varáves explcatvas numa equação envolvendo apenas oto compostos. Pode-se observar que os autores avalaram apenas o grau de ajuste da equação (cálculo de R e s). A avalação do grau de sgnfcânca da equação certamente revelara que a mesma não possu qualdade estatístca mínma e, portanto, não pode representar um modelo de QSAR. Kubny 7 apontou outros erros nessa equação: (a) atvdade bológca em escala mprópra (escalas acetas são log 1/C, C = IC50, ED50, LD100, etc.; log 1/K, K = constante de nbção enzmátca; log k, k = constante cnétca ou de equlíbro de uma reação; etc.) ; (b) pequena varabldade dos valores da atvdade (a dferença entre o composto mas atvo e o menos atvo é de apenas 0,4 undade logarítmca; o mínmo aconselhável é cerca de duas undades logarítmcas); (c) snal dos coefcente de (log P) e log P ncorretos (parábola nvertda); (d) desvo-padrão nconsstente com o tpo de atvdade (modelos que descrevem a atvdade antneoplásca costumam gerar valores de s >> 0,3); (e) não há ntervalo de confança para os coefcentes; (f) casas decmas em excesso. Outro exemplo de aberração fo publcado recentemente por Kong e colaboradores 74 (eq 1). log EC 50 = 0,116 log K ow -,50 E homo - 6,69 E S + + 3,11 π - 0, χ ν (1) (n = 4; R = 0,99; s = 0,7) Nessa equação percebe-se que o número de varáves explcatvas excede o número de compostos (!). Neste caso, não é possível sequer fazer testes de avalação do grau de sgnfcânca e de prevsbldade da equação, pos não há graus de lberdade dsponíves. Alás, embora o cálculo dos coefcentes da equação e do coefcente de correlação anda sejam possíves, o cálculo do desvo-padrão não o é. De acordo com o Quadro, s = SS Res /(n-k-1) e, nesse caso, n-k-1 = -, mplcando em s < 0 (!). O número de graus de lberdade para o cálculo do desvo-padrão (n-k-1) pressupõe a exstênca de um termo constante na equação de regressão (b 0 ), que não fo ncluído na eq 1. Modelo qualtatvo para o mecansmo de ação dos compostos Além da valdação estatístca, é fundamental que uma equação de regressão que pretende ser promovda a modelo de QSAR deve ser valdada em termos de sua capacdade de explcação do mecansmo de ação dos compostos da sére analsada. É o caso da eq 3, que é consstente com o mecansmo de Iníco N Conjunto de dados Seleconar varáves Consstente com o mecansmo de ação? S Compor equações de QSAR Elmnar equação N Faz prevsões fora da sére? E statstcamente sgnfcatva? N S S N Acomoda compostos análogos? Fgura 5, Esquema geral de proposção de modelos de QSAR. Modfcar equação S Modelo acetável Fm

13 670 Gaudo & Zandonade Qum. Nova bloqueo da atvdade adrenérgca exercdo pelas β-halo-βarlalqulamnas 1, mostrado na Introdução deste trabalho. Pode-se resumr o conteúdo desta seção através de um dagrama de blocos mostrando as prncpas etapas da elaboração de modelos de QSAR (Fgura 5). Nesse esquema percebe-se o camnho relatvamente longo entre a construção da equação de regressão e o modelo propramente dto. Para ser consderada como um modelo de QSAR, além de ser estatstcamente acetável, a equação precsa ser consstente com algum mecansmo de ação acetável para os compostos da sére, caso contráro deverá ser descartada. Também a equação deverá ser capaz de fazer prevsões fora da sére de compostos testada. Esse aspecto nem sempre é felmente verfcado pos mplca na síntese de compostos adconas. O que se costuma fazer é utlzar o resultado da valdação cruzada como verfcação da capacdade de prevsão da equação. Fnalmente, a equação deverá ser capaz de acomodar compostos com estrutura semelhante aos já ncluídos na sére sem que a equação seja aprecavelmente modfcada. CONCLUSÕES A proposção de modelos quanttatvos de relações entre estrutura químca e atvdade bológca é baseada nas cnco regras geras de proposção de modelos de Unger e Hansch 1 : (a) seleconar as varáves ndependentes do modelo dentre grande número de varáves; (b) valdar estatstcamente as varáves seleconadas; (c) aplcar o prncípo da parcmôna; (d) cada modelo deve apresentar cerca de cnco compostos para cada varável ndependente e; (e) o modelo deve ser consstente com o mecansmo de ação dos compostos. A valdação estatístca das equações de regressão lnear é feta através da avalação do modelo, dvdda em três níves: (a) avalação do grau de ajuste; (b) avalação do grau de sgnfcânca e; (c) avalação do grau de prevsbldade da equação. Em cada uma das etapas da avalação, testes estatístcos específcos são executados e seus resultados avalados. Uma equação de regressão que sobrevve às regras de proposção de modelos e à avalação completa pode ser promovda a modelo quanttatvo de relação estrutura-atvdade. AGRADECIMENTOS Os autores agradecem à Pró-Retora de Pesqusa e Pós- Graduação da Unversdade Federal do Espírto Santo, PRPPG- UFES, e ao Conselho Naconal de Desenvolvmento Centífco e Tecnológco, CNPq, pelo auxílo fnancero. REFERÊNCIAS 1. Unger, S. H.; Hansch, C.; J. Med. Chem. 1973, 16, Hansch, C.; Len, E. J.; Bochem. Pharmacol. 1968, 17, Graham, J. D. P.; Karrar, M. A.; J. Med. Chem. 1963, 6, Fujta, T.; Hansch, C.; Iwasa, J.; J. Am. Chem. Soc. 1964, 86, Hammett, L. P.; J. Am. Chem. Soc. 1937, 59, Cammarata, A.; J. Med. Chem. 197, 15, Kubny, H.; QSAR: Hansch Analyss and Related Approaches. In: Methods and Prncples n Medcnal Chemstry; R. Mannhold, P. Krogsgaard-Larsen e H. Tmmerman Eds.; Vol. 1; VCH; Wenhem, Gaudo, A. C.; Qum. Nova 1996, 19, Karelson, M.; Lobanov, V. S.; Katrtzky, A. R.; Chem. Rev. 1996, 96, Kubny, H.; J. Med. 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