INTRODUÇÃO MATERIAS E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO

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1 Comparação do período de carência em tecidos e leite bovino após administração de enrofloxacino e diclofenaco sódico (Quinotril Plus ) em diferentes vias parenterais 1 Aparecida Martinez Mangerona, Gerente P&D de Farmacêuticos e Testes Clínicos Vallée S.A, Montes Claros, MG, BRASIL. 2 Otto Domenici Mozzer, Diretor Técnico Vallée S.A, Montes Claros, MG, BRASIL. 3 Renato Ferreira Vieira, Gestor de Testes Clínicos Vallée S.A, Montes Claros, MG, BRASIL. 4 Cecília Ribeiro Dias, Analista P&D Vallée S.A, Montes Claros, MG, BRASIL. 5 Daniel Rossi Cappelini, Nanocore Biotecnologia S.A, Campinas, SP, BRASIL. INTRODUÇÃO MATERIAS E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONCLUSÃO INTRODUÇÃO O enrofloxacino pertence ao grupo dos antimicrobianos quinolonas e foi desenvolvido para uso exclusivo em Medicina Veterinária (Chu & Fernandes, 1989) enquanto que, seu principal metabólito ativo, o ciprofloxacino, é comumente utilizado em Medicina Humana (Emea, 1999). Este fármaco apresenta um amplo espectro antimicrobiano, eficaz contra bactérias gram-positivas e gram-negativas (Plumb, 1999; Idowu et al., 2010; Mitchell, 2006). Com relação à farmacocinética, as quinolonas apresentam melhor biodisponibilidade em monogástricos quando administradas por via oral, enquanto que em ruminantes há necessidade da administração por via parenteral (Rahal et al., 2007). O objetivo do estudo foi avaliar o período de carência do enrofloxacino e do diclofenaco sódico em tecidos e leite de bovinos tratados com o produto Quinotril Plus. Para o estudo de resíduo em tecidos foram formados três grupos de animais (IV, IM- U e IM-M) cujas avaliações foram realizadas nos tempos de 7 a 35 dias após o último tratamento. Para avaliação do resíduo em leite, foram formados três grupos (IV, IM-U e IM-M) cujas coletas foram realizadas nos tempos de 0 a 240 horas após o tratamento. Houve diferença entre as vias avaliadas para o período de retirada do diclofenaco sódico em leite (IV: 4 dias; IM-U: 8 dias; IM-M: 9 dias) e tecidos (IV: 8 dias; IM-U: 44 dias; IM-M: 39 dias). Para o enrofloxacino, também foi observada diferença entre as vias avaliadas quanto ao leite (IV: 2 dias; IM-U: 7 d; IM-M: 4 dias), porém em tecidos não houve diferença no período de retirada (8 dias). A. M. MANGERONA 1 ; O. D. MOZZER 2 ; R. F. VIEIRA 3 ; C. R. DIAS 4 ; D. R. CAPPELINI 5 Anti-inflamatórios não esteroidais, como o diclofenaco, são comumente associados a antimicrobianos por apresentarem, a partir desta associação, interações farmacocinéticas de interesse veterinário, proporcionando elevada eficácia terapêutica (Rahal et al., 2008). Nos últimos anos, problemas de segurança nos alimentos de origem animal tornaram-se recorrentes sendo essencial a determinação do período de carência em função do produto veterinário utilizado. O período de carência visa garantir que tais alimentos não contenham resíduos que excedam os limites máximos residuais (LMR) preconizados (Riviere, 2011). Devido a esta necessidade, o presente estudo teve por objetivo estabelecer o período de carência para o leite e para tecidos (fígado, gordura, músculo e rim) destinados ao consumo humano após o tratamento de bovinos com o produto farmacêutico, Quinotril Plus, à base de enrofloxacino e diclofenaco sódico, observando-se os valores de LMR preconizados pelo EMEA. 13 HV196-final.pmd 13

2 MATERIAS E MÉTODOS O estudo foi conduzido em fazenda experimental localizada no município de Esmeraldas, região metropolitana de Belo Horizonte/MG no período de junho a dezembro de Experimento 1 No estudo de resíduo em leite, foram utilizadas 60 fêmeas cruzadas (Girolando), peso corporal médio de 453 ± 74 kg em diferentes fases de lactação. Os animais foram estratificados de acordo com a ordem crescente de peso para receber um dos seguintes tratamentos: 1) Intravenoso (IV) (n=20), aplicação da dose de 2,5 mg de enrofloxacino / kg de peso vivo e 0,375 mg de diclofenaco sódico / kg de peso vivo, equivalente a 1 ml do produto para cada 40 kg de peso vivo durante três dias consecutivos, a cada 24 horas; 2) Intramuscular (IM-U) (n=20), aplicação da dose de 10 mg de enrofloxacino / kg de peso vivo e 1,5 mg de diclofenaco sódico / kg de peso vivo, equivalente a 1 ml do produto para cada 10 kg de peso vivo; e, 3) Intramuscular (IM-M) (n=20), aplicação de 2,5 mg de enrofloxacino / kg de peso vivo e 0,375 mg de diclofenaco sódico / kg de peso vivo, equivalente a 1 ml do produto para cada 40 kg de peso vivo durante três dias consecutivos, a cada 24 horas. Em ambos os experimentos, os animais do grupo IM receberam o medicamento na musculatura glútea. Já na administração pela via intravenosa, os animais foram submetidos ao tratamento com o produto Quinotril Plus pela veia mamária. Para a realização dos testes de determinação do período de carência em leite, foram colhidas duas amostras de 50 ml (prova e contraprova) em cada momento de coleta de cada animal. As coletas das amostras foram realizadas nas ordenhas referentes aos tempos 0 (imediatamente antes do início do tratamento), 12, 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168, 192, 216 e 240 horas após o término do tratamento. As amostras coletadas foram encaminhadas ao Laboratório Nanocore Biotecnologia S/A, localizado em Campinas-SP onde foram determinadas as concentrações do diclofenaco, enrofloxacino e ciprofloxacino utilizando-se metodologia analítica validada para os fármacos por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC/MS/MS) de acordo com a resolução n 899/2003 da ANVISA (BRASIL, 2003). Para avaliação do período de carência do leite, os dados foram submetidos ao método Time-to-safe-concentration TTSC method, assumindo uma distribuição log-normal corrigida por regressão monotônica. O cálculo foi realizado com um intervalo de confiança de 95% empregando-se o software MELK WTM 1.4 do EMEA. Experimento 2 Para o estudo de resíduo em tecidos foram selecionados 75 bovinos mestiços sendo a proporção machos:fêmeas do experimento de 3:2, média de peso vivo de 243,9 ± 41 kg e 12 a 36 meses de idade. Os animais foram divididos em três grupos (IV, IM-U e IM-M) (n=25) e cada grupo, tratado conforme as definições de dose supracitadas no experimento 1. Em cada um dos tratamentos, cinco animais foram escolhidos aleatoriamente para serem abatidos nos tempos 7, 14, 21, 28 e 35 d após a última aplicação do produto Quinotril Plus. Os animais foram abatidos de acordo com os princípios de boas práticas para o abate humanitário. Posteriormente a coleta dos tecidos, as amostras de fígado, rins, músculo e gordura foram processadas, condicionadas em sacos plásticos e estocadas a temperatura inferior a -20ºC até a realização das análises laboratoriais. As amostras de tecidos foram encaminhadas ao Laboratório Nanocore Biotecnologia S/A onde foram determinadas as concentrações do diclofenaco, enrofloxacino e ciprofloxacino conforme experimento 1. Os dados obtidos a partir da análise de tecidos foram submetidos à estatística por regressão linear utilizando o software - Withdrawal-Time Calculation Program (WT EMEA). Quando não houve o mínimo de três pontos de abate distintos com no mínimo três animais apresentando concentrações residuais mensuráveis, e quando as premissas de homogeneidade das variâncias, linearidade da reta de regressão e normalidade dos erros não foram cumpridas (F-TEST, COCHRAN-TEST e BARTLETT-TEST p>0,05; SHAP/WILK- TEST p>0,10), o cálculo foi realizado a partir do método alternativo (EMEA, 1995). Neste caso, o período de carência foi estabelecido a partir do primeiro ponto de abate em que as concentrações de resíduos, em todos os tecidos de todos os animais estiverem abaixo dos LMRs, adicionando-se a essa estimativa um intervalo de confiança entre 10% e 30%. RESULTADOS E DISCUSSÃO Período de carência em leite Enrofloxacino e Ciprofloxacino Todas as amostras apresentaram valores para concentrações de enrofloxacino e ciprofloxacino abaixo do LMR (100µg/kg) a partir de 48 horas após o tratamento intravenoso. O resultado obtido pela curva de depleção sugere que o período de carência para o enrofloxacino em leite de bovinos tratados com o produto Quinotril Plus pela via intravenosa seja de 48,697 horas (2 dias) (Figura 1A). Para o tratamento intramuscular dose única (IM-U) e dose múltipla (IM-M) todas as amostras apresentaram valores para concentrações de enrofloxacino e ciprofloxacino abaixo do LMR (100µg/kg) a partir de 96 horas após o tratamento. As curvas de depleção sugerem o período de carência de 153,1 horas (7 dias) e 85,8 horas (4 dias) respectivamente (Figura 1B e 1C). O cálculo do período de carência do produto antimicrobiano de uso veterinário foi realizado por interpolação dos dados da curva do gráfico resíduo versus tempo conforme recomendação da Instrução Normativa Nº 26 de 09 de julho de 2009 (BRASIL, 2009). A metabolização do enrofloxacino para ciprofloxacino ocorre de maneira mais rápida em vacas em lactação, sendo encontrada menor porcentagem de enrofloxacino ligado às proteínas plasmáticas pela aplicação do produto pela via intravenosa (Idowu et al., 2010). Estes dados podem explicar a HV196-final.pmd 14

3 Figura 1 - Curva de depleção para determinação do período de carência de enrofloxacino e ciprofloxacino em leite: A) bovinos tratados via intravenosa; B) bovinos tratados via intramuscular dose única; C) bovinos tratados via intramuscular dose múltipla. rápida eliminação do ciprofloxacino encontrada no presente estudo para a matriz leite. Diclofenaco Os dados obtidos para as concentrações de diclofenaco no tratamento intravenoso mostraram que apenas duas amostras apresentaram concentrações acima do valor de LMR preconizado pelo EMEA (0,1µg/kg) para este fármaco em leite bovino. As demais amostras a partir do tempo 96 horas apresentaram valores de concentração para diclofenaco abaixo do LMR preconizado. A curva de depleção indica que o período de carência para o diclofenaco em leite de bovinos tratados com o produto Quinotril Plus via intravenosa seja de 85,8 (4 dias) (Figura 2A). No tratamento intramuscular dose única as amostras apresentaram valores para concentrações de diclofenaco abaixo do LMR (0,1µg/ kg) a partir de 144 horas após o tratamento e a curva de depleção sugere o período de carência de 191,9 horas (8 dias) (Figura 2B). O resultado obtido pela curva de depleção obtida para o tratamento intramuscular dose múltipla sugere um período de carência de 195,4 horas (9 dias), sendo que as amostras apresentaram valores para concentrações de diclofenaco abaixo do LMR (0,1µg/ kg) a partir de 96 horas após o tratamento (Figura 2C). Os resultados obtidos no presente estudo indicam melhor viabilidade de utilização do produto após aplicação por via intravenosa, uma vez que a mesma apresentou período de carência em leite em torno de 50% menor quando comparada à via intramuscular. O tempo de retirada encontrado para via intramuscular está de acordo com o apresentado pelo EMEA (2003), que sugere um período de sete dias considerando a aplicação da dose de 2,5 mg/ kg de peso vivo por três dias consecutivos. Período de carência em tecidos Enrofloxacino e Ciprofloxacino Considerando a soma das concentrações de enrofloxacino e ciprofloxacino para o cálculo do período de carência em tecidos bovinos, não foram observadas diferenças para os tempos de retirada (8 d) do produto Quinotril Plus quando administrado nas diferentes vias (IV, IM-U e IM-M). Em todas as matrizes foi observado o tempo de retirada igual a 8 dias. Para enrofloxacino, pôde-se considerar seguro o período de tempo de 8 dias devido à todas as concentrações se encontrarem abaixo do LMR no primeiro ponto de abate (7 dias). Somou-se 10% deste período para compensar variações biológicas conforme recomendado pelo guia EMEA (1995). Diclofenaco Todas as matrizes de tecido bovino apresentaram concentrações de diclofenaco abaixo do LMR preconizado pelo EMEA (rim =10 ng/g; fígado e músculo = 5 ng/g; gordura = 1 ng/g) com sete dias após tratamento pela via intravenosa. Para o cálculo do período de carência foi utilizado método alternativo. 15 HV196-final.pmd 15

4 No tratamento pela via intramuscular dose única, os dados foram tratados de forma a cumprir os critérios estatísticos, tornando possível o cálculo pela regressão linear. O mesmo ocorreu para a matriz gordura pelo tratamento intramuscular dose múltipla, enquanto que para a matriz fígado foi possível traçar a curva de depleção sem a necessidade de tratamento dos dados. Por outro lado, para as matrizes músculo e rim, foi necessário a utilização do método alternativo para o cálculo do período de carência. Os períodos de carência obtidos estão apresentados na Tabela 1. A via intravenosa, para todas as matrizes, apresentou concentrações abaixo do LMR no primeiro ponto de abate (7 dias) estabelecendose, portanto, periodo de carência de 8 dias. Isto por sua vez difere do obtido para via intramuscular no qual a maioria das matrizes apresentaram valores de concentrações acima dos valores de LMR preconizados pelo EMEA, dentre elas, a depleção fora estabelecida pela matriz gordura. CONCLUSÃO Figura 2 - Curva de depleção para determinação do período de carência de diclofenaco em leite: A) bovinos tratados via intravenosa; B) bovinos tratados via intramuscular dose única; C) bovinos tratados via intramuscular dose múltipla. Mediante resultados obtidos no presente estudo podese inferir que o abate dos animais tratados pela via intravenosa somente deve ser realizado 8 dias após a última aplicação deste produto. Enquanto que pela via via intramuscular, somente deve ser realizado 44 dias após a última aplicação deste produto quando aplicado em dose única e 39 dias após a última aplicação deste produto quando utilizada dose múltipla. O leite dos animais tratados pela via intravenosa não deve ser destinado ao consumo humano até 4 dias após a 16 HV196-final.pmd 16

5 última aplicação deste produto. Pela via intramuscular, o leite não deve ser destinado ao consumo humano até 8 dias após aplicação do produto em dose única e 9 dias após a última aplicação do produto em dose múltipla. Portanto, a via intravenosa confere uma redução no periodo de carência para leite e tecidos, permitindo menor perda na produção de leite e menor tempo de espera para o abate. REFERÊNCIAS BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária ANVISA; RE nº 899, de 29/05/2003: Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos, Ministério da Saúde: Brasil, 2003, publicada em 02/06/2003. BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa nº 26 Regulamento técnico para a fabricação, o controle da qualidade, a comercialização e o emprego de produtos antimicrobianos de uso veterinário. Diário Oficial da União nº 130, de 09 de Julho de 2009, CHU, D. T. W.; FERNANDES, P. B. Structure activity relationships of the fluoroquinolones. Antimicrobials Agents and Chemotherapy. v. 33, n. 1, p , EUROPEAN MEDICINES AGENCY (EMEA). Committee for medicinal products for veterinary use: Diclofenac. - Summary Report (1), Disponível em: < Acesso em: 17 agosto EUROPEAN MEDICINES AGENCY (EMEA). Committee for medicinal products for veterinary use: Enrofloxacinsummary report (4) Extension to sheep, Disponível em: < Acesso em: 16 agosto EUROPEAN MEDICINES AGENCY (EMEA). Note For Guidance: Approach Towards Harmonization of Withdrawal Periods, Disponível em: < Acesso em: 16 agosto 2013 IDOWU, O. R. et al. Comparative pharmacokinetics of enrofloxacin and ciprofloxacin in lactating dairy cows and beef steers following intravenous administration of enrofloxacin. Research in Veterinary Science. v. 89, n. 1, p , MITCHELL, M. A. Enrofloxacin. Journal of Exotic Pet Medicine. v. 15, n. 1, p , PLUMB, D. C. Veterinary Drug Handbook. 3. Ed. Pocket edition. Iowa: Iowa State University, p. RAHAL, A. et al. Pharmacokinetics of ciprofloxacin in sheep following intravenous and subcutaneous administration. Small Ruminant Research. v. 73, n. 1, p , RAHAL, A. et al. Pharmacokinetics of diclofenac and its interaction with enrofloxacin in sheep. Research in Veterinary Science. v. 84, n. 1, p , RIVIERE, J. E. Comparative Pharmacokinetics. Principles, Techniques & Applications. 2ª Ed. Iowa: Wiley-Blackwell, Sumary Withdrawal period comparison in cattle tissues and milk after administration of enrofloxacin and diclofenac sodium (Quinotril Plus ) in two differents parenteral routes A. M. Mangerona et al. The aim of this study was to evaluate the withdrawal period of enrofloxacin and diclofenac sodium of bovine tissues and milk of animals treated with the product Quinotril Plus. The residues tissues study was conducted in three groups (IV, IM-U and IM-M) which evaluations were performed at 7 until 35d after the treatment. In the milk residue study, three groups were evaluated (IV and IM-U and IM-M).The milk samples were collected at time points, 0 until 240 h after treatment. There was difference among groups for the withdrawal period of diclofenac sodium (IV= 4 d; IM-U= 8 d; IM-M= 9 d) and enrofloxacin (IV= 2 d; IM-U= 7 d; IM-M= 4 d) in the milk. There was difference among groups for the diclofenac sodic in tissues (IV= 8 d; IM-U= 44 d; IM-M= 39 d). However, there was no difference among groups to the withdrawal period of the enrofloxacin in tissues (8d). 17 HV196-final.pmd 17

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7 Comparação do período de carência em tecidos e leite bovino após administração de oxitetraciclina LA e do diclofenaco sódico (Oxitrat LA Plus ) em duas diferentes vias parenterais O estudo avaliou o período de carência da oxitetraciclina LA e do diclofenaco sódico em tecidos e leite de bovinos tratados com o produto Oxitrat LA Plus. Para o estudo de resíduo em tecidos foram formados dois grupos de animais (IV e IM) cujas avaliações foram realizadas nos tempos 7, 14, 21, 28 e 35 dias após a última aplicação do produto. Para avaliação do resíduo em leite, foram formados dois grupos de fêmeas (IV e IM) cujas coletas foram realizadas nos tempos 0 e 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 240 e 252 horas após o tratamento. Não houve diferença entre os grupos IM e IV para o período de retirada do diclofenaco sódico e para a oxitetraciclina em tecidos (39 e 8 dias respectivamente). O período de carência em leite foi menor para o grupo IV (diclofenaco = 3 dias; oxitetraciclina = 7 dias) quando comparado com o grupo IM (diclofenaco = 7 dias; oxitetraciclina = 19 dias). A. M. MANGERONA 1 ; A. P. C. ARAUJO 2 ; O. D. MOZZER 3 ; E. B. QUEIROZ JÚNIOR 4 ; D. F. VIEIRA 5 1 Aparecida Martinez Mangerona, Gerente P&D de Farmacêuticos e Testes Clínicos Vallée S.A, Montes Claros, MG, Brasil. 2 Ana Paula Chaves de Araújo, Coordenadora de Testes Clínicos Vallée S.A, Montes Claros, MG, BRASIL. 3 Otto Domenici Mozzer, Diretor Técnico Vallée S.A, Montes Claros, MG, BRASIL. 4 Elbi Bernardes de Queiroz Júnior, Gerente Laboratório de Tecnologia Farmacêutica Vallée S.A, Montes Claros, MG, BRA- SIL. 5 Diogo Fernandes Vieira, Nanocore Biotecnologia S.A, Campinas, SP, BRASIL. INTRODUÇÃO MATERIAS E MÉTODOS RESULTADOS E DISCUSSÃO CONSIDERAÇÕES FINAIS CONCLUSÃO INTRODUÇÃO A utilização de antimicrobianos é amplamente empregada nos sistemas de produção animal. De acordo com o SINDAN (2012), 19% do mercado de produtos para a saúde animal brasileiro correspondem à classe de antimicrobianos e 54% é destinado a espécie bovina. Em vista da importância deste mercado e da saúde dos consumidores, é importante o conhecimento do período de carência, ou seja, o intervalo de tempo entre a suspensão da administração do produto veterinário até o momento em que os resíduos de relevância toxicológica, nas matrizes estudadas, sejam iguais ou inferiores aos limites máximos de resíduo (LMRs) estabelecidos (BRASIL, 2009). Segundo o Codex Alimentarius, é direito das pessoas possuírem a expectativa de que os alimentos que consomem sejam seguros e adequados. A fim de proteger a saúde humana, a Organização Mundial de Saúde (WHO), a Organização das nações Unidas para Alimentação e Agricultura (FAO) e a Agência Europeia de Medicamentos (EMEA) definiram normas para a ingestão diária aceitável (IDA) de resíduos e para LMR nos alimentos. A aplicação desses limites de tolerância é estabelecida tanto para fármacos como para substâncias químicas e seus metabólitos, os quais podem se acumular e depositar nos tecidos e fluidos animais, após a sua administração. De acordo com Sofos (2005), é importante monitorar as concentrações de resíduos em alimentos para verificar a utilização irregular de medicamentos veterinários, avaliar a toxicidade aguda e crônica além de alergias e problemas endócrinos, efeitos mutagênicos, carcinogênicos e teratogênicos, para a certificação de alimentos orgânicos e proteção da população de possíveis exposições acidentais ou de ações terroristas. No leite, o resíduo de antimicrobianos 19 HV196-final.pmd 19

8 pode apresentar ainda sérias consequências técnicas. Sua presença retarda ou mesmo impede os processos microbiológicos utilizados na manufatura de determinados produtos lácteos (Portugal, 2003). Dentre os vários grupos de antimicrobianos passíveis de monitoramento, os antibióticos da classe das tetraciclinas são utilizados em vários países, sendo os antimicrobianos de maior prevalência quando realizados estudos de determinação de multirresíduos. Ressalta-se ainda que a oxitetraciclina é a mais abrangente utilizada dentre a classe citada (Prado, 2012). A oxitetraciclina é um antibiótico bacteriostático que atua sobre bactérias gram-positivas e gram-negativas, clamídeas, riquétsias e até mesmo sobre alguns protozoários (Spinosa, 2006). Pelo seu caráter hidrossolúvel, sua distribuição se dá amplamente pelo organismo de forma relativamente lenta, atingindo concentrações significativas nos rins, fígado, bile, pulmões, baço e ossos. A oxitetraciclina é retirada do sangue pelo fígado e altas concentrações são alcançadas no parênquima e bile (Booth,1992). Já o diclofenaco sódico pertence à classe dos anti-inflamatórios não esteroidais (AINES) definida como agentes antiinflamatórios que inibem as enzimas que catalisam a conversão do ácido aracdônico em prostaglandinas e tromboxano (Spinosa, 2006). O fármaco possui potente efeito anti-inflamatório, analgésico e antipirético (Azevedo, 2011) e é amplamente utilizado nas associações com antimicrobianos para incrementar a indicação dos produtos farmacêuticos.o presente estudo objetivou determinar e comparar o período de carência da oxitetraciclina de longa ação e do diclofenaco sódico em leite e em tecidos (fígado, rins, músculo e gordura) de bovinos tratados com o produto Oxitrat LA Plus. MATERIAS E MÉTODOS O estudo foi conduzido na propriedade da Empresa Bio Horizonte Ltda, localizada no município de Esmeraldas, região metropolitana de Belo Horizonte/MG no período de janeiro a julho de Experimento 1 Para o estudo de resíduo em tecidos foram selecionados 50 bovinos mestiços sendo a proporção machos:fêmeas do experimento de 50:50, média de peso vivo de 252,5 ± 20 kg e 12 a 36 meses de idade. Os animais foram estratificados de acordo com o peso e sexo e classificados em ordem crescente de peso para receber um dos seguintes tratamentos: 1) Intravenoso (IV) (n=25), aplicação da dose de 10 mg de oxitetraciclina / kg de peso vivo e 0,5 mg de diclofenaco sódico / kg de peso vivo, equivalente a 1 ml do produto para cada 20 kg de peso vivo durante quatro dias consecutivos, a cada 24 horas e 2) Intramuscular (IM) (n=25), aplicação de duas doses de 20 mg de oxitetraciclina / kg de peso vivo e 1 mg de diclofenaco sódico / kg de peso vivo, equivalente a 1 ml do produto para cada 10 kg de peso vivo a cada 72 h. Em cada um dos tratamentos, cinco animais foram escolhidos aleatoriamente para serem abatidos nos tempos 7, 14, 21, 28 e 35 d após a última aplicação do produto Oxitrat LA Plus. Os animais foram abatidos de acordo com os princípios de boas práticas para o abate humanitário. Posteriormente a coleta dos tecidos, as amostras de fígado, rins, músculo e gordura foram processadas, condicionadas em sacos plásticos e estocadas a temperatura inferior a -20ºC até a realização das análises laboratoriais. Experimento 2 No estudo de resíduo em leite, foram formados dois grupos (IV e IM) de 20 fêmeas cruzadas (n total = 40), peso corporal médio de 453 ± 67 kg e em diferentes fases de lactação. Os dois grupos foram tratados de acordo com as definições de dose supracitadas no experimento 1. Para a realização dos testes de determinação do período de carência em leite, foram colhidas duas amostras de 50 ml de leite (prova e contraprova) em cada momento de coleta de cada animal. As coletas das amostras foram realizadas nas ordenhas referentes aos tempos 0 (imediatamente antes do início do tratamento), 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96, 108, 120, 132, 144, 156, 168, 180, 192, 204, 240 e 252 horas após o término do tratamento. Em ambos os experimentos, os animais do grupo IM receberam o medicamento na musculatura glútea (garupa) ou na musculatura da tábua do pescoço. Já na administração pela via intravenosa, os animais foram submetidos ao tratamento com o produto Oxitrat LA Plus pela veia jugular. As amostras de tecido e leite foram encaminhadas ao Laboratório Nanocore Biotecnologia S/A, localizado em Campinas-SP onde foram determinadas as concentrações do diclofenaco sódico, oxitetraciclina e 4-epioxitetraciclina utilizando-se de metodologia analítica validada para os fármacos por cromatografia líquida acoplada a espectrometria de massas (LC/ MS/MS) de acordo com a resolução n 899/2003 da ANVISA. Análise estatística Os dados obtidos a partir da análise de tecidos foram submetidos à estatística por regressão linear utilizando o software - Withdrawal-Time Calculation Program (WT EMEA). Quando não houve o mínimo de três pontos de abate distintos com no mínimo três animais apresentando concentrações residuais mensuráveis, e quando as premissas de homogeneidade das variâncias, linearidade da reta de regressão e normalidade dos erros não foram cumpridas (F-TEST, COCHRAN-TEST e BARTLETT-TEST p>0,05 ; SHAP/WILK- TEST p>0,10), o cálculo foi realizado a partir do método alternativo (EMEA, 1995a). Neste caso, o período de carência foi estabelecido a partir do primeiro ponto de abate em que as concentrações de resíduos, em todos os tecidos de todos os animais estiverem abaixo dos LMRs, adicionando-se a essa estimativa um intervalo de confiança entre 10 e 30%. Para avaliação do período de carência do leite, os dados foram submetidos ao método Time-to-safe-concentration TTSC method, assumindo uma distribuição log-normal corrigida por regressão monotônica. O cálculo foi realizado com um intervalo de confiança de 95% empregando-se o software MELK WTM 1.4 do EMEA. RESULTADOS E DISCUSSÃO Período de carência em tecidos Diclofenaco sódico Não foram encontradas concentrações de diclofenaco sódico acima do LMR preconizado pelo EMEA (rim =10 ng/g; 20 HV196-final.pmd 20

9 fígado e músculo = 5 ng/g; gordura = 1 ng/g) em todas as matrizes de tecido bovino avaliadas e nos diferentes tempos de abate (7, 14, 21, 28 e 35 dias) para os dois grupos estudados. O período de carência calculado foi de 192 h (8 dias) e os resultados demonstraram que não há diferença para o período de carência do anti-inflamatório não esteroidal, diclofenaco sódico, quando utilizado pela via IM ou IV (Tabela 1). pela curva de depleção (Figura 1) sugere que o período de carência para a oxitetraciclina em leite de bovinos tratados com o produto Oxitrat LA Plus pela via intravenosa seja de 155,11 horas (7 dias). De acordo com o EMEA (2004), aos 7 dias após o tratamento, a concentração de diclofenaco no fígado foi de 0,09 ng/g (menor que o LMR) e o diclofenaco não foi detectável no rim (menos de 5 ng/g) assim como o total de resíduos no músculo e gordura (exceto para um animal) foram muito inferiores para permitir a análise cromatográfica. Oxitetraciclina e 4-epioxitetraciclina Considerando a soma das concentrações de oxitetraciclina e seu epímero (4-epioxitetraciclina) para o cálculo do período de carência em tecidos bovinos, não foram observadas diferenças para os tempos de retirada (total = 39 d) do produto Oxitrat LA Plus quando administrado nas diferentes vias (grupo IV e IM) (Tabela 2). As concentrações de oxitetraciclina e seu epímero somente decaíram abaixo do LMR para a matriz gordura após 35 dias, isso porque quando não há valor de LMR definido para a substância, foi adotado como referência o valor de 10 ng/g. Este valor foi suficientemente baixo para ser detectado nos tecidos por um longo período, desta forma, a concentração da oxitetraciclina na gordura foi o fator determinante por estender o período de retirada do produto. O presente estudo concorda com o relatado pelo EMEA (1995b), sendo as maiores concentrações de oxitetraciclina e 4-epioxitetraciclina verificadas nos rins (3748,2 ng/g) seguida dos fígado (1091,05 ng/g). Landoni e Errecalde (1992), utilizando metodologia analítica microbiológica observaram um período de carência de 19,06 dias para os rins e 22,11 para o fígado, dados que corroboram com os dados observados para o Oxitrat LA Plus. Leite Oxitetraciclina e 4-epioxitetraciclina Todas as amostras do grupo IV apresentaram valores para concentrações de oxitetraciclina abaixo do LMR (100 ng/ g) a partir de 144 horas após o tratamento. O resultado obtido Quando avaliada a depleção de resíduo pela via intramuscular, todas as amostras do tempo 252 horas apresentaram valores para a concentração de oxitetraciclina abaixo do LMR preconizado pelo Codex alimentarius. Para uma concentração residual segura de oxitetraciclina em leite de vacas tratadas com o produto Oxitrat LA Plus pela via intramuscular, o período de carência calculado foi de 449,743 horas (19 dias) (Figura 2). As bulas vigentes no mercado, não recomendam a utilização de antimicrobianos a base de oxitetraciclina via sistêmica para animais em lactação, porém o estudo demonstra que a utilização de tais formulações pode ser recomendada respeitando-se o período de retirada para as diferentes vias e na dose recomendada pelo fabricante. Payne (2002) utilizando a mesma dose de oxitetraciclina pela via IM coletou amostras até 120h após administração e constatou resíduos acima do LMR. O maior tempo de depleção do fármaco quando utilizado na via intramuscular já era esperado pois a farmacocinética da oxitetraciclina possui diferentes características de acordo com a via administrada. Em estudos anteriores, Korchi (2006) constatou uma meia-vida da oxitetraciclina maior para a via de administração IM e relatou que essa taxa de eliminação no leite é influenciada significantemente pela farmacocinética. 21 HV196-final.pmd 21

10 Diclofenaco Os dados obtidos para as concentrações de diclofenaco no grupo IM mostraram que apenas duas amostras apresentaram concentrações para diclofenaco acima do valor de LMR preconizado pelo EMEA (0,1 ng/g) para esse fármaco em leite bovino, as demais amostras a partir do tempo 96 horas, apresentaram valores de concentração para diclofenaco abaixo do LMR preconizado. A curva de depleção (Figura 3) indica que o período de carência para o diclofenaco em leite de bovinos tratados com o produto Oxitrat LA Plus via intramuscular é de 153,7 horas (7 dias). Os dados obtidos para as concentrações de diclofenaco no grupo IV apontaram que nenhuma das amostras apresentou concentrações para diclofenaco acima do valor de LMR. O resultado obtido pela curva de depleção (Figura 4) sugere que o período de carência para o diclofenaco em leite de bovinos tratados com o produto Oxitrat LA Plus via intravenosa seja de 48,697 horas (3 dias). preparações clássicas, as quais representam uma mudança significante na praticidade e hábitos de utilização, porém também mantém níveis de resíduo por longos períodos em diferentes tecidos. Os procedimentos analíticos utilizados em estudos anteriores para as informações vigentes sobre os fármacos, não conferiam a mesma sensibilidade, precisão e exatidão no rastreamento, detecção e quantificação, tal como o atual método (LC/MS/MS). A literatura relata diferentes períodos de retirada para as mesmas substâncias utilizadas na terapêutica veterinária. Este fato revela a importância para que todo medicamento comercializado no mercado de saúde animal regulamente-se a partir de testes de resíduos de acordo com o preconizado pela Normativa 26. Isso resultará em períodos de carência distintos conforme as diferentes indicações (dose e posologia) e características farmacocinéticas das diversas formulações existentes. CONCLUSÃO Não há diferença para o período de carência em tecidos quando o produto Oxitrat LA Plus é administrado nas duas diferentes vias recomendadas (IV e IM). O abate dos animais deve ser realizado 39 dias após a última aplicação. O produto Oxitrat LA Plus possui um menor período de carência no leite quando administrado pela via IV e desta forma é recomendada sua utilização a partir desta para animais em lactação, conferindo um descarte de leite de 7 dias. Foi reportado na literatura que a depleção de resíduo em leite foi observada até 108 h, quando utilizada doses menores de oxitetraciclina pela via IM observando-se portanto que em 5 dias, todos os animais obtiveram concentrações de diclofenaco abaixo do limite de quantificação (EMEA, 2009). Os estudos com o Oxitrat LA Plus apresentam coerência com as pesquisas realizadas para os fármacos analisados. CONSIDERAÇÕES FINAIS As novas formulações de longa ação têm permitido a manutenção de altas concentrações por períodos maiores do que as REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS AZEVEDO, M.S. Biodisponibilidade e tolerabilidade do diclofenaco de sódio via tópica ou oral em pôneis sadios p. Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria, BOOTH, H.N.; MCDONALD, E.L. Farmacologia e Terapêutica em Veterinária. 6.ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, p , BRASIL. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Regulamento técnico para a fabricação, o controle da qualidade, a comercialização e o emprego de produtos antimicrobianos de uso veterinário. Diário Oficial da União nº 130, de 10 de Julho de 2009, BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA). Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos. 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