Débora Danielle Virgínio da Silva

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1 GOVERNO DO ESTADO DE SÃO PAULO SECRETARIA DA CIÊNCIA, TECNOLOGIA E DESENVOLVIMENTO ECONÔMICO FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA Tese de Doutorado EFEITO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL POR Candida guilliermondii EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR Débora Danielle Virgínio da Silva Lorena SP- Brasil 2004

2 FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL EFEITO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL POR Candida guilliermondii EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR Tese de Doutorado apresentada como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Biotecnologia Industrial Banca Examinadora: Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe, FAENQUIL (Presidente) Dr. Ismael Maciel de Mancilha, FAENQUIL Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata, FAENQUIL Dra. Luciane Sene, UNIOESTE Dr. Michele Vitolo, USP Estudante: Débora Danielle Virgínio da Silva Lorena SP Brasil 2004

3 Ficha Catalográfica Elaborada pela Biblioteca Universitária da FAENQUIL SILVA, Débora Danielle Virgínio da S586e Efeito da relação glicose:xilose na bioconversão de xilose em xilitol por Candida guilliermondii em hidrolisado de bagaço de cana-de-açúcar / Débora Danielle Virgínio da Silva. Lorena, p. Tese (doutorado) Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Departamento de Biotecnologia. Orientadora: Felipe, Maria das Graças de Almeida 1. Biotecnologia 2. Candida guilliermondii 3. Xilitol 4. Glicose 5. Bagaço de cana-de-açúcar I. Título II Felipe Maria das Graças de Almeida orientadora

4 FACULDADE DE ENGENHARIA QUÍMICA DE LORENA DEPARTAMENTO DE BIOTECNOLOGIA PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL EFEITO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL POR Candida guilliermondii EM HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR Este exemplar corresponde à versão final da Tese de Doutorado aprovada pela banca examinadora. Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe Orientadora e Presidente da Banca Examinadora Lorena SP Brasil 2004

5 Nada acontece por acaso. Não existe a sorte. Há um significado por detrás de cada pequeno ato. Talvez não possa ser visto com clareza imediatamente, mas sê-lo-á antes que se passe muito tempo. Richard Bach

6 AGRADECIMENTOS À Profª. Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe pela dedicação, paciência e competência com as quais me orientou durante o desenvolvimento deste trabalho. À Graça, pela amizade e confiança durante estes anos de convivência diária. ( A glória da amizade não é a mão estendida, nem o sorriso carinhoso, nem mesmo a delícia da companhia. É a inspiração espiritual que vem quando você descobre que alguém acredita e confia em você."_ Ralph W. Emerson). A todos os amigos do DEBIQ pelo companheirismo, pelo incentivo e pelo agradável convívio dentro e fora dos laboratórios. Em especial agradeço àqueles com os quais compartilhei a maior parte do meu tempo: Lili, Marcelo Marton, Martha, Francislene, Talita, Gilvani, Rita, Larissa Poppi, Larissa Canilha, Giovani, Priscila, Fernanda, Rimenys, Carol e Laís. ( Se a nossa amizade depende de coisas como o espaço e o tempo, então quando finalmente ultrapassarmos o espaço e o tempo, teremos destruído a nossa fraternidade! Mas ultrapassando o espaço, tudo o que nos resta é Aqui. Ultrapassando o tempo, tudo o que nos resta é Agora. E entre Aqui e Agora você não crê que poderemos vernos uma ou duas vezes? _Richard Bach). A todos os meus amigos que não são do DEBIQ, e que também foram muito importantes. ( As pessoas realmente ligadas não precisam de ligação física. Quando se reencontram, mesmo depois de muitos anos afastados, sua amizade é tão forte quanto sempre. _Deng Ming-Dao) À minha família: Válter, Neide, Glauce, João, Cleber, Milene e Beatriz, muito obrigada! ( Suas vidas são mais importantes que todo o ouro do mundo. Mais belas que as estrelas, apesar dos seus defeitos. Ninguém é igual a vocês. Vocês são insubstituíveis. _adaptado de Augusto Cury). A todos os professores e funcionários do Departamento de Biotecnologia (DEBIQ), pela colaboração e agradável convivência. Ao Departamento de Biotecnologia e à Faculdade de Engenharia Química de Lorena. À Coordenadoria de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa e à Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro destinado a este projeto.

7 RESUMO Efeito da Relação Glicose:Xilose na Bioconversão de Xilose em Xilitol por Candida guilliermondii em Hidrolisado de Bagaço de Cana-de-Açúcar. Débora Danielle Virgínio da Silva. Tese de Doutorado. Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Industrial. Departamento de Biotecnologia, Faculdade de Engenharia Química de Lorena. Orientadora: Dra. Maria das Graças de Almeida Felipe (Departamento de Biotecnologia, FAENQUIL, C. P. 116, , Lorena, SP, Brasil). Banca Examinadora: Dr. Ismael Maciel de Mancilha, Dr. Arnaldo Márcio Ramalho Prata, Dr. Michele Vitolo e Dra. Luciane Sene. Dezembro de Há alguns anos, pesquisadores do Departamento de Biotecnologia da FAENQUIL vêm estudando a utilização do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar como meio de cultivo para a levedura Candida guilliermondii, visando a produção biotecnológica de xilitol, um adoçante anticariogênico apropriado para diabéticos e obesos, comercialmente produzido a partir da catálise química de xilose obtida de materiais lignocelulósicos ricos em xilana. A assimilação da xilose presente nos hidrolisados hemicelulósicos é dependente da capacidade de leveduras em induzir a síntese das enzimas xilose redutase (XR) e xilitol desidrogenase (XDH), que participam das reações iniciais do metabolismo de xilose. As atividades destas enzimas podem ser influenciadas por diferentes compostos presentes no hidrolisado, como a glicose, apontada como um dos compostos reguladores da bioconversão de xilose em xilitol. A influência da glicose neste metabolismo foi avaliada a partir de fermentações em hidrolisado de bagaço de cana com diferentes relações glicose:xilose (1:25, 1:12, 1:5 e 1:2,5) empregando inóculo de Candida guilliermondii obtido do cultivo em meio contendo glicose, xilose e a mistura destas duas fontes de carbono. De acordo com os resultados, a relação glicose:xilose interferiu positivamente nesta bioconversão não se observando correlação entre a condição de favorecimento da produção de xilitol e as atividades das enzimas XR e XDH. A máxima atividade específica de XR (0,582 U/mg prot ) ocorreu na fermentação realizada em meio com relação glicose:xilose de 1:25 empregando-se inóculo cultivado em meio contendo apenas glicose. A máxima atividade específica de XDH (0,360 U/mg prot ) foi verificada na fermentação de meio com relação glicose:xilose de 1:2,5 e inóculo cultivado em mistura de glicose e xilose. Os máximos valores do fator de conversão de xilose em xilitol (Y P/S = 0,59 g/g) e produtividade volumétrica de xilitol (Q P =0,53 g/l.h) foram alcançados quando a relação glicose:xilose foi 1:5 e o inóculo cultivado apenas em xilose, indicando que não somente a relação glicose:xilose no meio de fermentação influenciou nestes resultados, mas também a presença de glicose no meio de preparo do inóculo. Quanto ao crescimento celular, verificou-se que o aumento da relação glicose:xilose favoreceu a formação de biomassa, com conseqüente aumento da formação dos subprodutos glicerol e etanol. iv

8 ABSTRACT For some years, researchers from the Department of Biotechnology of FAENQUIL have been studying the use of the sugarcane bagasse hemicellulosic hydrolysate as a cultivation medium for the yeast Candida guilliermondii. This study aims the biotechnological production of xylitol, an anticariogenic sweetener appropriate to diabetic and obese people. Xylitol is commercially produced from the chemical catalysis of xylose obtained from xylan-rich lignocellulosic materials. The assimilation of the xylose present in the hemicellulosic hydrolysates is dependent on the yeasts capacity to induce xylose reductase (XR) and xylitol dehydrogenase (XDH) enzymes, which participate in the initial reactions of the xylose metabolism. The activities of these enzymes can be influenced by different compounds present in the hydrolysate, like glucose, indicated as one of the regulatory compounds of the xylose-to-xylitol bioconversion. The influence of the glucose in this metabolism was evaluated from sugarcane bagasse hydrolysate fermentations with different glucose:xylose ratios (1:25, 1:12, 1:5 and 1:2.5) employing inoculum of C. guilliermondii obtained from the cultivation in medium containing glucose, a mixture of glucose and xylose or only xylose as carbon sources. According to the results, the glucose:xylose ratio interfered positively in this bioconversion and it was not observed a correlation between the favorable condition of xylitol production and the XR and XDH enzymes activities. The maximum specific activity of XR (0.582 U/mg prot ) occurred in the fermentation carried out in medium with 1:25 glucose:xylose ratio, using inoculum grown in medium containing only glucose. The maximum specific activity of XDH (0.360 U/mg prot ) was verified in the fermentation of medium with 1:2.5 glucose:xylose ratio and inocullum grown in a mixture of glucose and xylose, whereas the maximum values of xylitol yield (0.59 g/g) and volumetric productivity (0.53 g/l.h) were reached when the glucose:xylose ratio was 1:5 and the inoculum was grown in medium containing only xylose. This indicates that the results were influenced not only by the glucose:xylose ratio in the fermentation medium, but also by the presence of glucose in the inoculum growth medium. In relation to the cell growth, it was verified that the increase of the glucose:xylose ratio favored the biomass formation, which consequently increased the formation of glycerol and ethanol by-products. v

9 CONTEÚDO 1- INTRODUÇÃO...II 2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR XILITOL: PROPRIEDADES E APLICAÇÕES OCORRÊNCIA E OBTENÇÃO DE XILITOL Obtenção Química Obtenção Microbiológica FATORES QUE INFLUENCIAM A BIOCONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL Influência da Glicose como Co-Substrato na Bioconversão de Xilose em Xilitol AS ENZIMAS XILOSE REDUTASE E XILITOL DESIDROGENASE RECUPERAÇÃO DO XILITOL MATERIAL E MÉTODOS OBTENÇÃO E PREPARO DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR Hidrólise Ácida Caracterização e Concentração do Hidrolisado Tratamento do Hidrolisado MICRORGANISMO PREPARO DO INÓCULO FERMENTAÇÃO Avaliação do Efeito da Relação Glicose:Xilose Sobre a Conversão de Xilose em Xilitol por C. guilliermondii em Hidrolisado de Bagaço de Cana DETERMINAÇÃO DO COEFICIENTE VOLUMÉTRICO DE TRANSFERÊNCIA DE OXIGÊNIO (K L A) MÉTODOS ANALÍTICOS Rompimento Celular Medida das Atividades Enzimáticas Determinação de Proteína Solúvel Viabilidade e Pureza da Cultura...29 vi

10 Determinação da Concentração Celular Determinação da Concentração de Glicose, Xilose, Arabinose, Xilitol, Glicerol, Etanol e Ácido Acético Determinação da Concentração de Furfural e Hidroximetilfurfural Determinação da Concentração de Fenóis Totais Determinação do ph DETERMINAÇÃO DOS PARÂMETROS FERMENTATIVOS Fator de Conversão de D-xilose em Xilitol (Y p/s ) Produtividade Volumétrica de Xilitol (Q p ) Eficiência de Conversão (η) Velocidade de Consumo Fator de Conversão de D-xilose e D-glicose em Biomassa (Y X/s ) RESULTADOS E DISCUSSÃO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR INFLUÊNCIA DA GLICOSE NO CONSUMO DE AÇÚCARES E ÁCIDO ACÉTICO INFLUÊNCIA DA GLICOSE NA FORMAÇÃO DE XILITOL E NO CRESCIMENTO CELULAR INFLUÊNCIA DA GLICOSE NA FORMAÇÃO DE GLICEROL E ETANOL INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE SOBRE A ATIVIDADE DAS ENZIMAS XILOSE REDUTASE E XILITOL DESIDROGENASE CONCLUSÕES SUGESTÕES DE TRABALHOS FUTUROS REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...63 vii

11 LISTA DE TABELAS TABELA I. PRINCIPAIS AÇÚCARES ENCONTRADOS EM HIDROLISADOS HEMICELULÓSICOS DE DIFERENTES MATÉRIAS-PRIMAS...14 TABELA II. CARACTERÍSTICAS DO HIDROLISADO HEMICELULÓSICO DE BAGAÇO DE CANA..33 TABELA III. VELOCIDADE DE CONSUMO DE XILOSE DURANTE A FERMENTAÇÃO DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR C. GUILLIERMONDII EM FUNÇÃO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO MEIO DE FERMENTAÇÃO E DO PREPARO DO INÓCULO...36 TABELA IV. FATOR DE CONVERSÃO DE XILOSE E GLICOSE EM BIOMASSA CELULAR (Y X/S ) EM 96 H DE FERMENTAÇÃO DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR C. GUILLIERMONDII EM FUNÇÃO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO MEIO DE FERMENTAÇÃO E DO PREPARO DO INÓCULO...43 TABELA V. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA ATIVIDADE ESPECÍFICA DA XILOSE REDUTASE DURANTE AS FERMENTAÇÕES DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE + XILOSE; XILOSE...50 TABELA VI. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA ATIVIDADE ESPECÍFICA DA XILITOL DESIDROGENASE DURANTE AS FERMENTAÇÕES DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE + XILOSE; XILOSE...53 TABELA VII. RAZÕES ENTRE A VELOCIDADE DE CONSUMO DE XILOSE E AS VELOCIDADES DE FORMAÇÃO DE XILITOL E BIOMASSA EM FUNÇÃO DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO E DO PREPARO DO INÓCULO...58 viii

12 LISTA DE FIGURAS FIGURA 1. ESQUEMA COMPARATIVO DOS PROCESSOS DE OBTENÇÃO DO XILITOL....9 FIGURA 2. ESQUEMA DO METABOLISMO DE GLICOSE, XILOSE E ARABINOSE EM CANDIDA GUILLIERMONDII...12 FIGURA 3. ESQUEMA DO METABOLISMO DE D-XILOSE EM LEVEDURAS FIGURA 4. ESTRUTURA DA XILOSE REDUTASE DE C. TENUIS FIGURA 5. ESTRUTURA DA XILOSE REDUTASE DE P. GUILLIERMONDII...21 FIGURA 6. ESTRUTURA DA XILITOL DESIDROGENASE DE CANDIDA SP FIGURA 7. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE O CONSUMO DE XILOSE POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE FIGURA 8. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE O CONSUMO DE GLICOSE E ARABINOSE POR C. GUILLIERMONDII PRÉ- CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE...38 FIGURA 9. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE A VARIAÇÃO DO PH E O CONSUMO DE ÁCIDO ACÉTICO POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE FIGURA 10. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE A FORMAÇÃO DE XILITOL POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE...42 FIGURA 11. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE O FATOR DE CONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL (Y P/S ) E PRODUTIVIDADE (Q P ) DE XILITOL POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, EM MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE...44 ix

13 FIGURA 12. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE A FORMAÇÃO DE BIOMASSA CELULAR POR C. GUILLIERMONDII PRÉ- CULTIVADA EM MEIO CONTENDO APENAS GLICOSE, MISTURA DE GLICOSE E XILOSE OU APENAS XILOSE...46 FIGURA 13. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE A FORMAÇÃO DE GLICEROL POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE, GLICOSE + XILOSE OU XILOSE FIGURA 14. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA SOBRE A FORMAÇÃO DE ETANOL POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE, GLICOSE + XILOSE OU XILOSE...49 FIGURA 15. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA NA ATIVIDADE ESPECÍFICA MÁXIMA DE XR DE C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE + XILOSE; XILOSE...52 FIGURA 16. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA NA ATIVIDADE ESPECÍFICA MÁXIMA DE XDH DE C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE + XILOSE; XILOSE FIGURA 17. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA RAZÃO XR/XDH MÁXIMA NAS FERMENTAÇÕES DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR C. GUILLIERMONDII PRÉ- CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE + XILOSE; XILOSE...55 FIGURA 18. INFLUÊNCIA DA RELAÇÃO GLICOSE:XILOSE NA ATIVIDADE ESPECIFICA DE XR E XDH, NA FORMAÇÃO DE XILITOL E BIOMASSA, NO FATOR DE CONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL E PRODUTIVIDADE DE XILITOL COM 48 H DE FERMENTAÇÃO DO HIDROLISADO DE BAGAÇO DE CANA POR C. GUILLIERMONDII PRÉ-CULTIVADA EM MEIO CONTENDO GLICOSE; GLICOSE + XILOSE; XILOSE...56 FIGURA 19. CONDIÇÕES DE FERMENTAÇÃO PARA A OBTENÇÃO DAS MÁXIMAS ATIVIDADES DE XR E XDH, FATOR DE CONVERSÃO DE XILOSE EM XILITOL_Y P/S, PRODUTIVIDADE DE XILITOL_Q P, EFICIÊNCIA DE CONVERSÃO_η, FORMAÇÃO DE XILITOL, GLICEROL E ETANOL, E CRESCIMENTO CELULAR...59 x

14 Introdução 1- INTRODUÇÃO Os materiais lignocelulósicos como os resíduos florestais e agro-industriais constituem-se numa das mais abundantes fontes de matéria orgânica do planeta, com potencial uso como fonte de energia e na produção de insumos químicos, alimentos e enzimas. A cada dia cresce, portanto, o interesse em desenvolver tecnologias alternativas para reutilizar estas fontes renováveis de matéria orgânica visando a obtenção de novos produtos e a diminuição de impactos negativos ao meio ambiente causados pelo acúmulo de tais materiais. Diversos grupos de pesquisa vêm estudando o aproveitamento dos materiais lignocelulósicos para a obtenção biotecnológica de xilitol. Este produto é um poliol obtido por via química, de poder adoçante equivalente ao da sacarose, utilizado na dieta de diabéticos e obesos. Recentemente foi indicado no tratamento de infecções respiratórias, otites e osteoporose, tornando-se cada vez mais, alvo de estudos, não apenas pelas suas características, mas também devido à possibilidade de aplicação da biotecnologia para a sua obtenção a partir de materiais lignocelulósicos ricos em xilana, como é o caso do bagaço de cana-de-açúcar. O bagaço de cana, um subproduto da indústria sucro-alcooleira, se constitui em uma matéria-prima abundante para ser aplicada em bioprocessos, embora seja utilizado como fonte de energia nas próprias indústrias. O bagaço, para ser utilizado na produção de xilitol, deve ser submetido a um processo de hidrólise ácida para a liberação de monossacarídeos fermentescíveis da sua fração hemicelulósica, principalmente a xilose. O interesse pelo uso do hidrolisado hemicelulósico do bagaço de cana para a obtenção do xilitol se deve principalmente às características peculiares deste poliol, bem como à possibilidade de desenvolvimento de uma tecnologia capaz de agregar valor ao bagaço e também de contribuir para o meio ambiente pela redução do nível de poluentes. O aproveitamento do bagaço de cana-de-açúcar para a obtenção biotecnológica de xilitol é uma das principais linhas de pesquisa do Departamento de Biotecnologia (Debiq) da FAENQUIL. Os trabalhos desenvolvidos pelo grupo têm demonstrado que o processo biotecnológico se apresenta como alternativa ao processo químico, via industrial de obtenção de xilitol a partir de hidrolisados hemicelulósicos ricos em xilose. 1

15 Introdução A bioconversão de xilose em xilitol é influenciada por vários fatores, dentre os quais destacam-se: o tipo de hidrolisado hemicelulósico, a temperatura, o ph, a concentração inicial de xilose e suplementação nutricional do meio de fermentação, a relação glicose:xilose nos hidrolisados, bem como a concentração de compostos inibitórios ao metabolismo microbiano, tais como ácido acético, furfural, hidroximetilfurfural e compostos fenólicos. Estes compostos são tóxicos aos microrganismos, pois interferem nas atividades das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase, envolvidas nos passos iniciais de assimilação da xilose, em função de suas concentrações no meio de fermentação, o que resulta em baixa eficiência deste bioprocesso. Muitos dos parâmetros importantes para o desenvolvimento deste bioprocesso já foram estabelecidos, mas ainda são necessários estudos para melhor entendimento das vias metabólicas envolvidas nesta bioconversão, principalmente com relação às atividades das enzimas xilose redutase e a xilitol desidrogenase, as quais são induzidas pela xilose e requerem os cofatores NAD(P)H e NAD(P) +, respectivamente. O conhecimento dos parâmetros que possam interferir na indução e/ou atividade destas enzimas é muito importante, principalmente nas fermentações de hidrolisados hemicelulósicos, uma vez que neles está presente, além da xilose, a glicose, hexose apontada como reguladora do metabolismo de pentoses. Estudos realizados em meio sintético indicam que a glicose é prejudicial à bioconversão de xilose em xilitol, principalmente devido à repressão catabólica exercida pela glicose sobre a assimilação de xilose. Outros estudos também indicam que o efeito da glicose neste bioprocesso é dependente da sua concentração no meio de fermentação e da proporção em esta se encontra em relação à xilose. Em função dos vários resultados promissores até agora obtidos relativos ao aproveitamento do bagaço de cana-de-açúcar como matéria-prima para a produção biotecnológica de xilitol e ao fato da relação glicose:xilose variar de acordo com o tipo de material lignocelulósico a ser utilizado neste bioprocesso, este trabalho teve como objetivos principais avaliar o efeito da relação glicose:xilose sobre as atividades das enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase durante a fermentação do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana-de-açúcar, bem como da presença de glicose durante o cultivo do inóculo sobre a bioconversão de xilose em xilitol por Candida guilliermondii. 2

16 Revisão Bibliográfica 2- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1- BAGAÇO DE CANA-DE-AÇÚCAR O Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar, tendo sido estimada uma produção de 340 milhões de toneladas para a safra 2003/2004 (PROCANA, 2004). O bagaço, como subproduto da indústria sucro-alcooleira, atinge aproximadamente 28% desta quantidade, o que equivaleria à cerca de 100 milhões de toneladas por ano. Estimando que 88% do bagaço (aproximadamente 79 milhões de toneladas/ano) será consumido para a produção de vapor, aproximadamente 11 milhões de toneladas será o excedente (GRANDE MORAVIA INDUSTRIAL, 2004), o qual acarreta em graves problemas de estocagem e poluição ambiental (PROCKNOR, 2000), apesar de seu aproveitamento para a geração de energia elétrica nas próprias usinas (PATUSCO, 1997; PANDEY et al., 2000). Além disto, ele é também utilizado na produção de polpa, papel e produtos aglomerados (MITRANI et al., 1999), além de recentes pesquisas indicarem seu aproveitamento na produção de álcool combustível (PESQUISA FAPESP, 2004). As fibras do bagaço da cana contêm, como principais componentes, cerca de 40% de celulose, 35% de hemicelulose e 15% de lignina. A celulose é um polímero linear constituído por unidades de D-glicose unidas por ligações glicosídicas β-1 4; a hemicelulose é um heteropolímero composto predominantemente por pentoses como D-xilose e L-arabinose e hexoses como D-glicose e D-galactose, enquanto a lignina é uma macromolécula polifenólica constituída por unidades básicas de 3-5- dimetoxi-4-hidroxi-fenilpropano, 3-metoxi-4-hidroxi-fenilpropano e 4-hidroxifenilpropano (FENGEL, WEGENER, 1989). A elevada proporção de xilose na fração hemicelulósica do bagaço, podendo corresponder a até 80% do total de açúcar nesta fração (RODRIGUES et al., 2001) e a capacidade de assimilação desta pentose por várias leveduras (BARBOSA et al., 1988) são os principais fatores que impulsionam o aproveitamento deste resíduo em diferentes processos de bioconversão. Além do bagaço de cana, outros materiais lignocelulósicos também vêm sendo estudados como matéria-prima para a obtenção do xilitol, como por exemplo: cavacos de eucalipto (CANETIERI, ALMEIDA E SILVA, FELIPE, 2002), palha de arroz (MUSSATO, ROBERTO, 2003), palha de trigo (CANILHA, CÂNDIDO, 3

17 Revisão Bibliográfica ALMEIDA E SILVA, 2003), casca de aveia (FELIPE et al., 2003) e palha de cevada (CÂNDIDO et al., 2004) XILITOL: Propriedades e Aplicações O xilitol (C 5 H 12 O 5 ) é um carboidrato natural classificado como um poliol (álcool polihidroxilado ou açúcar-álcool), sem grupos redutores na sua molécula e com todos os cinco átomos de carbono ligando-se a um grupo OH. É descrito como um pó cristalino branco com poder edulcorante equivalente ao da sacarose e superior ao de outros polióis como sorbitol e manitol (FATIBELLO-FILHO et al., 1996; AGUIAR, OETTERER, MENEZES, 1999; MÄKINEN, 2000). Entre as propriedades do xilitol estão seus efeitos anti e não-cariogênico (MAKINEN, 1976). O xilitol não é metabolisado pelos microrganismos da flora bucal, principalmente pela bactéria Streptococcus mutans e, além disso, reduz a retenção de glicose na superfície dos dentes, diminuindo a incidência de cárie (MÄKINEN, 1992, IWATA et al., 2003). Sua utilização não proporciona a formação de ácidos que atacam o esmalte dos dentes e ajuda na estabilização de íons cálcio e fosfato na saliva, aumentando a remineralização e possibilitando a reversão de lesões recém formadas (MÄKINEN, 2000; MAGUIRE, RUGG-GUNN, WRIGHT, 2000). Estudos clínicos com crianças em idade escolar evidenciaram que o consumo de xilitol na forma de drágeas ou em produtos como doces, gomas de mascar e cremes dentais, é efetivo na prevenção de cárie dentária e na manutenção da higiene-oral (ALANEN et al., 2000; MAKINEN et al., 2001). Há ainda estudos indicando que o consumo de xilitol por gestantes, durante os últimos meses de gravidez e na amamentação, pode prevenir a transmissão de S. mutans para a criança (SODERLING et al., 2001; CHESTNUTT, 2003). Uma outra característica importante deste adoçante é o fato de seu metabolismo ser independente de insulina, tendo sido empregado como substituto da glicose em dieta de diabéticos (MANZ, VANNINEN, VOIROL, 1973; PEPPER, OLINGER, 1988; VALERO et al., 2001). Foi verificado ainda, que seu metabolismo pode contribuir para a síntese e glicosilação de colágeno em ratos diabéticos (KNUUTTILA et al., 2000). O xilitol também é usado na terapia da deficiência da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase nas hemácias (van EYS et al., 1974) e na dieta de obesos, uma vez que exerce pequena contribuição para a formação de 4

18 Revisão Bibliográfica tecidos gordurosos quando comparado a outros açúcares (MANZ, VANNINEN, VOIROL, 1973). Em estudos realizados com ratos a ingestão de xilitol reduziu o ganho de peso e o consumo de alimento, além de diminuir os níveis plasmáticos de triglicerídeos e colesterol (ELLWOOD et al., 1999). Pesquisas mais recentes revelam também o efeito do xilitol no tratamento de doenças respiratórias pela inibição do crescimento de Streptococcus pneumoniae na nasofaringe (KONTIOKARI, UHARI, KOSKELA, 1995; TAPIAINEN et al., 2001). A prevenção de infecção pulmonar em pacientes com fibrose cística também foi constatada com o uso de xilitol, pois este contribui para aumentar o sistema de defesa antibacteriano inato (ZABNER et al., 2000). A utilização de xilitol por crianças, na forma de xarope ou goma de mascar, preveniu também a otite, diminuindo a necessidade de antimicrobianos (UHARI, KONTIOKARI, NIEMELA 1998; UHARI, TAPIAINEN, KONTIOKARI, 2000). A prevenção de osteoporose pela utilização do xilitol foi também relatada em estudos realizados em ratos, onde foi constatado o aumento do volume, do conteúdo mineral e proteção contra a perda das propriedades biomecânicas dos ossos dos ratos cuja dieta continha xilitol (MATILLA, KNUUTTILA, SVANBERG, 1998; MATILLA, SVANBERG, KNUUTTILA, 2001). A incorporação de xilitol em alimentos é permitida por ser este uma substância atóxica, tendo sua utilização por humanos sido aceita pela European Economic Community (EEC) desde 1984, e reconhecido como um aditivo do tipo GRAS (Generally Regarded as Safe) pelo Food and Drug Admistration (FDA) dos Estados Unidos, em A partir de 1994 o xilitol foi considerado como seguro para os dentes (Safe for Teeth), e a Joint Expert Comittee on Food Additives (JEFCA), uma divisão da Organização Mundial de Saúde (OMC), confirmou os estudos de toxicidade do xilitol e o classificou como aceitável para consumo diário (Acceptable Daily Intake ADI). A DL 50 em ratos é de 25,7 g/kg de peso corporal, o que corresponde à ingestão diária de quase dois quilogramas para um adulto de 75 kg (AGUIAR, OETTERER, MENEZES, 1999). Segundo Mäkinen (apud AGUIAR, OETTERER, MENEZES, 1999), uma característica peculiar na absorção de xilitol é um aumento adaptável da absorção durante a administração prolongada. Para pessoas não adaptadas que não têm o costume de ingerir xilitol comumente, a dose máxima tolerável é de g/dia, enquanto o aumento das doses pode causar diarréia osmótica. 5

19 Revisão Bibliográfica De acordo com o Codex Alimentarius, o xilitol é um adoçante permitido para ser utilizado na dieta para diabéticos (AGUIAR, OETTERER, MENEZES, 1999). Atualmente o xilitol é usado em produtos alimentícios, farmacêuticos ou de saúde oral em países como Alemanha, Argentina, Bélgica, Canadá, Estados Unidos, Finlândia, França, Holanda, Inglaterra, Japão, México, Suécia, Suíça, Rússia (CCC Calorie Control Council, 2004). No Brasil, o xilitol também tem sido utilizado como insumo para diferentes produtos como creme dental, gomas de mascar e pastilhas OCORRÊNCIA E OBTENÇÃO DE XILITOL Na natureza o xilitol é encontrado em frutas, legumes, leveduras, líquens e algas, porém em baixa proporção (900 mg/100 g) (HYVÖNEN, KOIVISTOINEN, VOIROL, 1982; PEPPER, OLINGER, 1988). O xilitol é também um intermediário metabólico normal no metabolismo de carboidratos em mamíferos, sendo produzido no metabolismo de humanos na proporção de 5 a 15 g por dia (BÄR, 1991, apud WINKELHAUSEN, KUZMANOVA, 1998, p. 1). Em escala comercial, este adoçante é obtido por via química (MELAJA, HÄMÄLÄINEN, 1977). Segundo Winkelhausen e Kuzmanova (1998), na via química é difícil alcançar alto rendimento (50-60% baseado na xilana convertida) principalmente pelo alto custo dos processos de recuperação e purificação do xilitol, enquanto na produção microbiana são alcançados altos rendimentos a partir de xilose (65-85%) Obtenção Química De acordo com Melaja e Hämäläinen (1977) o processo comercial de síntese química de xilitol inicia-se com a obtenção de xilose, a partir de materiais lignocelulósicos ricos em xilana. A xilose é separada do hidrolisado por cromatografia e a solução de xilose pura sofre redução catalítica em xilitol na presença de catalisador (níquel). O xilitol passa então por processo de cristalização, que requer várias etapas de purificação para remoção de resíduos tóxicos do catalisador e de subprodutos que venham a ser formados durante a hidrogenação. O rendimento deste processo bem como a qualidade do xilitol estão intrinsecamente relacionados com a pureza da solução inicial de xilose, uma vez que 6

20 Revisão Bibliográfica a presença de impurezas interfere no processo de catálise, sendo necessárias exaustivas etapas de purificação para a obtenção de uma solução inicial de xilose de elevada pureza. Além disso, a produção de xilitol por via química requer várias etapas de purificação para a remoção de resíduos tóxicos do catalisador e de subprodutos originados durante o processo de hidrogenação (MELAJA, HÄMÄLÄINEN, 1977), ocasionando aumento do tempo de processo e encarecimento do produto (PARAJÓ, DOMINGUEZ, DOMINGUEZ, 1998a) Obtenção Microbiológica A possibilidade de uma tecnologia alternativa ao processo químico de obtenção de xilitol impulsiona as pesquisas com o objetivo de se alcançar a obtenção microbiológica de xilitol a partir do estudo de microrganismos fermentadores de xilose, podendo ser observado na FIGURA 1 um esquema comparativo entre os processos químico e biotecnológico. A obtenção de xilitol por fermentação da xilose pode ocorrer empregando-se bactérias, leveduras e fungos filamentosos, sendo as leveduras consideradas como as melhores produtoras (WINKELHAUSEN, KUZMANONA, 1998). Segundo Winkelhausen e Kuzmanona (1998), o metabolismo da xilose em leveduras inicia-se com o seu transporte através da membrana celular, que pode ocorrer por diferentes mecanismos. No caso de C. guilliermondii, no interior das células, a xilose é reduzida em xilitol, em uma reação catalisada pela enzima xilose redutase (E.C ) ligada à nicotinamida adenina dinucleotídeo, fosfatada ou não, em sua forma reduzida (NADPH/NADH). O xilitol é oxidado a xilulose pela enzima xilitol desidrogenase (E.C ) ligada à nicotinamida adenina dinucleotídeo, fosfatada ou não em sua forma oxidada (NADP + /NAD + ). A xilulose é fosforilada a xilulose-5- fosfato que pode ser convertida em piruvato através da conexão da via das fosfopentoses com a via Embden-Meyerhof-Parnas (HAHN-HÄGERDAL et al., 1994) (FIGURA 2). Segundo Gong et al. (1983), a redução de xilose em xilitol e a ativação da via das fosfopentoses em leveduras são controladas pela disponibilidade de NADP + e NADPH, sendo que a geração de NADP + durante a redução de xilose pode estimular a atividade da enzima glicose-6-fosfato desidrogenase a qual estimula a ativação da via das fosfopentoses. De acordo com Barbosa et al. (1988), o acúmulo de xilitol na 7

21 Revisão Bibliográfica célula e sua posterior excreção para o meio estão relacionados à geração de NADPH. Segundo Taylor et al. (1990), a produção de xilitol é favorecida pela elevada produção deste cofator reduzido. Segundo Barbosa et al. (1988), o NADPH é reoxidado a NADP + através da via das fosfopentoses e o NAD + é regenerado a partir de NADH via cadeia respiratória. Entretanto, sob condições de baixa aeração, o NADH produzido não é regenerado através da fosforilação oxidativa. Como resultado, uma fonte alternativa de geração de ATP deve ser obtida. Nestes casos, de acordo com Flores et al. (2000), o NADH produzido na glicólise é reoxidado a NAD + pela formação de etanol; enquanto o NADH resultante de reações não pertencentes à via glicolítica é regenerado principalmente pela produção de glicerol (FIGURA 2). A produção de etanol ou glicerol a partir do metabolismo de açúcares em leveduras é dependente das condições de cultivo, uma vez que a formação do glicerol é um mecanismo no qual o microrganismo evita a perda de água para o meio extracelular, enquanto que, no meio intracelular, a sua formação permite a manutenção do equilíbrio redox do citosol, principalmente na ausência de oxigênio (NEVOIGT, STAHL, 1997). Granström e Leisola (2002) observaram que a produção de glicerol ou etanol foi uma estratégia para regeneração de NAD + em C. guilliermondii e Candida tropicalis. A formação destes subprodutos foi também verificada durante o cultivo de C. guilliermondii em meio sintético (GRANSTRÖM, OJAMO, LEISOLA, 2001), em hidrolisado de bagaço de cana (MATOS, FELIPE, SILVA, 2003; RODRIGUES et al. 2003b) e em hidrolisado de casca de aveia (FELIPE et al., 2003). É interessante também notar que tanto o glicerol como o etanol podem ser utilizados como fontes de carbono e energia por um grande número de leveduras (WALKER, 1998). Segundo Rolland, Winderickx e Thevelein (2002), o etanol formado durante a fermentação pode ser subseqüentemente utilizado como fonte de carbono não fermentescível, resultando em completa utilização de todo o carbono disponível. Isto ocorreria porque, na presença de oxigênio, as células são capazes de respirar e gerar ATP a partir de fontes de carbono não fermentescíveis através da fosforilação oxidativa mitocondrial. Matos, Felipe, Silva (2003) observaram a assimilação de etanol por C. guilliermondii cultivada em hidrolisado de bagaço de cana. 8

22 9 FIGURA 1. Esquema comparativo dos processos de obtenção do xilitol (SILVA et al., 2004).

23 Revisão Bibliográfica O glicerol também pode ser utilizado como fonte de carbono por diferentes leveduras (FLORES et al., 2000). Duas diferentes vias de catabolismo são sugeridas em leveduras: (1) em Saccharomyces cerevisae ou Candida utilis o glicerol é fosforilado por uma glicerol quinase e o L-glicerol-3-fosfato formado é oxidado por uma glicerol fosfato ubiquinona oxirredutase mitocondrial; (2) em Schizosaccharomyces pombe a desidrogenação do glicerol por uma glicerol desidrogenase dependente de NAD + forma dihidroxiacetona, a qual é então fosforilada por uma dihidroxiacetona quinase (GANCEDO, apud FLORES et al., 2000, p. 519) Fatores que Influenciam a Bioconversão de Xilose em Xilitol Muitos fatores estão envolvidos na regulação da conversão de xilose em xilitol, destacando-se a temperatura (BARBOSA et al., 1988; SENE et al., 2000), a idade e a concentração inicial do inóculo (PFEIFER et al., 1996; SILVA et al., 1996a; FELIPE et al., 1997a), a concentração inicial de D-xilose (SILVA et al., 1996a; FELIPE et al., 1997a; ROSA et al., 1998), o suprimento de O 2 (FELIPE et al., 1996; MARTINEZ, SILVA, FELIPE, 2000), o ph (FELIPE et al., 1997b; MORITA, SILVA, FELIPE, 2000; RODRIGUES et al., 2003a). Além destes, a presença de D-glicose (FELIPE et al., 1993; ROSA et al., 1998) e L-arabinose (MATOS et al., 2002a e 2002b) como co-substrato, bem como de compostos fenólicos (PALMQVIST, HAHN- HÄGERDAL, 2000) e ácido acético nos hidrolisados (SILVA, 2001, LIMA et al., 2004) são fatores reguladores desta bioconversão. Barbosa et al. (1988) relataram que a produção de xilitol por C. guilliermondii cultivada em meio sintético foi favorecida na faixa entre 30 o C a 35 o C, enquanto Sene et al. (2000) encontraram, para esta levedura cultivada em hidrolisado de bagaço de cana, o favorecimento do rendimento em xilitol com o aumento da temperatura de 25 o C para 35 o C. Segundo Pfeifer et al. (1996) a utilização de inóculo de C. guilliermondii obtido de células jovens (16-24 h) favoreceu a produtividade do xilitol em meio sintético, semelhante ao obtido por Felipe et al. (1997a) quando se utilizou hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. Segundo estes autores, a utilização de inóculo de C. guilliermondii na faixa de 0,1 a 3,0 g/l favoreceu a produção de xilitol neste 10

24 Revisão Bibliográfica hidrolisado, sendo o nível do inóculo dependente da concentração de xilose e da aeração do meio. A influência da concentração inicial de xilose sobre esta bioconversão tem sido relacionada à disponibilidade de oxigênio no meio, sendo encontrado que, altas concentrações de xilose favoreceram a produção de xilitol por C. guilliermondii porém, concentração inicial acima de 170 g/l resultou em limitação de oxigênio dissolvido ou aumento da pressão osmótica exercida pelo meio de cultura, prejudicando esta bioconversão (SILVA et al., 1996a). Segundo Vandeska et al. (1995), a taxa de consumo de oxigênio determina quando a xilose é utilizada em processos respiratórios ou fermentativos. De acordo com Felipe et al. (1996), a bioconversão de xilose em xilitol por C. guilliermondii a partir do hidrolisado de bagaço de cana é afetada pela taxa de aeração, sendo que alta produtividade foi obtida quando a vazão específica utilizada foi de 0,6 vvm. Martinez, Silva e Felipe (2000) também relataram que o oxigênio é um importante parâmetro neste processo, observando que baixos valores (em torno de 20 h -1 ) do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (k L a) foram essenciais para obtenção dos máximos valores da produção do xilitol por esta levedura em hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana. De acordo com Rosa et al. (1998), durante o cultivo desta mesma levedura em meio sintético, os melhores resultados quanto aos parâmetros fermentativos da produção de xilitol foram obtidos com a concentração de xilose variando de 15 a 60 g/l. Um outro parâmetro que interfere neste metabolismo é o ph, principalmente quando da utilização de meios formulados à base de hidrolisados lignocelulósicos, devido à presença de ácido acético, cuja toxicidade está relacionada à forte acidez do meio (FELIPE et al., 1997a). Em fermentações de hidrolisado de bagaço por C. guilliermondii em ph inferior a 4,5 a bioconversão de xilose em xilitol foi fortemente inibida, encontrando-se o favorecimento da formação de xilitol em condições de ph próximo a 6,5 (FELIPE et al., 1997b). Morita, Silva e Felipe (2000) também constataram a influência do ph inicial do meio de fermentação, verificando que os máximos valores de rendimento e produtividade volumétrica de xilitol, produtividade de células e consumo de xilose foram obtidos em ph 7,0. De acordo com Rodrigues et al. (2003a), em fermentações em batelada do hidrolisado hemicelulósico de bagaço de cana por C. guilliermondii, os máximos valores de rendimento e produtividade de xilitol foram obtidos 11

25 12 FIGURA 2. Esquema do metabolismo de glicose, xilose e arabinose em Candida guilliermondii

26 Revisão Bibliográfica em ph 5,5, enquanto que em ph 7,5 o metabolismo de xilose pela levedura resultou em maior crescimento celular do que formação de xilitol. A arabinose, pentose presente em baixas concentrações no hidrolisado de bagaço de cana é lentamente assimilada por C. guilliermondii, porém durante a avaliação de sua influência sobre a bioconversão de xilose em xilitol, Matos et al. (2002a), encontraram que a obtenção do inóculo de C. guilliermondii a partir do cultivo das células em meio contendo arabinose resultou em favorecimento do rendimento em xilitol. No caso dos hidrolisados hemicelulósicos, a presença de compostos tóxicos aos microrganismos, como furfural, hidroximetilfurfural, ácido acético e compostos fenólicos, deve ser também considerada, uma vez que estes inibem a atividade microbiana. Furfural e hidroximetilfurfural exercem efeito inibitório no crescimento de C. guilliermondii em concentrações acima de 1 g/l (SANCHES, BAUTISTA, 1988). O ácido acético exerceu efeito inibitório sobre a bioconversão de xilose em xilitol em concentrações acima de 5 g/l (LIMA et al., 2004), sendo este efeito também dependente do tempo de fermentação em que a levedura foi exposta a este ácido (SILVA, 2001). Em relação aos compostos fenólicos, seu efeito inibitório é devido à capacidade de se associarem a membranas biológicas, causando perda de integridade e afetando sua habilidade de servir como barreira seletiva (PALMQVIST, HAHN-HÄGERDAL, 2000). Para contornar o problema da toxicidade do hidrolisado, este é concentrado e tratado, anteriormente à sua utilização como meio de fermentação, para reduzir as concentrações dos compostos tóxicos até níveis toleráveis pela levedura. O processo de concentração a vácuo, que é utilizado para aumentar o teor de xilose no hidrolisado e favorecer a produção de xilitol também auxilia na redução do teor dos compostos tóxicos voláteis, como o ácido acético, mas também aumenta a concentração dos não voláteis (RODRIGUES et al., 2001). Assim, são utilizados diferentes procedimentos de tratamento dos hidrolisados como variação do ph com ácidos e bases associada à adsorção em carvão ativo (ALVES et al., 1998; MARTON et al., 2003), a utilização de resinas de troca-iônica (VINÃLS, MANCILHA, POPPI, 2000,) ou mesmo a combinação destes procedimentos (MARTON et al., 2004). Outras metodologias que propiciaram a melhoria da produtividade de xilitol por C. guilliermondii foram a utilização de células adaptadas ao hidrolisado e a reutilização destas em sucessivas etapas de fermentação, encontrando-se a 13

27 Revisão Bibliográfica redução da concentração dos compostos tóxicos do hidrolisado de bagaço de cana principalmente pela assimilação do ácido acético (SENE et al., 1998; MATOS, 2004). Além disso, também tem sido avaliada a reutilização de células de C. guilliermondii imobilizadas em alginato de cálcio (CARVALHO et al., 2003) Influência da Glicose como Co-Substrato na Bioconversão de Xilose em Xilitol A produção de xilitol a partir de hidrolisados hemicelulósicos é um processo influenciado pela concentração de açúcares no meio de fermentação e pela proporção em que estes açúcares aparecem, uma vez que altas concentrações de açúcares monoméricos poderiam causar estresse osmótico, inibir a indução da enzima xilose redutase, ou levar à produção de etanol em concentração acima do nível de tolerância da levedura (WALTHER, HENSIRISAK, AGBLEVOR, 2001). Segundo Walther, Hensirisak e Agblevor (2001), a proporção de açúcares pode influenciar o transporte ou a cinética enzimática em casos em que ambos os açúcares competem pelo mesmo sistema de transporte ou são simultaneamente metabolizados. No caso de hidrolisados hemicelulósicos, obtidos por hidrólise ácida, a concentração destes açúcares é variável em função da matéria-prima (TABELA I). TABELA I. Principais açúcares encontrados em hidrolisados hemicelulósicos de diferentes matérias-primas Matéria- Prima Bagaço de cana Palha de trigo Palha de arroz Casca de aveia Cavacos de eucalipto Açúcares (g/l) Xilose Glicose Arabinose Relação glicose:xilose 18,24 1,20 1,71 1:15 10,65 2,79 1,78 1:4 18,33 3,29 3,40 1:6 Referências RODRIGUES et al., 2003b CANILHA, CÂNDIDO, ALMEIDA E SILVA, 2003 MUSSATO, ROBERTO, ,33 1,61 3,03 1:20 FELIPE et al., ,17 2,54 0,41 1:8 CANETTIERI, ALMEIDA E SILVA, FELIPE, 2002 De acordo com Spencer-Martins (1994), a utilização de carboidratos por leveduras requer ou seu transporte através da membrana plasmática ou sua 14

28 Revisão Bibliográfica hidrólise externa, seguida pelo consumo de seus produtos resultantes, encontrandose que os monossacarídeos podem entrar auxiliados por proteínas de membrana (permeases ou carreadores) a partir de mecanismos de difusão facilitada dependentes do gradiente de concentração do açúcar, ou por mecanismo ativo dependente de energia metabólica. A literatura não apresenta informações quanto aos mecanismos específicos para utilização de açúcares em C. guilliermondii, mas em geral as células transportam glicose preferencialmente, porém as membranas celulares não são livremente permeáveis a moléculas de açúcares altamente polares e vários mecanismos complexos existem para a translocação da glicose para o interior das células (WALKER, 1998). Em S. cerevisiae, o transporte de monossacarídeos como a glicose ocorre por difusão facilitada porém, a situação pode ser diferente em outras leveduras (FLORES et al., 2000). A difusão facilitada é mencionada como sistema de transporte para Kluyveromyces lactis a partir de dois genes que codificam transportadores com diferentes afinidades por glicose (BILLARD et al., 1996), enquanto em C. utilis este sistema ocorre quando as células são cultivadas sob altas concentrações de glicose embora o transporte por simporte com prótons ocorra sob baixa concentração desta hexose (van den BROEK et al., 1997). O transporte de xilose em leveduras tem sido bastante investigado bioquimicamente, evidenciando os mecanismos por simporte xilose/próton de alta afinidade e difusão facilitada como sistemas operados nestes microrganismos (GÁRDONYI et al., 2003). Ainda segundo Gárdonyi et al. (2003), o sistema de transporte ativo simporte xilose/próton mostra maior especificidade e alta afinidade para xilose quando comparado aos transportadores por difusão facilitada. Em Pichia stipitis o transporte de D-xilose (simporte de prótons) ocorre através de um sistema de alta afinidade e outro de baixa afinidade, sendo o de baixa afinidade compartilhado por D-xilose e D-glicose, ao passo que o de alta afinidade é inibido por D-glicose. Ao contrário do observado para P. stipitis, o transporte de D- xilose em Candida shehatae ocorre tanto por simporte de prótons como por difusão facilitada (KILIAN, van UDEN, 1988). Para leveduras, a glicose é a fonte de carbono e energia preferencial. É uma importante molécula mensageira primária, ótima sinalizadora das condições de crescimento para a maquinaria celular. A glicose também afeta muitas 15

29 Revisão Bibliográfica características de leveduras comercialmente importantes, como a taxa de crescimento, a capacidade fermentativa e a resistência ao estresse (ROLLAND, WINDERICKX, THEVELEIN, 2002). Várias leveduras fermentadoras de pentoses parecem diferir em suas respostas ao efeito regulatório que a glicose e outras hexoses podem exercer sobre o metabolismo de xilose e outros açúcares. Em geral, o modelo observado para o comportamento de leveduras durante o cultivo em mistura de açúcares é a inibição ou retardamento da utilização de xilose pela presença de glicose no meio, observando-se que os açúcares são assimilados seqüencialmente sendo a glicose o primeiro a ser consumido (DU PREEZ, 1994; TAVARES et al., 2000). Walther, Hensirisak e Agblevor (2001) observaram, durante o cultivo de C. tropicalis em meio contendo xilose (60 g/l) e glicose (0-80 g/l), a utilização seqüencial destes açúcares. Estes autores constataram que se a glicose estava presente no meio, alta densidade celular foi obtida sem o consumo da xilose e a produção de xilitol foi fortemente inibida por dois mecanismos: (1) o consumo de xilose foi reprimido e (2) o etanol produzido a partir da utilização da glicose inibiu parcialmente a formação de xilitol. Além disso, o rendimento de xilitol foi influenciado em função da presença de glicose e do regime de aeração, observando-se o máximo rendimento na presença de glicose em condição microaeróbia. Felipe et al. (1993) também constataram que o efeito da glicose sobre a bioconversão de xilose em xilitol foi dependente da proporção desta em relação a xilose, sendo que a formação de xilitol por C. guilliermondii em meio semi-sintético não foi afetada quando a concentração desta hexose foi inferior a 10% do total de xilose. ROSA et al. (1998) observaram o favorecimento da formação de xilitol por C. guilliermondii em meio sintético contendo xilose (60 g/l) e glicose (5 g/l). Em trabalhos realizados com Pachysolen tannophilus constatou-se um efeito benéfico no consumo de xilose com a presença de 0,5% de glicose no meio (JEFFRIES, LIGHTFFOT, FADY, 1985). Segundo Yahashi et al. (1996a), a bioconversão de xilose em xilitol por células imobilizadas de C. tropicalis foi mais eficiente na presença de glicose, a qual foi utilizada para o crescimento celular antes da utilização da xilose, permitindo a geração de NADPH pelo metabolismo através da via das fosfopentoses. De acordo com Lee (1992), a glicose parece inativar as enzimas envolvidas no metabolismo da xilose, mas a inativação pode ser reversível em baixas 16

30 Revisão Bibliográfica concentrações de glicose. A presença desta hexose prontamente metabolizável pode levar a problemas de regulação devido à interação entre o metabolismo de diferentes açúcares, resultando em pobre assimilação de xilose e grande influência no rendimento e produtividade de xilitol (TAVARES et al., 2000). A presença de glicose como co-substrato também é importante quando se utilizam microrganismos recombinantes para obtenção de xilitol, principalmente S. cerevisiae, a fim de se fazer manutenção da energia e geração de NAD(P)H (HALLBORN et al., 1994; THESTRUP, HAHN-HÄNGERDAL, 1995). A estimulação do metabolismo de xilose pela glicose pode ser explicada pela geração de intermediários metabólicos para os passos iniciais do metabolismo de xilose pela via das fosfopentoses, através do metabolismo da glicose (FIGURA 2), uma vez que coenzimas tais como NADH e NADPH são essenciais para a redução enzimática da xilose com xilose redutase (MEINANDER, BOELS, HAHN- HÄNGERDAL, 1999; CHUNG et al., 2002) As Enzimas Xilose Redutase e Xilitol Desidrogenase A enzima xilose redutase (XR) de C. guilliermondii é um membro da superfamília aldo-ceto redutase (HANDUMRONGKUL, MA, SILVA, 1998). Entre as enzimas que catalisam reações de oxidação e redução em sistemas vivos estão aquelas pertencentes à superfamília aldo-ceto redutase (AKR). Membros desta superfamília são encontrados em todos os tipos de organismos, como mamíferos, anfíbios, plantas, leveduras, protozoários e bactérias (JEZ, GEOFFREY, PENNING, 1997; JEZ, PENNING, 2001). A superfamília aldo-ceto redutase é composta por 14 famílias e mais de 100 proteínas (UNIVERSITY OF PENNSYLVANIA, 2004). Embora vários dímeros e tetrâmeros tenham sido caracterizados, elas são na maioria, proteínas monoméricas, com massa molecular de aproximadamente 35 kda, e catalisam a redução de aldeídos em seus correspondentes álcoois (JEZ, PENNING, 2001). Segundo Ellis (2002), as enzimas da superfamília AKR compartilham um dobramento tridimensional em forma de barril (α/β) 8, e informações estruturais têm revelado importantes detalhes sobre o mecanismo catalítico que envolve um conjunto de quatro aminoácidos que consiste de tirosina, histidina, aspartato e lisina (Tyr, His, Asp e Lys), que são uma seqüência conservada na maioria das AKR. De acordo 17

31 Revisão Bibliográfica com Wilson et al. (2003), após a transferência de H + do cofator, um próton da tirosina é ativado pela cadeia lateral da lisina; o aspartato serve para polarizar a cadeia lateral da lisina, enquanto que o papel da histidina ainda não está claro, mas parece estar associado à ligação do substrato. Todas as AKRs conhecidas possuem atividade enzimática utilizando o cofator NADPH como doador de H + e algumas podem utilizar, adicionalmente, o NADH (NEUHAUSER et al., 1998). Outra característica que também parece ser altamente conservada é a ligação destas enzimas ao cofator NADPH sem um dobramento Rossman (JEZ, GEOFFREY, PENNING, 1997; ELLIS, 2002). As XRs de leveduras formam a sub-família AKR2B8, as quais catalisam a redução de xilose em xilitol, como parte da via para a xilulose, a qual pode conectarse às vias fosfopentose, Embden-Meyerhof ou fosfocetolase (FIGURA 3). Elas são proteínas monoméricas consistindo de cerca de 320 aminoácidos, com um alto grau de similaridade na seqüência destes aminoácidos (ELLIS, 2002). FIGURA 3. Esquema do metabolismo de D-xilose em leveduras. ( ) via das fosfopentoses, (----) via fosfocetolase, (1) xilose redutase, (2) xilitol desidrogenase, (3) xilulosequinase, (4) enzimas da via das fosfopentoses, (5) enzimas da via glicolítica + piruvato descarboxilase + álcool desidrogenase, (6) fosfoglicose isomerase, (7) glicose 6P e 6 fosfogluconato desidrogenase, (8) xilulose 5P fosfocetolase, (9) acetatoquinase e álcool desidrogenase (GÍRIO, AMÁLIA PEITO, AMARAL-COLLAÇO, 1989). 18

32 Revisão Bibliográfica Xilose redutase de diferentes leveduras e fungos têm sido purificadas e parcialmente caracterizadas. A maioria destas enzimas é monomérica com massa molar em torno de 33 a 40 kda, porém, as enzimas de P. stipitis e C. tropicalis consistem de duas subunidades idênticas, sendo que a natureza da interação destas subunidades ainda não é bem conhecida, bem como a existência de interação alostérica durante a redução de xilose pela xilose redutase de P. stipitis (LEE, 1998). Estudos têm sido desenvolvidos para a identificação dos resíduos cataliticamente essenciais na XR, e esclarecimento quanto ao seu mecanismo de reação. Em estudos de modificação química, os aminoácidos cisteína e histidina mostraram-se essenciais para a atividade desta enzima (WEBB, LEE, 1990). Webb e Lee (1992) observaram modificações na atividade enzimática após tratamento com modificadores dos grupos histidil e tiol, sugerindo o envolvimento destes grupos no sítio catalítico da XR. Além disto, Kostrzynska, Sopher e Lee (1998) observaram que em P. stipitis os resíduos de lisina (Lis 270) estão envolvidos na ligação da XR ao cofator NADPH. O gene (xyl 1) da xilose redutase dependente de NAD(P)H de P. stipitis foi clonado e seqüenciado (AMORE et al., 1991; HALLBORN et al., 1991). Este gene não contém íntrons e é composto por uma região codante de 954 pb, que codifica um polipepetídeo com 318 aminoácidos e massa molar de 35,8 kda (LEE, 1998). Dois genes da XR de C. tropicalis também foram clonados e seqüenciados e os produtos destes genes diferem em apenas 3 aminoácidos (YOKOYAMA et al., 1995). Handumrongkul, Ma e Silva (1998) clonaram e caracterizaram o gene de xilose redutase (xyl 1) de C. guilliermondii ATCC A região codante de xyl 1 contém 954 nucleotídeos e codifica uma proteína de 317 aminoácidos com massa molar de 36 kda, baixo ponto isoelétrico (pi 5,7) e um alto conteúdo de aminoácidos hidrofóbicos com predominância de resíduos de leucina. Segundo estes autores, a seqüência de aminoácidos derivados da xilose redutase de C. guilliermondii foi 70,4% homóloga à de P. stipitis e diferenças na especificidade do cofator podem ser devido a diferenças no número de resíduos histidina e nas suas localizações entre as duas proteínas. As XRs de C guilliermondii e P. stipitis contêm número e localização idênticos para os resíduos de cisteína e diferentes localizações para histidina; além disto, C. guilliermondii possui um resíduo de histidina adicional, o que pode contribuir para a sua afinidade pelo cofator NADPH. 19

33 Revisão Bibliográfica Quanto à xilitol desidrogenase (XDH), ainda são encontrados poucos trabalhos na literatura que descrevem esta enzima. Em P. stipitis esta enzima possui duas subunidades de 32 kda, apresentando massa molecular de 63 kda (RIZZI et al., 1989). Já a xilitol desidrogenase de C. shehatae apresentou massa molar de 82 kda para a enzima na sua forma nativa e de 40 kda na forma desnaturada, indicando que a xilitol desidrogenase é composta de duas subunidades (YANG, JEFFRIES, 1990). No caso de Neurospora crassa, a XDH apresenta massa molar de 87 kda, sendo composta por duas subunidades idênticas de 43,6 kda (PHADTARE, RAWAT, RAO, 1997). KÖTTER et al. (1990) isolaram e caracterizaram o gene da xilitol desidrogenase (xyl 2) de P. stipitis. A região codante do gene xyl 2 contém 1089 nucleotídeos e codifica um polipeptídeo de 363 aminoácidos com massa molar de 38,5 kda. As estruturas moleculares das enzimas XR e XDH de diferentes leveduras podem ser observadas nas FIGURAS 4, 5 e 6. Dependendo da levedura, as enzimas xilose redutase e xilitol desidrogenase podem ter especificidades diferentes em relação aos cofatores oxidados e reduzidos. A enzima XR sintetizada por C. utilis requer como cofator NADPH, enquanto a XDH é dependente de NAD +. Porém, em P. stipitis, C. shehatae e P. tannophilus estas enzimas têm afinidade pelos cofatores reduzidos (NADPH/NADH) e oxidados (NAD + /NADP + ) (BRUINENBERG et al., 1984; HAHN-HÄNGERDAL et al., 1994). Em C. guilliermondii FTI a enzima XR é NADPH-dependente e a enzima XDH é NAD + ou NADP + -dependente (SILVA et al.,1996a). Segundo Silva et al. (1996a), a atividade enzimática de XR e XDH de C. guilliermondii foi fortemente afetada pela idade do inóculo e a concentração inicial de xilose durante fermentação de meio sintético. Estes autores determinaram que as maiores atividades de XR e XDH foram verificadas empregando-se inóculo de 40 h e concentração inicial de xilose de 120 g/l. De acordo com Lee, Sopher e Yau (1996), em C. guilliermondii a utilização de xilose está sujeita à regulação por indução e repressão catabólica, encontrando-se que a D-xilose e a L-arabinose são os melhores indutores das atividades de XR e XDH, enquanto que a D-glicose reprime esta indução. Sugai e Delgenes (1995) relataram que a glicose reprimiu parcialmente a indução da aldose redutase de C. guilliermondii pela xilose, e 20

34 Revisão Bibliográfica FIGURA 4. Estrutura da xilose redutase de C. tenuis, a partir do Structure Explorer 1MI3-PDB (KAVANAGH, KLIMACEK, NIDETZKY, 2003). FIGURA 5. Estrutura da xilose redutase de P. guilliermondii, a partir do Swiss-Model (Automated Protein Modelling Server) (KOPP, SCHEDE, 2004). FIGURA 6. Estrutura da xilitol desidrogenase de Candida sp., a partir do Swiss-Model (Automated Protein Modelling Server) (PEITSCH, 1995). 21