HPV OncoTect. Pr od uct Cod e C For In Vitro Diagnostic Use

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1 HPV OncoTect Pr od uct Cod e C12100 For In Vitro Diagnostic Use FOR EXPORT ONLY Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx, Inc

2 Page 2 Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx,Inc

3 Page 3 Table of Contents Page Number 10 Intended use 4 20 Summary and explanation of the test 4 30 Principles of the procedure 5 31 Reagents and materials supplied 5 32 Reagents preparation 6 33 Materials required but not supplied 6 40 Warning and precautions 6 50 Specimen collection and storage 7 60 Instrument setup 7 70 Preparation and recommendations 8 80 Procedure 8 81 Cell Fixation 8 82 Cell Hybridization 9 83 Cell Stringency Washes 9 84 Cell Analysis by Flow Cytometry Interpretation of results Quality Control 110 Procedural precautions 120 Procedural limitations Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx,Inc

4 Page 4 10 INTENDED USE The HPV OncoTect Test Kit is a cell based assay, which utilizes molecular in situ hybridization as the test method for the detection of Human Papillomavirus Virus (HPV) E6, E7 mrna in intact human cells This kit has been designed to be used with other established methodologies as an indicator of disease activity This test can be used in any single cell suspension appropriate for flow cytometry or image analysis Types of specimen may include: liquid-based cytology specimens, cell lines, dissociated tissues, and bodily fluids The HPV OncoTect Test provides specific information useful in assessing viral production at the cellular level Current investigations suggest that in situ detection of active viral mrna precedes or coincides with morphologic changes in cervical cells signifying dysplasia or cervical cancer 20 SUMMARY AND EXPLANATION OF THE TEST The detection of HPV has particular importance in the area of cervical cancer pathogenesis HPV is a partially double-stranded papillomavirus that has no RNA phase in its lifecycle HPV is an 8000 base-pair virus with a genome organization as follows: HPV genes: L1 - major capsid protein L2 - minor capsid protein E1 - initiation of DNA replication E2 - transcriptional regulation E3 - no known function E4 - late protein disrupts cytokeratin E5 - interacts with growth factor receptors E6 - transforming protein, targets degradation of p53 E7 - transforming protein that targets RB E8 - no known function Cervical cancer has been linked to HPV infection and in particular, oncogenic serotypes of HPV Genotypic DNA is encoded in the L1 gene region that consists of the major capsid proteins Detection of the presence of HPV and specifically oncogenic serotypes of HPV has been done by a variety of solution-based techniques Most of these techniques have in common the destruction of cells containing HPV, isolation and purification of total DNA, and detection of serotype-specific HPV DNA sequences (L1) The techniques used for detection include predominantly polymerase chain reaction (PCR), hybrid capture/liquid hybridization (HC2 ), and Southern blot All of these techniques involve destruction of cells, detection of HPV DNA, and detection of L1 genes for serotype specificity The HPV OncoTect E6, E7 mrna test utilizes a different approach to detect viral infection, including a different selection strategy for oncogenic serotypes, different detection methodology, and a different HPV gene target (mrna) Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx,Inc

5 Page 5 1 HPV OncoTect E6, E7 mrna test uses a novel in situ hybridization technique with proprietary probes 2 HPV OncoTect E6, E7 mrna test is based on the fact that oncogenic genotypes of HPV can over express E6, and E7 mrna following integration of HPV into genomic DNA; a process that causes cellular transformation and progression to cervical cancer 3 The HPV OncoTect E6, E7 mrna test does not destroy the cell for the purposes of detection so the cell remains intact 30 PRINCIPLES OF THE PROCEDURE The HPV OncoTect E6, E7 mrna test assay is composed of six (6) steps: 1 Proper collection and storage of the sample 2 Cell Fixation and Permeabilization 3 Pre-hybridization washes 4 Hybridization 5 Post-hybridization washes 6 Data acquisition and analysis Following any optional pre-hybridization cell handling procedures (eg, surface antigen labeling), the cells are fixed and permeabilized in a one-step reaction, washed twice in preparation for hybridization, hybridized with an oligonucleotide probe cocktail, washed to remove unbound probe and mismatches, and finally analyzed by flow (or image) cytometry This kit contains reagents for 100 tests 31 REAGENTS AND MATERIALS SUPPLIED 100 Test Kit Catalog Number C12100 Label Reagent Storage conditions (ºC) Reagent 1 Fixation Permeabilization Solution Reagent 2 Pre-hybridization Buffer Reagent 3 Pre-hybridization Buffer Reagent 4 Hybridization Buffer Reagent 5 HPV Probe Cocktail 2-8 Reagent 6 Stringency Wash Reagent 7 Stringency Wash Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx,Inc

6 Page 6 32 REAGENT PREPARATION Label Reagent Reagent 1 Fixation Permeabilization Add 15 ml sterile water Solution Reagent 4 Hybridization Buffer Add 32 ml formamide Reagent 5 HPV Probe Cocktail Add 315 L sterile water NOTE: When a new HPV OncoTect kit is opened for use, it is VERY IMPORTANT to properly prepare Reagents 1, 4 and 5 After the 315 L addition to Reagent 5, it is important to use vortex and wait 30 minutes before using it 33 MATERIALS REQUIRED BUT NOT SUPPLIED Chemical Products: - Formamide, Molecular Biology Grade - Sterile or nuclease-free water - PBS, ph 74 Consumables and Instrument: - Microcentrifuge tubes 15 ml (polypropylene) [Note: Samples are prepared in the 15 ml tubes but samples may need to be transferred to 12 x 75 mm polypropylene tubes to be run on the cytometer, depending on the instrument used] - Pipetman or equivalent pipetors (1-20uL, uL, uL range) - Vortex mixer - Centrifuge, which can be accurately set to 1000 X g - Vacuum aspirator or disposable pipets (eg, SAMCO transfer pipets) - Temperature controlled waterbath, which can be set to 43 C - Conventional Flow Cytometer or Capillary Flow Cytometer 40 WARNINGS AND PRECAUTIONS Reagent Handling: Formamide: It is a chemical product which can produce toxic effects by inhalation of its fumes or by its direct contact with skin This product must be handled carefully PBS: Should be handled in a manner that reduces the chance of contamination PBS must be kept covered when it is not being used It is not recommended to pipette PBS directly from the main container An adequate working volume (eg, 50 ml) should be transferred to a secondary container, maintaining clean conditions while doing so Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx,Inc

7 Page 7 HPV OncoTect E6, E7 mrna kit: With each new kit, it is important to remember to add sterile (or nuclease free) water to Reagent 1, to add formamide to Reagent 4 and to add sterile water to Reagent 5 Reagent 5: Reagents 1, 2, 3, 4, 6 and 7 can be stored at 15-30C Reagent 5 can be stored at 15-30C until the sample preparation process Once reconstituted, it should be replaced in the refrigerator at 2-8ºC About the cytometer: Between use, the flow cytometer should always be cleaned and maintained according to its manufacturer s instructions Failure to do so can adversely affect the quality of results obtained 50 SPECIMEN COLLECTION AND STORAGE Cervical cytology specimens are collected in the appropriate manner, as specified in the instructions supplied by the manufacturer of the sample collection brush and vial containing the preservative solution Alternatively, the collection procedure may be specified by the institution at which the collection is performed, as appropriate Specimens should be stored at 2-8ºC, as soon after collection as possible and until prepared for analysis Exposure of the specimens to high temperatures (in excess of C) has adverse effects on sample quality and such samples may need to be rejected The age of the sample can and will affect the quality of the results Optimally, samples should be prepared and analyzed within two weeks of collection Three weeks is considered to be the maximum time between sample collection and the preparation and analysis of the sample 60 INSTRUMENT SET UP Instrument standardization and quality control should be performed every day that samples will be run on the system The methods used to do this are provided by the instrument manufacturer and should be followed as previously described 1 The institution may have additional requirements for assessing system performance according to the laboratory s standard operating procedures These must also be performed and the results recorded Prior to running samples, instrument set-up should be performed as per the manufacturer s protocols 1 Purvis, N and Stelzer, G Multi-platform, multi-site instrumentation and reagent standardization Cytometry 33: , 1998 Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx,Inc

8 Page 8 70 PREPARATION AND RECOMMENDATIONS Each day that samples are to be prepared and run, the following should be done: - Prepare the Reagent mixture needed for the hybridization step of the procedure Select a tube size that is of sufficient volume to contain the amount of hybridization cocktail that is required for the number of samples that will be prepared (100 µl of Reagent µl of Reagent 5 for each sample) Gently mix the contents of the tube and pipet 103 µl of the mixture into each sample tube at the appropriate time of the sample preparation process Specimens and reagents specifications during the process: - There is only one point in the sample preparation process where an interruption is allowed After the addition of Reagent 1 to the sample(s), cells are universally permeabilized after 1 hour but can be held in Reagent 1 for up to 2 hours Once the sample preparation process has proceeded beyond the addition of Reagent 1, the preparation should be continued until its completion - When the preparation process is complete, the samples must be analyzed promptly, though they may be stored in the refrigerator (2-8ºC) for up to 12 hours, prior to analysis, if that becomes necessary 80 PROCEDURE The cytometer settings must be optimized for all measurement parameters that will be used to analyze the samples This process requires the use of a negative control cell sample and then 20 or 30 samples from cytology normal patients The sample preparation protocol provided has been designed to be relatively simple and rapid Optimal results will be obtained by paying careful attention to each step in the protocol, as well as by proper specimen handling throughout the procedure These guidelines have been determined based on previous research, and it is strongly recommended that the procedure be followed exactly as written Results may be adversely affected by any changes in the sample preparation protocol NOTE: When mixing cells, they should be either vortexed gently, preferably at a medium setting for 1 2 seconds, or mixed by flicking the tube with a finger Look closely at the cells in the tube to ensure that the cell pellet has been dissociated Over-vortexing or rough handling of the cells will lead to excessive debris and may adversely affect the results obtained 81 CELL FIXATION 1 Transfer 1 ml (approximately 1x10 6 cells) from each liquid based cervical cytology specimen into separate 15 ml polypropylene Eppendorf-style tubes or equivalent 15 ml microcentrifuge tube Centrifuge at 1000 x g for Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx,Inc

9 Page 9 5 min at room temperature Aspirate supernatant, being careful not to disturb cell pellet 2 Wash cells in 1 ml PBS ph 74 and centrifuge at 1000 x g for 5 minutes at room temperature Aspirate supernatant, being careful not to disturb cell pellet 3 Add 300 ul of Reagent 1 to each sample tube, vortex cells gently to prevent cell clumping Incubate at room temperature for 1 hour NOTE: If there is no visible pellet following the first centrifugation of the sample, the supernatant should be removed and another milliliter of sample should be added The sample is then centrifuged again 82 HYBRIDIZATION Prepare: Water bath at 43 C ± 1 C Place Reagent 6 and Reagent 7 in the 43 C water bath, to allow them to pre-heat (allow at least 30 minutes for these reagents to reach 43 C, prior to adding them to the samples) 1 Wash cells in 1 ml Reagent 2, vortex cells gently, centrifuge at 1000 x g for 5 minutes at room temperature, full brake Aspirate supernatant, being careful not to disturb cell pellet 2 Vortex cells gently in residual fluid 3 Add 1 ml Reagent 3, vortex cells gently, centrifuge at 1000 x g for 5 minutes at room temperature, full brake Aspirate supernatant, being careful not to disturb cell pellet Remove as much residual volume as possible without disturbing the pellet 4 Vortex cells gently in residual fluid 5 Prepare hybridization cocktail by mixing 100 L of Reagent 4 with 3 L of Reagent 5 per sample in a 15 ml polypropylene tube (or other tube that has sufficient volume for all of the cocktail) Add 103 L of the mixture to each sample tube Vortex cells gently 6 Incubate in preheated 43 C ± 1 o C water bath for 30 minutes 83 CELL STRINGENCY WASHES 1 Add 1 ml pre-warmed Reagent 6 to each sample tube; vortex cells gently Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx,Inc

10 Page 10 2 Centrifuge at 1000 x g for 5 minutes at room temperature, full brake Aspirate supernatant, being careful not to disturb cell pellet Vortex gently in residual fluid 3 Add 1 ml pre-warmed Reagent 7 to each sample tube, vortex cells gently 4 Incubate in 43 C water bath for 15 minutes 5 Centrifuge at 1000 x g for 5 minutes at room temperature, full brake Aspirate supernatant, being careful not to disturb cell pellet Vortex cells gently in residual fluid 6 Re-suspend cells in L of 1X PBS, ph 74 Vortex 7 Samples are ready for cytometric analysis 84 CELL ANALYSIS BY FLOW CYTOMETRY 1 Evaluate instrument performance, in accordance with the daily quality control procedures that are recommended by the instrument manufacturer or by the laboratory SOP for this procedure For example, if the cytometer is a Guava PCA, Guava Check must be run each working day before running the samples as a quality control 2 The instrument settings and the analysis protocol will vary, according to the type of cytometer that is used The QC procedures also typically vary from one cytometer to another 3 If available, use forward scatter versus side scatter gating to identify and set an analysis gate on the cell type of interest (ectocervical cells) for analysis There should be a minimum of 1000 events in the analysis gate 90 INTERPRETATION OF RESULTS The result is expressed as the percentage of cervical cells in the analysis gate that over-express oncoproteins E6 and E7 mrna If this percentage is above the clinical cut-off, the HPV OncoTect E6, E7 mrna test result is reported as positive If the result is less than the clinical cut-off, it is reported as a negative result The following are requirements for reporting a valid result: events is established as the target for data acquisition of the events must be ectocervical cells (ie, in the analysis gate) - The gated population should have the appropriate appearance [Note: a FSC vs SSC plot should be displayed for a conventional cytometer, in addition to the FSC vs PM2 for the Guava Technologies cytometer] Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx,Inc

11 Page 11 - Assuming the sample result is valid: Positive results are determined by reading above a cut off of 2% of cells or a cut-off as determined by taking the mean of 20 cytologically normal samples plus 2 standard deviations from the mean as a cut-off Negative results are less than 2% of cells 100 QUALITY CONTROL At least one replicate of the positive and negative controls should be processed with each batch of 24 specimens As with any new procedure, new operators may need to run more controls until such time that a high confidence is reached in their ability to perform the test procedure correctly If the negative or positive controls do not perform as expected then the run should be considered invalid and the test procedure should be repeated 110 PROCEDURAL PRECAUTIONS 1 As with any laboratory procedure, good laboratory technique is important to ensure proper performance of the assay Due to the high analytical sensitivity of the test, care should be taken to preserve purity of reagents Monitor reagents for purity and discard any reagents that appear suspect 120 PROCEDURAL LIMITATIONS 1 This test has been validated on cervical cells in liquid media including PreservCyt and SurePath Other specimen types have not been validated 2 Adequate specimen collection, transport and storage are important factors to obtain reliable results 3 The HPV OncoTect E6, E7 test has been performed on Partec CyFlow, Beckman-Coulter XL and FC500, Becton-Dickinson FACSCalibur and FACScan, Guava EasyCyte, and Accuri C5/C6 Flow Cytometers Labs utilizing different flow cytometers should validate the performance Copyright 2011 ALL RIGHTS RESERVED Not to be reproduced, duplicated, or disseminated without prior written consent of IncellDx,Inc

12 Página 12 Índice Número de página 10 Uso previsto Resumen y explicación de la prueba Principios del procedimiento Reactivos y materiales suministrados Preparación de reactivos Materiales necesarios pero no suministrados Advertencia y precauciones Recogida y conservación de muestras Configuración del instrumento Preparación y recomendaciones Procedimiento Fijación celular Hibridación celular Lavados celulares restrictivos Análisis celular mediante citometría de flujo Interpretación de resultados Control de calidad 110 Precauciones procedimentales 120 Limitaciones procedimentales Copyright 2011 TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS Prohibida la reproducción, duplicación o difusión sin la autorización previa por escrito de IncellDx, Inc

13 Página USO PREVISTO El kit de la prueba HPV OncoTect es un ensayo celular, que utiliza hibridación in situ molecular como herramienta para la detección del ARNm de E6, E7 del virus del papiloma humano (VPH) en células humanas intactas Este kit se ha diseñado para su uso con otras metodologías establecidas como indicador de actividad de la enfermedad Esta prueba puede usarse en cualquier suspensión de células individuales apropiada para citometría de flujo o análisis de imágenes Los tipos de muestra pueden incluir: muestras de citología en medio líquido, líneas celulares, tejidos disociados y líquidos corporales La prueba HPV OncoTect proporciona información específica útil en la evaluación de la producción viral a nivel celular Las actuales investigaciones sugieren que la detección in situ de ARNm viral activo precede o coincide con cambios morfológicos en las células cervicales que indican displasia o cáncer cervicouterino 20 RESUMEN Y EXPLICACIÓN DE LA PRUEBA la detección del VPH tiene particular importancia en el área de la patogénesis del cáncer cervicouterino de cérvix El VPH es un papilomavirus parcialmente de doble cadena que no tiene ninguna fase ARN en su ciclo vital El VPH es un virus de 8000 pares de bases con la siguiente organización genómica: VPH genes: L1 - proteína mayor de la cápside L2 - proteína menor de la cápside E1 - iniciación de la replicación de ADN E2 - regulación transcripcional E3 - sin función conocida E4 - proteína tardía que altera la citoqueratina E5 - interactúa con los receptores del factor de crecimiento E6 - proteína transformadora, induce la degradación de p53 E7 - proteína transformadora que se centra en RB E8 - sin función conocida Copyright 2011 TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS Prohibida la reproducción, duplicación o difusión sin la autorización previa por escrito de IncellDx, Inc

14 Página 14 El cáncer de cérvix se ha vinculado a la infección del VPH y en particular, a serotipos oncogénicos del HPV El ADN genotípico está codificado en la región del gen L1 que está compuesta de proteínas mayores de la cápside La detección de la presencia de VPH y específicamente de serotipos oncogénicos del VPH se ha realizado a través de una amplia variedad de técnicas basadas en soluciones La mayoría de estas técnicas tienen en común la destrucción de células que contienen VPH, el aislamiento y purificación del ADN total, y la detección de secuencias de ADN del VPH específicas de serotipo Las técnicas utilizadas para la detección incluyen principalmente la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la captura de híbridos/hibridación en soporte líquido (HC2 ) y el método de Southern (Southern blot) Todas estas técnicas implican la destrucción de células, la detección de ADN del VPH y la detección de genes L1 de especificidad serotípica La prueba VPH OncoTect del ARNm de E6, E7 utiliza un enfoque diferente para detectar la infección viral, incluida una estrategia de selección de serotipos oncogénicos diferente, una metodología de detección diferente y un gen diana del VPH diferente (ARNm) 1 La prueba HPV OncoTect del ARNm de E6, E7 utiliza una novedosa técnica de hibridación in situ con sondas patentadas 2 La prueba HPV OncoTect del ARNm de E6, E7 se basa en el hecho de que los genotipos oncogénicos del VPH pueden sobreexpresar el ARNm de E6 y E7 después de la integración del VPH en el ADN genómico; un proceso que provoca la transformación celular y la progresión del cáncer de cérvix 3 La prueba HPV OncoTect del ARNm de E6, E7 no destruye la célula con el propósito de la detección, de modo que la célula permanece intacta 30 PRINCIPIOS DEL PROCEDIMIENTO El ensayo de la prueba HPV OncoTect del ARNm de E6, E7 se compone de seis (6) pasos: 1 Recogida y conservación adecuadas de la muestra 2 Fijación y permeabilización celular 3 Lavados pre-hibridación 4 Hibridación 5 Lavados post-hibridación 6 Obtención y análisis de datos Después de cualquier procedimiento de manipulación celular prehibridación opcional (p ej, marcaje de antígenos de superficie), las células se fijan y permeabilizan en una reacción de un paso, se lavan dos veces en preparación para la hibridación, se hibridan con un combinado de sondas de oligonucleótidos, se lavan para eliminar sondas no ligadas y ligadas parcialmente, y finalmente se analizan mediante citometría de flujo (o imagen) Este kit contiene reactivos para 100 pruebas Copyright 2011 TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS Prohibida la reproducción, duplicación o difusión sin la autorización previa por escrito de IncellDx, Inc

15 Página REACTIVOS Y MATERIALES SUMINISTRADOS Número de catálogo del kit de 100 pruebas: C12100 Etiqueta Reactivo Condiciones de conservación (ºC) Reactivo 1 Fijación Permeabilización Solución Reactivo 2 Amortiguador prehibridación Reactivo 3 Amortiguador prehibridación Reactivo 4 Amortiguador de hibridación Reactivo 5 Combinado de sondas de VPH 2-8 Reactivo 6 Lavado restrictivo Reactivo 7 Lavado restrictivo PREPARACIÓN DE REACTIVOS Etiqueta Reactivo Reactivo 1 Fijación Permeabilización Solución Añada 15 ml de agua estéril Reactivo 4 Amortiguador de hibridación Añada 32 ml de formamida Reactivo 5 Combinado de sondas de VPH Añada 315 L de agua estéril NOTA: Cuando se abre un nuevo kit VPH OncoTect para su uso, es MUY IMPORTANTE preparar adecuadamente los Reactivos 1, 4 y 5 Después de añadir 315 L al Reactivo 5, es importante utilizar un agitador tipo vórtex y esperar 30 minutos antes de usarlo 33 MATERIALES NECESARIOS PERO NO SUMINISTRADOS Productos químicos: - Formamida, calidad para biología molecular - Agua estéril o sin nucleasas - PBS (Solución salina amortiguada con fosfatos), ph 7,4 Consumibles e instrumental: - Tubos de microcentrifuga de 1,5 ml (polipropileno) [Nota: las muestras se preparan en los tubos de 1,5 ml pero puede que sea necesario transferirlas a tubos de prolipropileno de 12 x 75 mm para su análisis en el citómetro, dependiendo del instrumento utilizado] - Pipetman o pipetas equivalentes (intervalo 1-20 ul, ul, ul) - Agitador tipo vórtex - Centrifuga, que pueda configurarse con precisión a 1000 x g - Aspirador de vacío o pipetas desechables (p ej, pipetas de transferencia SAMCO ) - Baño María de temperatura controlada, que pueda configurarse a 43 C Copyright 2011 TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS Prohibida la reproducción, duplicación o difusión sin la autorización previa por escrito de IncellDx, Inc

16 Página 16 - Citómetro de flujo convencional o citómetro de flujo capilar 40 ADVERTENCIAS Y PRECAUCIONES Manipulación de reactivos: Formamida: Es un producto químico que puede producir efectos tóxicos por la inhalación de sus emanaciones o por el contacto directo con la piel Este producto debe manipularse con precaución PBS (Solución salina amortiguada con fosfatos): Se debe manipular de forma que se reduzcan las posibilidades de contaminación La PBS debe mantenerse tapada cuando no se esté usando No se recomienda pipetear PBS directamente del recipiente principal Debe transferirse un volumen de trabajo adecuado (p ej, 50 ml) a un recipiente secundario, manteniendo las condiciones de limpieza al hacerlo Kit HPV OncoTect del mrna E6, E7: Con cada nuevo kit, es importante recordar añadir agua estéril (o sin nucleasas) al Reactivo 1, añadir formamida al Reactivo 4 y añadir agua estéril al Reactivo 5 Reactivo 5: Los reactivos 1, 2, 3, 4, 6 y 7 pueden conservarse a C El reactivo 5 puede conservarse a C hasta el proceso de preparación de la muestra Una vez reconstituido, se debe de volver a colocar en el refrigerador a 2-8 ºC Acerca del citómetro: Entre usos, el citómetro de flujo debe limpiarse y mantenerse siempre de acuerdo con las instrucciones del fabricante El incumplimiento de lo anterior puede afectar negativamente a la calidad de los resultados obtenidos 50 RECOGIDA Y CONSERVACIÓN DE MUESTRAS Las muestras de citología cervical se recogen de la forma correcta, según se especifica en las instrucciones suministradas por el fabricante del cepillo de recogida de muestras y el vial que contiene la solución de conservación Alternativamente, la institución en la que se realice la recogida puede especificar el procedimiento de recogida, según resulte apropiado Las muestras deben conservarse a 2-8 ºC, tan pronto después de la recogida como sea posible y hasta que se preparen para su análisis La exposición de las muestras a temperaturas elevadas (por encima de C) tiene efectos adversos en la calidad de la muestra y puede que estas muestras deban ser rechazadas La antigüedad de la muestra puede afectar y de hecho afectará a la calidad de los resultados En condiciones óptimas, las muestras deben prepararse y analizarse en las Copyright 2011 TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS Prohibida la reproducción, duplicación o difusión sin la autorización previa por escrito de IncellDx, Inc

17 Página 17 dos semanas siguientes a la recogida Se considera que tres semanas es el tiempo máximo que puede transcurrir entre la recogida de la muestra y la preparación y análisis de la muestra 60 CONFIGURACIÓN DEL INSTRUMENTO La estandarización y control de calidad del instrumento debe realizarse todos los días que vayan a analizarse muestras en el sistema El fabricante proporciona los métodos utilizados para ello y deben seguirse como se indicaba anteriormente 1 Puede que la institución tenga requisitos adicionales para evaluar el rendimiento del sistema según los procedimientos operativos estándar del laboratorio Éstos también deben llevarse a cabo y deben registrarse los resultados Antes de analizar muestras, debe realizarse la configuración del instrumento según los protocolos del fabricante 70 PREPARACIÓN Y RECOMENDACIONES Cada día que se preparen y analicen muestras, se debe realizar lo siguiente: - Prepare la mezcla de reactivos necesaria para el paso de hibridación del procedimiento Seleccione un tamaño de tubo que tenga el volumen suficiente para contener la cantidad de combinado de hibridación necesario para el número de muestras que se prepararán (100 µl de reactivo µl de reactivo 5 para cada muestra) Mezcle con suavidad los contenidos del tubo y pipetee 103 µl de la mezcla en cada tubo de muestra en el momento apropiado del proceso de preparación de la muestra Especificaciones de las muestras y los reactivos durante el proceso: - Sólo existe un punto en el proceso de preparación de la muestra en la que se permite realizar una interrupción Después de añadir el reactivo 1 a la muestra o muestras, las células se impermeabilizan a nivel universal después de 1 hora pero pueden mantenerse en reactivo 1 durante un máximo de 2 horas Una vez que el proceso de preparación de la muestra ha avanzado más allá del punto en que se añade el reactivo 1, la preparación debe continuar hasta su finalización - Cuando el proceso de preparación se completa, las muestras deben ser analizadas inmediatamente, aunque pueden conservarse en el refrigerador (2-8 ºC) durante un máximo de 2 horas, antes del análisis, si resultase necesario 1 Purvis, N and Stelzer, G Multi-platform, multi-site instrumentation and reagent standardization Cytometry 33: , 1998 Copyright 2011 TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS Prohibida la reproducción, duplicación o difusión sin la autorización previa por escrito de IncellDx, Inc

18 Página PROCEDIMIENTO La configuracion del citómetro debe optimizarse para todos los parámetros de medición que se utilizarán para analizar las muestras Este proceso requiere el uso de una muestra celular de control negativo y, a continuación, 20 ó 30 muestras de citologías de pacientes normales El protocolo de preparación de la muestra proporcionado ha sido diseñado para que sea relativamente sencillo y rápido Se obtendrán los resultados óptimos si se pone una gran atención en cada paso del protocolo, así como a través de la manipulación adecuada de la muestra a lo largo del procedimiento Estas pautas se han determinado en base a la investigación previa y se recomienda enérgicamente seguir las indicaciones del procedimiento con exactitud Los resultados pueden resultar afectados negativamente por cualquier cambio realizado en el protocolo de preparación de la muestra NOTA: Cuando se mezclen las células, o bien se deben agitar suavemente en un agitador tipo vórtex, preferiblemente en una configuración media de 1-2 segundos, o se deben mezclar dando golpecitos con un dedo en el tubo Observe detalladamente las células en el tubo para garantizar que el sedimento celular se haya disociado Una agitación excesiva o una manipulación brusca de las células puede provocar un exceso de residuos y afectar adversamente a los resultados obtenidos 81 FIJACIÓN CELULAR 1 Transfiera 1 ml (aproximadamente 1 x 10 6 células) de cada muestra de citología cervical en medio líquido a tubos tipo Eppendorf de 1,5 ml de polipropileno o tubos de microcentrifugadora de 1,5 ml tipo Eppendorf o equivalentes Centrifugue a 1000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente Aspire el sobrenadante, poniendo cuidado en no perturbar el sedimento celular 2 Lave las células en 1 ml de PBS con ph 7,4 y centrifugue a 1000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente Aspire el sobrenadante, poniendo cuidado en no perturbar el sedimento celular 3 Añada 300 ul de Reactivo 1 a cada tubo de muestra, agite las células suavemente en un agitador tipo vórtex para evitar la aglutinación celular Incube a temperatura ambiente durante 1 hora NOTA: Si no hay sedimento visible después del primer centrifugado de la muestra, debe eliminarse el sobrenadante y añadirse otro mililitro de muestra Luego se centrifuga la muestra de nuevo Copyright 2011 TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS Prohibida la reproducción, duplicación o difusión sin la autorización previa por escrito de IncellDx, Inc

19 Página HIBRIDACIÓN CELULAR Prepare: Baño María a 43 C ± 1 C Coloque el Reactivo 6 y el Reactivo 7 en el baño María a 43 C, para permitir que se atemperen (espere al menos 30 minutos para que estos reactivos alcancen 43 C, antes de añadirlos a las muestras) 1 Lave las células en 1 ml de Reactivo 2, agite las células suavemente en un agitador tipo vórtex, centrifugue a 1000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, con frenado total Aspire el sobrenadante, poniendo cuidado en no perturbar el sedimento celular 2 Agite suavemente las células en el fluido residual 3 Añada 1 ml de Reactivo 3, agite las células suavemente en un agitador tipo vórtex, centrifugue a 1000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, con frenado total Aspire el sobrenadante, poniendo cuidado en no perturbar el sedimento celular Retire tanto volumen residual como sea posible sin perturbar el sedimento 4 Agite suavemente las células en el fluido residual 5 Prepare el combinado de hibridación mezclando 100 l de Reactivo 4 con 3 l de Reactivo 5 por muestra en un tubo de polipropileno de 15 ml (u otro tubo que tenga suficiente volumen para todo el combinado) Añada 103 l de mezcla a cada tubo de muestra Agite las células suavemente en un agitador tipo vórtex 6 Incube en un baño María precalentado a 43 C ± 1 C durante 30 minutos 83 LAVADOS CELULARES RESTRICTIVOS 1 Añada 1 ml de Reactivo 6 precalentado a cada tubo de muestra; agite las células suavemente en un agitador tipo vórtex 2 Centrifugue a 1000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, con frenado total Aspire el sobrenadante, poniendo cuidado en no perturbar el sedimento celular Agite suavemente las células en fluido residual 3 Añada 1 ml de Reactivo 7 precalentado a cada tubo de muestra; agite las células suavemente en un agitador tipo vórtex 4 Incube en un baño María a 43 C durante 15 minutos Copyright 2011 TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS Prohibida la reproducción, duplicación o difusión sin la autorización previa por escrito de IncellDx, Inc

20 Página 20 5 Centrifugue a 1000 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente, con frenado total Aspire el sobrenadante, poniendo cuidado en no perturbar el sedimento celular Agite suavemente las células en el fluido residual 6 Vuelva a suspender las células en l de 1X PBS, ph 7,4 Agite en un agitador tipo vórtex 7 Las muestras están listas para el análisis citométrico 84 ANÁLISIS CELULAR MEDIANTE CITOMETRÍA DE FLUJO 1 Evalúe el rendimiento del instrumento, de acuerdo con los procedimientos de control de calidad diarios recomendados por el fabricante del instrumento o por los procedimientos operativos estándar del laboratorio para este procedimiento Por ejemplo, si el citómetro es un Guava PCA, se debe realizar "Guava" cada día laborable antes de analizar las muestras como control de calidad 2 Las configuraciones del instrumento y el protocolo de análisis variarán, de acuerdo con el tipo de citómetro utilizado Los procedimientos de control de calidad normalmente también varían de un citómetro a otro 3 Si está disponible, utilice la dispersión frontal (FSC) frente a la dispersión lateral (SSC) para identificar y fijar un acotamiento de análisis del tipo celular de interés (células exocervicales) para su análisis Debería haber un mínimo de 1000 eventos en la ventana de análisis 90 INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS El resultado se expresa como el porcentaje de células cervicales en el acotamiento de análisis que sobreexpresan ARNm de las oncoproteínas E6 y E7 Si este porcentaje está por encima del límite clínico, el resultado de la prueba VPH OncoTect del ARNm de E6, E7 se reporta como positivo Si el resultado está por debajo del límite clínico, se reporta como resultado negativo A continuación se mencionan los requisitos para informar un resultado válido: - Se establece la cifra de 5000 eventos como el objetivo para la adquisición de datos de los eventos deben ser células ectocervicales (es decir, en la ventana de análisis) - La población incluida en el acotamiento debe tener la apariencia adecuada [Nota: debe mostrarse un diagrama de dispersión frontal (FSC) frente a dispersión lateral (SSC) para un citómetro convencional, además de dispersión frontal (FSC) frente a PM2 para el citómetro de Guava Technologies] Copyright 2011 TODOS LOS DERECHOS RESERVADOS Prohibida la reproducción, duplicación o difusión sin la autorización previa por escrito de IncellDx, Inc

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