UVV - CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL

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1 UVV - CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA PROGRAMA DE MESTRADO EM CIÊNCIA ANIMAL CONCENTRAÇÕES DE TESTOSTERONA PLASMÁTICA EM UMA POPULACAO JUVENIL DE Chelonia mydas, NO EFLUENTE INDUSTRIAL DE UMA COMPANHIA SIDERÚRGICA - VITÓRIA, ESPÍRITO SANTO Jannine Garcia Forattini VILA VELHA ES Fevereiro de 2011

2 UVV - CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA CONCENTRAÇÕES DE TESTOSTERONA PLASMÁTICA EM UMA POPULACAO JUVENIL DE Chelonia mydas, NO EFLUENTE INDUSTRIAL DE UMA COMPANHIA SIDERÚRGICA - VITÓRIA, ESPÍRITO SANTO Jannine Garcia Forattini Orientadora: Profa. Dra. Flaviana Lima Guião Leite Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Ciência Animal do Centro Universitário Vila Velha, para a obtenção do título de Mestre em Ciência Animal. VILA VELHA ES Fevereiro de 2011

3 Catalogação na publicação elaborada pela Biblioteca Central / UVV-ES F692c Forattini, Jannine Garcia. Concentrações de testosterona plasmática em uma população juvenil de chelonia mydas no efluente industrial de uma companhia siderúrgica Vitória, Espírito Santo / Jannine Garcia Forattini f.: il. Orientador: Profª. Drª. Flaviana Lima Guião Leite. Dissertação (Mestrado em Ciência Animal) Centro Universitário Vila Velha, Inclui bibliografias. 1. Tartaruga marinha. 2. Testosterona. I. Leite, Flaviana Lima Guião. II. Centro Universitário Vila Velha. III. Título. CDD

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5 Dedico este trabalho aos meus pais e noivo.

6 AGRADECIMENTOS A Deus pelo dom e vontade de cuidar dos animais. Aos meus pais pelo carinho de sempre. Ao meu noivo pelas noites em claro, compreensão e ajuda. A Flaviana, amiga e orientadora, sempre com palavras de incentivo. A Cecília pelo apoio irrestrito. A Evelise, Marcillo, a equipe e o projeto ICM-Bio/TAMAR, sem eles nada teria acontecido. Ao Claudio e Priscila por me receberam de braços abertos na USP e ao Laboratório de Dosagens Hormonais do Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (LDH-VRA-FMVZ- USP) pelos kits de radioimunoensaio. Aos meus queridos professores Dominik e Romildo por não medirem esforços em me ajudar. Ao Dr. David Owens, pela paciência e interesse em me auxiliar e por dividir sua sabedoria e artigos enviados para colaboração deste trabalho. A Companhia Siderurgica ArcelorMittal por ceder seu espaço para as pesquisas conservacionistas. A FAPES pelo auxilio financeiro.

7 LISTA DE FIGURAS Figura 1 - Válvula de escape ( TEDs Turtle Excluder Device) em redes de arrasto para tartarugas marinhas FIgura 2 - Tartaruga verde, Chelonia mydas, em fase juvenil e filhote Figura 3 - Cadeia carbônica da testosterona Figura 4 - Sistema urogenital de uma tartaruga marinha Figura 5 - Imagem das gônadas de tartarugas marinhas da espécie Caretta caretta, através de videolaparoscopia... 26

8 LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Valores de média, desvio padrão, mínimo e máximo encontrados para o comprimento curvilineo de carapaca (CCC), largura curvilinea de carapaça (LCC), peso e testosterona para os grupos de machos, fêmeas, indeterminados e total de tartarugas verdes, Chelonia mydas, capturadas no efluente final da Companhia Siderúrgica ArcelorMittal. 32 Tabela 2 - Valores de contagem por minuto (CPM), capacidade de ligação (cap lig), ligacao não especifica (LNE), sensibilidade, coeficiente de variação intra ensaio e coeficiente de variação inter ensaio Tabela 3 - Comparação entre o número de fêmeas e o número de machos através do teste da binomial Tabela 4 - Teste t pareado para as amostras obtidas em dois momentos diferentes de um mesmo animal... 34

9 LISTA DE GRÁFICOS Gráfico 1 - Gráfico 2 - Gráfico 3 - Relação entre o comprimento curvilíneo de carapaça (CCC) e o peso de Chelonia mydas capturas na Companhia Siderúrgica ArcelorMittal, através de regressão linear (r 2 ) Relação entre o titulo de testosterona e o comprimento curvilíneo de carapaça (CCC) de Chelonia mydas capturadas na Companhia Siderúrgica ArcelorMittal através de regressão linear (r 2 ) Concentrações de testosterona (ng/dl) das amostras plasmáticas obtidas de tartarugas verdes capturadas no efluente final da Companhia Siderúrgica ArcelorMittal, Espírito Santo... 39

10 SUMÁRIO Página 1 INTRODUÇÃO REVISÃO DE LITERATURA Tartarugas Marinhas Chelonia mydas Determinação sexual dependente da temperatura Testosterona Proporção sexual Métodos de sexagem de acordo com a faixa etária Sexagem em ovos e filhotes de tartarugas marinhas Sexagem em tartarugas marinhas juvenis Sexagem em tartarugas marinhas adultas Radioimunoensaio OBJETIVO MATERIAL E MÉTODOS Área de estudo Captura Biometria Coleta de amostra de sangue Análise hormonal Análise estatística RESULTADOS DISCUSSÃO CONCLUSÃO REFERÊNCIAS... 42

11 Forattini, J.G. Concentrações de Testosterona Plasmática em uma População Juvenil de Chelonia mydas no Efluente Industrial de uma Companhia Siderúrgica Vitória, Espirito Santo RESUMO: A espécie Chelonia mydas, popularmente conhecida como tartaruga verde, habita o oceano Atlântico, Pacifico, Mediterrâneo e parte do Índico. Após o nascimento, o filhote migra para alto mar até se tornar juvenil e migrará para áreas costeiras para alimentação. Pouco se sabe sobre estes animais nesta fase que pode durar ate mais de 25 anos. Por serem animais que possuem uma fase juvenil prolongada, atingindo a maturidade sexual tardiamente, tem vida longa e os locais usados por elas para o acasalamento e alimentação são distantes entre si, torna-se essencial a obtenção de informações sobre seu status reprodutivo e fisiológico. Por estes motivos, faz-se necessário a coleta de informações biológicas de todos os estágios de vida para auxiliar na conservação desta espécie, sendo a determinação sexual de grande importância em estudos evolutivos e na conservação destes animais. O objetivo do presente trabalho foi determinar as concentrações de testosterona plasmática em uma população de Chelonia mydas juvenis através de radioimunoensaio. Foram capturados durante os meses de Janeiro a Junho de 2010, no efluente final da companhia siderúrgica ArcelorMittal 67 tartarugas verdes, Chelonia mydas, todas juvenis e em bom estado nutricional, com ausência de fibropapilomatose e sinais clínicos de outras doenças. Estes animais foram classificados como juvenis através de biometria onde o comprimento curvilíneo de carapaça (CCC) foi de 27,6 a 53,4 cm (38,4 ± 5,09 cm), a largura curvilínea de carapaça (LCC) de 26,1 a 49,7 cm (34,6 ± 4,6 cm) e o peso de 2,6 a 20,2 kg (6,8 ± 2,9 kg). Foram puncionados 4ml de sangue do seio venoso cervical de cada animal, alguns dos quais foram recapturados e coletados mais de uma vez totalizando assim 84 amostras. As amostras foram armazenadas em tubos contendo heparina para obtenção de plasma por meio de centrifugação e armazenada a -20 C ate processamento As analises laboratoriais foram realizadas em Setembro de 2010 no Laboratório de Dosagens Hormonais do Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (LDH-VRA-FMVZ-USP) através da utilização de kits comerciais para dosagem de testosterona por radioimunoensaio (Coat-a-Count, DPC, Los Angeles, CA, USA). Alem destas 84 amostras, 03 amostras foram fornecidas pelo TAMAR de tartarugas juvenis da mesma espécie, porém que se encontravam em estresse crônico e posteriormente vieram a óbito onde foi possível classificar o sexo através da análise das gônadas pela necropsia, completando assim 87 amostras. Destes, 76 amostras apresentaram títulos de testosterona abaixo de 0.98 ng/dl, e as demais apresentaram títulos entre 3,13 a 113,16 ng/dl. Comparando estes resultados com os encontrados em outras regiões, foi possível classificar 61 fêmeas, 2 machos e 4 indeterminados, o que gera uma proporção sexual de 30.5F:1.0M. Palavras-Chave: radioimunoensaio. tartaruga verde. testosterona.

12 Forattini, J. G Plasmatic Concentrations of Testosterone in a Juvenile Population of Chelonia mydas, Encountered at an Industrial Effluent of a Steel Company Vitória, Espírito Santo. ABSTRACT: The species, Chelonia mydas, most commonly known as Green turtle lives in the Atlantic, Pacific, Mediterranean and part of the Indian Ocean. After birth, the hatchling remains at open sea until it has reached the juvenile phase, where it will stay at feeding grounds around coastal areas. Little is known about this phase that can last over 25 years. The need for obtaining information about the reproductive and physiological status of these animals are considered essential seeing that these are animals that are known to have a long juvenile phase, are late in reaching sexual maturity, has a long life span and feeding and reproductive locations are distant from one another. For these reasons, it s extremely important to collect biological information of all life stages as to help in the conservation of these species, and a way to do so is determining the sex ratio. The goal of the present paper is to determine plasmatic concentrations of testosterone in a juvenile population of Chelonia mydas, conducted by radioimmunoassay. To do so, 67 juvenile green turtles, all considered healthy and without fibropapilloma tumors and other clinical signs of diseases, were captured from January to June, 2010 in the final effluent of a steel company, ArcelorMittal. They were all classified as juvenile because of the size of their straight carapace length (SLC) which varied from 27,6 to 53,4 cm (38,4 ± 5,09 cm), while their width varied from 26,1 to 49,7cm (34,6 ± 4,6 cm) and weight from 2,6 to 20,2 kg (6,8 ± 2,9 kg). 4 ml were drawn from the bilateral cervical sinus from each animal, some of which were captured more than once, totalizing 84 samples. Samples were collected into tubes containing Heparin to obtain plasma, which after centrifuged, was separated and stored at -20 C until processing. Laboratory analyses were done in September 2010 at the Laboratório de Dosagens Hormonais do Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (LDH- VRA-FMVZ-USP) through Radioimmunoassay kits for testosterone (Coat-a-Count, DPC, Los Angeles, CA, USA). Another three samples were donated from TAMAR that were collected from three juvenile green turtles that were encountered in chronic stress and later necropsy was performed to confirm their sex, completing 87 samples. 76 of these samples had testosterone titers lower than 0,98ng/dl and the rest obtained titers that ranged from 3,13 to 113,16 ng/dl. Comparing these results to ones encountered from a different location, it was possible to classify 61 sea turtles as females, 2 males and 4 as undetermined, which originates a highly female biased sex ratio of 30.5F:1.0M. Key words: green sea turtle. radioimmunoassay. testosterone.

13 11 1 INTRODUÇÃO As tartarugas marinhas encontram-se na terra desde a era Mesozóica, há 100 milhões de anos (POUGH; HEISER; MCFARLAND, 1999) sendo consideradas como um grupo de animais mais antigos do planeta. A espécie Chelonia mydas está atualmente incluída na lista da IUCN (International Union for the Conservation of Nature União Internacional para a Conservação da Natureza) no status ameaçada de extinção (POLIDORO et al., 2008). Como a maioria dos répteis, as tartarugas marinhas têm o seu sexo determinado pela temperatura de incubação do ninho, onde temperaturas mais altas produzem um maior número de fêmeas e temperaturas mais baixas, maiores números de machos (CUBAS; BAPTISTOTTE, 2007). A maioria das ações conservacionistas visam o aumento populacional de uma espécie em risco de extinção. Para animais que têm o sexo determinado pela temperatura, estas medidas não são suficientes visto que em uma população, poderá haver predominância de apenas um sexo, o que não garantiria a sobrevivência da espécie. Um exemplo foi a utilização de caixas de isopor com o objetivo de proteger os ovos destes animais de predadores e outras ameaças externas (MORREALE et al., 1982). Esta técnica obteve sucesso, pois estava havendo aumento no número de filhotes eclodidos por ninho, porém, foi descoberto que a temperatura encontrada dentro da caixa de 2 a 3 C mais baixa que a encontrada no ninho, o que levaria a uma produção de quase 100% de machos (MROSOVSKY; YNTEMA, 1980). Além disso, a determinação da proporção sexual de tartarugas marinhas auxilia indiretamente na preservação do ambiente utilizado por estes para nidificação como, por exemplo, na vegetação costeira. Um trabalho realizado por Kamel e Mrosovsky (2006) determinou que 91,4% das fêmeas preferem áreas com vegetação para ovipostura. Nestas áreas, a temperatura

14 12 do ninho chegava a ser 2 C mais baixa que em áreas sem vegetação ou apenas com palmeiras, proporcionando assim, uma temperatura mais próxima da temperatura pivotal. A proporção sexual pode ser determinada nas diferentes faixas etárias, sendo que, para Chelonia mydas, a faixa etária ideal é a juvenil, pois esta representa uma condensação de vários ninhos de diferentes praias e regiões, visto que ao atingirem esta fase, as tartarugas marinhas se encontram em locais de alimentação em comum onde permanecerão durante anos. Além disso, estes animais ainda não apresentam características comportamentais ligados ao sexo como migração, evitando assim o risco de ter uma proporção maior de um sexo devido à ausência do outro (DIEZ; VAN DAM, 2003). Por não terem dimorfismo sexual e havendo a necessidade em determinar o sexo de grandes números de tartarugas em um grupo, tornou se necessário a utilização de uma técnica confiável e de fácil aplicação. A técnica mais utilizada é a dosagem de testosterona através de radioimunoensaio por ser fácil de ser realizada, pois necessita apenas da coleta de sangue e processamento laboratorial. Desde 1978, esta técnica vem sendo utilizada para determinação da proporção sexual em diversos grupos e espécies de tartarugas marinhas (WIBBELS; OWENS; LIMPUS, 2000). No Brasil, não existe relato da realização de estudos para a definição da proporção sexual em grupos de Chelonia mydas. O objetivo deste trabalho foi identificar o sexo determinar a proporção sexual de uma população de Chelonia mydas juvenis encontradas no efluente final da Companhia Siderúrgica ArcelorMittal, através de dosagem de testosterona por radioimunoensaio. Este estudo foi executado através da cooperação entre o Programa de Mestrado em Ciência Animal do Centro Universitário Vila Velha, Projeto TAMAR - ICMBio e o Laboratório de Dosagens Hormonais do Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.

15 13 2 REVISÃO DE LITERATURA 2.1 TARTARUGAS MARINHAS Os quelônios estão presentes no mundo desde o período Triássico da era Mesozóica. Existem duas linhagens de quelônios que se diferem na forma de retração do pescoço, ou seja, os que retraem a cabeça para dentro do casco horizontalmente são conhecidos como os Pleurodira. Já os que retraem o pescoço formando um S vertical são os Cryptodira e é nesta linhagem que se encontram as tartarugas marinhas (POUGH; HEISER; MCFARLAND, 1999). As tartarugas marinhas são divididas em duas famílias: a família Dermochelyidae, gênero Dermochelys, onde se encontra apenas uma espécie, Dermochelys coriacea, mais conhecida como tartaruga de couro, e a familia Cheloniidae que possuem dois grupos: Grupo Chelonini que consiste no gênero Chelonia (C. mydas), e o Grupo Carettini que é subdividido em quatro gêneros: gênero Caretta (C. caretta), gênero Eretmochelys (E. imbricata), gênero Lepidochelys (L. olivacea e L. kempii) e, por último, o gênero Natator (N. depressus flat back turtle) (POUGH; HEISER; MCFARLAND, 1999). Uma das grandes ameaças à população de tartarugas marinhas é o homem que, através da caça tanto em alto mar quanto na areia durante a nidificação, do consumo desenfreado de ovos (SPOTILA, 2004), destruição da vegetação natural das praias, favorecendo assim uma produção maior de fêmeas em um ninho (KAMEL; MROSOVOSKY, 2006), poluição dos mares que leva a ingestão acidental de lixo e plásticos e da captura acidental em redes de pesca (HARMS et al., 2003), tem ameaçado cada vez mais as espécies. Além disso, as doenças estão cada vez mais presentes como, por exemplo, a fibropapilomatose que aumentou drasticamente sua incidência desde 1982 (AGUIRRE; BALAZS, 2000). A espécie Chelonia mydas está atualmente incluída na lista da IUCN (International Union for the Conservation of Nature União Internacional para a Conservação da Natureza) (POLIDORO et al., 2008). A captura acidental durante a pesca tem sido considerada a maior ameaça às tartarugas marinhas sendo que o arrasto de camarão é o método de pesca que mais causa a morte destes animais por afogamento (PUPO; SOTO; HANAZAKI, 2006; SILVA et al., 2007). Uma

16 14 solução para isso foi a criação de uma espécie de válvula de escape para as tartarugas nestas redes chamadas de TEDS (Turtle Excluder Device) (HARMS et al., 2003). No Brasil, existe uma lei que obriga o uso desses TEDS, mas devido a alguns fatores como falta de fiscalização, esta lei não é cumprida (SILVA et al., 2007). Figura 1- Ilustração de uma válvula de escape ( TEDs Turtle Excluder Device) em redes de arrasto para tartarugas marinhas. Por terem uma área de alimentação distinta da área de reprodução, houve uma forte pressão internacional para que houvesse proteção das tartarugas marinhas em todas as fases de suas vidas, com isso, todos os países teriam que colaborar com criações de projetos de conservação. Em 1980, foi criado o Programa de Conservação Nacional da Tartaruga Marinha (Projeto TAMAR), junto com o Instituto Brasileiro do Meio Ambiente (IBAMA) e em 1986, foi garantida a proteção total a todas as espécies de tartarugas marinhas com ocorrência no litoral capixaba (MARCOVALDI; MARCOVALDI, 1999). Como as tartarugas marinhas são animais que se caracterizam com uma fase juvenil prolongada, atingem a maturidade sexual tardiamente, possuem vida longa e os locais usados

17 15 por elas para o acasalamento e alimentação são distantes entre si, torna-se essencial a obtenção de informações sobre seu status reprodutivo e fisiológico (HAMANN et al., 2006, POLIDORO et al., 2008). Estas características associadas às ameaças vindas das atividades humanas são os motivos pelos quais estes animais estão em risco de extinção (POLIDORO et al., 2008). Levando estas características e ameaças em consideração, torna-se necessário a coleta de informações biológicas de todos os estágios de vida, tanto de animais de cativeiro quanto de vida livre, para auxiliar na conservação das espécies de tartarugas marinhas (BOLTEN; BJORNDAL, 1992; HAMANN et al., 2006). Por isso, em 1973, foi criado o Endangered Species Act que visa à implementação de planos administrativos que irão, efetivamente, proteger e recuperar populações de tartarugas marinhas listadas como ameaçadas ou em perigo de extinção (BRAUN-MCNEILL et al., 2007) Chelonia mydas Entre as sete espécies de tartarugas marinhas que habitam os oceanos, destaca-se a mais popular, a Chelonia mydas, conhecida como tartaruga verde ou green turtle. O peso dos adultos pode variar entre 70 e 230 kg (CUBAS; BAPTISTOTTE, 2007), enquanto que o comprimento curvilíneo de carapaça tem de 80 a 122 cm (SPOTILA, 2004). Possuem carapaça enegrecida e plastrão branco quando filhotes. O plastrão tende a ficar amarelo cremoso ou rosa e a carapaça marrom escuro ou claro quando juvenis enquanto que os adultos têm coloração oliva ou verde-cinza. Diferem-se das demais tartarugas marinhas por possuírem um par de placas pré-frontais, 4 placas laterais e 4 placas infra-marginais sem poros (WYNEKEN, 2001).

18 16 Figura 2 - Tartaruga verde, Chelonia mydas (wordpress.com, 2011) Os oceanos tropicais e subtropicais servem de local para alimentação e nidificação desta espécie (ENCALADA, et al., 1996; SPOTILA, 2004) sendo que as tartarugas juvenis tendem a permanecer nestas áreas durante muitos anos. Já as juvenis encontradas em ambientes temperados precisam retornar para as áreas subtropicais durante o inverno para não sofrerem com as temperaturas baixas (MUSICK; LIMPUS, 1997). As tartarugas verdes são encontradas desde os EUA até a América do Sul, habitando assim, o oceano Atlântico, além do Pacífico, Mediterrâneo e parte do Índico (SPOTILA, 2004). Após o nascimento, a Chelonia mydas assume uma fase pelágica (MUSICK; LIMPUS, 1997) e onívora onde ela permanecerá em alto mar se alimentando de diferentes tipos de alimentos que possam ser encontrado como algas, ctenophores e caramujos. Após atingirem fase juvenil que, dependendo da região poderá ocorrer quando o indivíduo atingir 20 ou 25 cm de comprimento de carapaça (SPOTILA, 2004), estas tartarugas migram para uma fase nerítica e predominantemente herbívora onde permanecerão no litoral ou em recifes se alimentando de capim marinho como, Thalassia testudinum, Syringodium, Halophila e Posidonia e, em menor quantidade, as algas como as Chaetomorpha, Sargassum e Hypnea (BJORNDAL, 1980; SPOTILA, 2004).

19 17 O crescimento lento e a maturidade sexual tardia da espécie Chelonia mydas podem ser justificados pela sua alimentação pobre em proteína, concluindo assim que estas características têm mais a ver com um fator nutricional que um fator genético, visto que tartarugas verdes em cativeiro fornecidas uma dieta rica em proteína apresentaram um crescimento mais rápido e conseqüentemente, atingiram a maturidade sexual mais precocemente (BJORNDAL, 1980; SPOTILA, 2004). Assim, a maturidade sexual da Chelonia mydas sofre grandes oscilações, podendo ser atingida dos 8 aos 15 anos ou mais em cativeiro (WOOD; WOOD, 1980) e aos 25 até os 40 anos de idade em vida livre, a depender assim da oferta e disponibilidade de alimento (SPOTILA, 2004). Deixando a fase juvenil, a tartaruga marinha entra em uma fase conhecida como pré-adulta ou sub-adulta onde ocorrem algumas mudanças reprodutivas como uma transição de um ciclo andrógeno relacionada à temperatura para um novo ciclo relacionado ao fotoperiodo (OWENS, 1997). Já sexualmente maduras, as fêmeas fazem até sete posturas em uma mesma temporada reprodutiva sendo que cada ninho poderá conter uma média de 110 ovos. O intervalo entre cada postura varia de 12 a 14 dias, sendo que o intervalo entre as épocas de nidificação pode ocorrer após 4 a 6 anos. Tem sido comprovado através de estudos genéticos que as fêmeas de C. mydas tendem a realizar a desova no mesmo local de seu nascimento (SPOTILA, 2004). 2.2 DETERMINAÇÃO SEXUAL DEPENDENTE DA TEMPERATURA Em diversos répteis, incluindo as tartarugas marinhas, a determinação sexual é dependente da temperatura de incubação. Em relação às tartarugas marinhas, temperaturas mais baixas produzem um maior numero de machos enquanto que temperaturas mais altas tendem a produzir mais fêmeas (WIBBELS et al., 1987; GEORGES; LIMPUS; STOUTJESDIJK, 1994; OWENS, 1997; WIBBELS, 2003; CUBAS; BAPTISTOTTE, 2007). Segundo Desvages, Girondont e Pieau (1993), um elemento importante durante a fase embrionária para a diferenciação sexual é o gene P-450. Este gene seria termossensível e produz uma enzima conhecida como aromatase, que por sua vez age na gônada convertendo

20 18 substrato de esteróide andrógeno em estrógeno que por sua vez, inicia o desenvolvimento de uma gônada feminina. Caso não haja essa variação abrupta de temperatura, não há produção de aromatase levando ao desenvolvimento de uma gônada masculina. Dentro da determinação sexual das tartarugas marinhas, existe uma temperatura capaz de produzir uma proporção sexual de 1:1. Esta temperatura é denominada de temperatura pivotal e pode variar entre e dentro de uma mesma espécie (WIBBELS, 2003). Acredita se que é possível esperar uma diversidade na proporção sexual de diferentes populações devido à variedade na relação entre a temperatura pivotal e a temperatura da praia (MROSOVSKY, 1994). Apesar das variações na temperatura pivotal entre as espécies, Mrosovsky (1994) e Wibbels (2003) encontraram uma temperatura pivotal comum para todas as espécies de tartarugas marinhas sendo o mesmo em torno de 29 C. Já Morreale e outros (1982) encontrou que, para Chelonia mydas,, temperaturas a baixo de 28 C produziriam em torno de 90 a 100% machos, temperaturas entre 28,5 C e 30,2 C produziriam maior numero de fêmeas enquanto que temperaturas acima de 30,5 C teriam 94 a 100% de produção de fêmeas. A formação do sexo dos embriões de tartarugas marinhas independe da temperatura constante do ninho e sim de um período conhecido como periodo termossensivel que ocorre durante o terço médio de incubação. É nesse período que ocorrerá a formação sexual dos embriões (YNTEMA; MROSOVSKY, 1980; STANDORA; SPOTILA, 1985). Segundo Mrosovsky e Yntema (1980), a temperatura do ninho tende a aumentar devido ao calor metabólico produzido pelo desenvolvimento dos embriões. Para que este calor metabólico seja capaz de interferir na produção de machos e fêmeas, é necessário que o mesmo aumente em pelo menos 1 C durante o terço médio de incubação, ou seja, durante o período termossensível.

21 TESTOSTERONA A testosterona é um hormônio esteróide composto por 19 carbonos (C), tendo dois grupos metílicos no C-3 e C-10, um grupo cetônico no C-3, uma dupla ligação entre C-4 e C-5 e um grupo hidroxílico no C-17 (FRIEDEN; LIPNER, 1975, apud LEITE, 2002). Figura 3 - Cadeia carbônica da testosterona (FRIEDEN; LIPNER, 1975, apud LEITE, 2002) Há produção deste hormônio nas tartarugas marinhas não só pelas gônadas de machos e fêmeas, mas também, em menor quantidade, pelas glândulas adrenais (JESSOP et al., 2004). Estudos endócrinos em tartarugas marinhas de cativeiro diferem-se das de vida livre devido a fatores como alimentação, onde tartarugas de cativeiro possuem uma oferta maior e constante de alimento, migração, onde em cativeiro, não há ocorrência de tal comportamento, e mudanças térmicas, pois tartarugas marinhas de cativeiro possuem condições térmicas constantes. Esses fatores podem alterar ciclos endócrinos e assim, não servindo de resultados comparáveis com os encontrados em tartarugas de vida livre (WIBBELS; OWENS; AMOSS, 1987). A produção de testosterona em tartarugas marinhas juvenis tem se mostrado extremamente variável, ocorrendo queda na sua produção quando há aumento de cortisol circulante, como em casos de estresse por captura, ou estresse crônico como inanição ou doenças (JESSOP et al., 2004) ou ainda quando o animal se encontra em determinado período do ano com temperaturas aquáticas e ambientais mais baixas (OWENS, 1997). Tartarugas marinhas juvenis e pré-adultos tendem a produzir mais testosterona com o aumento de idade (OWENS, 1997), e no início da puberdade, os testículos aumentam significativamente a secreção de testosterona (WIBBELS, 2003). Durante essa fase, a testosterona estimula o

22 20 desenvolvimento de algumas características sexuais secundárias como o crescimento e curvatura das garras nas nadadeiras peitorais, usadas para segurar a fêmea durante a cópula (OWENS, 1997), um aumento no comprimento e espessura da cauda e o amolecimento do plastrão para melhor encaixar a fêmea durante a cópula (HAMANN; LIMPUS; OWENS, 2003). Um estudo realizado por Licht e outros (1980, apud WHITTIER; CORRIE; LIMPUS, 1997) com Chlonia mydas fêmeas revelou um aumento tanto de testosterona quanto de progesterona durante a temporada de reprodução, sugerindo assim que a testosterona poderá ter participação importante nas características comportamentais durante o cortejo e acasalamento desta espécie. Por ser poligâmica, a Chelonia mydas macho apresenta um nível de testosterona circulante menor que os animais monogâmicos durante a fase reprodutiva devido à ausência ou infrequencia de comportamento agressivo entre os machos e a necessidade em demarcar seu território. O mesmo irá apresentar um aumento de testosterona durante a cópula, porém, esse aumento ainda não será maior que o aumento apresentado por animais monogâmicos (JESSOP et al., 1999). Em fêmeas iniciando o ciclo reprodutivo, há um aumento tanto em testosterona quanto em estrógeno. A migração para áreas de reprodução só iniciará quando houver queda significativa na produção de estrógeno enquanto que a testosterona atingirá seu máximo durante a temporada (HAMANN; LIMPUS; OWENS, 2003). Já durante o período de nidificação, a concentração de testosterona tende a decrescer de acordo com os episódios progressivos de ovipostura em uma mesma temporada (WHITTIER; CORRIE; LIMPUS, 1997). Devido às possíveis alterações causadas pelo estresse de captura e à sua sensibilidade térmica, é sempre recomendado fazer a coleta de sangue em tartarugas marinhas para dosagem de testosterona o mais rápido possível, de preferência, até 15 minutos após sua captura a fim de evitar tais alterações (OWENS, 1997).

23 PROPORÇÃO SEXUAL Um dos métodos para se obter dados sobre o status evolutivo e reprodutivo de Chelonia mydas é através da determinação da proporção sexual em um grupo, que tem tanto uma importância ecológica quanto conservacionista (WIBBELS et al., 1993). Estudos relacionados à proporção sexual natural em tartarugas marinhas tem sido de grande interesse visto o descobrimento comum de diversas populações compostos predominantemente por fêmeas aliado a preocupação dos efeitos possíveis que podem ocorrer devido às mudanças climáticas globais, podendo favorecer ainda mais o surgimento de tartarugas marinhas fêmeas. Além do mais, conhecer a proporção sexual natural de um grupo de tartarugas marinhas pode ajudar a desmascarar dados sobre o tamanho real de uma população visto que eventualmente, um grupo poderá sofrer com a predominância de um sexo (KAMEL; MROSOVSKY, 2006). Uma questão importante que deve ser levada em consideração ao estudar a proporção sexual em tartarugas marinhas é se há possibilidade de haver mortes referentes ao tipo de sexo do animal, pois isto levaria a uma proporção sexual dinâmica para cada faixa etária. Exemplo disso são as fêmeas que, durante a fase reprodutiva, são mais suscetíveis a mortalidade, pois, durante a nidificação, elas sofrem um gasto energético maior e ficam mais expostas a predação. Outro exemplo são os filhotes que também podem sofrer mortalidade referente ao sexo visto que os indivíduos que eclodem no inicio da temporada podem sofrer maior mortalidade que aqueles que eclodem no final devido à fatores como disponibilidade de alimento e condições da água (WIBBELS et al., 1987; WIBBELS, 2003). Como o sexo das tartarugas marinhas é dependente da temperatura, a definição da proporção sexual torna-se particularmente importante a esta espécie, pois auxilia tanto na tentativa de explicar a importância biológica deste processo em termos evolucionários quanto na modulação populacional destes animais (OWENS, 1997) além de determinar seu crescimento populacional (DELGADO; CANARIO; DELLINGER, 2010). Para Magnuson e outros (1990, apud BOLTEN et al., 1992), consideram o estudo da proporção sexual em grupos de tartarugas marinhas de vida livre como uma prioridade na conservação destes animais.

24 22 Com o aquecimento global, é possível que haja alterações drásticas na produção de machos e fêmeas nos ninhos de tartarugas marinhas, possivelmente tornando-se necessário a manipulação dos ovos, pelo homem, para evitar a produção de apenas um sexo (MROSOVSKY, 1994). Para isto, é de extrema importância um estudo prévio sobre a proporção sexual natural de cada espécie e seu efeito no sucesso reprodutivo e evolutivo das tartarugas marinhas evitando assim, gerar um efeito negativo na recuperação da população destes animais (WIBBELS, 2003). Assim, pode ser dito que a maioria das manipulações humanas de ovos de tartarugas marinhas têm o potencial de alterar a proporção sexual dos filhotes produzidos (GODFREY; BARRETO; MROSOVSKY, 1997). Além do aquecimento global, outro fator que pode alterar a proporção sexual das tartarugas marinhas é o desmatamento da vegetação litorânea. Um estudo realizado por Kamel e Mrosovsky (2006) concluiu que a temperatura dos ninhos encontrados em meios vegetativos era 2 C a menos que os encontrados em regiões apenas com areia e radiação solar direta o que resultava em ninhos com maior tempo de incubação e com uma proporção maior de machos do que de fêmeas. Alem disso, foi visto que 91,4% das tartarugas fêmeas optavam por realizar ovipostura nas regiões com vegetação enquanto apenas 8,6% fizeram seus ninhos em regiões sem vegetação. Outro fator visto foi que a temperatura em ninhos localizados em áreas com palmeiras era a mesma que a temperatura encontrada em áreas sem vegetação, levando a conclusão que a sombra gerada pelas palmeiras é insuficiente para auxiliar na produção de machos. Isso torna a preservação da mata litorânea um fator importante na proporção sexual das tartarugas marinhas, pois preservando a vegetação, estaria preservando diretamente o habitat que favorece uma produção equilibrada de machos e fêmeas em diferentes ninhos de tartarugas marinhas. Por serem listados como animais ameaçados de extinção, muitos programas de manejo e conservação, como a criação em cativeiro ou incubação artificial dos ovos, são criados mundialmente na tentativa de aumentar o numero de tartarugas marinhas que atingem a maturidade sexual, porém, estes mesmos programas podem alterar a proporção sexual de uma população de tartarugas marinhas e, consequentemente o sucesso reprodutivo do mesmo (WIBBELS et al.,1987). Um exemplo da manipulação de ovos de tartarugas marinhas com

25 23 intenções conservacionistas foi a utilização de caixas de isopor na tentativa de proteger e aumentar o numero de filhotes eclodidos por ninho. Por ter uma temperatura mais baixa que da areia (1 a 3 C menor), a caixa de isopor favorecia o nascimento de machos. Muitas vezes esse favorecimento chegava a ser 100% do ninho, o que resultaria em problemas reprodutivos para a espécie futuramente, surgindo assim a necessidade de estudos da proporção sexual natural das tartarugas marinhas (MROSOVSKY; YNTEMA, 1980). Assim, para que seja possível reconhecer quando uma proporção sexual sofreu alteração, é necessário que saiba primeiramente a proporção sexual natural daquele grupo de tartarugas marinhas (GODFREY; BARRETO; MROSOVSKY, 1997). 2.5 MÉTODOS DE SEXAGEM DE ACORDO COM A FAIXA ETÁRIA Existem diversas metodologias para a identificação sexual de tartarugas marinhas sendo que a escolha do método esta relacionado à faixa etária do animal (CASALE et al., 2006) Sexagem em ovos e filhotes de tartarugas marinhas Uma forma segura e definitiva de determinar o sexo de filhotes de tartarugas marinhas é através da dissecação e avaliação histopatológica das gônadas (GODFREY; BARRETO; MROSOVSKY, 1997; WIBBELS, 2003) que possuem características sexo-especificas, sendo que a gônada das fêmeas possui córtex bem desenvolvido e região medular pobremente organizada enquanto que a gônada do macho possui região cortical pouco definida e região medular bem organizada. O inconveniente deste método é o sacrifício dos filhotes a serem estudados, surgindo assim, a necessidade de obter métodos não invasivos (WIBBELS, 2003). Assim, devido às dificuldades em determinar o sexo de filhotes associado ao dilema conservacionista em relação ao sacrifício destes animais para estudos de proporção sexual, tornou se necessário a adoção de métodos indiretos que sugerissem o sexo de filhotes de tartarugas marinhas (OWENS, 1997).

26 24 Um destes métodos que sugere a proporção sexual de tartarugas marinhas é a mensuração diária da temperatura média dos ninhos (GODFREY; BARRETO; MROSOVSKY, 1997; WIBBELS, 2003). Para isto, é necessário que a temperatura pivotal e o método utilizado sejam conhecidos, pois, existe uma temperatura pivotal especifica para cada espécie e uma variedade de metodologias que possam ser utilizadas (WIBBELS, 2003). Variações podem ocorrer ao utilizar a temperatura do ninho para determinar a proporção sexual como, por exemplo, a localização do ninho onde, ninhos próximos à água ou vegetação tendem a ter uma temperatura mais baixa enquanto que os ninhos com radiação solar direta tendem a ter temperaturas mais altas (GODFREY; BARRETO; MROSOVSKY, 1997; WIBBELS, 2003), a temporada em que os dados foram coletados, podendo haver variações anuais (a depender de fatores como temperatura e hora de nidificação) (WIBBELS, 2003), e as alterações de temperatura causadas pelo calor metabólico, que é produzido pelo próprio ovo (CARR; HIRTH, 1961, apud GODFREY; BARRETO; MROSOVSKY, 1997). Portanto, segundo Wibbels e outros (1987), para determinar a proporção sexual em ninhos de tartarugas marinhas, é de extrema importância coletar dados específicos como a densidade do ninho relacionada a época do ano e localização do ninho na praia. Outro método não invasivo sugerido por Gross e outros (1995) para a identificação do sexo de filhotes de tartarugas marinhas é a dosagem de metabólitos de testosterona e estradiol presente no liquido corioalantóico e aminiotico encontrados nos ovos após eclosão dos filhotes. Apesar de ser um método confiável e simples de ser aplicado, seus resultados não representariam uma proporção sexual real visto que um pequeno numero de filhotes sobreviverão até a fase juvenil e adulta Sexagem em tartarugas marinhas juvenis A determinação do sexo de tartarugas marinhas imaturas (juvenis e subadultos) é difícil, pois estes não apresentam dimorfismo sexual externo (OWENS, 1997), sendo assim, necessário a implementação de técnicas para sexagem destes animais. Foram testados cinco metodologias na tentativa de identificar o sexo de tartarugas marinhas:

27 25 Um dos métodos testados foi a tentativa de identificação do cariótipo, mas, segundo Bickham e outros (1980, apud STANDORA; SPOTILA, 1985), não foi possível pois não foram encontrados cromossomos sexuais heteromórficos nas células de tartarugas marinhas. Outra técnica, baseada na identificação de antígenos H-Y, foi possível através de um ensaio de citotoxidade de antígenos H-Y realizado e publicado por Wellins (1987, apud WIBBELS; OWENS; LIMPUS, 2000) onde foi encontrada uma concentração maior destes antígenos em células sanguíneas de machos que nas de fêmeas, porem, apesar dos resultados, existem várias desvantagens, pois necessita de uma série de procedimentos bioquímicos, visualização direta de aproximadamente 200 células por amostra o que o torna trabalhoso, além de uma validação rigorosa e com maior número amostral. Outra desvantagem é a necessidade em utilizar sangue fresco, pois amostras com mais de 24 horas de coleta sofrem modificações. DNA fingerprinting permitiu a obtenção de fragmentos específicos para machos de C. mydas e L. kempi utilizadas no teste. Com isso, foi concluído por Demas e outros (1990, apud WIBBELS; OWENS; LIMPUS, 2000) a possibilidade de utilizar este método para sexagem de tartarugas marinhas, porém, uma validação rigorosa do mesmo seria necessário. Apesar dos resultados, este teste é extremamente trabalhoso, devido à necessidade em extrair o DNA de cada amostra, além de outros procedimentos, o que o torna desfavorável quando estiver utilizando um grande número amostral. Uma forma precisa e definitiva de determinar o sexo de tartarugas marinhas jovens é através de videolaparoscopia abdominal onde será visualizada a gônada de cada animal. As gônadas das tartarugas marinhas são órgãos pares localizadas na cavidade celomática, caudal aos pulmões e aderidas ao peritônio ficando sobrepostos aos rins. Macroscopicamente, as gônadas dos machos possuem aspecto liso com coloração variando do branco pálido ao laranja, geralmente irrigado por um sistema capilar menos desenvolvido enquanto que as gônadas femininas possuem aspecto granular com folículos parcialmente desenvolvidos (DELGADO; CANARIO; DELLINGER, 2010). Apesar de ser um método confiável, existem dificuldades em se realizar o mesmo a campo, pois além de consumir grande período de tempo, é extremamente invasivo e

28 requer treinamento cirúrgico prévio (WIBBELS et al., 1987; WITZELL et al., 2005) o que o torna desaconselhado para grandes grupos de tartarugas marinhas. 26 Figura 4 - Sistema urogenital da tartaruga marinha (WYNEKEN, 2001). Figura 5 Imagem obtida das gônadas de tartarugas marinhas da espécie Caretta caretta, através de videolaparoscopia onde o ovário tem aspecto granular devido a presença de folículos ovarianos (A) e o testículo com aspecto liso (B) (DELGADO; CANÁRIO; DELLINGER, 2010)

29 27 Segundo Wibbels e outros (1987), o método mais utilizado para definição sexual em tartarugas marinhas jovens é a dosagem de testosterona sérica através de Radioimmunoensaio (RIA) por ser preciso e confiável alem de prático, sendo um método menos invasivo que a laparoscopia abdominal e de fácil realização, pois consiste apenas na coleta de sangue a campo, o que consequentemente, permitiria uma maior amostragem em menor espaço de tempo (OWENS et al., 1978). É preciso levar algumas características em consideração ao utilizar este método para determinação sexual em tartarugas marinhas como, por exemplo, a estação do ano e o nível de estresse que o animal em questão se encontra, pois, os níveis de testosterona tendem a diminuir em temperaturas mais baixas e quando há altos níveis de cortisol circulante (OWENS, 1997). Além da praticidade, este teste oferece outras vantagens como a possibilidade de se testar grandes números de tartarugas marinhas utilizando apenas um kit de RIA e também a possibilidade em armazenar amostras a -20 C ou menos por tempo prolongado tendo mínima ou nenhuma degradação devido a estabilidade da testosterona (WIBBELS; OWENS; LIMPUS, 2000) Sexagem de tartarugas marinhas adultas Ao contrário dos juvenis, os adultos possuem dimorfismo sexual onde os machos desenvolvem uma musculatura da cauda maior durante a puberdade. Deve-se ter cautela em adotar esta característica para determinar o sexo de tartarugas marinhas, pois há possibilidade de se confundir machos juvenis grandes com fêmeas adultas pequenas (WIBBELS, 2003). Os testes utilizados para sexagem de tartarugas marinhas adultas são os mesmos utilizados em juvenis. Existe dificuldade ao estudar a proporção sexual em tartarugas marinhas adultas (WIBBELS et al., 1987), pois estes animais exibem características sexo-dependente como, por exemplo, comportamento sexual e migração sexo-dependente, o que geraria uma proporção sexual com erro sistemático (DIEZ; VAN DAM, 2003). A fim de evitar isso, a dosagem de testosterona nesta faixa etária deve ser realizada nos animais encontrados em áreas de alimentação durante um período não migratório (WIBBELS, 2003).

30 28 Devido às dificuldades em definir a proporção sexual em grupos de tartarugas marinhas adultas, tem sido proposto utilizar juvenis, pois estes possuem pouco ou nenhum comportamento relacionado ao sexo, portanto não haverá influência na probabilidade de captura destes animais (MROSOVSKY; PROVANCHA, 1991; DIEZ; VAN DAM, 2003) e por este grupo representar a reunião de grupos diferentes de filhotes de tartarugas marinhas ao longo de vários anos (WIBBELS, 2003). 2.6 RADIOIMUNOENSAIO A técnica de radioiminoensaio, considerada umas das mais sensíveis para detecção de anticorpos ou antígenos, foi desenvolvida por dois endocrinologistas na tentativa de determinar os níveis de complexos insulina-antiinsulina em diabéticos (KINDT; GOLDSBY; OSBORNE, 2008). Hoje, ela é utilizada para medir níveis de hormônios no sangue e fluidos (JANEWAY, 2008), além de concentrações de proteínas séricas, drogas e vitaminas. Sua técnica consiste na ligação competitiva entre um antígeno radiomarcado, sendo o marcador mais utilizado o Iodo 125 (I 125 ), e um antígeno não-marcado com um anticorpo de alta afinidade. O primeiro passo da técnica, é a construção de uma curva padrão através da adição de níveis variáveis de uma preparação padrão conhecida, não marcada. Assim, o ensaio poderá medir a quantidade de antígenos em amostras desconhecidas através da comparação com a curva padrão. Amostras como soro, plasma, e outros fluidos corporais são considerados a amostra teste, onde contem o antígeno não marcado. Este será adicionado a mistura do ensaio que contêm o antígeno marcado e o anticorpo especifico, onde um competirá com o outro pelos sítios de ligação (anticorpos). Para separar os complexos formados entre antígeno e anticorpo, a amostra é precipitada, sendo neste precipitado o local onde será medido a radioatividade em um contador especifico. A quantidade de antígeno marcado não ligado será obtido através da subtração do valor da quantidade total de antígeno marcado adicionada a amostra. Tipos de radioimunoensaio de fase sólida foram desenvolvidos na tentativa de facilitar a separação dos complexos antígeno-anticorpo do antígeno não ligado (KINDT; GOLDSBY; OSBORNE, 2008).

31 29 O teste utilizado no presente trabalho consiste em uma técnica de Radioimunoensaio de fase sólida. Recebe denominação de Coat-a-Count devido à película de anticorpos encontrada no fundo dos tubos de ensaio. O Iodo 125 (I 125 ) é o elemento traçador que irá marcar o antígeno dentro da amostra. O anticorpo e o antígeno marcado irão competir pelos mesmos sítios de ligação, portanto, os resultados serão inversamente proporcionais: quanto maior a quantidade de antígeno marcado com iodo estiver ligada nos sítios, menor quantidade de testosterona estará presente na amostra. Variações nas técnicas de radioimunoensaio devem ser levadas em consideração quando comparações entre estudos hormonais forem feitos (GREGORY et al., 1996). 3 OBJETIVO O presente trabalho teve como objetivo determinar as concentrações de testosterona plasmática em tartarugas marinhas juvenis da espécie Chelonia mydas encontradas no efluente da siderúrgica industrial da ArcelorMittal Tubarão através da dosagem do hormônio esteroidal testosterona, utilizando kits comerciais para radioimunoensaio. 4 MATERIAL E MÉTODOS 4.1 ÁREA DE ESTUDO A coleta de amostras foi realizada na companhia siderúrgica ArcelorMittal Tubarão, localizado a 14 km ao norte da cidade de Vitória, no estado do Espírito Santo, Brasil. O local onde se concentram as tartarugas marinhas se encontra na parte terminal do canal-efluente da ArcelorMittal Tubarão ( S e W), tendo uma extensão de 290 m e cerca de 30 m de largura, com uma média de 2 m de profundidade. Após serem previamente tratados, esgotos domésticos e industriais são lançados no canal pelo sistema de drenagem.

32 30 Outra característica da região é a temperatura elevada da água que é utilizada no resfriamento das máquinas. Com isso, a água local acaba tendo em média, 7,9 C acima da temperatura do mar, sendo que no ponto de captação a temperatura é em média 23,5 C, enquanto que efluente final possui uma média de 31,4 C. Devido q estas características e a disponibilidade de nutrientes, há um ambiente propício a multiplicação de algas, o que provavelmente leva as tartarugas verdes a permanecerem nesta região para se alimentar (TOREZINI, et al., CAPTURA O estudo foi realizado com um intervalo mínimo de sete dias entre as coletas durante os meses de Janeiro a Junho. O método de captura que se mostrou mais eficiente nesta região foi através do uso de tarrafa, podendo eventualmente haver captura manual. Após captura, o animal foi contido fisicamente através da imobilização de suas nadadeiras peitorais para coleta de sangue e biometria. 4.3 BIOMETRIA Após contenção física, foram registrados de cada animal, as medidas de comprimento curvilíneo da carapaça (CCC), largura curvilínea da carapaça (LCC) e peso. Os mesmos que foram encontrados sem identificação tiveram a colocação de marcas de monelinconel (National Band and Tag Co., USA) nas nadadeiras dianteiras, conforme metodologia padrão adotada pelo Projeto ICM-Bio/IBAMA (MARCOVALDI; MARCOVALDI, 1999). 4.4 COLETA DE AMOSTRAS DE SANGUE A fim de evitar possíveis variações causadas pelo estresse, priorizava-se a coleta de sangue imediatamente após a captura da tartaruga marinha. Após assepsia da região cervical com álcool iodado, foi coletado 4 ml de sangue do seio venoso cervical (OWENS; RUIZ, 1980 apud SANTOS, 2005) de cada animal através de material descartável sendo, seringas de 5 ml e agulhas 25x7 e repassado para tubos de ensaio contendo heparina, o anticoagulante utilizado em pesquisas com tartarugas marinhas para a obtenção de plasma. Este sangue armazenado em bolsas térmicas com gelo até centrifugação. O tempo entre a coleta e a centrifugação não

33 31 ultrapassou três horas. As amostras foram centrifugadas à 3500 rpm/min durante 10 minutos e posteriormente, o plasma separado com o uso de micropipetas e armazenados a -20 C em criotubos de 2 ml até analise laboratorial. 4.5 ANÁLISE HORMONAL As análises laboratoriais foram realizadas em Setembro de 2010 no Laboratório de Dosagens Hormonais do Departamento de Reprodução Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo (LDH-VRA-FMVZ-USP) através da utilização de kits comerciais para dosagem de testosterona por radioimunoensaio (Coat-a-Count, DPC, Los Angeles, CA, USA). Para a realização do radioimunoensaio, as amostras foram descongeladas a temperatura ambiente e numeradas para identificação. As amostras foram subdivididas através de pipetas de 50µl em tubos de ensaio em duplicata. Foi adicionado 1 ml de Iodo 125 em cada tubo e estes colocados em banho maria durante três horas, possibilitando a decantação do material e formação de complexos antígeno-anticorpo. Após este tempo, os tubos de ensaio contendo as amostras foram colocados em uma grade de esponja, a parte liquida das amostras, chamada de dejeto, foi descartada em uma pia própria e os tubos virados com a abertura do tubo de ensaio para baixo sobre papel toalha, a fim de garantir que todo o dejeto fosse desprezado, preparando assim as amostras para análise. Os tubos foram então colocados no equipamento Cobra Autogamma Packard para análise, obtendo assim os títulos de testosterona. 4.6 ANÁLISE ESTATÍSTICA Os valores foram descritos por meio de medidas descritoras, como média e desvio padrão, tabelas e gráficos. Para determinação dos valores de referência foi determinada a faixa compreendida entre o percentil 2,5 e 97,5. A comparação entre os níveis de testosterona quando houve captura do mesmo animal em dois momentos distintos, foi feita apartir do teste t pareado. A comparação entre machos e fêmeas foi feita pelo teste da Binomial. As diversas