Enumeração de Escherichia coli em carne bovina e de aves através de metodologia miniaturizada utilizando-se "eppendorf" e caldo fluorogênico

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1 RPCV (2008) 103 ( ) REVISTA PORTUGUESA DE CIÊNCIAS VETERINÁRIAS Enumeração de Escherichia coli em carne bovina e de aves através de metodologia miniaturizada utilizando-se "eppendorf" e caldo fluorogênico Enumeration of Escherichia coli in meat and poultry by using a miniaturized methodology "eppendorf" and fluorogenic broth Robson M. Franco 1 *, Samira P. S. Mantilla 2, Analy M. O. Leite 3 1 Departamento de Tecnologia de Alimentos da Universidade Federal Fluminense 2 Higiene Veterinária e Processamento Tecnológico de Produtos de Origem Animal da UFF 3 Universidade Federal do Rio de Janeiro Resumo: A Escherichia coli é considerada um patógeno emergente e pode ocasionar doenças de origem alimentar de sintomas brandos até quadros mais graves como a colite hemorrágica. Estas bactérias estão presentes no trato gastrointestinal dos animais, sendo comum a contaminação da carcaça e cortes de carne durante o abate e o processamento. A metodologia tradicional de enumeração de E. coli em alimentos é muito demorada e dispendiosa, por conseguinte, métodos miniaturizados vêm sendo pesquisados por diversos cientistas na área de microbiologia. Além disso, vem ocorrendo grande interesse pelos métodos microbiológicos que visem a redução de gastos na aplicação das técnicas analíticas laboratoriais alimentícias, desde que apresentem sensibilidade e especificidade da metodologia tradicional. Nesta pesquisa, a partir de amostras de acém (inteiro e moído) e de carne de aves, enumerou-se coliformes totais e E. coli através de metodologia miniaturizada e comparou-se os resultados com os padrões estabelecidos pela legislação brasileira. Das amostras de carne bovina e de aves analisadas, 13,33% e 20% respectivamente, apresentaram-se fora do padrão estabelecido. Metodologias rápidas e miniaturizadas apresentam vantagens sobre a metodologia tradicional com diminuição dos custos e menor tempo de análise, proporcionando um diagnóstico fidedigno e com maior rapidez. Summary: Escherichia coli is considered an emerging pathogen and can cause food-borne illnesses from mild symptoms to the most serious such as hemorrhagic colitis. These bacteria are present in the gastrointestinal tract of animals and are common to contamination of carcasses and cuts of meat during slaughter and processing. The traditional method of enumeration of E. coli in food is very time consuming and expensive, therefore, miniaturized methods are being researched by several scientists in the field of microbiology. Furthermore, much interest has occurred by microbiological methods to reduce costs of the application of analytical techniques laboratory products, provided that they have sensitivity and specificity of traditional methodology. In this research, from chuck steak samples (whole and ground) meat and poultry, it listed total coliform and E. coli through miniaturized methodology and compared the results with the *Correspondência: robsonmf@vm.uff.br Tel: +55 (21) / / standards established by Brazilian legislation. Samples of beef and poultry examined, 13.33% and 20% respectively, showed up outside the established standard. Rapid and miniaturized methods have advantages over the traditional methodology with lower costs and shorter time of analysis, providing an accurate diagnosis and more quickly. Introdução A carne bovina é considerada um alimento de origem animal com elevado teor de proteínas de alto valor biológico, necessárias para a manutenção do estado hígido. Porém, ao cominuir esse alimento nobre com alto valor nutricional, muitos fatores podem colaborar em comprometer este alimento nos aspectos de inocuidade, pois a moagem ao aumentar a área de superfície, facilita o crescimento e desenvolvimento microbiano. Aliado a este fato, a alta manipulação com baixo padrão higiênico-sanitário permite a multiplicação bacteriana e o desenvolvimento de bactérias patogênicas como E. coli. A carne de aves é também um alimento de alto valor nutritivo e de grande importância à viabilidade orgânica e recuperação das funções fisiológicas. Porém, devido à excelente composição nutricional, é um alimento muito perecível. Como a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), através da Resolução RDC nº 12, de 02 de janeiro de 2001 (Brasil, 2001), exige a enumeração de coliformes como prova analítica para liberação de carnes bovinas e de aves para consumo, essa enumeração em produtos cárneos é largamente pesquisada por diversos autores na área de microbiologia, e muitos deles detectaram altas contagens dessas bactérias em carnes bovinas e de aves como descrito por Leite et al. (1988), Costa et al. (2000), Delú et al. (2006) e Cardoso et al. (2005). A Escherichia coli é a espécie predominante entre 201

2 os diversos microrganismos anaeróbios facultativos que fazem parte da microbiota intestinal de animais de sangue quente. O significado da sua presença nos alimentos indica contaminação microbiana de origem fecal e, portanto condições higiênicas insatisfatórias; e o outro aspecto a ser considerado é que diversas linhagens são comprovadamente patogênicas para o Homem e os animais. A enumeração laboratorial de E. coli auxilia na detecção do perigo potencial de uma toxinfecção alimentar através da água e dos alimentos fornecidos ao consumo (Franco e Landgraf, 1996). O método tradicional da técnica de tubos múltiplos para detecção de coliformes totais e termotolerantes é laborioso e demorado, pois envolve várias etapas presuntiva e confirmativa, levando no mínimo 48 horas para identificação presuntiva. Recentemente, novos métodos vêm sendo desenvolvidos como forma alternativa para os métodos convencionais, baseados na tecnologia de substratos específicos marcados com indicadores cromogênicos e/ou fluorogênicos. A incorporação desses substratos em um meio seletivo pode eliminar a necessidade de subculturas e posteriores testes bioquímicos para identificação de certos microrganismos (Manafi, 2000). Segundo Bastholm et al. (2008) e Nikaeen et al. (2009), a bioluminescência baseada em atividade enzimática pode reduzir potencialmente o tempo de análise de bactérias indicadoras, tais como coliformes, em água potável. A enumeração de E. coli em alimentos deve ser realizada de forma rápida e fidedigna para que o laudo microbiológico seja expedido o quanto antes para a liberação do produto no mercado. Desta forma, métodos miniaturizados vêm sendo pesquisados por diversos cientistas na área de microbiologia. Ao invés da metodologia tradicional de enumeração de coliformes, que demora em torno de uma semana para concluir-se o diagnostico, outros meios de cultuta vêm sendo utilizados para agilizar o procedimento como o Caldo "Fluorocult". O meio "Fluorocult Broth" é um caldo de enriquecimento seletivo para a detecção simultânea de coliformes totais e E. coli em água e em alimentos. Através da adição de um substrato cromogênico, 5-bromo-4-cloro-3-indolil-D-galactopiranoside (X-GAL), que é quebrado pelos coliformes, e um substrato fluorogêncio, 4-metilumberiferi-D-glucoronide (MUG), que é muito específico para E. coli, a detecção simultânea de coliformes totais e E. coli é possível. Este método agiliza o diagnóstico proporcionando um resultado em até 24 h de incubação. A presença de coliformes é indicada pela coloração verde azulada do caldo e a E. coli pela fluorescência quando visualizada sob iluminação ultavioleta. Posteriormente, a reação do indol confirma a presença de E. coli (Merck, 2007). Algumas autoridades internacionais em microbiologia alimentar industrial têm desenvolvido trabalhos enfatizando métodos rápidos, miniaturizados e de automação para que sejam validados e aceitos internacionalmente, tais como os descritos por: Fung e Cox (1981), Cox et al. (1984), Fung et al. (1984), Fung et al. (1988), Ligugnana e Fung (1990). Nos trabalhos acima aludidos, as modificações inseridas nos métodos aplicados na indústria e comercialização de alimentos, são sumariadas em cinco categorias: aperfeiçoamento da amostragem e preparação das amostras; miniaturização dos procedimentos convencionais e desenvolvimento de "kits" para diagnósticos; modificações nos procedimentos de contagem de células viáveis; desenvolvimento de novos métodos para estimar a população microbiana e identificar microrganismos por instrumentos e métodos sofisticados. Os objetivos desta pesquisa foram enumerar coliformes totais e Escherichia coli, a partir de carne bovina e de aves, comparando os resultados obtidos frente aos padrões de identidade e qualidade nacionais vigentes, constantes na Resolução RDC nº 12 e avaliar a eficiência da metodologia rápida e miniturizada e do meio fluorogênico para enumeração destas bactérias. Material e métodos Foram analisadas quinze amostras de carne bovina inteira, onde o corte selecionado foi o acém, e quinze amostras desta carne moída adquiridas em estabelecimentos comercias incluindo supermercados e açougues de diferentes níveis sociais do município de Niterói RJ, totalizando trinta amostras de acém e também trinta amostras de coxas de frango obtidas em abatedouros e supermercados do Município do Rio de Janeiro, RJ. As análises bacteriológicas foram realizadas no laboratório de Controle Microbiológico de Produtos de Origem Animal da Faculdade de Veterinária da Universidade Federal Fluminense, onde foram realizados a enumeração de coliformes totais e de bactérias da espécie Escherichia coli. Neste projeto foram efetuadas algumas mudanças operacionais nas técnicas laboratoriais, objetivando maior rapidez e economia no diagnóstico bacteriológico. Os tubos de ensaio foram substituídos por "eppendorf", utilizaram-se pipetadores automáticos acoplados com pontas esterilizadas para preparo e inoculações de 0,1 ml (100 µl) das diferentes diluições em 1 ml (1000 µl) do meio caldo seletivo "Fluorocult". As pontas contidas em "rack" apropriados foram esterilizadas em autoclave a 121 ºC/15 minutos, tal como os meios de cultura, cujo controle da esterilização era confirmado com o uso de ampolas (bioindicador). Foram utilizados 0,9 ml de solução salina peptonada 0,1% para diluições em série, em "eppendorf" ao invés de 9 ml desta solução; os meios de cultura foram acondiciona- 202

3 dos assepticamente no volume de 1 ml (1000 µl) ao invés de 10 ml, em tubos "eppendorf", no momento de uso. A tabela de Mac Crady (Tabela 1) foi utilizada para o cálculo do número mais provável. Entretanto, a unidade subamostral permaneceu original (25 g homogeneizada em 225 ml), isto é, a proporção entre a alíquota semeada e a solução diluente permaneceu constante 1:10 para não ocorrerem resultados falso negativos. A metodologia utilizada para enumeração, isolamento e identificação de Escherichia coli foi a descrita por Merck (2000) onde foram pesados assepticamente 25 g da amostra e homogeneizados juntamente com 225 ml de solução salina peptonada a 0,1% em "stomacher". Prosseguiu-se fazendo as diluições 10-2, 10-3, 10-4,10-5, 10-6 e Foram semeadas séries de três "eppendorf" contendo cada um 1 ml (1000 µl) do meio "Fluorocult LMX Broth Modified acc. to Marrafi and Osmer". A incubação foi a ºC por horas e logo após procedeu-se a leitura e interpretação do teste. Foi determinado o Número Mais Provável (NMP), tanto para coliformes totais como para fecais, de acordo com os "eppendorf" positivos. Os "eppendorf" que apresentaram fluorescência Tabela 1 - Tabela de Mac Crady utilizada para a determinação do número mais provável Número de Tubos Positivos NMP/g ou ml Intervalo Confiança (95%) 0,1 0,01 0,001 Inferior Superior <3, , ,0 0,15 9, ,0 0, ,1 1, ,2 1, ,4 3, ,6 0, ,2 1, , ,4 1, , , , , ,2 1, , , , , , , , , , , , , > Fonte: Brasil,

4 verde azulada na presença da luz ultravioleta eram considerados coliformes fecais. Por outro lado, os que demonstraram somente coloração verde azulada, eram tidos como coliformes totais. Para a confirmação, realizou-se a prova do indol nos "eppendorf" Fluorocult positivos, pingando-se gotas de reativo de Kovacs sobre o cultivo. Aqueles cultivos que apresentaram um anel vermelho na superfície foram considerados positivos para E. coli. Resultados e discussão Para melhor entendimento dos resultados encontrados nas provas analíticas deste experimento, sugere-se a consulta da Tab. 2 onde consta que, na amostra de carne bovina inteira o número de coliformes totais variou de 2,8x10 2 NMP/g a >1,1x10 7 NMP/g, e o de coliformes termotolerantes variou de <3 NMP/g a 1,5x10 5 NMP/g. As quinze amostras de carne bovina inteira (100%) apresentavam-se contaminadas por E. coli patogênicas. Nesta mesma tabela, observa-se para a amostra moída que o número de coliformes totais variou de 2,1x10 2 NMP/g a >1,1x10 7 NMP/g, e o de coliformes termotolerantes variou de 4,0x10 NMP/g a 7,5x10 5 NMP/g. Além dos coliformes totais oriundos de ambientes não fecais, a presença de E. coli, indica que também houve contaminação de origem fecal na produção, processamento, armazenamento inadequado das amostras e/ou falta de higiene dos manipuladores, podendo indicar até a presença de enteropatógenos e deterioração potencial do alimento. De acordo com a Resolução RDC número 12, de 02 de janeiro de 2001 (Brasil, 2001), a qual aprova o Regulamento sobre padrões microbiológicos para alimentos, a tolerância para amostra indicativa de coliformes termotolerantes para carne refrigerada é no máximo Assim sendo, verifica-se que 13,33% das amostras inteiras apresentaram contaminação por coliformes termotolerantes acima do permitido. Em relação às amostras moídas, não existe um padrão específico para a quantidade de coliformes termotolerantes presente na amostra, entretanto comparando-se com a amostra inteira, 26,66% das amostras moídas mostraram-se contaminadas com número acima do máximo permitido. Kasnowski (2004) apresentou resultados semelhantes quando analisou amostras de carne bovina (alcatra) inteira e moída, através da utilização do caldo "Fluorocult", onde a variação do resultado da enumeração de coliformes totais e termotolerantes foi respectivamente de 4,0x10 3 NMP/g a 1,1x10 6 NMP/g e 0 NMP/g a 2,4x10 3 NMP/g para carne interia e de 4,4x10 3 NMP/g a 2,5x10 7 NMP/g e 0 NMP/g a 3,0x10 5 NMP/g para moída. Leite et al. (1988) analisou diferentes alimentos e observou que 100% as amostras examinadas apresentaram coliformes totais em contagens significativas e 56% tiveram NMP de coliformes termotolerantes acima de 5,0x10 2 NMP/g, inclusive as amostras de carne moída que apresentaram 3,5x10 4 /g coliformes. Resultados semelhantes em análise bacteriológicas de carne bovina também Tabela 2 - Resultados das análises de coliformes a partir de amostras de cortes de carne bovina (acém, peça inteira e moída) Amostras inteiras Amostras moídas CT(NMP) CTer(NMP) CT(NMP) CTer(NMP) NMP/g NMP/g NMP/g NMP/g 1 3,6x10 4 1,5x ,9x10 3 4,3x ,8x10 2 1,5x10 2 1,2x10 4 9,x ,4x10 4 2,3x10 3 >1,1x10 7 4,3x10 4 5,3x10 4 7,5x10 4 2,3x10 3 9,3x10 5 >1,1x10 7 1,1x10 5 >1,1x10 7 4,3x10 6 5,3x10 5 1,5x ,1x10 5 7,5x ,1x10 4 4,3x10 7 2,1x10 2 7,0x10 8 2,1x10 5 1,5x ,3x10 3 2,3x ,5x10 4 2,3x10 9 3,9x10 4 3,0x ,9x10 5 7,0x ,4x10 5 3,0x >1,1x10 7 4,0x >1,1x10 7 4,0x ,5x10 6 7,0x >1,1x10 7 7,5x ,1x10 7 4,0x >1,1x10 7 2,3x >1,1x10 7 0,9x10 14 >1,1x10 7 2,1x ,5x10 4 <3 15 4,2x10 5 4,0x10 MÉDIA 3,1x10 6 1,2x10 4 4,5x10 6 5,8x10 4 CT Coliformes totais CTer Coliformes termotolerantes NMP Número mais provável NMP/g Unidades Formadoras de Colônia por grama de alimento 204

5 foram encontradas por Costa et al. (2000) ao verificarem que 10% das 30 amostras estavam contaminadas com coliformes totais, 90% com coliformes termotolerantes e 40% positivas para E. coli. Conforme resultados encontrados demonstrado na Tab. 3, a média do NMP de coliformes termotolerantes nas amostras de carne de aves analisadas foi 9,8x10 5 NMP/g, variando de <3 NMP/g a 2,9x10 7 NMP/g, ocorrendo em doze amostras (40%). Na contagem de coliformes totais, a média foi 2,0x10 7 NMP/g com valores variando de <3 NMP/g a >2,4x10 8 NMP/g, sendo que somente uma (3,33%) amostra apresentou o menor valor. Das treze amostras positivas para E. coli, nove (69%) foram adquiridas em abatedouros clandestinos, evidenciando que os cuidados com as práticas higiênicas muitas vezes são negligenciados, confirmando o perigo da comercialização da carne clandestina e a necessidade de uma inspeção sanitária eficiente. Dentre as amostras de carne de aves analisadas, 24 (80%) enquadraram-se nos padrões de qualidade e identidade da legislação vigente, consideradas próprias para o consumo. Enquanto que seis (20%), obtiveram contagem de E. coli superior ao estabelecido pelo padrão (104 NMP/g), sendo cinco delas (83%), provenientes de abatedouros sem inspeção. Delú et al. (2006), avaliaram as condições higiênicosanitárias de trinta amostras de cortes de frango resfriados, comercializados em dez estabelecimentos diferentes do município de Lavras - MG e revelaram que 100% das amostras estavam contaminadas com coliformes totais e fecais, porém dentro dos padrões estabelecidos pela legislação. Cardoso et al. (2005) também avaliaram a qualidade microbiológica de 29 carcaças e 35 cortes de frango oriundos de abatedouros avícolas de São Paulo, e os valores mínimos e máximos do NMP para coliformes fecais por grama de carcaça (<3 NMP/g e 9,6x10 2 NMP/g) e cortes de frango (<3 NMP/g e 11,2 x10 2 NMP/g) obtidos foram bem mais baixos que o presente Tabela 3 - Resultados das análises de coliformes de amostras de coxas de frango Amostra Origem CT (NMP) CTer(NMP) NMP/g NMP/g 1 Trailer 1,1x105 2,4x104 2 Aviário 2,3x103 2,3x103 3 Supermercado 4,0x103 <3,0 4 Supermercado <3,0 <3,0 5 Supermercado 2,7x104 <3,0 6 Açougue >1,1x106 <3,0 7 Supermercado 4,3x103 9,0x102 8 Supermercado 4,0x102 <3,0 9 Supermercado 1,1x104 7,0x Supermercado 3,5x104 1,1x Trailer 2,1x108 2,9x Açougue 1,1x105 9,3x Açougue 1,1x107 2,9x Supermercado 4,0x103 <3,0 15 Supermercado >1,1x106 <3,0 16 Açougue >1,1x107 <3,0 17 Supermercado 2,4x108 <3,0 18 Açougue 6,2x102 <3,0 19 Feira 2,4x105 4,3x Supermercado 2,3x103 <3,0 21 Supermercado 4,3x104 <3,0 22 Supermercado 1,5x104 <3,0 23 Supermercado 2,8x104 2,3x Feira 2,0x105 9,3x Feira >1,1x108 9,3x Supermercado 2,9x105 <3,0 27 Aviário 2,4x107 4,3x Aviário 4,0x102 <3,0 29 Feira 2,4x105 <3,0 30 Açougue 9,3x103 <3,0 Média 2,0x107 9,8x105 CT Coliformes Totais CF Coliformes termotolerantes 205

6 trabalho, todas consideradas próprias para o consumo. A metodologia rápida e miniaturizada mostraram-se eficiente para enumeração de coliformes totais e E. coli nas amostras de carne bovina e de aves, podendo ser utilizada de forma rotineira nas pesquisas microbiológicas de alimentos por ser um método mais rápido, econômico e com sensibilidade e especificidade semelhantes a metodologia tradicional. Estudo prévio realizado por Beloti et al. (2002) em amostras de leite, também revelou eficiência do caldo "Fluorocult" para enumeração de coliformes, com a vantagem de ser facilmente utilizado e requerer menor tempo de análise do que a metodologia convencional. Gleissler et al. (2000) e Suwansonthichai e Rengpipat (2003) compararam a eficiência destes métodos rápidos com os convencionais em amostras de água do mar e camarão, respectivamente, e concluíram que o meio "Fluorocult" é sensível e específico na determinação de E. coli, sendo uma alternativa apropriada na enumeração deste microrganismo. Manafi e Kremsmaier (2001) compararam diferentes meios de cultura fluorogênicos/cromogênicos para detecção de E. coli O157:H7 com o ágar convencional Mac Conkey Sorbitol e relataram que na análise de amostras de alimentos, o ágar Mac Conkey Sorbitol apresentava 57,3% de resultados falso positivos, enquanto que o ágar "Fluorocult" O157:H7 6,2%, indicando comportamento insatisfatório do ágar convencional. Na pesquisa realizada por Mantilla et al. (2005) onde comparou-se a eficiência do método fluorogênico (meio "Fluorocult") utilizando-se tubos "eppendorf" para a enumeração de coliformes fecais com a metodologia tradicional em amostras de frango resfriadas, foi comprovada a inexistência de diferença estatisticamente significativa entre os dois métodos, concluindo-se, assim, que este método rápido pode ser utilizado para a enumeração de coliformes fecais, possuindo a vantagem de ser um método mais prático e econômico. E de acordo com o resultado obtido por Bastholm et al. (2008) em seu estudo, a análise de água potável apresentou resultados comparáveis para enumeração de coliformes através da técnica tradicional, Colilert- 18 e da bioluminescência com o Caldo "Fluorocult". No trabalho desenvolvido por Dogan et al. (2002), comparou-se a metodologia tradicional (tubos múltiplos com o Caldo LST) para enumeração de E. coli com o método fluorogênico rápido (MUG) em 500 amostras de alimentos. Foi encontrada uma conformidade entre os dois métodos em 81,8% das amostras analisadas, em 16,2% das amostras houve um resultado numericamente maior no método fluorogênico. De acordo com a análise estatística realizada por esses autores, através do coeficiente de correlação de Pearson e teste do qui-quadrado, foi constatada uma diferença significativa entre os dois métodos, indicando que o método rápido foi mais confiável que o tradicional, visto que das 500 amostras analisadas, 409 (81,8%) apresentaram resultados idênticos para os dois métodos, enquanto 81 (16,2%) apresentaram valores mais elevados na contagem bacteriana pelo método rápido e apenas 10 (2,0%) apresentaram maiores valores de contagem pelo método tradicional. Nikaeen et al. (2009) comparou o desempenho de caldo LMX ("Fluorocult") como um ensaio enzimático com a metodologia tradicional dos tubos múltiplos para a detecção de coliformes em amostras de água potável. Das 50 amostras testadas, 8 (16%) e 7 (14%) continham coliformes totais e E. coli, como indicado pelas duas técnicas. Embora em média, a contagem de coliformes totais e E. coli foi mais altas no método LMX, não houve diferença significativa. Esses autores concluíram que o ensaio enzimático demonstrou ser um método rápido e menos dispendioso, permitindo a detecção simultânea de coliformes totais e E. coli. Conclusões Verificou-se que 13,33% das amostras de carne bovina inteiras apresentaram contaminação por coliformes termotolerantes acima do permitido pela legislação brasileira, não sendo consideradas aptas para consumo. Em relação às amostras moídas, não existe um padrão específico para este grupo bacteriano, entretanto comparando-se com a amostra inteira, 26,66% das amostras moídas mostraram-se contaminadas com número acima do máximo permitido. Das treze amostras de carne de frango, 24 (80%) se enquadraram nos padrões de qualidade e identidade da legislação vigente, enquanto que seis (20%), obtiveram contagem de E. coli superior ao estabelecido pelo padrão (10 4 ), sendo portanto, impróprias ao consumo. Fato este, que deve servir como alerta às autoridades sanitárias, sendo motivo de maior fiscalização aos estabelecimentos, principalmente sobre os clandestinos. A metodologia miniaturizada foi eficaz na enumeração de coliformes totais e termotolerantes quer seja em amostras inteiras e moídas de carne bovina e de carne de aves, pois em nenhuma delas ocorreu resultado falso negativo. Nesta metodologia pode ser observado que o NMP do coliforme total foi sempre superior ao NMP do coliforme termotolerante, o que conclui-se que além de coliformes totais oriundos de ambientes não fecais, também houve contaminação no processamento tecnológico de obtenção das amostras por coliformes termotolerantes que denotam contaminação de origem fecal. Além disso, a miniaturização tornou o procedimento técnico mais fácil e minimizou os riscos de manipulação; as pontas e pipetas automáticas otimizaram a técnica por reduzir o tempo no preparo das diluições e 206

7 os riscos de acidentes quando se trabalha com pipetas de vidro; a redução dos volumes de solução salina peptonada de 9 ml para 0,9 ml (900 µl) e dos meios de cultura de 10 ml para 1 ml (100 µl), economizaram em 10 vezes as quantidades utilizadas, reduzindo os custos. Bibliografia Bastholm S, Wahlstrøm L, Bjergbæk LA e Roslev P (2008). A simple bioluminescence procedure for early warning detection of coliform bacteria in drinking water. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 24(10): Beloti V, Barros MAF, Nunes MP, Santana EHW, Nero LA e Souza JA (2002). Use of Readycult: LMX for Enumeration of total coliforms and Escherichia coli in milk. Brazilian Journal of Microbiology, 33: Brasil. Ministério da Saúde. Agência Nacional de Vigilância Sanitária (2001). Resolução RDC número 12, de 02 de janeiro de Aprova o Regulamento sobre padrões microbiológicos para alimentos e seus Anexos I e II. Diário Oficial, de 12/01/01. Brasil. Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (2003). Instrução Normativa nº 62, de 26 de agosto de Oficializa os Métodos Analíticos Oficiais para Análises Microbiológicas para Controle de Produtos de Origem Animal e Água. Diário Oficial da União de 18/09/2003, Seção 1, Página 14. Cardoso ALSP, Castro AGM, Tessari ENC, Baldassi L, Pinheiro ES (2005). Pesquisa de Salmonella spp., coliformes totais, coliformes fecais, mesófilos, em carcaças e cortes de frango. Higiene Alimentar, 19(128): Costa FN, Alves LMC, Monte SS (2000). Avaliação das condições higiênico-sanitárias de carne bovina moída, comercializada na cidade de São Luís, MA. Higiene Alimentar, 14(77): Cox NA, Fung DYC, Goldschmidt MC, Bailey JS, Thomson JE (1984). Selecting a miniaturized system for identification of Enterobacteriaceae. Journal Food Protection, 47: Delú MAF, Shampato CG, Mendonça AT, Piccoli RH, Maia SC (2006). Avaliação Microbiológica de cortes de frango resfriado, comercializados no município de lavras, MG. Higiene Alimentar, 20(138): Dogan HB, Cakir I, Baspinar E. e Halkman AK (2002). Comparison of LST + MUG broth technique and conventional method for the enumeration of Escherichia coli in foods. Letters in Applied Microbiology, 34: Franco BDGM e Landgraf M (1996). Microrganismos Patogênicos de Importância em Alimentos. In: Microbiologia dos Alimentos. Editora: Atheneu (São Paulo), Fung DYC e Cox NA (1981). Rapid identification systems in food-industry: present and future. Journal Food Protection, 44: Fung DYC, Goldschmidt MC, Cox NA (1984). Evaluation of boterial diagnostic kits and systems at na international workshop. Journal Food Protection, 44: Fung DYC, Cox NA, Bailey JS (1988). Rapid methodes and automation in Microbiology. Dairy Food Sanitary, 8: Gleissler K, Manafi M, Amorós I, Alonso JL (2000). Quantitative determination of total coliforms and Escherichia coli in marine waters with chromogenic and fluorogenic media. Journal of Applied Microbiology, 88: Kasnowski MC (2004). Listeria spp., Escherichia coli: Isolamento, identificação, estudo sorológico e antimicrobiano em corte de carne bovina (alcatra) inteira e moída. Niterói RJ (2004). 110 f. Dissertação (Mestrado em Higiene Veterinária e Processamento Tecnológico de Produtos de Origem Animal). Universidade Federal Fluminense, UFF. Niterói, RJ. Leite CQF, Valentini SR, Falcão DP (1988). Pesquisa de enteropatógenos e alimentos cárneos crus. Ciência e tecnologia de Alimentos (SBCTA), 8(2): Ligugnana R e Fung DYC (1990). Training of food and dairy staff for Microbiology an and surface hygiene. Dairy Food Environmental Sanitary, 10: Manafi M (2000). New developments in chromogenic and fluorogenic culture media. International Journal of Food Microbiology, 60: Manafi M e Kremsmaier B (2001). Comparative evaluation of different Chromogenicrfluorogenic media for detecting Escherichia coli O157:H7 in food. International Journal of Food Microbiology, 71: Mantilla SPM, Kasnowski MC, Vieira TB, Platte CS, Franco RM, Oliveira LAT, Freitas M Q (2005). Comparação entre a metodologia tradicional e dois métodos rápidos para enumeração de Escherichia coli em amostras de frango resfriadas. In: I Congresso Nacional de Saúde Pública Veterinária, 2005, Guarapari. Mantilla SPM, Vieira TB, Kasnowski MC, Alves FJX, Platte CV, Franco RM, Oliveira LAT, Freitas MQ (2007). Comparação entre métodos de enumeração de coliformes termotolerantes em cortes de frango resfriados. Revista CFMV, 41: Merck (2000). Microbiology Manual. Berlin. Germany. 407p. Merck (2007). Fluorocult LMX Broth. Disponível em Acesso em 10 de outubro de Nikaeen M, Pejhan A, Jalali M (2009). Rapid monitoring of indicator coliforms in drinking water by an enzymatic assay. Iran J, Environ Health, Sci Eng, 6 (1), Suwansonthichai S e Rengpipat S (2003). Enumeration of coliforms and Escherichia coli in frozen black tiger shrimp Penaeus monodon by conventional and rapid methods. International Journal of Food Microbiology, 81: