Acachaça é a terceira das bebidas alcoólicas mais consumidas no
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- Martín Avelar Neves
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1 5 Análise de Poluentes Orgânicos Tóxicos na Cachaça Haroldo Silveira Dórea* Maria das Graças Cardoso** Sandro Navickiene*** Elissandro Soares Emídio**** Tamires Cruz Santos Silva***** Marcell Mendes Santos Silva****** Resumo Acachaça é a terceira das bebidas alcoólicas mais consumidas no mundo. Esta pode sofrer a contaminação por hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) quando a cana-de-açúcar utilizada é queimada antes da colheita ou pelo contato com recipientes plásticos. Foram selecionados os HPAs fluoreno, antraceno e benzo(a)pireno. A extração em fase sólida foi empregada para a extração dos compostos na cachaça. Os analitos foram analisados por cromatografia em fase gasosa acoplada ao espectrômetro de massas (GC-MS). Os testes de otimização da metodologia mostraram a importância ao se adicionar a acetonitrila na solubilização dos HPAs e acetato de etila como eluente. As recuperações dos HPAs foram 86,2% para o fluoreno, 118,9% para o antraceno e 96,4%, para o benzo(a)pireno. Os limites de detecção (LD) foram: 3 µg.l -1, 8 µg.l -1, 4,24 mg.l -1 para o fluoreno, antraceno e benzo(a)pireno, respectivamente. Os limites de quantificação (LQ) foram: 9 µg.l -1, 35 µg.l -1 e 12,74 mg.l -1 para o fluoreno, o antraceno e o benzo(a)pireno, respectivamente. O método apresenta boa linearidade e sensibilidade. As amostras de cachaça analisadas tiveram faixa de concentração de 0,14 mg. L -1 para o fluoreno a 0,93 mg. L -1 para o benzo(a)pireno. PALAVRAS CHAVE: Cachaça, HPA, SPE, GC-MS. * Doutor em Química, Professor Associado da Universidade Federal de Sergipe, Departamento de Química, Av. Marechal Rondon, s/n Jardim Rosa Elze, CEP , São Cristóvão SE. hdorea@ufs.br. ** Doutora em Química Orgânica, Professora da Universidade de Lavras, Departamento de Química, Caixa Postal 3037, DQI - Campus Universitário UFLA, CEP , Lavras MG. mcardoso@ufla.br *** Doutor em Química, Professor Adjunto da Universidade Federal de Sergipe, Departamento de Química. sandnavi@ufs.br. **** Farmacêutico, Mestrando em Química pela Universidade Federal de Sergipe, Núcleo de Pós-Graduação em Química. elissandro_se@yahoo.com.br. ***** Graduanda em Engenharia de Alimentos pela Universidade Federal de Sergipe, Núcleo de Engenharia de Alimentos. tss.cruz@gmail.com. ****** Graduando em Engenharia Química pela Universidade Federal de Sergipe, Departamento de Engenharia Química, marcell.mendes@hotmail.com.
2 6 Haroldo Silveira Dórea; Maria das Graças Cardoso e outros 1. Introdução Tipicamente brasileira, cachaça é o destilado de cana mais consumido no Brasil. A bebida é obtida do caldo de cana fermentado e recebe várias denominações como caninha, limpa, água-de-cana, perigosa, pinga, danada, dengosa, moça branca e outras, variando de acordo com a região. A cachaça foi e ainda é cantada em verso e prosa, em machinhas carnavalescas ou em outros estilos musicais. Tornou-se popular desde a época do Brasil colônia. Nos últimos dez anos a cachaça deixou de ser apenas uma bebida de botequim de esquina, das classes mais pobres e passou a ser também consumida em bares e ambientes mais sofisticados, ganhou um estilo mais nobre e extrapolou as fronteiras brasileiras. O drinque caipirinha está hoje nos cardápios de bares e restaurantes de vários países. Essa importância no contexto econômico, as exigências advindas do mercado da cachaça, inclusive com a exportação aos países da Europa, Japão e Estados Unidos, juntamente com a crescente preocupação em proteger o consumidor, demandam uma melhor qualidade do produto fabricado e seu permanente controle. Segundo a ABRABE (Associação Brasileira de Bebidas), estima-se que a produção nacional encontra-se em torno de 1,5 bilhões de litros por ano. O estado de São Paulo é o maior produtor de aguardente industrial e Minas Gerais o quinto produtor nacional e o mais especializado em cachaça artesanal. No cenário internacional a bebida se destaca como o terceiro destilado mais consumido do mundo. Segundo Campelo (2002) as exportações em 2001 fecharam em US$ 8,5 milhões, o que corresponde a 11 milhões de litros da bebida. Para 2010 a meta é que as exportações cheguem a US$100 milhões. A cachaça pode ser produzida utilizando colunas ou torres de destilação, cujo processo é denominado industrial ou ainda em alambique, o modo artesanal, onde são utilizados tradicionalmente alambiques de cobre, tendo em vista que esses favorecem a qualidade da bebida, pois o cobre atua como catalisador de importantes reações que ocorrem durante a destilação em pequena quantidade. O processo de produção da cachaça artesanal envolve uma série de detalhes especiais espalhados por todo o processo, desde a escolha do tipo de cana, passando pela época certa da colheita, o tempo de moagem, os ingredientes e o tempo de fermentação, a forma de destilação, os barris para o envelhecimento, até o engarrafamento. A diferença destes processos está na etapa de destilação. Na destilação em alambique ocorre a separação da fração inicial (cabeça) e da final (cauda), utilizando somente o coração do destilado, permitindo que a bebida de alambique seja rica em componentes secundários favoráveis ao aroma e ao sabor. O corte correto das frações permite um ajuste adequado desses componentes. O aprimoramento da produção com o controle da fermentação através de linhagens selecionadas levou a melhor padronização da cachaça. A produção artesanal cresceu em detrimento da industrial. Apesar de o processo ser mais trabalhoso e demorado, garante a tradição da melhor cachaça. A maioria dos compostos presentes na cachaça são formados no processo de fermentação, isto requer um controle adequado das etapas, envolvendo assepsia dos equipamentos, utilização de leveduras selecionadas, controle de ph, temperatura do mosto e ajuste do grau Brix. De acordo com a Instrução Normativa nº 13, de 30/ 6/2005, a aguardente é a bebida com graduação de 38% v/v a 54% v/v a 20ºC, obtida do destilado alcoólico simples de cana-de-açúcar ou pela destilação do mosto fermentado do caldo de cana-de-açúcar, podendo ser adicionado açúcares até 6g.L -1. Cachaça é a denominação típica e exclusiva da aguardente de cana produzida no Brasil, com graduação alcoólica de 38% a 48% v/v a 20ºC, e com características sensoriais peculiares (BRASIL, 2005). As cachaças recém destiladas não estão prontas para o consumo devido à presença de acetaldeído, uma substância de aroma pungente que irrita a mucosa nasal. É necessário, ainda, que seja maturada ou descansada de três a seis meses (não em madeira), geral-
3 Análise de Poluentes Orgânicos Tóxicos na Cachaça 7 mente em inox, e/ou envelhecida (um a três anos) em recipiente de madeira. Neste período, alguns procedimentos naturais permitem ajustar a composição e apurar o sabor e o aroma da bebida. O processo de maturação corresponde a um período de armazenamento suficiente para suavizar, amaciar o aroma e o sabor da cachaça. Isto porque, os aldeídos presentes, principalmente o acetaldeído, são oxidados a ácidos carboxílicos, devido à troca de oxigênio com a atmosfera ambiente por meio da porosidade da madeira. A oxidação pode ser acelerada aplicando-se aeração à cachaça. O recurso tradicional consiste em circular a cachaça, por meio de bombeamento, retirando-a pela base e retornando-a pelo topo do tonel, em forma de chuveiro, até obter o efeito esperado. Outra opção, mais eficiente, consiste em efetuar a aeração por meio de ar comprimido puro e filtrado. O ar deve borbulhar suavemente na bebida, sob a forma de bolhas muito finas, durante algumas horas por dia (MAIA & CAMPELO, 2006). aldeídos, álcoois superiores, ésteres, metanol, dentre outros. Os principais compostos responsáveis pelo sabor e aroma da bebida são os aldeídos, ésteres e álcoois superiores, porém, os aldeídos em excesso são indesejáveis por serem os principais responsáveis pela ressaca. Os álcoois superiores de cadeia longa também devem ser evitados devido ao seu aspecto oleoso que deprecia a qualidade do produto final. Devido a sua alta toxicidade, o metanol presente na bebida, por processo oxidativo, forma CO 2 causando acidose no sangue podendo levar ao coma e até a morte (CARDO- SO, 2006). Foram definidas quantidades máximas permitidas de alguns contaminantes anteriormente não mencionados, como carbamato de etila, acroleína, álcool secbutilíco, álcool butílico, chumbo e arsênio. O prazo máximo para adequação e controle dos contaminantes da aguardente é até 2008, com exceção do carbamato de etila, até O envelhecimento é uma etapa importante da produção da bebida, porém, não obrigatória. A madeira é uma matriz ideal para o envelhecimento da cachaça, pois permite uma disponibilidade lenta de oxigênio, ocorrendo reações químicas e incorporando diversas substâncias, como os fenóis, ésteres, óleos voláteis, açúcares, substâncias tânicas, pigmentos e compostos inorgânicos que influenciam na cor, odor, sabor e adstringência, formando assim, um buquê especial. A madeira tradicionalmente empregada na fabricação dos barris para o envelhecimento da cachaça é o carvalho, por ser utilizado mundialmente no envelhecimento de outras bebidas, como uísque, conhaque, vinho, etc. A busca de madeiras nacionais (como umburana, jequitibá, jatobá, bálsamo, amendoim, castanheira, louro canela) para o envelhecimento desta bebida está sendo feita por vários pesquisadores da área. O controle de qualidade da cachaça é essencial devido à busca de um produto padronizado, com qualidade química e sensorial. De acordo com a Instrução normativa nº 13, de 30 de junho de 2005 (Brasil, 2005), os padrões de Identidade e Qualidade (PIQ s) para aguardente de cana-de-açúcar e cachaça, estabelecidos pela legislação brasileira, envolvem a determinação de teores como Com aumento das exportações e com o maior grau de exigência dos consumidores, pesquisas têm sido realizadas em toda a cadeia produtiva da cachaça: seleção de variedades de cana-de-açúcar, aspectos fermentativos, seleção de cepas de leveduras, aperfeiçoamento do processo de destilação, escolha de madeiras para envelhecimento do produto; e a determinação das análises visa obter uma padronização para o produto, conferindo melhores características sensoriais a bebida. Um parâmetro importante para obtenção da qualidade da cachaça e que ainda não consta na Instrução Normativa nº13 é a presença dos contaminantes orgânicos tóxicos como, por exemplo, os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs). Essas substâncias poluentes resultantes da emissão de uma grande variedade de fontes, incluindo processos de combustão industrial, da queima da madeira, de combustíveis fósseis e de matéria orgânica em geral, estão presentes em bebidas derivadas da canade-açúcar, como a cachaça e está relacionado ao fato da colheita ser feita principalmente após a queima dos
4 8 Haroldo Silveira Dórea; Maria das Graças Cardoso e outros canaviais. Este recurso é utilizado para eliminar a palha e a ponteira da cana e facilitar a colheita manual, permitindo um maior acesso à cultura. Além disso, protege os cortadores de cana de folhas afiadas, insetos, cobras e aumenta o teor de açúcar devido à evaporação da água. Ao mesmo tempo, a prática da queima dos canaviais introduz partículas de palhiço queimado na atmosfera, assim como inúmeros compostos potencialmente tóxicos, dentre eles os HPAs. Estes compostos podem contaminar a cana-de-açúcar e, conseqüentemente, os produtos obtidos de seu processamento (TFOUNI, et al, 2007). seguintes: seletividade, repetitividade, reprodutividade, linearidade, recuperação, sensibilidade, limites de detecção e quantificação. Figura 1: Fórmula Estrutural do Fluoreno Além da queima da cana, a presença de HPAs em bebidas pode ser proveniente de contaminações nas etapas do processo de produção, tais como: o emprego de lubrificantes nos equipamentos; a utilização de recipientes não-adequados para o armazenamento da bebida; tanques revestidos com resinas asfálticas ricas em HPAs; pelo açúcar adicionado na bebida e durante a maturação da bebida em tonéis de madeira tratada termicamente (BETTIN e FRANCO, 2005). Figura 2: Fórmula Estrutural do Antraceno. Até o momento não existe limite legal para os teores dos HPAs em água e alimentos. Na falta de limites legais, alguns países passaram a adotar limites próprios. A União Européia (UE) como também a German Society for Fat Science estabeleceram os limites de 2,00 µg.l -1 e 25 µg.l -1, respectivamente, para os produtos alimentares. Dentre eles, estão a Alemanha, Suíça, Escócia, Polônia que adotaram um limite tolerável de benzo[a]pireno de 1µg.Kg. -1 em alimentos defumados (SIMKO, 2002). A seriedade dos efeitos que a exposição aos HPA pode ter sobre o organismo humano fez com que atenção especial fosse dedicada ao desenvolvimento de metodologias analíticas hábeis para a identificação e determinação desses compostos tóxicos. Os HPAs selecionados nesse estudo são mostrados nas Figuras 1 a 3. Para o desenvolvimento de uma metodologia, a etapa de validação é essencial para que se possa avaliar objetivamente o grau de confiabilidade dos resultados. Os principais parâmetros a serem observados atestam a exatidão e a precisão da metodologia e são os Figura 3: Fórmula estrutural do benzo[a]pireno. 2. Objetivo Validar uma metodologia analítica através da extração em fase sólida (SPE) para analisar os hidrocarbonetos poliaromáticos (HPAs) fluoreno (Flu), antraceno (Ant) e benzo[a]pireno (B[a]P) em cachaças por GC-MS. 3. Materiais e métodos 3.1. MATERIAIS Micropipeta µl (Drummond Microdispenser, made in USA), micropipeta µl (Nichiryo model 800), evaporador rotatório (Fisatom 802D), coletor à vácuo para SPE da Varian, compressor aspirador da FANEM (modelo 089-CRL).
5 Análise de Poluentes Orgânicos Tóxicos na Cachaça AMOSTRAS Foram analisadas amostras de cachaça da cidade de Aracaju-SE, como também de produtores de Minas Gerais. As concentrações dos HPAs foram calculadas utilizando a seguinte relação de concentração (FILHO, 2005): 3.3. REAGENTES E ADSORVENTES Diclorometano (Tedia, USA), acetonitrila (Merck, Germany), acetato de etila (Tedia, USA), metanol (Carlo Erba, Italy) todos de grau HPLC. Padrões certificados dos HPA utilizados foram: fluoreno, antraceno e benzo[a]pireno (AccuStandard na concentração de 2000 µg.ml -1 ). Cartuchos de C-18 / 500 mg/3 ml (Chromabond, Macherey-Nagel, Germany) EXTRAÇÃO DAS AMOSTRAS DE CACHAÇA Inicialmente o cartucho contendo a fase sólida C18 foi condicionado com uma seqüência dos solventes: 5,0 ml de diclorometano; 5,0 ml de metanol e 5,0 ml de água destilada adicionados separadamente. Depois de condicionado, passou-se 50 ml da amostra de cachaça com 10,0 ml de acetonitrila. O cartucho foi submetido ao vácuo, com uma pressão de 20 KPa, sem tempo de secagem. A amostra foi eluída com 50 ml de acetato de etila. O extrato coletado foi concentrado em evaporador rotatório e, posteriormente, concentrado para um volume de exatamente 1mL com fluxo de nitrogênio gasoso. A figura 4 mostra o fluxograma de todo o processo de clean-up da amostra. Figura 4: Fluxograma do processo de clean-up da amostra.
6 10 Haroldo Silveira Dórea; Maria das Graças Cardoso e outros 3.5. CONDIÇÕES CROMATOGRÁFICAS 4.2. SELEÇÃO DO ELUENTE As análises dos HPAs na cachaça foram realizadas no cromatógrafo gasoso acoplado a espectrômetro de massas (GC-MS) da Shimatzu modelo QP5050A, injetor split-splitless (250 C), coluna ZB- 5 5% (30 m x 0,25 mm d.i. x 0,25 µm) com programação de temperatura inicial de 80ºC min -1, taxa-1 de 30ºC.min -1 até 180ºC; taxa-2 de 8ºC.min -1 até 280ºC por 15 min. O espectrômetro de massas foi operado com monitoramento do íon seletivo (SIM) com impacto de elétrons de 70 ev. Os íons selecionados para os HPAs foram: 202 m/z para o fluoreno, 178 m/z para o antraceno e 252 m/z para o benzo[a]pireno. Volume de injeção de 1 ì L. Partindo de dados obtidos na literatura, foi observado que o solvente mais utilizado na etapa de eluição dos analitos é a mistura diclorometano/hexano e que outros solventes como o acetona/hexano, acetato de etila são menos utilizados. Para a seleção do eluente mais adequado, foram realizadas extrações dos HPAs da matriz de cachaça com diferentes solventes orgânicos. Os solventes testados foram: 50 ml acetona/ hexano (1:4) e 50 ml de acetato de etila. A figura 6 mostra os valores de recuperação destes dois testes. 4. Resultados e discussão Para a otimização do procedimento por SPE, foram realizados com a adição do padrão (1 mg.l -1 ) dos HPAs SOLUBILIDADE DOS HPAS Com o intuito de evitar problemas de sorção durante a extração dos HPAs, realizou-se a comparação da adição de acetonitrila (10,0 ml) na cachaça e sua ausência na mesma, testando assim, a eficiência da recuperação (Figura 5). Os outros parâmetros foram mantidos de acordo com a metodologia. Figura 6: Teste para escolha do solvente de eluição. Os resultados mostram que na eluição com acetona e hexano as recuperações foram bastante elevadas (acima de 130%) para o fluoreno e o antraceno, evidenciando que este solvente eluiu os compostos endógenos da matriz no mesmo tempo de retenção dos HPAs. Entretanto, utilizando-se 50 ml de acetato de etila não foi evidenciado o efeito da matriz, apresentando recuperações que variam de 86,2% para o fluoreno a 96,4% paro o benzo(a)pireno SELETIVIDADE (EFEITO DA MATRIZ) Figura 5: Influência da adição de solvente orgânico na recuperação dos HPAs na cachaça. A seletividade de um método instrumental de separação é a capacidade de avaliar, de forma inequívoca, as substâncias em exame na presença de componentes que podem interferir com a sua determinação em uma amostra complexa. A seletividade avalia o grau de interferência de espécies como outro ingrediente
7 Análise de Poluentes Orgânicos Tóxicos na Cachaça 11 ativo, excipientes, impurezas e produtos de degradação, bem como outros compostos de propriedades similares que possam estar, porventura, presentes. A seletividade garante que o pico de resposta seja exclusivamente do composto de interesse. Se a seletividade não for assegurada, a linearidade, a exatidão e a precisão estarão seriamente comprometidas (ROCKVILLE, 1999; VESSMAN et al., 2001 apud RIBANI et al, 2004). O tratamento estatístico mais utilizado para avaliar se os resultados obtidos em um conjunto de análises são realmente confiáveis é o teste F, onde utiliza-se da análise de variância para tal fim, relacionando a maior variância com a menor, que pode ser descrito matematicamente desta forma: onde s 1 é o desvio padrão das áreas obtidas com as injeções do padrão com solvente, e s 2 é desvio padrão das áreas obtidas com as injeções do padrão com a matriz. A tabela abaixo mostra os valores de F calculado para cada um dos HPAs, bem como o valor F tabelado, utilizado como referência para verificar o efeito de matriz. Tabela 1. Resultados do Teste F. HPA F calculado Literatura (n=7) Flu 2,04 Ant 4,78 4,28 B[a]P 1, CURVAS ANALÍTICAS A partir das soluções padrão de 50 mg.l -1 em diclorometano, preparadas a partir de suas respectivas soluções estoque de 2000 mg.l -1, foram obtidas as curvas analíticas nas concentrações de 0,5; 1,0; 2,0 e 5,0 mg.l -1. A tabela abaixo mostra as equações das curvas de regressão linear obtidas, bem como seus respectivos coeficientes de correlação (r). Tabela 2. Curva analítica dos HPAs estudados. HPA Equação da reta r Flu y = x ,9999 Ant y = x ,9987 B[a]P y = 66452x ,9936 Os coeficientes de correlação (r) das curvas analíticas de calibração pelo Método dos Mínimos Quadrados estão acima de 0,9936, indicando que o modelo linear pode ser usado na quantificação dos analitos. A construção da curva analítica com a presença da matriz deu-se a partir da visualização dos graus de recuperação e de concentração obtidos nos testes realizados em que as amostras foram contaminadas com 1 mg.l -1 do padrão de cada HPA, enquanto que as curvas plotadas apenas com padrão e solvente, foram percebidos valores muito elevados de recuperação. Foram construídas curvas de calibração para os três HPAs, só que, os padrões diluídos nas quatro concentrações supracitadas foram adicionados à cachaça para que os erros ocasionados pelo efeito da matriz fossem diminuídos. Posteriormente, utilizando o teste F, foram feitas comparações entre a variância das áreas dos padrões de 1,0 mg.l -1 somente em diclorometano, e a variância das áreas dos padrões nesta mesma concentração, só que adicionadas ao extrato da cachaça. A partir da análise dos dados obtidos (tabela 1) foi detectado efeito de matriz apenas para o antraceno (F calculado > F tabelado). Neste caso, deve-se considerar a realização deste ensaio com o emprego de curvas analíticas de naturezas distintas ou assumir o efeito da matriz para todos os analitos avaliados. Diante deste fato, optou-se por fixar para todas as análises posteriores, curvas analíticas construídas no extrato da cachaça, tornando-se de grande valia para minimizar erros decorrentes de interferentes desta matriz sobre os resultados obtidos (CARDOSO et al., 2008).
8 12 Haroldo Silveira Dórea; Maria das Graças Cardoso e outros 4.5. LINEARIDADE A linearidade é a resposta obtida em função da concentração do analito, a qual deve ser estudada em um intervalo de concentração apropriado (LANÇAS, 2004). Para testar a linearidade das curvas de calibração dos HPAs estudados, foram escolhidos quatro pontos de extrapolação, sendo que três para baixo (0,005; 0,01 e 0,05 mg.l -1 ) e um para cima (50,0 mg.l -1 ) para que fosse possível ter uma faixa linear de trabalho bastante grande (BISPO, 2005). As figuras abaixo mostram as curvas obtidas com a adição destes pontos. Figura 9: Teste de Linearidade do Benzo(a)pireno. Com a adição do ponto de extrapolação para cima, todos os analitos obtiveram boa linearidade. Com a adição dos pontos de extrapolação para baixo, apenas o fluoreno foi detectado para as concentrações de 0,01 e 0,05 mg.l SENSIBILIDADE A sensibilidade de um método indica a sua capacidade de discriminar, com uma fidelidade estabelecida, concentrações próximas de um analito (LANÇAS, 2004). A sensibilidade pode ser determinada por intermédio da inclinação do gráfico de calibração. No caso de uma reta, quanto maior o ângulo de inclinação da reta, mais sensível (LANÇAS, 2004). As Figuras 10, 11 e 12 ilustram de forma clara a diferença de sensibilidade entre as curvas analíticas preparadas com o padrão apenas em solvente puro e o padrão disperso na matriz (cachaça). Figura 7: Teste de Linearidade do Fluoreno Figura 8: Teste de Linearidade do Antraceno. Figura 10: Sensibilidade relativa do Fluoreno
9 Análise de Poluentes Orgânicos Tóxicos na Cachaça 13 na qual se encontra presente. A recuperação pe determinada pela relação: Esses estudos são efetuados adcionando-se soluções do padrão analítico de interesse com concentração conhecida à matriz isenta do analito.(lanças, 2004). Figura 11: Sensibilidade relativa do Antraceno. A precisão de um método pode ser expressa com valores de repetitividade, reprodutibilidade e/ou precisão intermediária. A repetitividade ( repeatability ) representa a concordância entre os resultados de medições sucessivas de um mesmo método, efetuadas sob as mesmas condições de medição, chamadas condições de repetitividade e pode ser expressa através da estimativa do desvio padrão relativo (RSD) (RIBANI et al., 2004). Figura 12: Sensibilidade relativa do Benzo(a)pireno Analisando os resultados obtidos, observou-se que as curvas dos analitos referente ao padrão apenas com o solvente puro obtiveram ângulos maiores que o das curvas preparadas a partir do padrão disperso na matriz, o que indica um maior sinal analítico para o primeiro método em relação ao segundo. Portanto, o primeiro método possui maior sensibilidade que o segundo método RECUPERAÇÃO E PRECISÃO DO MÉTODO A recuperação é uma medida de eficiência do processo de isolamento do analito de interesse da matriz A reprodutibilidade é o grau de concordância entre os resultados das medições de uma mesma amostra, efetuadas sob condições variadas (mudança de operador, local, equipamentos, etc.). A reprodutibilidade refere-se aos resultados dos estudos de colaboração entre laboratórios e deve ser considerada em situações como a padronização de procedimentos analíticos a serem incluídos, por exemplo, em farmacopéias, procedimentos do CODEX, etc (RIBANI et al., 2004). Este parâmetro também pode ser medido através do cálculo do RSD das replicatas. A tabela 3 representa o grau de reprodutibilidade dos resultados durante as injeções: Tabela 3: Recuperação e reprodutibilidade do método por SPE para análise de HPA. HPA Faixa (%) Média (%) Reprô (%) Flu 83,0-113,6 99,7 31,1 Ant 85,2-120,5 105,4 23,5 B[a]P 68,4-86,3 76,4 53,45
10 14 Haroldo Silveira Dórea; Maria das Graças Cardoso e outros 4.8. LIMITE DE DETECÇÃO (LOD) E LIMITE DE QUANTIFICAÇÃO (LOQ) COMPARAÇÃO DOS RESULTADOS OBTIDOS COM DADOS DA LITERATURA O Limite de Detecção (LOD) corresponde à menor quantidade ou concentração de um analito que pode ser diferenciada do ruído do sistema, porém não necessariamente quantificada como um valor exato. (LAN- ÇAS, 2004). A tabela 4 demonstra os valores dos LODs obtidos para os HPAs analisados. O Limite de Quantificação (LOQ) corresponde à menor quantidade de um analito que pode ser quantificada conforme a exigência da metodologia. A tabela 5 demonstra os valores dos LOQs obtidos para os HPAs analisados. Tabela 4: Limites de Detecção HPAs LODs (mg.l -1 ) Flu 0,003 Ant 0,008 B[a]P 4,24 Tabela 5: Limites de Quantificação HPAs LOQs (mg.l -1 ) Flu 0,009 Ant 0,024 B[a]P 12, ANÁLISE DE AMOSTRAS REAIS A tabela 6 mostra os resultados encontrados nas análises das amostras de cachaça. Tabela 6: Concentrações dos HPAs estudados em amostrras reais. Tfouni e Toledo (2007) avaliaram 57 amostras de açúcar e 25 amostras de cachaça comercializadas na cidade de Campinas-SP. Os níveis da somatória dos HPAs analisados nas amostras de açúcar (cristal, refinado, mascavo, demerara e orgânico) variaram entre não detectado e 1,35 µg/kg e nas amostras de cachaça entre não detectado e 1,94 µg/l. O HPA mais comumente encontrado foi o benzo (a) antraceno. Franco, et al (2007) analisaram quinze HPAs por cromatografia líquida acoplada a um detector de fluorescência em 131 amostras de cachaça de cana-deaçúcar queimada e não-queimada. A principal diferença entre estas duas classes de cachaças está no perfil quantitativo, do mais potente cancerígeno HPA, o benzo(a)pireno, que é mais abundante nas cachaça produzidas a partir de cana-de-açúcar queimada (0,0454 µg.l -1 ) do que na cachaça produzida a partir de culturas não-queimadas (0,00902 µg. L -1 ). Bettin e Franco (2005) investigaram a presença de HPAs em aguardentes por cromatografia líquida (CLAE) após sua prévia extração em fase sólida (SPE). Os HPAs foram identificados e quantificados em vinte e oito amostras de aguardentes de cana. Realizou-se um estudo estatístico para diferenciação entre o perfil das aguardentes produzidas a partir de cana-de-açúcar queimada e não-queimada. As tabelas 7, 8 e 9 demonstram valores de LOD, LOQ, concentração média dos HPAs fornecidos pela literatura, bem como os limites estabelecidos pela legislação escocesa. HPA Concentração Média (mg.l -1 ) Flu 0,40 0,14 0,14 0,14 0,14 Ant 0,72 0,28 0,29 0,29 0,62 B[a]P 0,46 0,37 0,93 0,48 0,55 Tabela 7: Valores de LODs na Literatura HPAs LODs (mg.l -1 ) Lit. 1 Lit. 2 Lit. 3 Lit. 4 Flu 0,01 0,00293 Ant 0,005 0,0042 B[a]P 0,001 0,011 0,06 0,000592
11 Análise de Poluentes Orgânicos Tóxicos na Cachaça 15 Tabela 8: Valores de LOQs na literatura. HPAs LOQs (mg.l -1 ) Lit. 1 Lit. 2 Lit. 3 Lit. 4 Flu 0,10 0,00879 Ant 0,01 0,0126 B[a]P 0,01 0,00177 Tabela 9: Dados de concentração média dos HPAs, fornecidos pela literatura e limites da legislação escocesa. HPAs Concentração Média (mg.l -1 ) Limite* Cana queimada Cana não-queimada Flu 0,001 0, ,0005 Ant 0,001 0,0034 ND** B[a]P 0,002 0,00155 ND** *Limite estabelecido pela legislação escocesa. **Concentração abaixo do LOD fornecido na literatura Conclusão A metodologia empregada na análise dos hidrocarbonetos policíclicos aromáticos nas amostras de cachaça, utilizando a extração em fase sólida, seguida da análise por GC-MS se apresentou satisfatória. Foram realizados testes para otimização da metodologia analítica e os parâmetros de validação foram determinados. Amostras de cachaça de Sergipe e Minas Gerais foram analisadas e tiveram faixa de concentração de 0,14 mg.l -1 para o fluoreno a 0,93 mg.l -1 para o benzo (a) pireno. As amostras de cachaça analisadas apresentaram altas concentrações dos três HPAs, mostrando que é necessário que se tenha uma maior preocupação quanto ao controle de qualidade desta bebida, desde o momento de cultivo até o produto final. A metodologia desenvolvida possui tempo de extração curto, pequenas quantidades de solvente orgânico, reduzida quantidade de amostra, em comparação com a técnica de extração líquido-líquido, reduzindo o seu custo de análise.
12 16 Haroldo Silveira Dórea; Maria das Graças Cardoso e outros REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ABRABE Associação Brasileira de Bebidas. Disponível em: < cachaca.php>.acessado em: 28 jan de identidade e qualidade para a aguardente de cana a para a cachaça. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 30 de jun Seção 1, n.124, p Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA); Resolução RE nº 899,de 29/05/2003. BARCELOS, L. V. F.; CARDOSO, M. G.; VILELA, F. J.; ANJOS, J. P. Teores de carbamato de etila e outros componentes secundários em diferentes cachaças produzidas em três regiões do estado de Minas Gerais: Zona da mata, sul de minas e vale do jequitinhonha. Química Nova, São Paulo, v. 30, n. 4, p , BARTLE, K. D. Analysis and occurence of polycyclic aromatic hydrocarbons in food. In: CREASER, C. & PURCHASE, R. (Eds) Food contaminants: sources and surveillance. Cambridge: The Royal Society of Chemistry, Cap.3, p.41-60, BRASIL, Portaria n. 36, de 19 de Janeiro de Aprova normas e o padrão de portabilidade da água destinada ao consumo humano. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 23 de jan Disponível em: < Acesso em: 06 de jan CAMPELO, E.A.P. Agronegócio da cachaça de alambique de Minas Gerais: panorama econômico e social. Informe agropecuário, Belo Horizonte, v. 23, n. 217, p. 7-18, CALDAS, E. D.; SOUZA, L. C. K. R.; Avaliação de risco crônico da ingestão de resíduos de pesticidas na dieta brasileira; Revista Saúde Pública, v. 34, n. 5, p , BETTIN, S. M.; FRANCO, D. W. Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) em aguardentes. Ciência de Tecnologia de Alimentos, v. 25, n.2, p , BISPO, J. R. L. Determinação de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos em Água Produzida por Extração em Fase Sólida e Cromatografia Gasosa com Detectar de Ionização por Chama. São Cristovão, p. Dissertação (Mestrado) Universidade Federal de Sergipe. CARDOSO, M. das G. Produção de Aguardente de Cana. Editado por Maria das Graças Cardoso.- 2ª ed. Editora UFLA, Lavras: CARDOSO, M. H. W. M.; NÓBREGA, A. W.; ABRANTES, S. Efeito da resposta cromatográfica acentuada e induzida pela matriz: estudo de caso em tomates. Revista Analytica, n. 34, p , CUMBICA: história da cachaça. Disponível em: < / Acesso em 14 de jan BRASIL, Instrução normativa n.13, 29 de junho de Regulamento técnico para fixação dos padrões de identidade e qualidade para a aguardente de cana a para a cachaça. Diário Oficial da União, Brasília, DF, 30 de jun Seção 1, n.124, p FALCÓN, M. S. G.; LAMELA, C. P.; GÁNDARA, J. S. Comparison os strategies for extraction of high molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons from drinks waters. Journal of Agricultural and Food Chemistry A, v.921, p , BRASIL, Instrução normativa n.13, 29 de junho de Regulamento técnico para fixação dos padrões FRANCO, D. W.; GALINARO, C. A.; CARDOSO, D. R. Profiles of Polycyclic aromatic hydrocarbons in
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