ANÁLISE DO POLIMORFISMO DA P53 NO CÓDON 72 EM PACIENTES COM LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA E AGUDA
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- Matilde Padilha Natal
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1 ANÁLISE DO POLIMORFISMO DA P53 NO CÓDON 72 EM PACIENTES COM LEUCEMIA MIELÓIDE CRÔNICA E AGUDA Jeany Camelo Santos 1,4 ; Rafael Lucas Leonídio 3,4 ; Flávio Monteiro Ayres 2,4,5,6 ; Priscila de Souza Barros 6 ; Aparecido Divino da Cruz 5,6. 1 Bolsista PBIC/UEG 2 Pesquisador Orientador 3 Voluntário Iniciação Científica PVIC/UEG 4 Curso de Ciências Biológicas, Unidade Universitária de Ciências Exatas e Tecnológicas, UEG 5 Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular, SuLeide, SES/GO. 6 Núcleo de Pesquisas Replicon, Departamento de Biologia, Universidade Católica de Goiás. RESUMO As leucemias resultam da proliferação neoplásica generalizada de células leucopoéticas e podem ser classificadas de acordo com o tipo celular envolvido e o grau de maturação das células. Até o presente momento, escassos estudos genético investigaram o envolvimento de variantes da proteína supressora de tumor P53 na leucemogênese. Os alelos polimórficos do códon 72 no gene p53 inclui variantes codantes da Arginina (p53arg) ou da Prolina (p53pro) que, portanto, geram dois genótipos homozigotos para p53argarg e p53propro, e um genótipo heterozigoto para p53argpro. O presente estudo tem como objetivo investigar as freqüências alélicas polimórficas do códon 72 do gene p53 em pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) e leucemia mielóide crônica (LMC). Assim, amostras de DNA foram extraídas pelo método do fenol/clorofórmio e precipitadas em álcool isoamílico de sangue periférico de 8 pacientes com LMA e outros 8 pacientes com LMC. Os alelos polimórficos foram amplificados por PCR e analisados gel de poliacrilamida 8% corado com nitrato de prata. Para as amostras analisadas de leucemia mielóide aguda observamos que 37,5% (3/8) das amostras demonstraram-se homozigotas para prolina, 25% (2/8) homozigotas para arginina e 37,5% (3/8) heterozigotos para os dois alelos, prolina e arginina. No que diz respeito às amostras de leucemias mielóides crônicas encontramos 37,5% (3/8) de homozigotos para prolina e 62,5% (5/8) de heterozigotos para os alelos prolina e arginina. Esses resultados preliminares sugerem que indivíduos 1
2 homozigotos para prolina possuem uma freqüência populacional elevada em pacientes com leucemias mielóides. Entretanto, estudos anteriores relatam que o genótipo homozigoto Arg/Arg é até sete vezes mais susceptíveis ao desenvolvimento do câncer do que o genótipo heterozigoto Arg/Pro, enquanto o genótipo homozigoto Pro/Pro foi encontrado em menor freqüência. As etapas seguintes deste projeto incluem a obtenção e análise de novas amostras de pacientes atendidos na Santa Casa de Misericórdia de Goiânia. Palavras-chave: leucemia mielóide, p53, polimorfismo Introdução A Leucemia Mielóide Crônica (LMC) é uma doença mieloproliferativa clonal das células pluripotentes da medula óssea e constitui 14% de todas as leucemias com uma incidência anual de 1.6 casos por 100 mil indivíduos (Bergatini et al, 2005). A progressão clínica da LMC inclui as fases crônica, acelerada e blástica, caracterizada pelo aumento de blastos leucêmicos no sangue periférico e/ou medula óssea. A LMC é caracterizada pelo cromossomo Philadelphia (Ph), produto de uma translocação recíproca entre os braços longos dos cromossomos 9 e 22 t(9;22)(q34;q11) que expressa um gene híbrido pela fusão dos genes bcr e abl (Artigas et al, 2003). O gene bcr (breakpoint cluster region), localizado no cromossomo 22, codifica uma proteína com atividade regulatória do ciclo celular. Enquanto o gene abl (Abelson Leukemia Vírus), localizado no cromossomo 9, codifica uma proteína tirosina-quinase. A proteína quimérica BCR-ABL apresenta atividade tirosina-quinase envolvida na transformação da célula progenitora hematopoética normal em maligna (Bergatini et al, 2005). Quanto ao prognóstico da LMC, destacam-se os seguintes fatores: cromossomo Ph, sexo, idade, data do diagnóstico, tamanho estômago e do baço, hemoglobina, contagem de plaquetas e de leucócitos, e a porcentagem de circulantes mieloblastos, além da porcentagem de basófilos e eosinófilos (Sokal et al, 1984). O tratamento da LMC por imatinib apresenta notável progressão, que em conjunto com atividade quinase da proteína p210 inibe a proliferação de células portadoras do cromossomo Ph (Bocchia et al, 2005). O imatinib induz a uma acentuada resposta citogenética em 80% dos casos Ph+ (Kim et al, 2004). A Leucemia Mielóide Aguda (LMA) é caracterizada por uma população de células blásticas mielóides monoclonais que, por vantagem proliferativa, substituíram as células normais da medula óssea (Boyer et al., 1998). A patogênese das leucemias envolve um processo de múltiplas etapas iniciadas, por exemplo por: dano ao DNA, instabilidade genômica, deficiências no reparo de DNA ou perturbações nas rotas 2
3 celulares de transdução de sinais (Willman, 1999). A promoção e progressão desses eventos podem resultar na dissociação entre os fatores reguladores da replicação e os da maturação celular (Lee et al., 1998). O gene p53, localizado no sítio 17p13.1, é um gene supressor tumoral que codifica uma proteína fosfonuclear de 53 kd. O p53 encontra-se inativado ou mutado em cerca de 60% dos tumores malignos. Mutações do gene p53 são consideradas as alterações genéticas mais freqüentes nos tumores malignos, sendo as mutações pontuais freqüentes na crise blástica da LMC. Devido às alterações no ciclo celular, no reparo de DNA, na imunidade e ocorrência de quimio-resistência às drogas, as mutações no gene p53 são usualmente associadas à instabilidade genômica (Cavalcante Jr., 2002). Os alelos polimórficos do p53 incluem as variantes no códon 72 que codificam ou o aminoácido arginina ou o aminoácido prolina. A homozigose para os alelos codantes da prolina no códon 72 é o genótipo observado em maior freqüência entre as populações humanas, sendo relacionado com a capacidade de induzir a apoptose. (Bergamaschi et al, 2006). O polimorfismo em LMA e LMC ocorre por substituição de uma base no códon 72 que resulta em alteração estrutural da proteína p53 (Lima et al, 2006). Por outro lado, acredita-se que a homozigose para arginina confere elevado risco de câncer cervical (Inserra et al, 2003), de mama (Vieira et al, 2005) e infecção ao papiloma vírus humano (HPV) (Anschau et al, 2005). O gene p53 é um importante supressor tumoral, cujo polimorfismo no códon 72 apresenta relevante função individual na suceptibilidade ao câncer e determinação prognóstica ao tratamento, por exemplo, com imatinib. Entretanto, as pesquisas sobre esse polimorfismo em pacientes com leucemias mielóides ainda são escassas, bem como a relação entre os alelos polimórficos do códon 72 e o processo de leucemogênese. Assim, este estudo tem como objetivo genotipar o polimorfismo do códon 72 de p53 em pacientes com leucemias mielóides crônicas e/ou agudas. Materiais e métodos Amostras de sangue periférico, extração e purificação de DNA. Para o estudo piloto deste projeto, amostras de DNA de oito pacientes com LMA e de outros oito pacientes com LMC foram utilizadas como molde para amplificação de DNA por PCR. Essas amostras foram obtidas de sangue periférico, células da mucosa oral ou medula óssea, confome descrito previamente (Ayres et al., 2004). Adicionalmente, 15 amostras sangue de pacientes com LMA e LMC atendidos no Serviço de Hematologia da Santa Casa de 3
4 Misericórdia de Goiânia (SCMG) foram coletadas para posterior extração de DNA por fenol-clorofórmio e precipitação em etanol e álcool isoamílico. A participação individual foi voluntária, mediante a autorização formal e, assinatura de termo de consentimento de investigação, conforme aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da SCMG (Protocolo No. 058/06). De acordo com o projeto, um total de 20 amostras será coletado e analisado quanto ao polimorfismo do p53. Genotipagem do polimorfismo do códon 72 de p53. As amostras de DNA foram amplificadas por PCR utilizando um conjunto individual de primers para o alelo polimórfico da arginina (5 TCC CCC TTG CCG TCC CAA 3 e 5 CTG GTG CAG GGG CCA CGC 3 ) e outro conjunto para o alelo polimórfico da prolina (5 GCC AGA GGC TGC TCC CCC 3 e 5 CGT GCA AGT CAC AGA CTT 3 ) com produtos de amplificação esperados de 141 pb e 177 pb, respectivamente. O protocolo de amplificação seguiu os parâmetros descritos previamente por Oliveira (2005). Os produtos de PCR foram analisados em PAGE 8% corado por nitrato de prata. Resultados e discussão As freqüências genotípicas encontradas em pacientes com LMA são de 37,5% (3/8) para TP53ProPro, 25% (2/8) para TP5ArgArg e 37,5% (3/8) para TP53ArgPro. Os pacientes com LMC tiveram 37,5% (3/8) para TP53ProPro e 62,5% (5/8) para genótipos de TP53ArgPro, como mostrado na tabela 1. Esses resultados corroboram os poucos estudos já realizados sobre o polimorfismo do códon 72 do p53 em pacientes com LMC. Bergamaschi et al. (2004) relataram elevada freqüência do alelo codante da prolina em pacientes com LMC quando comparado com um grupo controle. Adicionalmente, o alelo codante da prolina foi identificado como fator de risco para o desenvolvimento da LMC e resistência ao imatinib. Ao nosso conhecimento, inexistem dados publicados sobre o polimorfismo do códon 72 do p53 em pacientes brasileiros com leucemias mielóides. Tal investigação se faz relevante, pois a freqüência de alelos polimórficos é um fator inerente à composição étnica da população estudada. 4
5 Conclusões Apesar do pequeno número de amostras analisadas até a presente etapa deste estudo, conclui-se que o alelo da prolina foi o mais prevalente nos pacientes com leucemias mielóides. Tabela 1. Descrição de alelós e freqüências genotípica do códon 72 do gene p53 em pacientes com LMA e LMC. Leucemia Pacientes Alelos Freqüência Genótipo TP53Pro TP53Arg genotípica LMA A A p53propro 37,5% (3/8) A A A p53proarg 37,5% (3/8) A A A p53argarg 25% (2/8) LMC C C p53propro 37,5% (3/8) C C C C p53proarg 62,5% (5/8) C C Agradecimentos J. C. Santos foi bolsista PBIC/UEG. Referências bibliográficas ANSCHAU, F.; SCHIMITT, V.M.; GONÇALVES, M. A. G.; GARICOCHEA, B. Associação entre o polimorfismo no codon 72 da p53 e as lesões pré-malignas e malignas cervicais. Rev Brás Ginecol Obstet. Rio Grande do Sul, v.27, n.10, p , out, ARTIGAS, C. G.; MELO, A.; ROA, J.C.; QUIJADA, I.; VITTINI, C.; CABRERA, M. E. & RISUENO, C. Transcritos de fusion del gen BCR/ABL em pacientes com Leucemia Mielóide Crônica. Int, J. Morphol, Temuco, Chile, v.21, n.13, p , 14 Jul, AYRES, F.M.; NARITA M.; TAKAHASKHI, M.; YANO, T.; AICHUN, L.; TOBA, K.; FURUKAWA, T.; AIZAWA, Y. Human dendritic cells mediate anti-tumor activity against hematopoietic tumor cells without direct and Fas/ FasL Killing pathway. BERGAMASCHI, G; MERANTE, S.;ORLANDI, E.; GALLI,A.; BERNASCONI, P.; CAZZOLA,M. TP53 codon 72 polymorphism in patients with chronic myeloid leukemia. Haematologica the journal, n. 7, v. 89, p Jul
6 BERGANTINI, A. P. F.; CASTRO, F. A.; SOUZA, A, M.; Leucemia Mieloide Crônica e o sistema Faz-FasL. Rev Brás Hematol Hemoterapia. Rio de Janeiro. V. 27, n.2, p Abr/ Jun BOCCHIA, M.; GENTILI, S.; ABRUZZESE, E.; FANELLI, A.; JULIANO, F.; TABILIO, A.; AMAKILI, M.; FORCONI, F.; GOZZETE, A.; RASPADORI, D.; AMADORI, S.; LAURIA, F. Effect a p210 multipeptide vaccine associated with imatinib or interferon in patients with Chronic Myeloid Leukemia and persistent residual disease a multicentre observational trial. The Lancet. Siena,Italy, v. 365, p , 19 Fev BOYER, J.C.; RISINGER, J,L.; FARBER, R. A. Stability of microsatellite in myeloid neoplasias. Cancer Genet Cytogenet, v. 106, p , CAVALCANTI- JÚNIOR, G.B.; KLUMB, C.E.; MAIA R. C. P53 e as neoplasias malignas. Revista Brasileira de Cancerologia. Rio de Janeiro, v. 48, n. 3, p INSERRA, P.; ABRAHAMSEN, M.; PAPENFUSS, M.; GIULIANO, A. R. ethic varuation of the p53 codon 72 polymorphism, HPV persistence, and cervical câncer risk. International journal of STD & AIDS, n. 14, p , KIM, Y.J.; KIM, D.W; LEE, S.; MIN, C. K.; GOB, H. G.; KIM, S.H.; LEE, J.Y.; KIM, Y. L.; KIM, H. J.; KIM, H. J.; LEE, J. W.; KIM, T.G.; MIN, W. S.; KIM, C.C. early prediction of Molecular Remission by monitoring BCR-ABL transcript Levels in patients Achieving a Complete Cytogenetic Response after Imatinib Therapy for Posttransplation Chronic Myelogenous Leukemia Relapse. Biology of Bood and Marrow Transplantation. Arlington Heights, v. 10, p , Jun LIMA, J.M.; SERAFIM, P.V.P.; SILVA, I. D. C. G.; FORONES, N. M. Estudo do polimorfismo genético no gene p53 (códen 72) em câncer colorretal. Câncer/ Oncologia/ Tumor. São Paulo, v. 43, n. 1, Jan/MAR Disponível em < em: 03 Out de 2007 LEE, G. R.; BITHELL, T.C.; FOERSTER, J.; ATHENS, J.W.; LUKENS, J. N. hematologia clínica. 9 ed. São Paulo. Ed. Manole, p. SOKAL, J. E.; COX, E. B.; BACCARANI, M.; TURA, S.; GOMEZ, G.A.; ROBERTSON, J.E.; TSO, C. Y.; BRAUN, T.J.; CLARKSON, B.D.; CERVANTES, F.; ROZMAN, C. prognostic Discrimination in Good Risk Chronic Granulocytic Leukemia. Blood, v. 63, n. 4, p , Abr, 1984 VIEIRA, J.O.; GEBRIM, L. H.; SILVA, I. D. C. G. Estudo de polimorfismo de p53 no códon 72 em pacientes com câncer de mama. Revista Brás. Ginecol. Obstret. Rio de Janeiro, v. 28, n. 5, p , Mai, WILLMAN, C. L.; Molecular evaluation of acute myeloid leukemia. Semin in Hematol. New York, v. 4, n. 36, p Out,
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